Name: Wpływ przeciwciała anty-c-fms na tworzenie i proliferację prekursora osteoklastów in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj metodę izolacji szpiku kostnego myszy i generowania osteoklastów in vitro z wykorzystaniem przeciwciała Anti-c-fms. Technika ta umożliwia badanie osteoklastogenezy i potencjalne zastosowania terapeutyczne w chorobach zapalnych kości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez grant JSPS KAKENHI od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (nr 16K11776 dla H. K., nr 17K17306 dla K. S., nr 16K20637 dla K. K., nr 16K20636 dla M. S., nr 18K09862 dla I. M.).

Wszystkie procedury i opieka nad zwierzętami były wykonywane zgodnie z zasadami i przepisami Uniwersytetu Tohoku.
1. Rozwarstwienie i postępowanie z kończynami tylnymi myszy
<ol>
	<li>Przed sekcją napełnij płytkę około 50 ml α-MEM w zależności od wielkości pojemnika i umieść go na lodzie. Będzie on służył jako pojemnik zbiorczy do czasu zakończenia sekcji wszystkich kości. Do tego i kolejnych eksperymentów należy użyć α-MEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 j.m./ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Poddać eutanazji mysz C57Bl/6J przez wdychanie przedawkowania 5% izofluranu.</li>
	<li>Zamocuj mysz w pozycji leżącej na plecach za pomocą kołków przebitych przez dłonie i stopy i dokładnie spryskaj 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie skóry za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych i pęsety na poziomie biodra i rozciągnij je w dół do stóp, odsłaniając mięśnie.</li>
	<li>Przetnij ścięgno przyczepiające mięsień czworogłowy uda i ścięgno przyczepiające mięsień ścięgna podkolanowego do kości. Oderwij mięśnie odsłaniające zarówno stawy biodrowe, jak i kolanowe. Zlokalizowanie tych ścięgien ułatwi uwolnienie obu mięśni z przyczepów bez pozostawiania znaczników tkanek miękkich. Nie przecinaj kości.</li>
	<li>Umieść nożyczki między głową kości udowej a przestrzenią stawową i wtnij się w nią, uwalniając kość udową, ale pozostawiając nienaruszoną kość. Umożliwi to oderwanie kości bez ryzyka odsłonięcia szpiku kostnego.</li>
	<li>Podobnie odetnij mięśnie przyczepiające się do kości piszczelowej. Odetnij kość piszczelową od jej przyczepu w stawie skokowym, utrzymując kość w stanie nienaruszonym, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Zeskrob pozostałą tkankę miękką z kości udowej i piszczelowej za pomocą ostrzy nożyczek i kimwipe i umieść ją na talerzu z α-MEM umieszczonym na lodzie.</li>
</ol>
2. Izolacja szpiku kostnego kończyn tylnych myszy
<ol>
	<li>Napełnić strzykawkę z igłą 30 g α-MEM.</li>
	<li>Odłącz kość piszczelową i kość udową od stawu kolanowego.</li>
	<li>Odetnij końce długiej kości z obu stron za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Przytrzymaj kość z trzonu za pomocą pęsety, włóż igłę do przestrzeni szpiku kostnego i powoli przepłucz zawartość szpiku do naczynia hodowlanego o średnicy 6 cm. Kość będzie biała, co oznacza ekstrakcję całej zawartości szpiku kostnego. Powtórz dla wszystkich kości.</li>
	<li>Odcedzić ekstrakt ze szpiku kostnego za pomocą sitka do komórek nylonowych o pojemności 40 μm do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant, przemyć 5 ml α-MEM i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Powtórzyć mycie w sumie 2 razy.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml α-MEM i przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą hemocytometru w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Zawiesinę komórek należy rozcieńczyć w stosunku 1:1, dodając 10 μl zawiesiny komórek do 10 μl 0,4% błękitu trypanowego w probówce o pojemności 1,5 ml i jednokrotnie pipetować.</li>
		<li>Przykryj komorę hemocytometru szkiełkową osłoną i przenieś zawiesinę barwnika do hemocytometru. Ważne jest, aby nie przepełniać ani nie przepełniać komory i pozwolić, aby zawiesina wypełniła komorę poprzez działanie kapilarne.</li>
		<li>Umieść hemocytometr na stoliku mikroskopu. Używając obiektywu 10x, skup się na środkowym kwadracie. Policz wszystkie komórki ograniczone 3 liniami. Aby upewnić się, że komórki nie są liczone dwukrotnie, policz górny i prawy róg każdego kwadratu. Martwe komórki będą ciemnoniebieskie, są one wyłączone z liczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W zależności od dalszej aplikacji, należy zasiać komórki w odpowiednim naczyniu hodowlanym. W przypadku tego konkretnego eksperymentu postępuj zgodnie z sekcją 3.</li>
</ol>
3. Generacja BMM
<ol>
	<li>Wysiew 1 x 10 7 komórek/10 ml w 10 cm naczyniu hodowlanym i dodaj M-CSF 100 ng/ml. Końcowe stężenie M-CSF wynosi 100 ng/ml pożywki hodowlanej. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 dni.</li>
	<li>Po 3 dniach usunąć pożywkę hodowlaną, energicznie przemyć komórki dwukrotnie 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu usunięcia nieprzylegających komórek, dodać 5 ml 0,02% trypsyny-EDTA o temperaturze pokojowej w PBS i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 min.</li>
	<li>Odłączyć ogniwa przez dokładne pipetowanie. Upewnij się, że komórki zostały odłączone, obserwując hodowlę pod mikroskopem (komórki powinny wydawać się zaokrąglone i unoszące się w pożywce). Jeśli komórki pozostają połączone, należy dokładnie powtórzyć pipetowanie, aby je odłączyć. Po odłączeniu komórek dodaj 5 ml α-MEM, aby dezaktywować reakcję.</li>
	<li>Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć 5 ml α-MEM.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 10 ml α-MEM.</li>
	<li>Wykonaj zliczanie komórek zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 2.7.1.</li>
	<li>Wysiew 1 x 106 komórek/10 ml w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm i dodaj M-CSF 100 ng/ml. Końcowe stężenie M-CSF wynosi 100 ng/ml pożywki hodowlanej. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 dni.</li>
</ol>
4. Generowanie osteoklastów z BMM jako prekursorów osteoklastów
<ol>
	<li>Po 3 dniach zbierz przyłączone komórki, które reprezentują BMM jako prekursory osteoklastów, wykonując kroki 3.2-3.7.</li>
	<li>Wysiewaj BMM w 5 x 104 komórek/200 μl α-MEM na płytce 96-dołkowej. Dodaj RANKL dla końcowego stężenia 50 ng/ml lub TNF-α dla końcowego stężenia 100 ng/ml. Dodaj M-CSF do każdego dołka o końcowym stężeniu 100 ng / ml.</li>
	<li>Dodaj przeciwciało anty-c-fms (końcowe stężenia 0, 1, 10, 100, 100 ng / ml) do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 4 dni. Zmieniaj nośniki co drugi dzień przez 4 dni.</li>
</ol>
5. Barwnik kwaśnej fosfatazy odpornej na winian (TRAP)
<ol>
	<li>Po 4 dniach inkubacji delikatnie zassać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki. Umyj każdą studzienkę raz 200 μl o temperaturze pokojowej 1x PBS.</li>
	<li>Dodaj 200 μl 10% formaliny do każdego dołka w celu utrwalenia i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać formalinę i umyć każdą studzienkę 3 razy wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Dodać 200 μl 0,2% Triton X-100 w PBS do każdej studzienki w celu przepuszczalności i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Zassać Triton X-100 i umyć każdą studzienkę 3 razy wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 200 μl roztworu plamy TRAP. Wizualizuj plamę pod mikroskopem. Potrzeba od 10-30 minut, aby plama rozwinęła się prawidłowo.</li>
	<li>Zassać plamę i umyć każdą studzienkę wodą dejonizowaną 3 razy i wysuszyć na powietrzu. Przechowywać w temperaturze pokojowej do wykorzystania w dalszej obserwacji.</li>
</ol>
6. Test proliferacji
<ol>
	<li>Nasiona BMM jako prekursory osteoklastów w 5 x 10 3 komórkach/200 μl α-MEM w 96-dołkowej płytce. Dodaj M-CSF do każdego dołka o końcowym stężeniu 100 ng / ml.</li>
	<li>Dodać przeciwciało anty-c-fms (końcowe stężenia 0, 1, 10, 100, 1 000 ng/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 dni bez zmiany pożywki.</li>
	<li>Po 3 dniach umyj komórki 1x PBS. Dodać 100 μl α-MEM do każdej studzienki.</li>
	<li>Dodać 10 μl roztworu zestawu do liczenia komórek i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 godziny i oznaczyć absorbancję każdego dołka przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
</ol>

<ol><li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology%3A+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287(2015).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF%2FRANKL-RANK+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li>
<li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li>
<li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li>
<li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li>
<li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li>
<li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angle+Orthodontist%22%5BJournal%5D)">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li>
<li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Develpoment%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li>
<li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+%28op%2Fop%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li>
<li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li>
<li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu zbadaliśmy wpływ przeciwciała anty-c-fms na tworzenie osteoklastów indukowane przez RANKL, tworzenie osteoklastów indukowane przez TNF-α i proliferację prekursorów osteoklastów indukowaną przez M-CSF. Stwierdziliśmy, że skuteczna ilość przeciwciała anty-c-fms do hamowania osteoklastogenezy wśród tworzenia osteoklastów indukowanego przez RANKL, tworzenia osteoklastów indukowanego przez TNF-α i indukowanej przez M-CSF proliferacji prekursorów osteoklastów jest inna.
RANKL pośrednic...

Osteoklasty są wysoce wyspecjalizowanymi komórkami i odróżniają się od hematopoetycznych komórek macierzystych poprzez fuzję wielu prekursorów osteoklastów. Są one niezbędne do zdrowej przebudowy kości i przyczyniają się do patologicznej resorpcji kości związanej z zapalnymi chorobami osteolitycznymi, takimi jak reumatoidalne zapalenie stawów i choroby przyzębia1.
Osteoklastogeneza i funkcja osteoklastów są zależne od dwóch kluczowych czynników; czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywatora receptora ligandu czynnika jądrowego kappa-B (RANKL). Zarówno M-CSF, jak i RANKL są ważne dla różnicowania osteoklastów2. Innym czynnikiem, który, jak wykazano, indukuje tworzenie osteoklastów z makrofagów szpiku kostnego in vitro, jest czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α)3,4,5. Wykazano, że tworzenie osteoklastów za pośrednictwem TNF-α ma kluczowe znaczenie dla osteolizy w destrukcyjnych chorobach kości, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów6, choroby przyzębia7 i osteoporoza pomenopauzalna8.
C-fms jest receptorem błonowym M-CSF i pośredniczy w jego działaniu. Rola c-fms jest dobrze udokumentowana w literaturze, ponieważ wykazano, że podanie przeciwciała przeciwko c-fms (anti-c-fms anti-fms) całkowicie zatrzymało osteoklastogenezę w modelu zapalenia stawów, a także w nadżerkach kości wywołanych przez TNF-α, podczas gdy osteoklastogeneza oddalona od stawu objętego stanem zapalnym była nadal solidna9. Podanie przeciwciała anty-c-fms hamowało tworzenie osteoklastów i resorpcję kości indukowaną przez lipopolisacharyd (LPS) u myszy calvariae10, a także w indukowanym przez LPS zapaleniu przyzębia model11. Co więcej, przeciwciało anty-c-fms hamowało resorpcję korzeni wywołaną naprężeniami mechanicznymi podczas ortodontycznego ruchu zębów12, a także ortodontyczny ruch zębów i resorpcję kości związane z ortodontycznym ruchem zęba13.
M-CSF ma inne funkcje, które są niezbędne dla odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Brak M-CSF u myszy op/op z bakteryjnym zapaleniem płuc prowadzi do wzrostu obciążenia bakteryjnego i rozprzestrzeniania się bakterii do wątroby z martwicą wątroby14. Dlatego M-CSF jest ważny dla odpowiedzi immunologicznej w ochronie przed infekcją.
To badanie pokazuje wpływ przeciwciała anty-c-fms na M-CSF i RANKL lub TNF-α indukowane tworzenie osteoklastów in vitro oraz indukowaną przez M-CSF proliferację prekursorów osteoklastów. Protokół ten demonstruje izolację mysich komórek szpiku kostnego z kości długich oraz etapy generowania makrofagów szpiku kostnego (BMM), które są uważane za prekursory osteoklastów, oraz indukowania różnicowania BMM w wielojądrzaste osteoklasty za pomocą dwóch metod; RANKL lub TNF-α. W protokole porównano również zatrzymanie osteoklastogenezy w obu metodach przy użyciu przeciwciała anty-c-fms.
Proces, w którym szpik kostny jest pobierany, a następnie wykorzystywany do generowania prekursorów osteoklastów, jest niezawodny w produkcji dużych ilości czystych kultur osteoklastów, które mogą być używane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak testowanie leków. Zastosowanie RANKL lub TNF-α do indukcji osteoklastogenezy w tym protokole odróżnia osteoklastogenezę jako proces fizjologiczny (RANKL) od osteoklastogenezy jako procesu patologicznego (TNF-α), co z kolei zapewnia dwie alternatywne procedury do podjęcia decyzji, która z nich jest lepsza pod względem odczynników, które mają być stosowane w dalszych zastosowaniach. Protokół ten zapewnia również metodę, za pomocą której możemy określić odpowiednie stężenie przeciwciała anty-c-fms, które można bezpiecznie wykorzystać do późniejszych badań związanych z resorpcją kości i chorobami osteolitycznymi.

<table><tbody><tr>Przeciwciało <td></td><td></td><td>anty-c-Fms</td><td>AFS98, szczurze przeciwciało monoklonalne, antymysie, przeciwciało c-Fms (IgG2a)</td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td></td><td></td><td>Rekombinowana mysia TNF-&alpha; przygotowana w naszym laboratorium. TNF-&alfa; Fragment cDNA sklonowany metodą RT-PCR i sklonowany do pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) w celu wygenerowania białka fuzyjnego GST. GST-TNF-&alfa; ulegała ekspresji w komórkach Escherichia coli BL21 (Stratagene, La Jolla, CA). Komórki poddano lizie w warunkach niedenaturujących i GST-TNF-&alpha; został oczyszczony nad kolumną glutation-sefaloza. GST został odcięty przez PreScission Protease (Amersham Biosciences) przez producenta s kierunków i został usunięty przez kolumnę glutation-sefaroza.</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PEPROTECH</td><td>315-11</td><td>Rekombinowany mysi ligand sRANK, Źródło: E. coli</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td></td><td></td><td>Rekombinowany ludzki M-CSF. 1/10 vol CMG14&ndash; 12 Supernatant do hodowli linii komórkowych w 5x106&nbsp; w naczyniu do hodowli zawiesiny o średnicy 10 cm.</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako</td><td></td><td>z L-glutaminą i czerwienią fenolową</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Biowest</td><td>s1820-500</td><td>Płodowa surowica bydlęca pochodzenia francuskiego</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane Naczynie</td> w stylu <td>Corning</td><td></td><td>100 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Thermofischer Scientific</td><td></td><td>Nun clon Powierzchnia Delta</td></tr><tr><td>Zestaw do liczenia komórek-8</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td></td><td>40 &mu; m Nylonowa</td></tr><tr><td>rurka wirówkowa</td><td>Corning</td><td></td><td>50 ml Nasadka CentriStar</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td></td><td>Eter polioksyetylenowy (10) oktyfenylowy</td></tr></tbody></table>

wpływ przeciwciała anty-c-fms na tworzenie i proliferację prekursora osteoklastów in vitro

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Przebudowa kości jest złożonym procesem i obejmuje okresy depozycji i resorpcji. Resorpcja kości to proces, w którym kość jest rozkładana przez osteoklasty w odpowiedzi na różne bodźce. Prekursory osteoklastów różnicują się w wielojądrzaste osteoklasty w odpowiedzi na czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywator receptora liganda czynnika jądrowego Kappa-B (RANKL). W warunkach patologicznych profil cytokin jest inny i obejmuje mieszaninę cytokin zapalnych. Czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α) jest jedną z najważniejszych cytokin, ponieważ występuje w dużych ilościach w obszarach związanych z zapalną osteolizą. Celem tego protokołu jest zapewnienie metody, za pomocą której mysi szpik kostny jest izolowany w celu wytworzenia osteoklastów poprzez indukcję za pomocą M-CSF i RANKL lub TNF-α które zostaną następnie zahamowane przez zwiększenie dawek przeciwciała anty-c-fms, receptora dla M-CSF. Eksperyment ten podkreśla wartość terapeutyczną przeciwciała anty-c-fms w chorobach zapalnej resorpcji kości.

Celem niniejszego protokołu jest ocena wpływu przeciwciała przeciwko c-fms na tworzenie się osteoklastów w obecności RANKL lub TNF-α oraz określenie wpływu M-CSF na proliferację prekursorów osteoklastów. W niniejszym protokole przedstawiliśmy niezawodny proces generowania dużych ilości czystych kultur osteoklastów. Przedstawiliśmy również sposób badania odpowiedniego stężenia przeciwciała przeciwko c-fms w celu hamowania tworzenia się osteoklastów w różnych warunkach hodowli.
<p class...

Ten protokół obejmuje preparację mysich kości długich i izolację szpiku kostnego, w celu wytworzenia makrofagów szpiku kostnego i wytworzenia osteoklastów za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywatora receptora liganda czynnika jądrowego Kappa-B (RANKL) lub czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α) i ich zatrzymanie przez przeciwciało anty-c-fms, receptor M-CSF.

Wpływ przeciwciała anty-c-fms na tworzenie i proliferację prekursora osteoklastów in vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Eksperyment ten podkreśla wartość terapeutyczną przeciwciała anty-c-fms w chorobach zapalnych kości, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów i zapalenie przyzębia. Proces, w którym szpik kostny jest ekstrahowany i wykorzystywany do wytwarzania prekursorów osteoklastów, daje duże ilości czystych osteoklastów, które mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach. Protokół ten zapewnia dwie alternatywne metody osteoklastogenezy, przy użyciu liganda RANKL lub TNF alfa.Ponadto metoda ta zapewnia wgląd w wpływ przeciwciała anty-c-fms na osteoklastogenezę. Wizualny pokaz tej procedury zapoznaje badacza z procesem preparacji i pozyskiwania komórek szpiku kostnego w dużych ilościach. Na początek napełnij talerz, który będzie służył jako pojemnik zbiorczy, około 50 mililitrami alpha MEM, w zależności od wielkości pojemnika, i umieść go na lodzie.Użyj szpilek, aby przebić dłonie i stopy myszy poddanej eutanazji, aby zamocować ją w pozycji leżącej na plecach i dokładnie spryskaj 70% etanolem. Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych i pęsety, aby wykonać nacięcie skóry na poziomie biodra i rozciągnąć je w dół do stóp, odsłaniając mięśnie. Zlokalizuj i przetnij ścięgno przyczepiające mięsień czworogłowy.Oderwij mięsień i przetnij go na poziomie biodra. Następnie zlokalizuj ścięgno przyczepiające mięsień ścięgna podkolanowego do kości. Oderwij mięśnie odsłaniające kość i uwolnij ścięgno podkolanowe z jego przyczepu, uważając, aby nie przeciąć kości.Umieść nożyczki między głową kości udowej a przestrzenią stawową. Wciąć się w nią uwalniając kość udową, ale pozostawiając kość w stanie nienaruszonym, co umożliwi oderwanie kości bez ryzyka odsłonięcia szpiku kostnego. W podobny sposób odetnij mięśnie przyczepione do kości piszczelowej.Następnie odetnij kość piszczelową od jej przyczepu w stawie skokowym, zachowując kość w stanie nienaruszonym, aby uniknąć zanieczyszczenia. Za pomocą ostrzy nożyczek i chusteczek laboratoryjnych zeskrob pozostałą tkankę miękką z kości udowej i piszczelowej i umieść je na przygotowanej płytce z alpha MEM umieszczonej na lodzie. Sekcję należy przeprowadzić ostrożnie, aby zminimalizować zanieczyszczenie.Dlatego tak ważne jest dokładne usunięcie tkanek miękkich i lokalizacja kości. Napełnij strzykawkę z igłą o rozmiarze 30 rozmiarów roztworem alpha MEM. Odłącz kość piszczelową i udową od stawu kolanowego i odetnij końce kości długiej z obu stron za pomocą nożyczek.Użyj pęsety, aby przytrzymać kość z trzonu. Włóż igłę do przestrzeni szpiku kostnego i powoli przepłucz zawartość szpiku do sześciocentymetrowego naczynia hodowlanego i powtórz dla wszystkich kości. Kość zmieni kolor na biały, co oznacza ekstrakcję całej zawartości szpiku kostnego.Użyj nylonowego sitka do komórek o średnicy 40 mikrometrów, aby przecedzić ekstrakt ze szpiku kostnego do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Odwirować probówkę o stężeniu 300 razy G przez pięć minut. Odrzucić supernatant.Aby umyć, dodaj pięć mililitrów alpha MEM do granulki. Odpipetuj komórki, aby je odłączyć, odwiruj i powtórz mycie w sumie dwa razy. Po policzeniu tych izolowanych komórek, zgodnie z opisem w manuskrypcie, wysiewaj 10 milionów komórek na 10 mililitrów w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym i dodaj M-CSF do komórek.Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez trzy dni. Usuń pożywkę po trzech dniach i dwukrotnie energicznie umyj komórki 10 mililitrami PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki. Dodaj pięć mililitrów 0,02% trypsyny-EDTA i PBS o temperaturze pokojowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez pięć minut.Dokładnie odpipetuj komórki, aby je odłączyć. Obserwuj kulturę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki zostały oderwane i wydają się zaokrąglone i unoszące się w pożywce. Po odłączeniu komórek dezaktywuj reakcję, dodając pięć mililitrów alfa MEM.Zbierz komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i wiruj przy 300 razy G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu przemyć pięcioma mililitrami alfa MEM i ponownie odwirować w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach alpha MEM.Wysiewaj 1 milion komórek na 10 mililitrów w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym i dodaj M-CSF. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez trzy dni. Zbierz przyłączone komórki, które reprezentują BMM jako prekursory osteoklastów po trzech dniach, tak jak to miało miejsce wcześniej podczas generowania BMM.Wysiewaj BMM w 50 000 komórek na 200 mikrolitrów alfa MEM w 96-dołkowej płytce na dołek. Do każdej studzienki dodaj pożądane bodźce. A następnie dodaj M-CSF, aby uzyskać końcowe stężenie 100 nanogramów na mililitr.Dodaj przeciwciało anty-c-fms do każdej studzienki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez cztery dni, zmieniając pożywkę co drugi dzień przez cztery dni. A następnie przystąp do barwienia i testów, zgodnie z opisem w rękopisie.Oceniono tworzenie osteoklastów w hodowli traktowanej M-CSF i RANKL z przeciwciałem Anti-c-fms. Przy 101 000 nanogramów na mililitr przeciwciała Anti-c-fms zaobserwowano znaczny spadek liczby osteoklastów w porównaniu z kontrolą. Natomiast przy jednym na 10 nanogramów na mililitr przeciwciała anty-c-fms nie nastąpił znaczący spadek.Następnie oceniono tworzenie osteoklastów w kulturach traktowanych M-CSF i TNF alfa z przeciwciałem Anti-c-fms. Przy 10, 100, 1 000 nanogramach na mililitr przeciwciała anty-c-fms zaobserwowano znaczny spadek liczby osteoklastów w porównaniu z kontrolą, bez znaczącego spadku przy jednym nanogramie na mililitr. A hodowla M-CSF z 1, 10, 100 nanogramami na mililitr przeciwciała anty-c-fms nie wykazała znaczącego spadku liczby prekursorów osteoklastów w porównaniu z kontrolą.Jednak przy 1 000 nanogramów na mililitr nastąpił znaczny spadek liczby prekursorów osteoklastów, co wskazuje, że stężenie tak wysokie jak 1 000 nanogramów na mililitr jest potrzebne do znacznego zahamowania proliferacji prekursorów osteoklastów. Upewnij się, że uwolniłeś wiązania, zachowując nienaruszoną kość, co zminimalizuje ryzyko zanieczyszczenia.

effect-anti-c-fms-antibody-on-osteoclast-formation-proliferation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie pokazujemy wpływ różnych stężeń przeciwciał anty-c-fms na osteoklastogenezę, która jest procesem powstawania osteoklastów z komórek progenitorowych osteoklastów.

Wpływ przeciwciała anty C-fms na osteoklastogenezę w komórkach szpiku kostnego myszy in vitro

Różnicowanie komórek prekursorowych w osteoklasty jest regulowane przez cytokiny i czynniki wzrostu. W tym artykule opisano nową technikę transferu genów do różnicowania osteoklastów in vivo oraz protokoły hodowli komórkowych do różnicowania komórek prekursorowych w osteoklasty in vitro jako metodę badania wpływu cytokin na osteoklastogenezę.

Nowatorska technika transferu genów in vivo i testy komórkowe in vitro do badania utraty masy kostnej w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Sygnalizacja Notch to forma komunikacji komórkowej, która opiera się na bezpośrednim kontakcie między komórkami. Aby prawidłowo indukować sygnalizację Notch in vitro, ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym. Protokół ten opisuje metody stymulacji in vitro sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy.

Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy

Ten manuskrypt opisuje protokół izolacji i hodowli osteoklastów in vitro ze szpiku kostnego myszy oraz badania roli ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 w tworzeniu osteoklastów.

Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną procedurę testową dla testów resorpcyjnych z użyciem płytek do hodowli komórkowych pokrytych fosforanem wapnia.

Prosty protokół testu wgłębnego do wizualizacji i ilościowego określenia resorpcji osteoklastycznej in vitro

Osteoklasty są kluczowymi komórkami resorpcyjnymi kości w organizmie. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę różnicowania in vitro osteoklastów z ludzkich monocytów krwi obwodowej. Metoda ta może być wykorzystana jako ważne narzędzie do lepszego zrozumienia biologii osteoklastów w homeostazie i chorobach.

Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej

Niniejszy artykuł opisuje procedurę tworzenia i wizualizacji biofilmu bakteryjnego hodowanego w szkiełku przedmiotowym z komorą...

In vitro tworzenie biofilmu w szkiełku przedmiotowym z 8-komorowym układem

Przedstawiona metoda umożliwia wykrycie funkcjonalnych, efektywnych kardiotropowych autoprzeciwciał w osoczu pacjentów z rozstrzeniowym kardiomiopatią, niezależnie od konkretnego antygenu, poprzez analizę wpływu wyizolowanych immunoglobulin pacjenta na skracanie się komórek oraz wewnątrzkomórkowe przejścia wapniowe w izolowanych kardiomiocytach szczura.

Pomiar wpływu przeciwciał na funkcje komórkowe izolowanych kardiomiocytów

Poznaj metodę izolacji szpiku kostnego myszy i generowania osteoklastów in vitro z wykorzystaniem przeciwciała Anti-c-fms. Technika ta umożliwia badanie osteoklastogenezy i potencjalne zastosowania terapeutyczne w chorobach zapalnych kości.

Wpływ przeciwciała anty-c-fms na tworzenie i proliferację prekursora osteoklastów in vitro

Przeglądaj więcej filmów