Name: Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i klirens bakteryjny u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metody analizy fagocytozy makrofagów pęcherzykowych i klirensu bakteryjnego u myszy. Techniki in vitro i in vivo pozwalają badać odpowiedź immunologiczną na zakażenia płuc Pseudomonas aeruginosa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez R01HL116826 grantowe dla X. Zhao.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Szkoły Medycznej Wschodniej Wirginii.
1. Koraliki fluorescencyjne Fagocytoza
<ol>
	<li>Eutanazja myszy (C57BL/6J, 6 tygodni, samica) przez uduszenie CO2 zgodnie z protokołami IACUC dotyczącymi etycznej eutanazji zwierząt.</li>
	<li>Połóż mysz brzuchem do góry na desce sekcyjnej pokrytej ręcznikami papierowymi. Przygwoźdź jego łapy do dołu z rozłożonymi kończynami i zaczep sznurek pod przednimi zębami, aby odciągnąć głowę do tyłu, tak aby tchawica była ustawiona prosto i poziomo.</li>
	<li>Zwilż gardło, klatkę piersiową i brzuch myszy 70% etanolem, aby zdezynfekować i zapobiec przywieraniu futra do narzędzi.</li>
	<li>Za pomocą zwykłych kleszczy podciągnij skórę na linii środkowej ciała i przetnij nożyczkami chirurgicznymi w górę linii środkowej do górnej części gardła.</li>
	<li>Używając końca standardowych nożyczek chirurgicznych, ostrożnie odsuń mięśnie i tkanki łączne na gardle i użyj nożyczek sprężynowych (mikronożyczek), aby odsłonić tchawicę.</li>
	<li>Chwytając pierścień chrząstki kleszczami, ostrożnie wykonaj małe nacięcie (~1,5 mm) za pomocą mikronożyczek na powierzchni komory tchawicy i włóż kaniulę 18 G do tchawicy.</li>
	<li>Delikatnie przepłukać 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), po 1 ml na raz. Za każdym razem delikatnie pobieraj płyn do strzykawki i wlej go z powrotem do płuc, 3 razy z rzędu. Po pobraniu BALF należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić eutanazję. Przenieś pobrany PBS (~2,8 ml), który jest płynem z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), do probówki, odwiruj przy 1,000 x g przez 10 minut i zbierz osad. Dodać 1 ml świeżego PBS do probówki i odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut, aby umyć zanieczyszczenia i zebrać granulowane makrofagi pęcherzykowe.</li>
	<li>Zawiesić osad w 2 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 10% nieinaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i posaź pierwotne makrofagi pęcherzykowe w tym samym podłożu przez 2 dni na naczyniu ze szklanym dnem w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze.</li>
	<li>Odessać starą pożywkę, przemyć ją 1 ml PBS i dodać 2 ml świeżej pożywki. Dodać kulki FITC (karboksylowane kulki lateksowe o średnicy 2 μm, 50 kulek/komórkę) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze.</li>
	<li>Dokładnie umyj PBS (1 ml na raz, w sumie pięć prań), aby usunąć kulki zewnątrzkomórkowe. Zobrazuj losowo 100 komórek i policz komórki za pomocą kulek wewnątrzkomórkowych (488 nm). 
	UWAGA: Indeksy fagocytarne to liczba połkniętych kulek podzielona przez całkowitą liczbę makrofagów; Procent komórek fagocytarnych to liczba makrofagów, które połykają co najmniej jeden koralik podzielona przez całkowitą liczbę makrofagów16.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, po 1 godzinnej inkubacji z kulkami, umyj komórki 3 ml PBS i przetwórz je do cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia fagocytozy. Podobnie, przetwarzaj AM bez kulek jako niebarwione komórki lub komórki kontrolne. Oblicz procentową dodatniość i średnią intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej, wybierając te opcje w oprogramowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Fagocytoza zależna od FcγR i CR
<ol>
	<li>W celu opsonizacji inkubować 2 x 108 czerwonych krwinek owczych (SRBC) z 50 μL króliczego anty-SRBC-IgM lub 50 μL króliczego anty-SRBC-IgG przez 30 minut w temperaturze pokojowej11.</li>
	<li>Inkubować opsonizowane IgM-opsonizowane SRBC z 50 μl ludzkiej surowicy z niedoborem C5 (C5D) przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu utrwalenia fragmentów dopełniacza C3b i C3bi na SRBC pokrytych IgM.</li>
	<li>Wysiewaj mysie komórki makrofagów myszy (komórki MH-S) (10 000 komórek / dołek) na 96-dołkowej płytce i inkubuj przez noc, aby uzyskać ~ 70% konfluencji. Dodać 100 μl 1 x 10 opsonizowanych SRBC 7/ml do każdego dołka komórek MH-S i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Bardzo szybko (~1 min) przemyć niezwiązane SRBC 100 μl buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK).</li>
	<li>Zjonizować komórki 0,1% SDS i dodać 50 μl 2,7-diaminofluorenu (DAF) zawierającego 3% nadtlenku wodoru i 6 M mocznika. Zmierzyć absorbancję formacji błękitu fluorenowego katalizowanego hemoglobiną przy długości fali 620 nm.</li>
	<li>Określić liczbę SRBC, stosując krzywą wzorcową przy wartościach absorbancji 620 nm ze znaną liczbą SRBC. Podobnie, przetwarzaj komórki MH-S inkubowane z nieopsonizowanymi SRBC w celu wykorzystania jako kontroli negatywnej.</li>
</ol>
3. Fagocytoza zależna od PRR
<ol>
	<li>Wykonaj kroki 1.1-1.9, aby wyizolować i wyhodować pierwotne makrofagi pęcherzykowe myszy.</li>
	<li>Po 2 dniach usuń pożywkę, umyj komórki 1 ml PBS i dodaj 500 μl świeżej pożywki zawierającej biocząstki zymozanu A sprzężone z Alexa Fluor-488 (100 cząstek/naczynie).</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zatrzymać fagocytozę, dodając 500 μl lodowatego PBS.</li>
	<li>Dokładnie umyj komórki PBS (1 ml na raz, w sumie pięć płukań). Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dokładnie umyj komórki PBS (1 ml na raz, w sumie pięć płukań) i trzymaj komórki w 500 μl PBS.</li>
	<li>Zobrazuj komórki w kontraście interferencyjnym różnicowym i kanale fluorescencyjnym przy 488 nm. Policz AM zawierające biocząstki zymozanu-A i określ procent fagocytozy.</li>
</ol>
4. Fagocytoza in vivo przez makrofagi pęcherzykowe
UWAGA: Zaszczepij P. aeruginosa GFP na płytce z pożywką i inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez noc. Następnego dnia zaszczepij pojedynczą kolonię do 2 ml bulionu odżywczego i hoduj bakterie w temperaturze 37°C przez noc.
<ol>
	<li>Następnego dnia znieczulij myszy dootrzewnowym podawaniem 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Połóż mysz na płaskiej desce z gumką recepturką w poprzek górnych siekaczy i umieść ją w pozycji półleżącej (45°) z powierzchnią brzuszną i mównicą skierowaną do góry. Za pomocą zakrzywionych kleszczy częściowo schuj język. Za pomocą mikroopryskiwacza podać dotchawiczo 50 μL (5 x 106 jednostek tworzących kolonie [CFU])17 P. aeruginosa GFP do płuc znieczulonych myszy.</li>
	<li>Po 1 godzinie od infekcji wykonaj kroki 1.1-1.7.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w PBS i poddać je cytowirówce (1000 x g, 1 min w temperaturze pokojowej) na szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Różnicowo wybarwić szkiełka cytospinowe pod kątem makrofagów pęcherzykowych, neutrofili i limfocytów, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Losowo wybierz 100 AM, policz AM zawierające bakterie wewnątrzkomórkowe i określ procent fagocytozy.</li>
</ol>
5. Usuwanie bakterii in vivo za pomocą P. aeruginosa
<ol>
	<li>Zaszczepić P. aeruginosa na płytce agarowej do izolacji P. aeruginosa i inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez noc. Zaszczep pojedynczą kolonię do 2 ml bulionu lizogenicznego (LB) i hoduj bakterie w temperaturze 37°C przez noc. Oblicz jtk, używając następującego wzoru. 
	 
	CFU/ml = (liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia)/objętość płytki hodowlanej. 
	 
	Rozcieńczyć kulturę PBS, aby uzyskać pożądany CFU/ml.</li>
	<li>W badaniu 1 wstrzyknąć dotchawiczo subletalną dawkę ~ 2,5 x 105 CFU / ml P. aeruginosa znieczulonym myszom typu dzikiego (WT) i TRIM72KO, jak podano w kroku 4.2. Mierz masę ciała codziennie przez 6 dni.</li>
	<li>W badaniu 2 należy wstrzyknąć drugą dawkę P. aeruginosa (5 x 105 CFU/ml) myszom, które przeżyły w badaniu 1 i mierzyć masę ciała przez 4 dni.</li>
	<li>W badaniu 3, przy użyciu innego zestawu myszy, wstrzyknij myszom WT i TRIM72KO śmiertelną dawkę (3 x 107 CFU/mL) P. aeruginosa i zarejestruj śmiertelność w ciągu 2 dni od wstrzyknięcia. Zwierzęta wykazujące oznaki silnego stresu, takie jak znaczna utrata masy ciała, zgarbione plecy, anoreksja lub duszność, zostaną ocenione przez lekarzy weterynarii. Zwierzęta, które nie nadają się do leczenia, będą natychmiast uśmiercane.</li>
	<li>W chwili śmierci lub po eutanazji w 2. dniu po wstrzyknięciu należy pobrać całą tkankę płucną w celu ilościowego określenia obciążenia bakteryjnego płuc w szczytowym momencie zakażenia.</li>
	<li>Aby zbadać obciążenie bakteryjne płuc, dodaj 200 μl soli fizjologicznej do tkanek płucnych i homogenizuj je, używając wcześniej przetestowanego ustawienia na elektronicznym homogenizatorze, który całkowicie rozbija tkankę płucną bez rozbijania bakterii. Dostosować całkowitą objętość homogenatu płucnego do 1 ml i umieścić 100 μl lizatu płucnego na płytkach agarowych do izolacji Pseudomonas w 10-krotnych rozcieńczeniach seryjnych.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny i policzyć kolonie bakteryjne w celu oznaczenia jtk na całe płuco.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Użyj testu t-Studenta, aby określić istotność statystyczną różnicy między dwiema grupami. Rozważmy różnicę statystycznie istotną, gdy p < 0,05. Wszystkie dane są przedstawione jako średnie ± błędu standardowego średniej (SEM).</li>
</ol>

<ol><li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+plasticity+in+a+tissue-specific+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li>
<li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li>
<li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia%3A+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li>
<li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li>
<li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li>
<li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li>
<li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li>
<li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc%CE%B3+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).</li>
<li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li>
<li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li>
<li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li>
<li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pełniąc funkcję wymiany gazowej, płuca nieustannie konfrontują się z obcymi cząstkami, patogenami i alergenami. AM stanowią pierwszą linię obrony ze względu na swoją główną funkcję, a mianowicie fagocytozę. AM koordynują również z innymi komórkami odpornościowymi w niszczeniu patogenów i ustępowaniu stanu zapalnego. Tutaj opisaliśmy metody specyficznej oceny fagocytozy przez AM wyizolowane z płuca myszy. Protokół przedstawiony w tym manuskrypcie wyjaśnia szczegółowe badanie fagocytozy zarówno in vivo, jak i in vitro, któ...

AMs są głównymi fagocytami rezydującymi w pęcherzykach płucnych w stanie spoczynku i jednym z głównych czynników wpływających na wrodzoną odpowiedź immunologiczną poprzez rozpoznawanie i internalizację wdychanych patogenów i obcych cząstek1,2. Doniesiono, że AM są niezbędne do szybkiego usuwania wielu patogenów płucnych, takich jak P. aeruginosa i Klebsiella pneumonia3,4, więc niedobór fagocytozy AM często powoduje infekcje dróg oddechowych, takie jak ostre zapalenie płuc, które powodują wyższą śmiertelność i zachorowalność.
AMs również inicjują wrodzone reakcje zapalne w płucach, wytwarzając cytokiny i chemokiny, takie jak TNF-α i IL-1β, które komunikują się z innymi komórkami środowiska pęcherzykowego w celu produkcji chemokin i rekrutacji zapalnych neutrofili, monocytów i adaptacyjnych komórek odpornościowych w płucach5. Na przykład IL-1β wytwarzana przez AMs pomaga w uwalnianiu chemokiny neutrofilowej CXCL8 z komórek nabłonkowych6. Co więcej, AM przyczyniają się do fagocytozy apoptotycznych leukocytów wielojądrzastych (PMN), których niepowodzenie prowadzi do trwałego wycieku enzymów wewnątrzkomórkowych z PMN do otaczającej tkanki, co skutkuje uszkodzeniem tkanek i przedłużonym stanem zapalnym7,8,9.
Fagocytoza przez AMs jest pośredniczona przez bezpośrednie rozpoznawanie wzorców molekularnych związanych z patogenami na powierzchni patogenu przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR) AMs lub przez wiązanie opsonizowanych patogenów z receptorami efektorów immunologicznych klasy AMs<sup="xref">10. W tym ostatnim przypadku AM mogą rozpoznawać cele opsonizowane immunoglobuliną (IgG) przez ich receptory Fcγ (FcγR) lub patogeny pokryte fragmentami dopełniacza, C3b i C3bi, poprzez ich receptory dopełniacza (CR)11. Wśród receptorów dopełniacza CR nadrodziny immunoglobulin (CRIg) ulega selektywnej ekspresji w makrofagach tkankowych12, a niedawne odkrycie podkreśliło rolę CRIg w fagocytozie AM w kontekście zapalenia płuc P. aeruginosa13.
Wiele oryginalnych badań wykorzystuje metody do oceny fagocytozy makrofagów w celu opisania molekularnych mechanizmów funkcji makrofagów14,15. Jednak metody takie jak fagocytoza in vivo wymagają precyzyjnego określenia ilościowego fagocytozy. W tym miejscu podsumowujemy szczegółową metodologię fagocytozy zarówno in vitro, jak i in vivo, stosując odpowiednio kulki szklane izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i białko zielonej fluorescencji (GFP) P. aeruginosa. Ponadto wyjaśniamy metodę różnicowania fagocytozy za pośrednictwem PRR, CR i FcγR. Na koniec przedstawiamy metodę charakteryzowania klirensu bakteryjnego u myszy w odniesieniu do zapalenia płuc wywołanego przez P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Igła 18-G</td><td>Nipro Medyczna&nbsp;</td><td>CI + 1832-2C</td><td>Biologia molekularna klasy</td></tr><tr><td>2,7-diaminofluoren (DAF)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D17106</td><td>Biologia molekularna klasy</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>18C27B</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy klasy ACK</td> do biologii komórki <td>Life Technologies</td><td>A10492</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 Biocząstka Zymosan-A</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z23373</td><td>Biologia molekularna klasy</td></tr><tr><td>C5 niedobór surowicy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1163</td><td>Odczynnik biochemiczny</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Labnet International</td><td>C0160-R</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytotrifuge</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A78300101 wydanie 11</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Klasa biologii komórki</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Klasa biologii komórki</td></tr><tr><td>Przepływ Cytometr</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo Software</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>0508-SS/45-PS-1</td><td>Nadaje się do laboratoryjnej sekcji zwierząt</td></tr><tr><td>FITC-karboksylowane kulki lateksowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4530</td><td>Klasa biologii komórki</td></tr><tr><td>GFP-P. aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>101045GFP</td><td>Nadaje się do dla&nbsp; testy infekcji komórkowych</td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka wysokociśnieniowa</td> klasy biologii komórki <td>Penn-Century</td><td>FMJ-250</td><td>Nadaje się do użytku laboratoryjnego</td></tr><tr><td>dla zwierząt Homogenizator</td><td>Omni International</td><td>TH-01</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td> Mikroskop <td></td></tr><tr><td>odwróconej fluorescencji</td> klasy analitycznej <td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina Chlorowodorek</td><td>Hospira</td><td>CA-2904</td><td></td></tr><tr><td>Barwienia Shandon Kwik-Diff</td> klasy farmaceutycznej <td>Thermofisher Scientific</td><td>9990700</td><td>Klasa biologii komórki</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td>Biologia molekularna klasa</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427</td> Mikroopryskiwacz <td>klasy biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Aerozol</td><td>Penn-Century</td><td>IA-1C</td><td>Nadaje się do użytku laboratoryjnego na zwierzętach</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Odczynnik klasy</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>Klasa Cell Biology</td></tr><tr><td>królik anty-SRBC-IgG&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Nadaje się do testów immunologicznych</td></tr><tr><td>królika anty-SRBC-IgM&nbsp;</td><td>Cedarline Laboratories</td><td>CL9000-M</td><td>Nadaje się do testów immunologicznych</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Miltex</td><td>5-2</td><td>Nadaje się do sekcji zwierząt laboratoryjnych</td></tr><tr><td>Laryngoskop dla małych zwierząt</td><td>Penn-Century</td><td>LS-2</td><td>Nadaje się do użytku laboratoryjnego</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Analityczne</td></tr><tr><td>nożyczki sprężynowe (Med)</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>15012-12</td><td>Nadaje się do laboratoryjnego rozbioru zwierząt</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe (małe)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Nadaje się do laboratoryjnego rozbioru</td></tr><tr><td>czerwonych krwinek owiec (SRBC)&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55876</td><td>Umyte, zakonserwowane SRBC</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Ksylazyna&nbsp;</td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-110-20</td><td>Klasa farmaceutyczna</td></tr></tbody></table>

fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i klirens bakteryjny u myszy

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Makrofagi pęcherzykowe (AM) strzegą przestrzeni pęcherzykowej płuca. Fagocytoza przez AM odgrywa kluczową rolę w obronie przed atakującymi patogenami, usuwaniu martwych komórek lub obcych cząstek oraz w rozwiązywaniu reakcji zapalnych i przebudowie tkanek, procesach, w których pośredniczą różne receptory powierzchniowe AM. W tym miejscu przedstawiamy metody analizy funkcji fagocytarnej AM przy użyciu testów in vitro i in vivo oraz strategii eksperymentalnych w celu różnicowania fagocytozy za pośrednictwem receptora rozpoznawania wzorców, receptora dopełniacza i receptora gamma Fc. Na koniec omawiamy metodę ustalania i charakteryzowania modelu zapalenia płuc P. aeruginosa u myszy w celu oceny klirensu bakteryjnego in vivo. Testy te reprezentują najczęstsze metody oceny funkcji AM i mogą być również wykorzystywane do badania funkcji makrofagów i klirensu bakteryjnego w innych narządach.

W pierwszej kolejności przeprowadziliśmy eksperyment w celu analizy fagocytozy przez pierwotne makrofagi pęcherzykowe (AMs) myszy. We wszystkich analizach porównywano AMs wyizolowane z myszy WT oraz TRIM72KO. Jak pokazano na Ryc. 1A, mikroskopia fluorescencyjna wykazała, że fagocytoza szklanych kuleczek FITC przez pierwotne AMs myszy zachodzi po 1 h inkubacji. Ryc. 1B przedstawia anali...

Tutaj przedstawiamy powszechne metody analizy funkcji fagocytarnej mysich makrofagów pęcherzykowych i klirensu bakteryjnego z płuc. Metody te badają fagocytozę in vitro kulek izotiocyjanianu fluoresceiny oraz fagocytozę in vivo białka zielonej fluorescencji Pseudomonas aeruginosa. Opisujemy również metodę usuwania P. aeruginosa u myszy.

Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i klirens bakteryjny u myszy

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Pseudomonas aeruginosa jest patogenem na poziomie BSL-2. Pamiętaj, aby przestrzegać wszystkich zasad bezpieczeństwa na poziomie BSL-2 podczas obchodzenia się z tym organizmem. Tutaj pokażemy pierwotną izolację komórek, fagocytozę in vitro i analizę szlaku fagocytarnego oraz fagocytozę in vivo i ocenę klirensu bakteryjnego u myszy.Pomyślny poród dotchawiczy wymaga praktyki. Upewnij się, że mikrorozpylacz jest prawidłowo załadowany, igła znajduje się między dwoma fałdami głosowymi, a prędkość tłoka jest odpowiednio kontrolowana. Zacznij od zabezpieczenia myszy w pozycji leżącej z kończynami rozłożonymi na desce preparacyjnej pokrytej ręcznikami papierowymi i zaczepieniu sznurka pod przednimi zębami, aby cofnąć głowę tak, aby tchawica była ustawiona prosto i poziomo.Zdezynfekuj mysz 70% etanolem i użyj zwykłych kleszczy, aby podciągnąć skórę w środkowej linii ciała. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć skórę od brzucha do górnej części gardła. Użyj końca standardowych nożyczek chirurgicznych, aby dokładnie wypreparować mięsień gardła i tkanki łączne.Otwórz ścianę brzucha poniżej klatki piersiowej. Przetnij przeponę i odetnij dolną część klatki piersiowej, aby częściowo odsłonić

alveolar-macrophage-phagocytosis-and-bacteria-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

Makrofagi odgrywają centralną rolę w homeostazie i patologii wielu tkanek. Przedstawiony tutaj protokół opisuje metody usuwania makrofagów in vivo, otrzymywania spolaryzowanych makrofagów z aspiratów szpiku kostnego oraz adoptywnego transferu makrofagów do myszy. Techniki te pozwalają na określenie roli, jaką spolaryzowane makrofagi odgrywają w zdrowiu i chorobie.

Wyczerpanie i rekonstytucja makrofagów u myszy

Źródło: Nagre, N. i inni. Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i usuwanie bakterii u myszy. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje ocenę fagocytozy pośredniczonej przez receptory komplementacyjne przy użyciu czerwonych krwinek owiec opsonowanych IgM i dopełniakiem, a następnie ich przyjmowania przez mysie makrofagi. Zakres fagocytozy mierzy się poprzez pomiar niebieskiego produktu chromogenicznego powstałego w wyniku katalyzowanej przez hemoglobinę utleniania diaminofluorenu.

Modelowanie fagocytozy podleganej komplementem za pomocą opsonizowanych czerwonych krwinek in vitro

Weźmy wyznawczą kulturę myszich makrofagów.Dobrze traktuj test buforem zawierającym Wnt5A, cząsteczkę sygnalizacyjną, a kontrolę tylko z buforem.Zainfekuj patogenem bakteryjnym i inkubuj.W komórkach testowych Wnt5A aktywuje kaskadę sygnalizacyjną, która wzmacnia reorganizację cytoszkieletu, zwiększając absorpcję bakterii do fagosomów, podczas gdy komórki kontrolne pozbawione tego sygnału internalizują mniej bakterii.Przemyj, aby usunąć bakterie nieinternalizowane, a następnie inkubuj w podłożu...

Zwiększanie usuwania bakterii w makrofagach mysich za pośrednictwem Wnt5A

Metoda oceny zdolności izolowanych makrofagów pęcherzykowych myszy do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Ta komunikacja opisuje metodologie izolacji i hodowli makrofagów pęcherzykowych od ludzi oraz modeli mysich do celów eksperymentalnych.

Izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych

Ten manuskrypt opisuje protokół określający, czy narażenie na ozon, podstawowe zanieczyszczenie powietrza, upośledza efferocytozę makrofagów pęcherzykowych in vivo. Protokół ten wykorzystuje powszechnie stosowane odczynniki i techniki i może być dostosowany do wielu modeli uszkodzenia płuc w celu określenia wpływu na efferocytozę makrofagów pęcherzykowych.

Ocena in vivo efferocytozy makrofagów pęcherzykowych po ekspozycji na ozon

Ten protokół opisuje izolację makrofagów śródmiąższowych płuc (IM) i ich adoptywny transfer po stymulacji pęcherzyków płucnych przez IL-33 w modelu mysim, co może ułatwić badanie in vivo idiopatycznego zwłóknienia płuc (IPF).

Adoptywny transfer makrofagów stymulowanych przez IL-33 do modeli mysich indukowanych bleomycyną w celu zbadania ich wpływu na idiopatyczne zwłóknienie płuc in vivo

Poznaj metody analizy fagocytozy makrofagów pęcherzykowych i klirensu bakteryjnego u myszy. Techniki in vitro i in vivo pozwalają badać odpowiedź immunologiczną na zakażenia płuc Pseudomonas aeruginosa.

Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i klirens bakteryjny u myszy

Przeglądaj więcej filmów