Name: Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę oceny ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego. Technika ta pozwala uzyskać obrazy wysokiej rozdzielczości makro-, mezo-, mikro- i nanostruktur w predefiniowanym układzie współrzędnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują kolegom z ośrodka dla zwierząt na Wydziale Medycznym Uniwersytetu Ruhry w Bochum za wsparcie i opiekę nad zwierzętami.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalne komisje etyki zwierząt krajów związkowych Hamburg i Nadrenia Północna-Westfalia w Niemczech. Używaj sterylnych narzędzi, rękawic ochronnych i aseptycznych fartuchów podczas całego zabiegu chirurgicznego.
1. Transdukcja w macicy
<ol>
	<li>Przygotować kodowanie wirusa związanego z adenowirusem typu 1 (AAV1) dla pożądanego celu (4 x 1011 cząstek wirusa/μl AAV1) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) o pH 7,4. Dodać 0,1 mg/μL Fast Green i przechowywać mieszaninę AAV1-Fast-Green w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj cienką końcówkę kapilarną o pożądanym kształcie (8 mm długości, średnicy zewnętrznej 80 μm i średnicy wewnętrznej 50 μm), używając ściągacza do mikropipet (ustawienia: ciśnienie = 500, ciepło = 700, pociągnięcie = 0, prędkość = 80, czas = 200, patrz Tabela materiałów). Złam końcówkę kapilary tak, aby miała 4-5 mm.</li>
	<li>Zamontuj rurkę aspiratora (44 cm x 0,7 cm) z końcówką kapilarną i zasysaj 15 μl mieszaniny AAV1-Fast-Green do kapilary.</li>
	<li>Utrzymuj zwierzęta w stałej fizjologicznej temperaturze ciała wynoszącej 37 °C przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Umieść ciężarną mysz C57Bl/6 (14,5 dnia embrionalnego) w komorze preinkubacyjnej i znieczulij mysz gazowym 4% izofluranem (o objętościowym natężeniu przepływu powietrza 0,6-0,8 l/min).</li>
	<li>Podskórnie wstrzyknąć buprenorfinę (0,1 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na podgrzanej płytce chirurgicznej (37 °C).</li>
	<li>Zakryj oczy lubrykantem.</li>
	<li>Dopasuj mysz do maski anestezjologicznej (gazowy 1,5% izofluranu o objętościowym natężeniu przepływu powietrza 0,6-0,8 l/min) na płytce operacyjnej i ogol obszar skóry brzucha. Przetrzyj ogolony obszar 3X 75% etanolem, a następnie roztworem betadyny. 
	nuta: Stale monitoruj zachowanie oddechowe znieczulonej myszy. Dostosuj stężenie izofluranu zgodnie ze wzorcem wdechu i wydechu myszy.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma odruchu podeszwowego, ściskając paliczki tylnej łapy myszy.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną, chwytając skórę zakrzywionymi ząbkowanymi kleszczykami do tęczówki (10 cm) i przecinając skórę wzdłuż kresy środkowej prostymi nożyczkami z węglika wolframu (10 cm), a następnie chwytając ścianę otrzewnej prostą pęsetą Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) i przecinając ścianę wzdłuż kresy białej prostymi nożyczkami Vanny (8 cm).</li>
	<li>Umieść kawałek fenestrowanej folii parafinowej na otworze brzusznym i przymocuj folię na obu końcach za pomocą kleszczy hemostatycznych do mikrokomarów (12,5 cm, zakrzywionych).</li>
	<li>Odsłoń rogi macicy za pomocą urządzenia przypominającego łyżkę, aby uniknąć uszkodzenia zarodków wewnątrz rogów macicy. Wlej kilka kropli PBS (37 °C) na rogi macicy i sprawdź zarodki pod kątem uszkodzeń lub wad rozwojowych wewnątrz worka macicy.</li>
	<li>Udokumentuj kolejność i położenie zarodków w rogach macicy. Ostrożnie obracać zarodki wewnątrz worka macicy, aż do osiągnięcia pożądanej pozycji do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1-2 μl mieszaniny AAV1-Fast-Green, dokonując oględzin miejsca wstrzyknięcia (np. komór mózgu) i penetracji barwnika pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Udokumentuj wstrzyknięte zarodki i umieść rogi macicy z wstrzykniętymi zarodkami z powrotem w jamie brzusznej.</li>
	<li>Wlać kilka kropli PBS (37 °C) do jamy brzusznej. Zamknij jamę, zszywając ścianę otrzewnej (użyj szwów poliamidowych w rozmiarze 6-0) i skórę (użyj szwów poliamidowych w rozmiarze 3-0), używając kleszczyków hemostatycznych Halsteda (12,5 cm, zakrzywionych). Alternatywnie użyj prostego przerywanego wzoru lub szwów/zszywek ze stali nierdzewnej, aby zamknąć jamę brzuszną i skórę.</li>
</ol>
2. Telemakrofotografia izolowanych tkanek
<ol>
	<li>Przygotowanie
	<ol>
		<li>Przygotować bufor Sörensena (1 l), rozpuszczając 14,95 g Na2HPO4 i 2,18 g KH2PO4 w 1 l wody destylowanej, mieszając przy 200 obr./min. W celu perfuzji młodych w późnej ciąży i/lub młodych w okresie poporodowym, należy użyć igieł odpowiedniego rozmiaru do wstrzyknięcia brzusznego lub dożołądkowego i upewnić się, że stężenie końcowego znieczulenia pentobarbitalem sodu nie przekracza 180 mg/kg masy ciała.</li>
		<li>Przygotować roztwór utrwalający Mugnainiego (5 l), ogrzewając 500 ml wody destylowanej do temperatury 75 °C i dodając 50 g proszku paraformaldehydu mieszając przy 200 obr./min, dodając 200 μl 5 N NaOH, dodając 1500 ml buforu Sörensena, 1750 ml wody destylowanej i 500 ml 25% aldehydu glutarowego. Napełnij do 5,000 ml wodą destylowaną. Użyj tego ostatniego bufora do perfuzji. 
		UWAGA: Przygotuj roztwór utrwalający Mugnaini pod maską, noś okulary ochronne i unikaj oparów. Dodaj błękit metylenowy (0,05 g/l), aby uzyskać lepszą wizualizację perfuzji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja myszy i izolacja tkanek
	<ol>
		<li>Perfuzja przezskórna ciężarnych myszy, które noszą transdukowane zarodki (w przypadku badań na zarodkach) lub urodzonych transdukowanych zarodków w pożądanym wieku (np. 24 dzień po porodzie) zgodnie ze standardowymi procedurami6,7,11,12,13,14,15,16,17, przy użyciu dootrzewnowego końcowego znieczulenia pentobarbitalem sodu (200 mg/kg masy ciała).</li>
		<li>Wstrzyknąć myszom przezsercowo roztwór heparyny (500 j.) za pomocą igły o stężeniu 26 G, 1 w igle, a przed utrwaleniem wstrzyknąć myszom przezsercowo 10 ml PBS w celu wypłukania krwi z organizmu i perfuzjować je przezsercowo za pomocą 30 ml wstępnie podgrzanego roztworu utrwalającego Mugnainiego o temperaturze 40 °C. 
		nuta: W przypadku dorosłych myszy wykonaj alternatywną perfuzję wsteczną przez aortę brzuszną14.</li>
		<li>Wyizolować perfundowaną tkankę będącą przedmiotem zainteresowania (np. cały mózg lub rdzeń kręgowy) i umieścić ją w co najmniej 10 ml roztworu utrwalającego Mugnainiego przez kolejne 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Myj chusteczkę w 10 ml PBS przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie w agarozie, dokumentacja i przekroje
	<ol>
		<li>Dostosuj wyizolowaną tkankę (np. cały mózg) w specjalnej ramce o powtarzalnym kącie przekroju8,9,10. Alternatywnie użyj wibratomu o regulowanej grubości cięcia.</li>
		<li>Umieść tkankę nerwową w kadrze, dostosuj tkankę do telemakrografii i udokumentuj współrzędne.</li>
		<li>Przygotować 3% niskotopliwą pożywkę do zatapiania agarozy: dodać 3 g agarozy do 100 ml buforu Sörensena i podgrzać mieszaninę w łaźni wodnej do temperatury 90 °C.</li>
		<li>Wlać 3% agarozy (30 °C) do ramki, w której znajduje się chusteczka. Przykryj ramę ciepłym metalowym blokiem i poczekaj, aż stwardnieje. Podczas utwardzania użyj urządzeń telemakrograficznych, aby zobrazować osadzoną tkankę i jej współrzędne w ramie.</li>
		<li>Przenieś tkankę osadzoną w agarozie do ramy z wycięciami odpowiadającymi współrzędnym pierwszej ramki.</li>
		<li>Pokrój osadzoną tkankę na odcinki o pożądanej grubości (np. 1,5 mm) za pomocą urządzenia z cienką i wibrującą żyletką (patrz Tabela materiałów). 
		nuta: Aby poprawić poślizg żyletki, wlej kilka kropel gliceryny na osadzoną tkankę.</li>
		<li>Zobrazuj każdy fragment tkanki w PBS i zbierz obrazy do folderu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie wyizolowanej tkanki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej
UWAGA: Wykonuj wszystkie dalsze etapy inkubacji w szklanych naczyniach z szczelnie zamykanymi pokrywkami na platformie do wytrząsania pod maską.
<ol>
	<li>Myj skrawki tkanek przez 2x 30 min w PBS. Inkubować skrawki w 2% wodnym roztworze tetratlenku osmu (OsO4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. 
	ostrożność: Tetrtlenek osmu jest toksyczny i może być szkodliwy w kontakcie ze skórą.</li>
	<li>Płukać osmiczne sekcje przez 2x 30 min w PBS.</li>
	<li>Inkubować skrawki w 30%, 50% i 70% etanolu w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut (opcjonalnie: inkubować w 70% etanolu w temperaturze 4 °C przez noc).</li>
	<li>Zobrazuj osmiczne próbki w 70% etanolu pod światłem LED RGB class8,9,10 (2x 15 W) nałożony na próbkę z lewej i prawej strony pod kątem 45°. Używaj czarnych naczyń i matowego czarnego tła, aby zminimalizować rozpraszanie i odbicie światła podczas oświetlenia. 
	ostrożność: Nie dopuścić do wyschnięcia przekroju podczas obrazowania.</li>
	<li>Utwórz atlas obrazów przekroju ze współrzędnymi, zbierając obrazy w seriach w folderze.</li>
	<li>Próbki inkubować w 100% etanolu (2x przez 30 min) i 100% tlenku propylenu (2x przez 30 min) w temperaturze pokojowej. 
	ostrożność: Nie pozwól, aby sekcje wyschły podczas zmiany roztworów.</li>
	<li>Wymieszaj 260 ml żywicy z 240 ml bezwodnika dodecenylobursztynowego w szklanym naczyniu, delikatnie mieszając szklanym prętem. Okresowo sprawdzaj, czy nie ma niejednorodności, pęcherzyków i rozmazów. Bardzo delikatnie mieszaj ręcznie przez co najmniej 45 minut.</li>
	<li>Przygotować żywicę/tlenek propylenu w stosunku 1:2 i 1:1 i dodać 3% akcelerator (2,4,6-tris(dimetyloaminometylo)fenol).</li>
	<li>Inkubować tkankę w roztworze do zatapiania w stosunku 1:2 z kroku 3.8 przez 2 godziny, a następnie w roztworze do zatapiania w stosunku 1:1 z kroku 3.8 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na obracającym się kole.</li>
	<li>Umieść chusteczkę w płaskich naczyniach polipropylenowych, przykryj tkankę świeżą żywicą zawierającą 3% akcelerator i utwardź osadzoną tkankę w temperaturze 65-85 °C przez 12-24 godziny.</li>
	<li>Schłodzić osadzoną tkankę do temperatury pokojowej i usunąć próbki zatopione w żywicy z naczyń polipropylenowych.</li>
</ol>
4. Wybór parametrów neuroplastyczności ultrastrukturalnej do analizy ilościowej
<ol>
	<li>Mapowanie obszaru zainteresowań
	<ol>
		<li>Wybierz obszar zainteresowania (np. hipokamp lub móżdżek) i zlokalizuj obszar w sekcji atlas, wybierając obraz z atlasu (krok 3.5), który zawiera ten obszar.</li>
		<li>Naszkicuj granice obszaru zainteresowania na obrazie przekroju i znajdź/nałóż te obramowania obszarów na próbkę żywicy.</li>
		<li>Zaznacz granice obszaru zainteresowania (np. hipokampa lub móżdżku) na próbce żywicy za pomocą cienkiej igły (26 G, 1 cal).</li>
		<li>Podgrzej próbkę żywicy do 85 °C w piekarniku, aby zmiękczyć żywicę do przycinania lub, alternatywnie, użyj urządzenia do przycinania, cienkiego ostrza lub papieru ściernego.</li>
		<li>Wyciąć obszar zainteresowania z próbki żywicy za pomocą żyletki (patrz Tabela materiałów). Zamontuj próbkę na prętach mocujących ze szkła akrylowego o wymaganym kalibrze (np. o średnicy 8 mm i długości 1 cm) za pomocą kleju. Przyciąć zamontowaną próbkę do cięcia pół- i ultracienkiego.</li>
		<li>Przygotować półcienkie (0,75 μm) i ultracienkie (70 nm) odcinki przycinanego obszaru za pomocą ultramikrotomu: ustawić go na 1,5 mm/s dla grubości 0,75 μm i na 0,7 mm/s dla grubości 70 nm.</li>
		<li>Zebrać półcienkie skrawki na szklanych nośnikach i zabarwić je 1% błękitem toluidynowym w PBS (przez 4 minuty).</li>
		<li>Umyj sekcje kilka razy w wodzie dejonizowanej. Zbadaj zabarwione skrawki pod mikroskopem świetlnym za pomocą obiektywów 4x (NA 0,1 ∞/-), 10x (NA 0,22 ∞/0,17), 40x (NA 0,65 ∞/0,17) i 100x (NA 1,25 ∞/0,17).</li>
		<li>Zbieraj ultracienkie sekcje na siatkach niklowych. Poddaj sieci działaniu TEM przy napięciu 180 kV i powiększeniu 3,200x, 6,000x i/lub 8,000x.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza TEM
	<ol>
		<li>Wybierz parametry ultrastrukturalne będące przedmiotem zainteresowania do ilościowej analizy TEM (np. bulony z pęcherzykami i mitochondriami lub mielinizowane i niezmielinizowane aksony) i wykonaj obrazy TEM tych parametrów w powiększeniu 3,500x, 6,000x i/lub 8,000x.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+axo-dendritic+synapses+in+the+hippocampal+cortex%3A+electron+and+light+microscopic+studies+on+the+layer+of+mossy+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers.</a> Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159(1961).</li>
<li>Hamlyn, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+the+mossy+fibre+endings+in+the+hippocampus+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit.</a> Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).</li>
<li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+Fine+Structure+of+the+Nervous+System%22">The Fine Structure of the Nervous System</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).</li>
<li>Rollenhagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+transmission+at+large+hippocampal+mossy+fiber+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).</li>
<li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+cleaves+cell+adhesion+molecule+L1+and+promotes+neuritogenesis+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).</li>
<li>Lutz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Basic+Protein+Cleaves+Cell+Adhesion+Molecule+L1+and+Improves+Regeneration+After+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury.</a> Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).</li>
<li>Kraus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fragment+of+Adhesion+Molecule+L1+Binds+to+Nuclear+Receptors+to+Regulate+Synaptic+Plasticity+and+Motor+Coordination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination.</a> Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).</li>
<li>Andres, K. H., von Düring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferenzph%C3%A4nomene+am+osmierten+Pr%C3%A4parat+f%C3%BCr+die+systematische+elektronenmikroskopische+Untersuchung%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopie%22%5BJournal%5D)">Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung.</a> Mikroskopie. 30, 139(1974).</li>
<li>Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndres%2C+KH+%22Principle+and+Techniques+of+Electron+Microscopy%3A+Biological+Appliccations%22">Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations</a>. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).</li>
<li>Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndres%2C+KH+%22Techniques+in+Neuroanatomical+Research%22">Techniques in Neuroanatomical Research</a>. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).</li>
<li>Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+neural+tissues+or+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).</li>
<li>Webster, H. F., Collins, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+osmium+tetroxide+and+glutaraldehyde+perfusion+fixation+for+the+electron+microscopic+study+on+the+normal+rat+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).</li>
<li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Methodik+der+Perfusionsfixierung+des+Zentralnervensystems+von+S%C3%A4ugern%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopie%22%5BJournal%5D)">Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern.</a> Mikroskopie. 21, 169(1967).</li>
<li>Forssmann, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+par+perfusion+pour+la+microscopie+%C3%A9lectronique.+Essai.+De+g%C3%A9n%C3%A9ralisation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Microscopie%22%5BJournal%5D)">Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation.</a> Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).</li>
<li>Descarries, L., Schröder, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+du+tissue+nerveux+par+perfusion+%C3%A0+grand+debit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Microscopie%22%5BJournal%5D)">Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit.</a> Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).</li>
<li>Langford, L. A., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+potassium+ferricyanide+in+neural+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Records%22%5BJournal%5D)">The use of potassium ferricyanide in neural fixation.</a> Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin-positive+L5a+pyramidal+neurons+in+the+development+of+the+paralemniscal+pathway+in+the+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex.</a> Molecular Brain. 7, 84(2014).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilins+regulate+synaptic+plasticity+and+mitochondrial+calcium+homeostasis+in+the+hippocampal+mossy+fiber+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway.</a> Molecular Neurodegeneration. 12, 48(2017).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).</li>
<li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960(2012).</li>
<li>Nishiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+regulated+gene+expression+in+murine+Purkinje+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation.</a> European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).</li>
<li>Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORalpha+regulates+multiple+aspects+of+dendrite+development+in+cerebellar+purkinje+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowym etapem transdukcji in utero jest procedura iniekcji. Precyzyjne wstrzyknięcie do komór mózgu lub do innego obszaru zainteresowania wymaga doświadczenia i umiejętności praktycznych. Im cieńsza końcówka mikrokapilarna, tym mniej może dojść do uszkodzenia tkanki; Odbywa się to jednak kosztem zwiększenia ciśnienia wtrysku. W przeciwieństwie do elektroporacji in utero 19,20,21,22, przeżywa...

Żaden foton nie może przeniknąć przez ultracienką próbkę tkanki na głębokości elektronu. Przypisuje to TEM nieocenione korzyści w rejestrowaniu obrazów drobnych struktur w rozdzielczości nanometrowej w porównaniu z technikami mikroskopii świetlnej. Na przykład TEM pozwala na wizualizację organelli wewnątrzkomórkowych, takich jak mitochondria, melanosomy i różnego rodzaju granulki wydzielnicze, mikrotubule, mikrofilamenty, rzęski, mikrokosmki i połączenia międzykomórkowe (specjalizacje powierzchni komórki), w szczególności synaps w układzie nerwowym1,2,3,4. Ogólnym celem niniejszego badania metodologicznego jest ultrastrukturalne rozpoznanie zmian plastyczności neuronalnej podczas rozwoju po interferencji prenatalnej poprzez połączenie najnowocześniejszych technik transdukcji in utero i TEM. Interesujące nas białka kodowane wirusowo zostały transdukowane w macicy do ośrodkowego układu nerwowego5,6,7, w tym rdzeń kręgowy6. Na przykład transdukcja in utero w połączeniu z TEM została wykorzystana do badania wpływu cząsteczki adhezyjnej L1 na plastyczność uczenia się motorycznego u myszy z niedoborem L1, w szczególności w odniesieniu do interakcji między L1 a białkami receptora jądrowego w neuronach móżdżku7.
Analiza parametrów neuroplastyczności wymaga precyzyjnych informacji na temat lokalizacji najmniejszych obszarów w układzie nerwowym. W związku z tym wystarczające jest opisanie szczegółów ultrastrukturalnych i ich dokładnej orientacji topograficznej w stosunku do innych konstrukcji. W niniejszej pracy przedstawiono specyficzną metodę przygotowawczą mającą na celu szczegółowe zbadanie odrębnych obszarów morfologicznych w oparciu zarówno o mikroskopię świetlną, jak i elektronową. Podejście to łączy w sobie kilka technik manipulacji tkankami, zaczynając od transdukcji in utero mózgu myszy i rdzenia kręgowego, a następnie utrwalania perfuzji, osadzania pleśni i przetwarzania tkanki pod kątem TEM. Istotnym etapem pomiędzy zatopieniem a przetworzeniem tkanki do TEM jest dokumentacja tkanki przy użyciu techniki odbicia światła interferencyjnego, która pozwala na precyzyjną dokumentację mikrofotograficzną i dokumentację próbek tkanek w małym powiększeniu8,9,10. Technika ta, zastosowana w niniejszym podejściu, umożliwia naukowcom badanie szczegółów topograficznych i strukturalnych powierzchni tkanek nerwowych oraz profili warstw próbek przed ich przygotowaniem do TEM.
Specjalna ramka do dzielenia całych mózgów odpowiada współrzędnym stereotaktycznym. Rama ta korzystnie wpływa na morfologiczną trójwymiarową (3D) rekonstrukcję obszarów w tkance nerwowej i może być wykorzystana do analizy morfometrycznej. Makrografiom wizualizowanych przekrojów przypisywane są współrzędne topograficzne, a odcinki ponumerowane szeregowo budują mapy w atlasie tkankowym.
Po przetworzeniu żywicy, osadzona tkanka jest dzielona na ultracienkie odcinki (<70 nm) zawierające wybrane obszary, zgodnie z mapami wyżej wymienionego atlasu tkanek. Ultracienkie skrawki poddawane są działaniu TEM w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości obrazów parametrów plastyczności (np. profili przekrojowych, obszarów profili synaptycznych lub włókien aksonalnych), ich zawartości oraz kontaktów z sąsiednimi strukturami w obrębie kompleksu neuropil.
Dzięki opisanej tu metodzie, płynne przejście od wizualizowanych makrostruktur do mikro- i nanostruktur pozwala na porównawcze dogłębne badania morfologicznej plastyczności neuronów po transdukcji in utero rozwijającego się układu nerwowego.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-tris(dimetylo-aminometylo)fenol</td><td>Serva</td><td>36975</td><td></td></tr><tr><td>Igła 26 G x 1''</td><td>Henke-Sass, Wolf GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>410 Jednostka anestezjologiczna do pompy powietrza</td><td>Instrumenty biomedyczne (Univentor)</td><td>8323102</td><td></td></tr><tr><td>Wirus związany z adenowirusem serotyp 1 (AAV1)</td><td>UKE (Viral Core Facility)</td><td>-</td><td>Aby zapoznać się z odniesieniami i obszarami docelowymi AAV1, zobacz: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ a także: Projektant wektorów dostarczania genów: inżynieria molekularna i ewolucja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w celu zwiększonego transferu genów. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar; 25(3):489-99. Rekombinowane wektory wirusa AAV pseudotypowane kapsydami wirusowymi z serotypów 1, 2 i 5 wykazują różną wydajność i tropizm komórkowy po dostarczeniu do różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 sierpień; 10(2):302-17. Samokomplementarne wektory rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (scAAV) sprzyjają efektywnej transdukcji niezależnie od syntezy DNA. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 sierpień; 8(16):1248-54.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>nisko żelująca pompa powietrza z agarozą</td></tr><tr><td></td><td>Instrumenty biomedyczne (Univentor)</td><td>Żywica Eheim 100</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>CIBA-GEIGY</td><td>23857.9</td><td>do zatapiania</td></tr><tr><td>zespołów strojenia aspiratora</td> tkankowego <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Maska oddechowa Mysz Anodowane aluminiowe</td><td>instrumenty biomedyczne (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina</td><td></td><td>Ampułki</td><td>przeciwbólowe</td></tr><tr><td>kapilary</td><td>Science-Products</td><td>GB100TF-10</td><td>z fillamentem</td></tr><tr><td>Bezwodnik dodecenylsztynowy</td><td>Fluka</td><td>44160</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont (#3, 12 cm, prosta, 0,2 x 0,12 mm)</td><td>FST</td><td>11203-23</td><td></td></tr><tr><td>golarka elektryczna</td><td>Phillips</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Nici Ethicon (Ethilon, 6-0 i 3-0)</td><td></td>Ethicon-poliamidowy <td></td><td></td></tr><tr><td>lubrykant do oczu</td><td>Bepanthene-Fast</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>do wizualizacji wstrzykiwanych cieczy</td></tr><tr><td>Przełącznik routingu gazu Złącza 4/2</td><td>Instrumenty biomedyczne (Univentor)</td><td>8433020</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze hemostatyczne halsted Mosquito (12,5 cm, proste)</td><td>FST</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>25 000 I.E./5 mL</td></tr><tr><td>Pudełko indukcyjne dla myszy z pokrywą przesuwaną poziomo. Wymiary wewnętrzne: LxBxW: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Grubość ścianki: 6 mm</td><td>Instrumenty biomedyczne (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>kleszczyki do tęczówki (10 cm, zakrzywione, ząbkowane)</td><td>FST</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do przysłony (11 cm, proste, węglik wolframu)</td><td>FST</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran OP Tisch, podgrzewany elektrycznie, sm Wymiary zewnętrzne: 257mm x110 mm x 18 mm. Powierzchnia grzewcza: 190 mm x 90 mm Usuwanie izofluranu ulatniającego się maski oddechowej odbywa się w dół zgodnie z przepisami </td><td>Instrumenty biomedyczne (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>izofluran (Attane)JD</td> <td>medical</td><td></td><td>znieczulenie wziewne</td></tr><tr><td>Lampy LED RGB</td><td>Cameo</td><td>CLQS15RGBW</td><td>LED 2 x 15 W</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny Basic DM E</td><td>Leica-4x</td><td></td> <td>(N.A. 0.1 &infin;/-), 10x (N.A. 0.22 &infin;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &infin;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &infin;/0.17) Ściągacz</td></tr><tr><td>do mikropipet</td><td>Science-Products</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki hemostatyczne do komarów (12.5 cm, zakrzywione)</td><td>FST</td><td>13010-12</td><td></td></tr><tr><td>Siatki niklowe, oczka 200</td><td>Ted Pella</td><td>1GC200</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek osmu (VIII)</td><td>Degussa</td><td>73219</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu</td><td>Fluka</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>żyletki</td><td>Schick</td><td>87-10489</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu (Narcoren)</td><td>Merial GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TC01mR 1-kanałowy regulator temperatury ze sprzężeniem zwrotnym</td><td>Instrumenty biomedyczne (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Technovit 4004 dwuskładnikowy klej</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telemacrodevice</td><td>Canon-Canon</td><td></td> <td>Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Obiektyw, Przedłużenie poniżej 150 mm, Ręczna rurka przedłużająca Pierścień 7 mm, Pierścień 14 mm, Pierścień 28 mm, Pierścień wsteczny makro (58 mm), Podstawka pod kopię Canon.</td></tr><tr><td>Thermopuller P-97</td><td>Sutter Instruments</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>cienkie wibrujące żyletki</td><td>Krup-z</td><td></td> <td>cienkimi ostrzami Szabo</td></tr><tr><td>toluidyna niebieska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy C20</td><td></td> <td>Phillips-do</td> <td>200 kV</td></tr><tr><td>Tygon 6/4 Materiał rurki do łączenia wszystkich części Średnica zewnętrzna: 6 mm Średnica wewnętrzna: 4 mm Wa ll grubość: 1 mm</td><td>Instrumenty biomedyczne (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut E</td><td>Reichert-Jung-ultramikrotom</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Univentor Scavenger</td><td>Instrumenty biomedyczne (Univentor)</td><td>8338001</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas (8 cm, proste)</td><td>FST</td><td>Numer katalogowy 15009-08</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Niniejsze badanie łączy transdukcję in utero z transmisyjną mikroskopią elektronową (TEM) mającą na celu precyzyjną analizę morfometryczną parametrów ultrastrukturalnych w jednoznacznie zidentyfikowanych strukturach topograficznych, na które wpływa białko będące przedmiotem zainteresowania, które jest wprowadzane do organizmu poprzez transfer wirusa. To połączone podejście pozwala na płynne przejście od identyfikacji makrostrukturalnej do ultrastrukturalnej poprzez śledzenie map nawigacji topograficznej w atlasie tkanek. Mikroskopia elektronowa o wysokiej rozdzielczości tkanki transdukowanej w macicy ujawnia delikatną ultrastrukturę neuropilu i jego parametry plastyczności, takie jak przekroje poprzeczne obszarów bouton synaptycznych, liczba pęcherzyków synaptycznych i mitochondriów w profilu bouton, długość kontaktów synaptycznych, obszary aksonów o przekroju poprzecznym, grubość osłonek mielinowych, liczba blaszek mielinowych i obszary przekroju poprzecznego profili mitochondriów. Analiza tych parametrów ujawnia istotne informacje na temat zmian plastyczności ultrastrukturalnej w obszarach układu nerwowego, na które wpływa transfer wirusa konstruktu genetycznego. Ta połączona metoda może być nie tylko wykorzystana do badania bezpośredniego wpływu genetycznie modyfikowanych biomolekuł i/lub leków na plastyczność neuronów, ale także otwiera możliwość badania ratowania plastyczności neuronów in utero (np. w kontekście chorób neurodegeneracyjnych).

W celu zapewnienia niezawodnej i szybkiej anestezji myszy rozważono liczne parametry bezpieczeństwa, a zoptymalizowana przestrzeń robocza jednostki anestezjologicznej okazała się odpowiednia (Rysunek 1A). Jednostka ta jest zaprojektowana do kontrolowania mieszaniny ciekłego izofluranu i powietrza otoczenia z precyzją wymaganą do pomyślnego przeprowadzenia zabiegów chirurgicznych u małych zwierząt, takich jak myszy i szczury. Powietrze i izofl...

Połączenie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i transdukcji in utero jest potężnym podejściem do badania zmian morfologicznych w ultrastrukturze układu nerwowego podczas rozwoju. Ta połączona metoda pozwala na dogłębny wgląd w zmiany w szczegółach strukturalnych leżących u podstaw neuroplastyczności w odniesieniu do ich reprezentacji topograficznej.

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Nasze połączone podejście pomaga odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób zmieniają się parametry neuroplastyczności ultrastrukturalnej po wczesnych interwencjach rozwojowych w rodzącym się układzie nerwowym w macicy. Główną zaletą naszej metody jest pozyskiwanie wysokiej rozdzielczości obrazów makro-mezo-mikro- i nanostruktur w predefiniowanym układzie współrzędnych w obrębie atlasu tkankowego. Implikacją naszej metody jest jej translacyjny potencjał terapeutyczny w przypadku wrodzonych chorób neurodegeneracyjnych.Na przykład leczenie i ratowanie w stadiach embrionalnych przy użyciu tej techniki transdukcji in utero. Naszą metodę można zastosować do każdego innego modelu. Na przykład można zmienić gatunek myszy, a także obszar zainteresowania.Badacze próbujący naszej metody po raz pierwszy potrzebują gruntownego przeszkolenia chirurgicznego, a także wiedzy na temat przygotowania tkanki do obrazowania pod mikroskopem elektronowym. Zacznij od załadowania niestandardowej końcówki kapilarnej zawierającej cztery razy od 10 do 11 cząstek wirusa typu 1 związanego z adenowirusem dla pożądanego celu i oznaczonej barwnikiem Fast Green na probówkę aspiratora. Dodaj 15 mikrolitrów znakowanych cząstek wirusa związanego z adenowirusem do kapilary.Następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej embrionalnej myszy w ciąży w 14,5 dniu i zdezynfekuj skórę. Użyj zakrzywionych ząbkowanych kleszczyków tęczówki i prostych nożyczek z węglika wolframu, aby wykonać nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej. Używając prostej pęsety Dumont, aby chwycić ścianę otrzewnej, kontynuuj wzdłuż linea alba prostymi nożyczkami Vannas i umieść kawałek fenestrowanej folii parafinowej na otworze brzusznym i użyj urządzenia przypominającego łyżkę, aby odsłonić rogi macicy bez uszkadzania zarodków wewnątrz rogów.Po nałożeniu kilku kropli PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza na rogi macicy, sprawdź zarodki pod kątem uszkodzeń lub wad rozwojowych wewnątrz worka macicy. Ostrożnie obracać zarodki wewnątrz ich woreczków, aż do uzyskania pożądanej pozycji dla każdego wstrzyknięcia. Gdy zarodki są już na miejscu, wstrzyknij od jednego do dwóch mikrolitrów roztworu cząsteczek wirusa znakowanego Fast Green do każdego zarodka.Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków umieść rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej i dodaj kilka kropli PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza do jamy brzusznej. Następnie użyj szwów poliamidowych w rozmiarze 6-0, aby zamknąć ścianę otrzewnej i szwów poliamidowych w rozmiarze 3-0 oraz kleszczyków hemostatycznych Halsted's Mosquito, aby zamknąć skórę. Aby osadzić izolowane tkanki będące przedmiotem zainteresowania do fotografii telemakro, umieść próbkę tkanki w specjalnej ramce o powtarzalnym kącie przekroju i udokumentuj współrzędne.Napełnij ramkę 3% agarozą o temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż tkanka zostanie pokryta, i przykryj ramkę plastikową pokrywką, aż agaroza stwardnieje. Podczas gdy agaroza twardnieje, użyj urządzenia telegraficznego makro, aby zobrazować osadzoną tkankę i jej współrzędne w kadrze. Gdy agaroza zastygnie, przenieś tkankę osadzoną w agarozie do ramy z wycięciami odpowiadającymi współrzędnym pierwszej ramki.Użyj urządzenia z cienką i wibrującą żyletką, aby pociąć osadzoną tkankę na odcinki o odpowiedniej eksperymentalnej grubości. Następnie zobrazuj każdą sekcję tkanki w PBS i zbierz obrazy do folderu. Aby przygotować próbki tkanek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, umyj skrawki tkanek dwoma 30-minutowymi płukaniami w PBS, a następnie dwugodzinną inkubacją w 2% wodnym roztworze tetratlenku osmu w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji przemyć osmiczne sekcje jeszcze dwa razy w PBS przez 30 minut na pranie i odwodnić skrawki w sekwencyjnych 10-15-minutowych zanurzeniach w etanolu, jak wskazano. Po zanurzeniu w 70% etanolu umieść każdą próbkę w czarnym naczyniu na matowym czarnym tle i zobrazuj próbki w 70% etanolu pod światłem LED RGB przyłożonym do próbek z lewej i prawej strony pod kątem 45 stopni. Utwórz atlas obrazów przekrojów ze współrzędnymi, zbierając obrazy próbek w serii w folderze.Próbki należy poddać dwóm 30-minutowym inkubacjom ze 100% etanolem, a następnie dwóm 30-minutowym inkubacjom ze 100% tlenkiem propylenu, obie w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji próbek należy wymieszać świeżo przygotowaną żywicę z tlenkiem propylenu w proporcjach jeden do jednego i jeden do dwóch i dodać 3% akcelerator do obu roztworów. Po drugiej inkubacji tlenku propylenu przenieść próbki do roztworu pożywki z tlenkiem propylenu zawierającym jedną do dwóch żywic przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przeprowadzić dwugodzinną inkubację w roztworze pożywki z tlenkiem propylenu w temperaturze pokojowej jeden do jednego.Pod koniec drugiej inkubacji przenieś tkanki do płaskich szalek polipropylenowych i utwardź osadzone tkanki świeżą żywicą zawierającą 3% akcelerator przez 12 do 24 godzin w temperaturze od 65 do 85 stopni Celsjusza. Następnie schłodzić tkankę do temperatury pokojowej i usunąć próbki zatopione w żywicy z naczyń polipropylenowych. Aby zmapować obszar zainteresowania, należy wybrać obraz zawierający obszar zainteresowania z wcześniej przygotowanego atlasu obrazów.Naszkicuj granice obszaru zainteresowania na przekrojonym obrazie, optycznie nałóż te obramowania na osadzoną próbkę pod mikroskopem i użyj jednocalowej igły o rozmiarze 26, aby zarysować te granice obszarów na próbce żywicy. Następnie podgrzej próbki do 95 stopni Celsjusza, aby zmiękczyć żywicę. Następnie wyjmij ciepłe próbki żywicy z piekarnika i użyj żyletki, aby wyciąć interesujące obszary.Przyklej próbki do prętów mocujących ze szkła akrylowego o odpowiednim kalibrze i przytnij zamontowane próbki do pół- i ultracienkiego cięcia. Użyj ultramikrotomu, aby uzyskać półcienkie odcinki 0,7 mikrometra i ultracienkie 70 nanometrów, zbierając półcienkie sekcje na szklanych nośnikach, a ultracienkie sekcje na siatkach niklowych. Zabarwić półcienkie skrawki 1% błękitem toluidynowym w PBS przez cztery minuty, a następnie kilkakrotnie przepłukać w wodzie dejonizowanej, a następnie zbadać skrawki za pomocą mikroskopii świetlnej.Ultracienkie przekroje można następnie bezpośrednio ocenić za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy napięciu 180 kilowoltów bez dalszych modyfikacji. Po przecięciu, wycinki tkanki są obrazowane za pomocą tele-makrofotografii, jak właśnie pokazano. Po osmikacji i zanurzeniu w etanolu, skrawki są ponownie obrazowane za pomocą tele-makrografii światła interferencyjnego, odsłaniając specyficznie kolorowy wzór dla każdej powierzchni tkanki.Po dodatkowym odwodnieniu i zatopieniu w żywicy, obszary zainteresowania są wybierane i dalej przetwarzane do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W hipokampie i móżdżku synapsy z włókien omszałych wykazują unikalne cechy ultrastrukturalne w porównaniu z innymi synapsami, w tym dużymi butonami presynaptycznymi. W swoich profilach przekrojowych bulony zawierają ogromną liczbę pęcherzyków i mitochondriów, a bardzo często otaczają kilka kolców dendrytycznych.W rdzeniu kręgowym funiculus grzbietowy zawiera wiele włókien aksonalnych, które są mielinizowane przez oligodendroglia. Na odcinkach poprzecznych funiculus grzbietowy można znaleźć między oboma tylnymi rogami rdzenia kręgowego. Na obrazach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej aksony mielinowe o przekroju poprzecznym wydają się okrągłe, a osłonki mielinowe otaczające aksony są zorganizowane w blaszki.Przygotowane obrazy parametrów ultrastrukturalnych z atlasu i mikrograficznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej są pomocne nie tylko w porównaniu neuroplastyczności morfologicznej różnych odcinków w różnych warunkach leczenia, ale także w porównaniach parametrów w obrębie tego samego obszaru. Pamiętaj, aby dokładnie zaplanować i przygotować się przed rozpoczęciem transdukcji in utero, a także mieć pewność, że masz zapas materiałów i narzędzi w przypadku powikłań. Zgodnie z naszą metodą można dodać inne techniki, takie jak znakowanie immunozłotem przed mikroskopią elektronową w celu ultrastrukturalnego śledzenia zdefiniowanej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania.Zaczynając od holistycznego spojrzenia na cały organizm i zbliżając się do topografii molekularnej, jesteśmy w stanie badać i manipulować związkiem między funkcją tkanki a morfologią. Tetratlenek osmu jest niebezpieczny. Pamiętaj, aby zawsze pracować pod maską i nosić okulary ochronne i rękawice podczas pracy z tym odczynnikiem.

assessment-ultrastructural-neuroplasticity-parameters-after-utero

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Źródło: Lutz, D., et al. Ocena parametrów neuroplastyczności ultrastrukturalnej po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje transdukcję wirusa poprzez wstrzyknięcie do macicy w zarodkach myszy. Ciężarna mysz jest przygotowywana do operacji, a następnie wykonuje się nacięcie w linii środkowej w celu odsłonięcia rogów macicy. Mieszanina wirusa zawierającego pożądany gen i barwnika śledzącego jest wstrzykiwana do zarodków w...

Transdukcja wirusa w macicy u myszy

Źródło: Lutz, D., et.al.  Ocena parametrów neuroplastyczności ultrastrukturalnej po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2019). Ten film demonstruje przygotowanie i analizę za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wycinka mózgu szczeniaka myszy. Protokół rozpoczyna się od tkanki utrwalonej tetratlenkiem osmu w żywicy, a następnie precyzyjnego przycinania w celu wyizolowania obszaru zainteresowania i ultramikrotomii w celu...

Analiza ultrastrukturalna wycinka mózgu myszy z wykorzystaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Wyzwanie dla młodych neuronów w nowych regionach mózgu może ujawnić ważne informacje na temat tego, jak środowisko kształtuje los i dojrzewanie neuronów. Protokół ten opisuje procedurę zbierania prekursorów interneuronów z określonych regionów mózgu i przeszczepiania ich homotopowo lub heterotopowo do mózgu młodych po urodzeniu.

Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Poznaj metodę oceny ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego. Technika ta pozwala uzyskać obrazy wysokiej rozdzielczości makro-, mezo-, mikro- i nanostruktur w predefiniowanym układzie współrzędnych.

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów