Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

Nasze połączone podejście pomaga odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób zmieniają się parametry neuroplastyczności ultrastrukturalnej po wczesnych interwencjach rozwojowych w rodzącym się układzie nerwowym w macicy. Główną zaletą naszej metody jest pozyskiwanie wysokiej rozdzielczości obrazów makro-mezo-mikro- i nanostruktur w predefiniowanym układzie współrzędnych w obrębie atlasu tkankowego. Implikacją naszej metody jest jej translacyjny potencjał terapeutyczny w przypadku wrodzonych chorób neurodegeneracyjnych.

Na przykład leczenie i ratowanie w stadiach embrionalnych przy użyciu tej techniki transdukcji in utero. Naszą metodę można zastosować do każdego innego modelu. Na przykład można zmienić gatunek myszy, a także obszar zainteresowania.

Badacze próbujący naszej metody po raz pierwszy potrzebują gruntownego przeszkolenia chirurgicznego, a także wiedzy na temat przygotowania tkanki do obrazowania pod mikroskopem elektronowym. Zacznij od załadowania niestandardowej końcówki kapilarnej zawierającej cztery razy od 10 do 11 cząstek wirusa typu 1 związanego z adenowirusem dla pożądanego celu i oznaczonej barwnikiem Fast Green na probówkę aspiratora. Dodaj 15 mikrolitrów znakowanych cząstek wirusa związanego z adenowirusem do kapilary.

Następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej embrionalnej myszy w ciąży w 14,5 dniu i zdezynfekuj skórę. Użyj zakrzywionych ząbkowanych kleszczyków tęczówki i prostych nożyczek z węglika wolframu, aby wykonać nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej. Używając prostej pęsety Dumont, aby chwycić ścianę otrzewnej, kontynuuj wzdłuż linea alba prostymi nożyczkami Vannas i umieść kawałek fenestrowanej folii parafinowej na otworze brzusznym i użyj urządzenia przypominającego łyżkę, aby odsłonić rogi macicy bez uszkadzania zarodków wewnątrz rogów.

Po nałożeniu kilku kropli PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza na rogi macicy, sprawdź zarodki pod kątem uszkodzeń lub wad rozwojowych wewnątrz worka macicy. Ostrożnie obracać zarodki wewnątrz ich woreczków, aż do uzyskania pożądanej pozycji dla każdego wstrzyknięcia. Gdy zarodki są już na miejscu, wstrzyknij od jednego do dwóch mikrolitrów roztworu cząsteczek wirusa znakowanego Fast Green do każdego zarodka.

Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków umieść rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej i dodaj kilka kropli PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza do jamy brzusznej. Następnie użyj szwów poliamidowych w rozmiarze 6-0, aby zamknąć ścianę otrzewnej i szwów poliamidowych w rozmiarze 3-0 oraz kleszczyków hemostatycznych Halsted's Mosquito, aby zamknąć skórę. Aby osadzić izolowane tkanki będące przedmiotem zainteresowania do fotografii telemakro, umieść próbkę tkanki w specjalnej ramce o powtarzalnym kącie przekroju i udokumentuj współrzędne.

Napełnij ramkę 3% agarozą o temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż tkanka zostanie pokryta, i przykryj ramkę plastikową pokrywką, aż agaroza stwardnieje. Podczas gdy agaroza twardnieje, użyj urządzenia telegraficznego makro, aby zobrazować osadzoną tkankę i jej współrzędne w kadrze. Gdy agaroza zastygnie, przenieś tkankę osadzoną w agarozie do ramy z wycięciami odpowiadającymi współrzędnym pierwszej ramki.

Użyj urządzenia z cienką i wibrującą żyletką, aby pociąć osadzoną tkankę na odcinki o odpowiedniej eksperymentalnej grubości. Następnie zobrazuj każdą sekcję tkanki w PBS i zbierz obrazy do folderu. Aby przygotować próbki tkanek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, umyj skrawki tkanek dwoma 30-minutowymi płukaniami w PBS, a następnie dwugodzinną inkubacją w 2% wodnym roztworze tetratlenku osmu w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji przemyć osmiczne sekcje jeszcze dwa razy w PBS przez 30 minut na pranie i odwodnić skrawki w sekwencyjnych 10-15-minutowych zanurzeniach w etanolu, jak wskazano. Po zanurzeniu w 70% etanolu umieść każdą próbkę w czarnym naczyniu na matowym czarnym tle i zobrazuj próbki w 70% etanolu pod światłem LED RGB przyłożonym do próbek z lewej i prawej strony pod kątem 45 stopni. Utwórz atlas obrazów przekrojów ze współrzędnymi, zbierając obrazy próbek w serii w folderze.

Próbki należy poddać dwóm 30-minutowym inkubacjom ze 100% etanolem, a następnie dwóm 30-minutowym inkubacjom ze 100% tlenkiem propylenu, obie w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji próbek należy wymieszać świeżo przygotowaną żywicę z tlenkiem propylenu w proporcjach jeden do jednego i jeden do dwóch i dodać 3% akcelerator do obu roztworów. Po drugiej inkubacji tlenku propylenu przenieść próbki do roztworu pożywki z tlenkiem propylenu zawierającym jedną do dwóch żywic przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przeprowadzić dwugodzinną inkubację w roztworze pożywki z tlenkiem propylenu w temperaturze pokojowej jeden do jednego.

Pod koniec drugiej inkubacji przenieś tkanki do płaskich szalek polipropylenowych i utwardź osadzone tkanki świeżą żywicą zawierającą 3% akcelerator przez 12 do 24 godzin w temperaturze od 65 do 85 stopni Celsjusza. Następnie schłodzić tkankę do temperatury pokojowej i usunąć próbki zatopione w żywicy z naczyń polipropylenowych. Aby zmapować obszar zainteresowania, należy wybrać obraz zawierający obszar zainteresowania z wcześniej przygotowanego atlasu obrazów.

Naszkicuj granice obszaru zainteresowania na przekrojonym obrazie, optycznie nałóż te obramowania na osadzoną próbkę pod mikroskopem i użyj jednocalowej igły o rozmiarze 26, aby zarysować te granice obszarów na próbce żywicy. Następnie podgrzej próbki do 95 stopni Celsjusza, aby zmiękczyć żywicę. Następnie wyjmij ciepłe próbki żywicy z piekarnika i użyj żyletki, aby wyciąć interesujące obszary.

Przyklej próbki do prętów mocujących ze szkła akrylowego o odpowiednim kalibrze i przytnij zamontowane próbki do pół- i ultracienkiego cięcia. Użyj ultramikrotomu, aby uzyskać półcienkie odcinki 0,7 mikrometra i ultracienkie 70 nanometrów, zbierając półcienkie sekcje na szklanych nośnikach, a ultracienkie sekcje na siatkach niklowych. Zabarwić półcienkie skrawki 1% błękitem toluidynowym w PBS przez cztery minuty, a następnie kilkakrotnie przepłukać w wodzie dejonizowanej, a następnie zbadać skrawki za pomocą mikroskopii świetlnej.

Ultracienkie przekroje można następnie bezpośrednio ocenić za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy napięciu 180 kilowoltów bez dalszych modyfikacji. Po przecięciu, wycinki tkanki są obrazowane za pomocą tele-makrofotografii, jak właśnie pokazano. Po osmikacji i zanurzeniu w etanolu, skrawki są ponownie obrazowane za pomocą tele-makrografii światła interferencyjnego, odsłaniając specyficznie kolorowy wzór dla każdej powierzchni tkanki.

Po dodatkowym odwodnieniu i zatopieniu w żywicy, obszary zainteresowania są wybierane i dalej przetwarzane do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W hipokampie i móżdżku synapsy z włókien omszałych wykazują unikalne cechy ultrastrukturalne w porównaniu z innymi synapsami, w tym dużymi butonami presynaptycznymi. W swoich profilach przekrojowych bulony zawierają ogromną liczbę pęcherzyków i mitochondriów, a bardzo często otaczają kilka kolców dendrytycznych.

W rdzeniu kręgowym funiculus grzbietowy zawiera wiele włókien aksonalnych, które są mielinizowane przez oligodendroglia. Na odcinkach poprzecznych funiculus grzbietowy można znaleźć między oboma tylnymi rogami rdzenia kręgowego. Na obrazach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej aksony mielinowe o przekroju poprzecznym wydają się okrągłe, a osłonki mielinowe otaczające aksony są zorganizowane w blaszki.

Przygotowane obrazy parametrów ultrastrukturalnych z atlasu i mikrograficznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej są pomocne nie tylko w porównaniu neuroplastyczności morfologicznej różnych odcinków w różnych warunkach leczenia, ale także w porównaniach parametrów w obrębie tego samego obszaru. Pamiętaj, aby dokładnie zaplanować i przygotować się przed rozpoczęciem transdukcji in utero, a także mieć pewność, że masz zapas materiałów i narzędzi w przypadku powikłań. Zgodnie z naszą metodą można dodać inne techniki, takie jak znakowanie immunozłotem przed mikroskopią elektronową w celu ultrastrukturalnego śledzenia zdefiniowanej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania.

Zaczynając od holistycznego spojrzenia na cały organizm i zbliżając się do topografii molekularnej, jesteśmy w stanie badać i manipulować związkiem między funkcją tkanki a morfologią. Tetratlenek osmu jest niebezpieczny. Pamiętaj, aby zawsze pracować pod maską i nosić okulary ochronne i rękawice podczas pracy z tym odczynnikiem.