Name: Behawioralne podejścia do badania wrodzonego stresu u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Poznaj nowatorski test zbiornikowy do badania zachowań związanych ze stresem u dorosłych danio pręgowanych. Ta metoda łączy podejście farmakologiczne z analizą torów ruchu, pomagając zrozumieć mechanizmy modulacji stresu w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z Jupiter Life Science Initiative na Florida Atlantic University dla ERD i ACK. Prace te były również wspierane przez granty R21NS105071 (przyznane ACK i ERD) oraz R15MH118625 (przyznane ERD) z National Institutes of Health.

Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Florida Atlantic.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Wyznaczyć odizolowane pomieszczenie do przeprowadzania badań behawioralnych lub odgrodzić część pokoju tak, aby była odizolowana. 
	UWAGA: Pomieszczenie powinno być ciche i o niskim natężeniu ruchu, aby uniknąć zakłócenia normalnego zachowania ryb.</li>
	<li>Przenieść następujące materiały i sprzęt do pomieszczenia behawioralnego: (i) aparat z obiektywem, (ii) filtr podczerwieni, który można przymocować do obiektywu, (iii) statyw do aparatu, (iv) komputer z oprogramowaniem do akwizycji obrazu, (v) sztywny i stabilny stół do przeprowadzenia testu, (vi) lampy podczerwone (lampy IR; 850 nm lub 940 nm), (vii) biały dyfuzor akrylowy, który jest dłuższy niż długość zbiornika rejestracyjnego, (viii) trapezoidalny plastikowy zbiornik testowy o pojemności 1,8 L (określany jako „nowy zbiornik”; w tym przypadku użyto zbiornika o wymiarach 12 x 18 cali) oraz (ix) wiadro wody z systemu utrzymania ryb. 
	UWAGA: Jako nowego zbiornika nasze laboratorium wykorzystuje dostępne komercyjnie naczynia plastikowe o kształcie trapezoidalnym. Wymiary zbiornika wynoszą w przybliżeniu 6 cali x 9 cali (szczegółowe wymiary podano na Rysunku 1A). Stosowana przez nas płyta dyfuzyjna jest nieco większa niż nowy zbiornik (12 cali x 18 cali). Eksperymenty z nowym zbiornikiem przeprowadzano z wykorzystaniem zbiorników o różnych kształtach, np. prostokątnych lub o innych wymiarach trapezoidalnych20,21. Zazwyczaj zachowanie ryb jest podobne we wszystkich zbiornikach, niezależnie od ich wymiarów: we wszystkich naczyniach ryby początkowo preferują dolną połowę, jednak z czasem zaczynają częściej eksplorować górną połowę.</li>
	<li>Przymocować filtr podczerwieni do obiektywu aparatu. Długości fal taśm światła podczerwonego zazwyczaj mieszczą się w zakresie od 850 nm do 940 nm. Filtr jest filtrem długoprzepustowym, który blokuje transmitowanie do aparatu światła o długościach fal mniejszych niż 720 nm.</li>
	<li>Wybrać odpowiednie parametry w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Dla większości nagrań ustawić częstotliwość akwizycji aparatu na 30 klatek na sekundę, a czas trwania nagrania na 10 min. 
	UWAGA: Parametry te mogą się różnić w zależności od eksperymentu. Na przykład do badania habituacji w nowym zbiorniku22,23 mogą być wymagane dłuższe nagrania.</li>
</ol>
2. Konfiguracja
UWAGA: Kroki w tej sekcji opisują przygotowanie nowej próby w zbiorniku (novel tank assay). Schemat końcowego układu przedstawiono na Rysunku 1B.
<ol>
	<li>Umieść nową zbiornik w środku stołu.</li>
	<li>Ustaw lampy podczerwone za zbiornikiem i umieść białą płytkę akrylową lub ekran dyfuzyjny pomiędzy zbiornikiem a źródłem światła LED.
	<ol>
		<li>Ustaw dyfuzor w taki sposób, aby maksymalnie rozpraszał światło pochodzące z diod LED, a natężenie światła było wystarczające do oświetlenia zbiornika. Im bliżej źródła światła znajduje się płyta, tym jaśniejsze będzie światło, ale tym mniejsza będzie jego dyfuzja. Z kolei umieszczenie płyty dyfuzyjnej dalej od źródła światła zmniejszy natężenie światła, ale lepiej je rozproszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypełnij nową zbiornik w około trzech czwartych wodą systemową dla ryb. 
	UWAGA: Woda systemowa jest przygotowywana poprzez odwróconą osmozę wody z kranu, a następnie dozowanie składników w taki sposób, aby przewodność wynosiła 900 ± 100 µS, pH było obojętne (7,2), a temperatura wynosiła 27 ± 1 °C.</li>
	<li>Zamocuj kamerę na statywie i podłącz ją do komputera. Uruchom oprogramowanie do akwizycji wideo i ustaw kamerę przodem do zbiornika, upewniając się, że cały zbiornik jest widoczny i że w obrazie wideo nie ma obszarów zasłoniętych. Dostosuj ustawienie zbiornika i lamp podczerwonych tak, aby podczas obserwacji przez kamerę w całym zbiorniku panowało wystarczające i równomierne oświetlenie. 
	UWAGA: Przed przystąpieniem do eksperymentów często przydatne może być przeprowadzenie próby, podczas której rejestrowane jest wideo ryby i przeprowadzane jest śledzenie. Pozwoli to upewnić się, że konfiguracja jest odpowiednia do badania zachowania.</li>
</ol>
3. Konfiguracja testu nowego akwarium
<ol>
	<li>Przygotować zlewkę o pojemności 250 mL wypełnioną wodą z systemu rybnego oraz co najmniej dwa zbiorniki przechowawcze.</li>
	<li>W dniu testu, rano, przenieść z hodowli do zbiornika przechowawczego co najmniej 10 dorosłych ryb zebrafish przeznaczonych do każdego z warunków eksperymentalnych (grupa kontrolna i eksperymentalna), przenieść je do pomieszczenia behawioralnego i pozwolić im na aklimatyzację przez co najmniej jedną godzinę. 
	UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentów należy przeprowadzić analizę mocy statystycznej, jednak w naszym doświadczeniu liczba n = 10 jest zazwyczaj wystarczająca do wykrycia istotności statystycznej. Ponadto zbiornik przechowawczy nie powinien zawierać więcej niż pięć osobników na litr wody. Aklimatyzacja trwająca jedną godzinę jest wystarczająca, ponieważ wykazano, że dorosłe ryby zebrafish habituują do nowego zbiornika w ciągu 30 minut22. Ponadto rytmy behawioralne są zależne od procesów okołodobowych, dlatego powtórzenia eksperymentalne wykonywane w różne dni powinny odbywać się w tych samych godzinach. Zazwyczaj przeprowadzamy wszystkie eksperymenty między godziną 11:00 a 18:00.</li>
	<li>Oznaczyć zbiorniki w taki sposób, aby warunek lub genotyp zwierząt był nieznany eksperymentatorowi (metoda ślepej próby). 
	UWAGA: Można łatwo zastosować ślepą próbę, oznaczając zbiorniki za pomocą liter lub cyfr (np. jeden zbiornik jako „A”, kolejny jako „B” itd.). Osoba niezaangażowana w eksperymenty oznacza zbiorniki w ten sposób i ukrywa tożsamość grup przed eksperymentatorem aż do zakończenia analizy danych.</li>
	<li>Za pomocą siatki delikatnie umieścić jedną dorosłą rybę w wypełnionej wcześniej zlewce z kroku 3.1. Pozostawić rybę do aklimatyzacji w zlewce na 10 minut. 
	UWAGA: Należy odnotować płeć osobnika, ponieważ podczas analizy danych może to być istotne w celu poszukiwania różnic specyficznych dla płci.</li>
	<li>Po aklimatyzacji w zlewce wprowadzić rybę do nowego zbiornika (przygotowanego w sekcji 1), delikatnie wlewając wodę wraz z rybą ze zlewki.</li>
	<li>Po wprowadzeniu dorosłej ryby do nowego zbiornika uruchomić nagrywanie kamerą i odsunąć się od stanowiska, aby uniknąć wywołania dodatkowego stresu u ryby.</li>
	<li>Po zakończeniu nagrywania wyjąć osobnika z nowego zbiornika i przenieść go do nowego zbiornika przechowawczego. 
	UWAGA: Należy użyć innego zbiornika przechowawczego niż ten z kroku 3.2, aby zapobiec powtórnemu testowaniu tych samych osobników.</li>
	<li>Powtarzać kroki od 3.4 do 3.7 dla każdej dorosłej ryby, aż wszystkie zwierzęta zostaną przetestowane. 
	UWAGA: Oprócz maskowania warunków lub genotypów, należy zrandomizować kolejność prób. Użyć generatora liczb losowych lub dowolnego narzędzia umożliwiającego randomizację prób. Powinno to zostać zrobione przed rozpoczęciem eksperymentów, tak aby kolejność każdej próby była ustalona przed startem badań.</li>
	<li>Po zakończeniu wszystkich testów zwrócić ryby do hodowli.</li>
</ol>
4. Obróbka wstępna lekiem
UWAGA: Celem poniższych kroków jest porównanie zachowania osobnika przed i po podaniu leków. Porównanie to przeprowadza się poprzez wykonanie najpierw testu nowego zbiornika zgodnie z krokami 3.4 do 3.6, następnie podanie leku, a potem przeprowadzenie drugiego testu nowego zbiornika (Rysunek 3A).
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zapasu leku, w tym kontrole pozytywne i negatywne. 
	UWAGA: Jeśli lek był wcześniej stosowany w literaturze, należy ustalić odpowiednią dawkę roboczą i jej użyć. Na przykład w przypadku buspironu w wynikach reprezentatywnych przygotowujemy 100-krotny roztwór zapasu i stosujemy stężenie końcowe 0,05 mg/mL, zgodnie z opisem w literaturze13,20. Jeśli sugerowana dawka jest nieznana, należy przeprowadzić krzywą zależności dawka-odpowiedź, badając kilka stężeń. Przygotować więcej zlewków z rozcieńczeniami seryjnymi leku. Jeśli lek nie rozpuszcza się w wodzie, jako rozpuszczalnik należy użyć dimetylosulfoksydu (DMSO).</li>
	<li>Rozcieńczyć leki do stężenia roboczego w zlewkach o pojemności 250 mL za pomocą wody systemowej. Na przykład, jeśli przygotowano roztwór 100x, rozcieńczyć go w stosunku 1:100 w wodzie systemowej. Przygotować zlewek zawierający wyłącznie wodę systemową jako kontrolę. 
	UWAGA: Jeśli w kroku 3.1 jako rozpuszczalnik użyto DMSO, w zlewku kontrolnym należy zastosować taką samą objętość DMSO.</li>
	<li>Z pomocą innego badacza zakodować tożsamość zlewków z lekiem i kontrolą, aby zapewnić, że osoba testująca nie zna warunków traktowania aż do momentu analizy. 
	UWAGA: Można zastosować system numerów lub liter.</li>
	<li>Przeprowadzić test nowego zbiornika, postępując zgodnie z krokami od 3.1 do 3.6, aby uzyskać bazową behawioralną odpowiedź stresową.</li>
	<li>Po rejestracji bazowej natychmiast wyjąć siatką dorosłą rybę z nowego zbiornika i umieścić ją w zlewku z dawką leku lub nośnika, zgodnie z opisem w kroku 4.2. Pozostawić osobnika w zlewku na 10 min. 
	UWAGA: Należy upewnić się, że siatka nie dotyka wody w zlewkach, aby zapobiec krzyżowemu zanieczyszczeniu lekami. Należy zapewnić odpowiednią dawkę i czas podania w zależności od zastosowanego leku. 10-minutowy czas traktowania może nie być odpowiedni dla wszystkich leków.</li>
	<li>Po traktowaniu wyjąć siatką osobnika ze zlewka z kroku 4.5 i umieścić go w innym zlewku wypełnionym wyłącznie świeżą wodą systemową. Jest to okres wypłukiwania, który ma na celu zminimalizowanie dalszego dawkowania podczas drugiego testu nowego zbiornika. Pozostawić osobnika w zlewku do wypłukiwania przez kolejne 10 min. 
	UWAGA: Dla każdego warunku lekowego należy używać oddzielnych siatek, aby zapobiec niepożądanemu krzyżowemu traktowaniu lekiem. Okres wypłukiwania można pominąć, jeśli badacz tak uzna.</li>
	<li>Przeprowadzić test nurkowania w nowym zbiorniku po raz drugi, wyjmując osobnika ze zlewka z poprzedniego kroku, umieszczając go w nowym nowym zbiorniku i postępując zgodnie z krokami od 3.5 do 3.6.</li>
	<li>Po drugim teście nowego zbiornika przenieść osobnika do oddzielnego zbiornika przechowawczego. Wylać wodę systemową z drugiego nowego zbiornika i napełnić go świeżą wodą systemową dla kolejnego testu. Krok ten zapobiega krzyżowemu zanieczyszczeniu jakimkolwiek lekiem. 
	UWAGA: W zależności od okresu półtrwania leków, świeże zlewki z lekami należy przygotowywać co 3 godziny. W przypadku buspironu należy przygotowywać świeże roztwory co 3 godziny. Ponadto, zgodnie z uwagą w kroku 3.8, próby powinny być randomizowane pomiędzy kontrolami a traktowaniem lekiem.</li>
	<li>Po zakończeniu wszystkich prób zwrócić osobniki do pomieszczenia dla ryb. 
	UWAGA: W zależności od rodzaju użytego leku, efekty tych traktowań u osobników mogą być długotrwałe. Dlatego nie należy wykorzystywać tych osobników w innych eksperymentach.</li>
</ol>
5. Analiza wideo
<ol>
	<li>Po zakończeniu wszystkich prób wgrać pliki wideo do wybranego oprogramowania do śledzenia. 
	UWAGA: Zazwyczaj korzystamy z komercyjnie dostępnego oprogramowania do śledzenia, jednak można użyć kilku bezpłatnych pakietów oprogramowania. Kroki służące do realizacji śledzenia mogą się różnić w zależności od użytego pakietu oprogramowania.</li>
	<li>Używając klatki z wideo, zdefiniować wirtualne granice wokół (i) całego obszaru nowego zbiornika wypełnionego wodą oraz granice wokół (ii) górnej jednej trzeciej, (iii) środkowej jednej trzeciej i (iv) dolnej jednej trzeciej zbiornika. Wykorzystać je do ustalenia czasu, jaki ryby spędziły w każdej części nowego zbiornika.</li>
	<li>Obliczyć przemieszczenie x-y na klatkę dla każdego obszaru zdefiniowanego w kroku 5.2.</li>
	<li>Zdefiniować górny, środkowy i dolny obszar zbiornika. Każdy region powinien być zbliżony rozmiarem. Szybką metodą wyznaczania tych regionów jest obliczenie długości zbiornika w kierunku y i podzielenie tej wartości przez 3. 
	UWAGA: Istnieją warianty ogólnego protokołu. Na przykład niektóre laboratoria stosują podział na połowy zamiast na trzecie14.</li>
	<li>Wyznaczyć czas spędzony w każdym obszarze, dystans oraz prędkość. 
	UWAGA: Większość pakietów do śledzenia automatycznie oblicza te parametry dla użytkownika. Jeśli jednak oprogramowanie do śledzenia tego nie robi, można je łatwo obliczyć z wartości przemieszczenia x-y. Na przykład dystans można wyznaczyć za pomocą wzoru: 
	<img alt="Wzór na dystans, √((x₂-x₁)²+(y₂-y₁)²), schemat koncepcyjny w matematyce." src="/files/ftp_upload/59092/59092eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	a prędkość można wyznaczyć zgodnie ze wzorem: 
	<img alt="wzór na prędkość, prędkość=dystans/czas, równanie, obliczenia fizyczne, wyznaczanie prędkości" src="/files/ftp_upload/59092/59092eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"></li>
	<li>Powtórzyć kroki od 5.2 do 5.4, aby uzyskać ścieżki i pomiary dla wszystkich prób. 
	UWAGA: Warianty tego ogólnego protokołu</li>
</ol>
6. Testowanie normalności rozkładu
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do obliczania różnic statystycznych należy przeprowadzić analizę statystyczną. Należy sprawdzić, czy dane mają rozkład normalny, stosując test Shapiro-Wilka.</li>
	<li>Jeśli hipoteza zerowa o normalności rozkładu danych zostanie odrzucona (tj. dane nie wykazują rozkładu Gaussa), wszystkie testy należy przeprowadzić z wykorzystaniem testów nieparametrycznych. I odwrotnie, jeśli stwierdzono, że dane mają rozkład normalny, należy zastosować testy parametryczne. 
	UWAGA: Do przeprowadzania analiz statystycznych wykorzystujemy dostępne komercyjnie oprogramowanie, jednak można również użyć języka programowania R. Analizę Shapiro-Wilka można przeprowadzić za pomocą funkcji shapiro.test w programie R.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów ani interesów finansowych.

Danio pręgowany wykazuje silną reakcję na stres w nowym zbiorniku W tym miejscu opisujemy proste podejście behawioralne do badania reakcji na stres u dorosłych danio pręgowanego i walidujemy to podejście jako prostą miarę stresu za pomocą farmakologii.
Nowatorski test zbiornikowy jest szeroko stosowanym testem do badania wrodzonego stresu u danio pręgowanego i innych gatunków ryb 12,14,21,35,36, a danio pręgowany okazał się potężnym modelem do badania farmakologicznych skutków le...

Reakcje na stres to zmienione stany behawioralne i fizjologiczne wynikające z potencjalnie szkodliwych lub awersyjnych bodźców. Reakcje na stres są zachowane w całym królestwie zwierząt i mają kluczowe znaczenie dla przetrwania organizmu1. Dziesięciolecia badań znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat niektórych mechanizmów genetycznych i neuronalnych leżących u podstaw stanów stresowych. Obecnie obszary mózgu, takie jak ciało migdałowate i prążkowie2, oraz czynniki genetyczne, takie jak hormon uwalniający kortykotropinę (CRH) oraz receptory glikokortykosteroidowe (gr) i mineralokortykoidowe (MR), są intensywnie badane3,4,5,6. Pomimo tych krytycznych ustaleń, wiele pozostaje niewiadomych na temat genetycznej i neuronalnej regulacji stresu. W związku z tym wiele zaburzeń związanych ze stresem cierpi z powodu braku środków terapeutycznych.
Genetycznie modyfikowalne organizmy modelowe dostarczają użytecznego narzędzia w badaniach nad genetyczną i neuronalną kontrolą zachowania. W szczególności modele ryb są niezwykle potężne: są małymi organizmami o krótkim czasie generacji, ich wykorzystanie w warunkach laboratoryjnych jest łatwe, ich genomy są łatwo modyfikowane, a jako kręgowce dzielą nie tylko homologię genetyczną, ale także neuroanatomiczną ze swoimi ssaczymi odpowiednikami7,8. Standardowe testy do pomiaru stresu można połączyć z liniami danio pręgowanego zawierającymi mutacje genetyczne lub takimi, w których możliwa jest manipulacja precyzyjnymi podzbiorami neuronów, a wpływ pojedynczych genów lub zdefiniowanych neuronów można ocenić szybko i skutecznie.
Behawioralnie, reakcje na stres można scharakteryzować u ryb jako okresy nadpobudliwości lub długotrwałe okresy bezczynności (podobne do 'zamrożenia')9, zmniejszona eksploracja10, szybki oddech, zmniejszone spożycie pokarmu11, oraz preferencja miejsca na dnie zbiornika12. Na przykład, po umieszczeniu w nieznanym zbiorniku, dorosłe modele danio pręgowanego i inne małe ryby wykazują początkową preferencję dla dolnej połowy zbiornika, jednak z czasem ryby zaczynają eksplorować górną i dolną połówkę z prawie równą częstotliwością12. Leczenie dorosłych lekami, o których wiadomo, że zmniejszają lęk, powoduje, że ryby natychmiast eksplorują górną połowę10,13. I odwrotnie, leki, które zwiększają niepokój, powodują, że ryby wykazują silną preferencję dla dolnej połowy zbiornika12,14,15. Tak więc zmniejszona eksploracja i preferencja dla dolnej połowy zbiornika są prostymi i wiarygodnymi wskaźnikami stresu.
Podobnie jak w przypadku większości kręgowców, reakcje na stres u ryb są napędzane przez aktywację osi podwzgórze-przysadka-międzynerkowo (HPI; analogiczna do osi podwzgórze-przysadka-nadnercza [HPA] u ssaków)14,16. Neurony podwzgórza wyrażające hormon hormon uwalniający kortykotropinę (CRH) sygnalizują przysadce mózgowej, która z kolei uwalnia adrenokortykotropowy hormon uwalniający (ACTH). Następnie ACTH wysyła sygnał do gruczołu międzynerkowego, aby wytwarzał i wydzielał kortyzol, który ma wiele dalszych celów16, z których jednym jest ujemne sprzężenie zwrotne neuronów podwzgórza wytwarzających crH3,17,18,19.
Tutaj opisujemy metodę oceny behawioralnych miar wrodzonego stresu. Jeśli chodzi o zachowanie, szczegółowo opisaliśmy protokoły za pomocą nowatorskiego testu nurkowania w butli12,14. Następnie pokazujemy na przykład, że znany lek przeciwlękowy, buspiron, zmniejsza behawioralne miary stresu.

<table><tbody><tr><td>Kamera</td><td></td><td></td><td>Używamy kamery USB Point Grey Grasshopper3 z obiektywem firmy Edmund Optics.</td></tr><tr><td>Filtr podczerwieni</td><td>Edmund Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Video Acquisition Program</td><td></td><td></td><td>Korzystaj z programów takich jak Virtualdub lub FlyCapture, ponieważ można ustawić liczbę klatek na sekundę akwizycji.</td></tr><tr>Światła <td></td><td></td><td></td><td>LED na podczerwień</td></tr><tr><td>Zbiornik testowy</td><td>Aquaneering</td><td>Numer katalogowy ZT180</td><td>Rozmiar: M3 1,8 litra</td></tr><tr><td>Stojak i zacisk lub standardowy statyw do aparatu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zlewka</td><td></td><td></td><td></td>250 ml</tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> śledzące <td>Używamy Ethovision XT 13 firmy Noldus Information Technology</td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>buspironuSigma-Aldrich</td><td>B7148</td><td></td></tr><tr>Generator <td></td><td></td><td>randomizowanego badania</td><td>Używamy funkcji RANDBETWEEN w programie Microsoft Excel</td></tr></tbody></table>

behawioralne podejścia do badania wrodzonego stresu u danio pręgowanego

Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Odpowiednie reagowanie na stresujące bodźce jest niezbędne dla przetrwania organizmu. Przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad szerokim spektrum chorób związanych ze stresem i zaburzeniami psychicznymi, jednak nadal potrzebne są dalsze badania nad genetyczną i neuronalną regulacją stresu, aby opracować lepsze metody leczenia. Danio pręgowany stanowi potężny model genetyczny do badania neuronalnych podstaw stresu, ponieważ istnieje duża kolekcja zmutowanych i transgenicznych linii. Co więcej, farmakologię można łatwo zastosować w przypadku danio pręgowanego, ponieważ większość leków można dodawać bezpośrednio do wody. Opisujemy tutaj zastosowanie "nowego testu zbiornikowego" jako metody badania wrodzonych reakcji na stres u danio pręgowanego i pokazujemy, w jaki sposób potencjalne leki przeciwlękowe mogą być walidowane za pomocą testu. Metodę tę można łatwo połączyć z liniami danio pręgowanego, w których występują mutacje genetyczne lub te, w których stosuje się transgeniczne podejścia do manipulowania precyzyjnymi obwodami neuronalnymi. Test może być również stosowany w innych modelach ryb. Razem opisany protokół powinien ułatwić przyjęcie tego prostego testu w innych laboratoriach.

Badanie stresu u danio pręgowanych 
Aby zbadać zachowania stresowe w czasie u danio pręgowanych typu dzikiego, przetestowano dorosłe ryby szczepu AB24 w teście nowego akwarium (novel tank test). Dorosłe ryby AB poddano protokołowi opisanemu powyżej. W skrócie, ryby przeszły 1-h okres aklimatyzacji w zbiorniku w pomieszczeniu do badań behawioralnych. Pojedynczą rybę umieszczano w zlewce na 10-min, a następnie delikatnie przenoszono do nieznanego akwarium...

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę behawioralnego pomiaru stresu u dorosłego gryba. Podejście to wykorzystuje wrodzoną tendencję do tego, że danio pręgowany preferuje dolną połowę zbiornika, gdy jest w stanie stresu. Opisano również metody sprzężenia testu z farmakologią.

Behawioralne podejścia do badania wrodzonego stresu u danio pręgowanego

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

Nowatorski test w zbiorniku w połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi w danio pręgowanym oferuje metodę analizy, w jaki sposób mózg moduluje stres i jak obwody nerwowe mogą być rozregulowane. Genetyczne i neuronalne szlaki sygnałowe są wysoce konserwatywne między danio pręgowanym a ssakami, a ta technika może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw reakcji na stres. Metoda nie jest specyficzna dla danio pręgowanego i była stosowana w przypadku meksykańskich ślepych ryb jaskiniowych, a zatem może być potencjalnie rozszerzona na inne gatunki ryb.Próba może być pomocna w określeniu właściwego oświetlenia i kontrastu zwierzęcia na tle, aby osiągnąć udane śledzenie. Test jest rzadko stosowany, ale może być skomplikowanym procesem. Wizualizacja kroków pomoże innym badaczom pomyślnie przeprowadzić procedurę.Jacqueline Chin, doktorantka w laboratorium, i Lydia Albert, studentka studiów licencjackich, zademonstrują tę procedurę. Zacznij od napełnienia zlewki o pojemności 250 mililitrów i co najmniej dwóch zbiorników zbiornikowych wodą z systemu rybnego. Rankiem w dniu testu przenieś co najmniej 10 dorosłych ryb danio pręgowanego dla każdego warunku doświadczalnego do indywidualnych zbiorników przed przeniesieniem wszystkich ryb do pokoju zachowania w celu aklimatyzacji na co najmniej godzinę.Oznaczyć zbiorniki w taki sposób, aby stan lub genotyp zwierząt był ślepy dla eksperymentatora i użyć siatki, aby delikatnie umieścić pojedynczego dorosłego osobnika w wstępnie napełnionej zlewce. Pozwól dorosłym rybom zaaklimatyzować się w zlewce przez 10 minut, a następnie delikatnie przelej wodę i ryby ze zlewki do eksperymentalnego zbiornika nowatorskiego. Gdy tylko ryba znajdzie się w zbiorniku, rozpocznij nagrywanie z kamery i odsuń się od konfiguracji, aby zapobiec dodatkowemu stresowi ryb.Po zakończeniu nagrywania wyjmij osobnika z nowego zbiornika i umieść rybę w nowym zbiorniku retencyjnym. Aby ocenić działanie określonych leków, które są przedmiotem zainteresowania, rozcieńczyć lek do stężenia roboczego w 250 mililitrowych zlewkach wody systemowej. Używanie zlewki z wodą systemową tylko jako kontrola.Zamaskuj tożsamość leku i zlewki kontrolne, aby upewnić się, że tester jest ślepy na warunki leczenia do czasu zakończenia analizy i wykonaj nowatorski test zbiornika, jak wykazano, w celu uzyskania wyjściowej reakcji na stres behawioralny. Pod koniec zapisu linii podstawowej należy użyć siatki, aby natychmiast przenieść rybę do jednej ze zlewek testowych na 10 minut, a następnie przenieść rybę do zlewki do wymywania zawierającej wyłącznie świeżą wodę systemową. Ważne jest, aby używać oddzielnych sieci przeznaczonych dla każdej zlewki do zabiegu, aby zapobiec przypadkowemu dozowaniu ryb kontrolnych, zwłaszcza gdy w grę wchodzi kilka rodzajów leczenia farmakologicznego.Po 10 minutach umieść rybę w nowym zbiorniku na nową, nowatorską próbę w zbiorniku. Pod koniec testu przenieś dorosłego danio pręgowanego do nowego zbiornika retencyjnego i zastąp wodę systemową w drugim nowym zbiorniku świeżą wodą systemową w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu krzyżowemu eksperymentalnego leku. Po zakończeniu wszystkich prób należy zwrócić osobniki do obiektu rybackiego.Tutaj pokazano aktywność lokomotoryczną pojedynczego danio pręgowanego podczas pierwszej i ostatniej minuty 10-minutowego nowego testu w zbiorniku. Po pierwszym wprowadzeniu do zbiornika ryby zazwyczaj spędzają większość czasu na dnie nowego zbiornika. Z biegiem czasu jednak dorosłe ryby wykazują stopniowy wzrost ilości czasu spędzanego w górnej części zbiornika.Rzeczywiście, całkowity czas spędzony w górnej części zbiornika w ciągu pierwszej minuty jest znacznie krótszy w porównaniu z ostatnią minutą testu nowego zbiornika. Natomiast całkowity dystans przebyty między pierwszą a ostatnią minutą nie wykazuje żadnych istotnych różnic. W tym reprezentatywnym eksperymencie analiza ścieżek lokomotorycznych dorosłych danio pręgowanego wykazała niewielką różnicę między aktywnością pływania danio pręgowanego przed i po leczeniu w grupach dorosłych narażonych na sam nośnik.W przeciwieństwie do tego, dorośli narażeni na lek przeciwlękowy spędzali dużą ilość czasu w górnej części zbiornika w porównaniu ze ścieżkami lokomotorycznymi tych samych ryb przed ekspozycją na lek. Różnice te nie wynikały z mniejszej lokomocji w ogóle, ponieważ nie zmierzono istotnych różnic w przebytej odległości dla żadnej z grup. Ponieważ na rytmy behawioralne wpływają procesy okołodobowe, należy przeprowadzić repliki eksperymentalne wykonywane w różnych dniach o tej samej porze dnia dla każdego eksperymentu.Dodatkowe testy behawioralne, takie jak test otwartego pola lub inne fizjologiczne pomiary stresu, mogą być wykonane w celu dalszej walidacji wyników uzyskanych z nowatorskiego testu nurkowania w butlach. Ta metoda może być stosowana jako test o wysokiej przepustowości do rozwiązywania problemów związanych ze stresem, strachem i niepokojem.

behavioral-approaches-to-studying-innate-stress-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Film opisuje test preferencji jasnego i ciemnego w celu zbadania zachowania związanego z lękiem u danio pręgowanego po ekspozycji na etanol.

Test preferencji jasno-ciemnej: metoda badania zachowań związanych z lękiem u danio pręgowanego

Artykuł opisuje behawioralną metodę oceny stresu u danio pręgowanego. W odpowiedzi na stres danio pręgowany ma tendencję do pływania na dnie zbiornika, dopóki stres nie zostanie usunięty. Przykładowy protokół opisuje krokową metodę wykonywania testu.

Nowatorski test nurkowania w butli: metoda badania wrodzonych reakcji na stres u danio pręgowanego

Nasze laboratorium opracowało nowatorski system automatycznego obrazowania o wysokiej przepustowości, który jest przydatny do wykrywania kilku różnych zachowań u 7-dniowych larw danio pręgowanego. System może być używany do wykrywania subtelnych zmian w zachowaniu po wystawieniu larw na działanie toksyn środowiskowych lub farmaceutyków.

Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe analizy behawioralne larw danio pręgowanego

Wyjaśniono nowatorską metodę zmniejszania zmienności podczas wystawiania ryb na działanie narkotyków.  Stwierdzono, że ryby wystawione na różne wzorce ekspozycji na etanol miały zmieniony poziom lęku podczas odstawienia w teście skotoksji jasnej/ciemnej.

Nowa metoda podawania leków wielu danio pręgowanemu (Danio rerio) i kwantyfikacja odstawienia

Ten manuskrypt opisuje przygotowanie, implementację i analizę śmiałości, agresji i ławicy u danio pręgowanego oraz testy na obecność zespołu behawioralnego. Ustandaryzowane podejście do kwantyfikacji behawioralnej pozwoli na łatwiejsze porównanie między badaniami. Modyfikacje tego protokołu są możliwe, ponieważ każdy test może być przeprowadzany indywidualnie.

Testy śmiałości, agresji i płycizny dla zespołów behawioralnych danio pręgowanego

Opisujemy protokół behawioralny zaprojektowany do oceny, jak osobowość danio pręgowanego wpływa na ich reakcję na prądy wodne i słabe pola magnetyczne. Ryby o tych samych osobowościach są rozdzielane na podstawie ich zachowania eksploracyjnego. Następnie obserwuje się ich reotaktyczne zachowanie orientacyjne w tunelu pływackim o niskim natężeniu przepływu i w różnych warunkach magnetycznych.

Ocena wpływu osobowości na wrażliwość na pola magnetyczne u danio pręgowanego

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do oceny neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiska przy użyciu modelu larw danio pręgowanego, w tym procesu ekspozycji i testów wskaźników neurobehawioralnych.

Badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego

Celem obecnego protokołu jest nakreślenie kroków niezbędnych do ustanowienia i użycia testu preferencji społecznych dla dorosłych ryb danio pręgowanego i pokazanie, że można go użyć do scharakteryzowania wad społecznych wywołanych etanolem.

Modelowanie płodowych zaburzeń alkoholowych u danio pręgowanego w celu scharakteryzowania wpływu niekorzystnego środowiska embrionalnego na zachowania społeczne dorosłych

Tutaj prezentujemy kompleksowy zestaw testów behawioralnych, w tym nowatorski zbiornik, Shoaling i testy preferencji społecznych, aby skutecznie określić potencjalne neurotoksyczne skutki chemikaliów (np. metamfetaminy i glifosatu) na dorosłe rybki danio pręgowane za pomocą jednego zbiornika. Metoda ta jest istotna dla badań neurotoksycznych i środowiskowych.

Ocena neurotoksyczności u dorosłych Danio rerio przy użyciu baterii testów behawioralnych w jednym zbiorniku

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Poznaj nowatorski test zbiornikowy do badania zachowań związanych ze stresem u dorosłych danio pręgowanych. Ta metoda łączy podejście farmakologiczne z analizą torów ruchu, pomagając zrozumieć mechanizmy modulacji stresu w układzie nerwowym.

Behawioralne podejścia do badania wrodzonego stresu u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów