Name: Wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę szybkiego wstrzykiwania do wytwarzania nanocząstek pokrytych lipidami z falkarindiolem dla terapii przeciwnowotworowej. Technika ta umożliwia skuteczne wychwytywanie przez ludzkie komórki mezenchymalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Moustapha Kassem (Szpital Uniwersytecki w Odense, Dania) za ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste. Autorzy dziękują Duńskiemu Centrum Bioobrazowania Medycznego za dostęp do ich mikroskopów. Autorzy dziękują fundacjom Carlsberg i Villum za wsparcie finansowe (dla E.A.C.). Autorzy dziękują za wsparcie finansowe w postaci profesury Nielsa Bohra przyznanej przez Duńską Narodową Fundację Badawczą.

1. Synteza nanocząstek techniką szybkiej zmiany rozpuszczalnika
<ol>
	<li>Do przygotowania nanocząstek należy przygotować następujące elementy: podgrzewacz blokowy/koncentrator próbki, eksykator, cyfrowy system dozowania ze szklaną strzykawką o pojemności 1 ml, szklaną fiolkę o pojemności 12 ml, mieszadło magnetyczne, pchłkę magnetyczną (15 mm x 4,5 mm, w kształcie cylindrycznym z powłoką z politetrafluoroetylenu [PTFE]) wewnątrz szklanej fiolki oraz parownik obrotowy.</li>
	<li>Dozować 2,4 ml 250 μM bulionu falcarindiolu rozpuszczonego w 70% mieszaninie wody EtOH w fiolce scyntylacyjnej.</li>
	<li>Odparować frakcję ciekłą za pomocą koncentratora próbek przez około 4 godziny, aby uzyskać suchy falkarindiol.
	<ol>
		<li>Umieścić fiolkę scyntylacyjną w podgrzewaczu blokowym; koncentrator próbki dostarcza gaz do próbki za pomocą igieł ze stali nierdzewnej, zagęszczając próbkę. Odparować w temperaturze pokojowej; Nie używaj ciepła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wysuszeniu dodać następujące składniki powłoki lipidowej do wyżej wymienionej fiolki scyntylacyjnej: 16,3 μl 31,64 mM roztworu podstawowego chloroformu DSPC, 3,4 μl 17,82 mM roztworu podstawowego chloroformu DSPE PEG 2000, 24 μl 25 mM roztworu podstawowego chloroformu cholesterolu i 6 μl 4 mM roztworu podstawowego chloroformu DiI. Wyczyść strzykawkę chloroformem po dodaniu każdego składnika, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. 
UWAGA: Natychmiast zamknąć fiolki zawierające lipidy, aby rozpuszczalnik nie wyparował, a tym samym zmodyfikować stężenie. Praca pod wyciągiem. 
	UWAGA: Stężenia roztworów podstawowych chloroformu mogą się różnić w zależności od dostawcy substancji chemicznej lub rozcieńczeń wykonanych w laboratorium.</li>
	<li>Owinąć fiolkę folią aluminiową, aby chronić DiI przed światłem. Pozostawić próbkę na noc w eksykatorze w celu odparowania chloroformu.</li>
	<li>Rozpuścić wysuszoną próbkę w absolutnym etanolu do końcowej objętości 1,2 ml, co daje końcowe stężenia DSPC, DSPE PEG 2000, cholesterolu i DiI odpowiednio 0,43 mM, 0,05 mM, 0,5 mM i 0,02 mM. To rozwiązanie reprezentuje fazę organiczną.</li>
	<li>Weź szklaną fiolkę o pojemności 12 ml, napełnij ją 9 ml oczyszczonej wody i dodaj pchłę magnetyczną do fiolki zawierającej 9 ml wody. Trzymaj fiolkę na mieszadle magnetycznym, mieszając z prędkością 500 obr./min (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Podłącz szklaną strzykawkę o pojemności 1 ml do systemu dozującego i wyczyść ją chloroformem, aby uniknąć zanieczyszczenia. Odbywa się to poprzez powolne wciąganie chloroformu do szklanej strzykawki i ręczne dozowanie do pojemnika na odpady co najmniej 10 tiems. 
	UWAGA: Należy to zrobić pod wyciągiem.</li>
	<li>Zalać strzykawkę etanolem. Zalewanie zastępuje stary rozpuszczalnik, a także usuwa wszelkie pęcherzyki powietrza. 
	UWAGA: Należy to zrobić pod wyciągiem.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki odessać 1 ml fazy organicznej.</li>
	<li>Włożyć strzykawkę do szklanej fiolki do połowy znaku wodnego o pojemności 9 ml i utrzymywać ją nieruchomo w środku fiolki (jak pokazano na Rysunek 1).</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór z wybraną prędkością wtrysku (833 μL/s), naciskając przycisk dozowania na systemie dozowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). W ten sposób powstaje 10 ml 50 μM pokrytych lipidami nanocząstek falkarindiolu w 10% wodzie zawierającej etanol. 
	UWAGA: Stwierdzono, że ta prędkość wtrysku pozwala osiągnąć najdrobniejsze cząstki, uzyskując wąski rozkład wielkości cząstek. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że strzykawka znajduje się pośrodku, stabilnie i prosto podczas dozowania roztworu.</li>
	<li>Natychmiast po wstrzyknięciu wyjąć fiolkę z mieszadła i przenieść próbkę do kolby okrągłodennej o pojemności 50 ml (RBF).</li>
	<li>Podłączyć RBF do wyparki obrotowej i odparować 1 ml rozpuszczalnika organicznego za pomocą wyparki obrotowej w temperaturze pokojowej. Unikaj nadmiernego tworzenia się pęcherzyków. 
	UWAGA: Ten krok zajmie ~5 minut.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę nanocząstek z RBF do innej szklanej fiolki o pojemności 12 ml. Upewnij się, że objętość wynosi 9 ml. Podziel próbkę na dwie szklane fiolki o pojemności 12 ml (wlej 4,5 ml do każdej).</li>
	<li>Dodać 0,5 ml ultraczystej wody do jednej z fiolek i 0,5 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do drugiej fiolki. Pobrać 1 ml każdej próbki do pomiaru wielkości cząstek.</li>
</ol>
2. Analiza wielkości cząstek przy użyciu techniki DLS
UWAGA: Pomiary wielkości zostały przeprowadzone za pomocą analizatora DLS, który określa rozkład wielkości cząstek. Wyposażony jest w laser o mocy 100 mW, który działa na długości fali 662,2 nm oraz w detektor fotodiody lawinowej umieszczony pod kątem 90° do kąta padania. Wiązka jest rozpraszana przez nanocząstki i wykrywana przez fotodetektor.
<ol>
	<li>Włącz przyrząd DLS i ustaw żądaną temperaturę na 20 °C, aż się ustabilizuje.</li>
	<li>Ustaw parametry przyrządu w następujący sposób: czas akwizycji danych = 4 s, liczba akwizycji = 30, funkcja automatycznego tłumienia = włączona, a limity czasu automatycznego tłumienia = 0.</li>
	<li>Napełnij plastikową kuwetę 1 ml zawiesiny nanocząstek i rozpocznij pomiar.</li>
	<li>Podaj zmierzoną wielkość w zależności od użytego rozpuszczalnika (woda lub PBS). 
	UWAGA: Pomiar w PBS ma na celu uzyskanie przybliżonego wyobrażenia o wielkości komórek w pożywce podczas leczenia komórek. Leczenie komórkowe zostanie wykonane za pomocą nanocząstek rozpuszczonych w wodzie.</li>
	<li>Powtórzyć pomiary 24 godziny po syntezie, aby sprawdzić agregację cząstek.</li>
</ol>
3. Leczenie komórkowe
<ol>
	<li>Hoduj hMSC w minimalnej pożywce niezbędnej (MEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną, w wilgotnej komorze w temperaturze 37°C z 5% CO2, 
	UWAGA: Pracuj w sterylnym okapie z przepływem laminarnym dla kroków 3.1, 3.2 i 3.3.</li>
	<li>Wysiewaj około 50 000 komórek, aby uzyskać gęstość komórek około 30% na wcześniej bezwzględnie sterylizowanych EtOH szkiełkach nakrywkowych #1,5 umieszczonych na płytkach 6-dołkowych. Dodaj MEM, aby uzyskać końcową objętość 3 ml w każdym dołku. Inkubować przez 24 godziny w takich samych warunkach, jak w kroku 3.1. Wysiewać komórki 24 godziny przed zabiegiem. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby komórki zostały wysiane co najmniej 24 godziny przed obróbką nanocząsteczkami, aby upewnić się, że komórki znajdują się w odpowiednim zbiegu.</li>
	<li>Nie usuwając pożywki, dodać 3 μl roztworu nanocząstek, aby uzyskać końcowe stężenie falkarindiolu wynoszące 5 μM. Inkubować przez 24 godziny w takich samych warunkach, jak w kroku 3.1. 
	UWAGA: Przygotowanie nanocząstek przeprowadzono w dniu leczenia komórkami, aby uniknąć agregacji cząstek.</li>
	<li>Następnie, po 24 godzinach leczenia, umyj komórki 2x PBS, utrwal je w 4% formaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przechowuj w PBS w temperaturze 4°C przez okres do kilku miesięcy, aż do zobrazowania. 
	UWAGA: Należy to zrobić pod wyciągiem.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, po utrwaleniu, można przeprowadzić barwienie jądrowe 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI). W tym celu po utrwaleniu komórek należy je przepuszczać 0,1% Triton X-100 przez 30 minut, umyć je 2x PBS i zabarwić 250 μl 300 nM DAPI przez 5 minut, chroniąc przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mikroskopia
<ol>
	<li>Mikroskopia fluorescencyjna
	<ol>
		<li>Do pozyskiwania obrazów należy używać szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD zwielokrotnioną elektronami. Użyj obiektywu olejowego 150x NA 1.45 i kanału GFP LP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia konfokalna
	<ol>
		<li>Uzyskaj obrazy mikroskopii konfokalnej za pomocą obiektywu olejowego 63x NA 1.4, lasera argonowego (514 nm) dla DiI i lasera dwufotonowego (780 nm) dla DAPI, aby zweryfikować wchłanianie nanocząstek do komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Firestone, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Density+Lipoprotein+as+a+Vehicle+for+Targeting+Antitumor+Compounds+to+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 5 (2), 105-113 (1994).</li>
<li>Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolic+reprogramming+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolic reprogramming in cancer cells.</a> Oncogenesis. 5 (1), 189(2016).</li>
<li>Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+on+nanoparticle-based+drug+delivery+systems+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy.</a> Cancer Biology & Medicine. 14 (3), 228(2017).</li>
<li>Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+unexplained+hypoalbuminaemia+and+new+cancer+diagnoses+in+UK+primary+care+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Family+Practice%22%5BJournal%5D)">Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients.</a> Family Practice. 33 (5), 449-452 (2016).</li>
<li>Yue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesteryl+ester+accumulation+induced+by+PTEN+loss+and+PI3K%2FAKT+activation+underlies+human+prostate+cancer+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 393-406 (2014).</li>
<li>dos Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDL-cholesterol+signaling+induces+breast+cancer+proliferation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion.</a> Lipids in Health and Disease. 13 (16), (2014).</li>
<li>Gallagher, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+tumor+LDLR+expression+accelerates+LDL+cholesterol-mediated+breast+cancer+growth+in+mouse+models+of+hyperlipidemia+HHS+Public+Access%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access.</a> Oncogene. 36 (46), 6462-6471 (2017).</li>
<li>Needham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom+up+design+of+nanoparticles+for+anti-cancer+diapeutics%3A+%22put+the+drug+in+the+cancer%27s+food%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food".</a> Journal of Drug Targeting. 24 (9), 836-856 (2016).</li>
<li>Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cancer+chemotherapy+using+synthetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22United+States+Patent+Application+Publication%22%5BJournal%5D)">Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles.</a> United States Patent Application Publication. , Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).</li>
<li>Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+nano-LDL+with+paclitaxel+oleate+as+a+targeted+drug+delivery+vehicle+for+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme.</a> Journal of Controlled Release. 124 (3), 163-171 (2007).</li>
<li>Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+data+from+LDL+composition+and+size+measurement+are+compatible+with+a+discoid+particle+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape.</a> Journal of Lipid Research. 45 (5), 954-966 (2004).</li>
<li>Schweizer, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+niclosamide+in+combination+with+enzalutamide+in+men+with+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer.</a> PLoS ONE. 13 (8), 0202709(2018).</li>
<li>Allen, T. M., Hansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+of+stealth+versus+conventional+liposomes%3A+effect+of+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068 (2), 133-141 (1991).</li>
<li>Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Enhanced+Permeability+and+Retention+%28EPR%29+Effect+in+Tumor+Vasculature%3A+The+Key+Role+of+Tumor-Selective+Macromolecular+Drug+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Enzyme+Regulation%22%5BJournal%5D)">The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting.</a> Advances in Enzyme Regulation. 41 (1), 189-207 (2001).</li>
<li>Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Enhanced+Permeation+and+Retention+%28EPR%29+Effect%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0123461(2015).</li>
<li>Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanocarriers+Usage+for+Drug+Delivery+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Iranian+Journal+of+Psychiatry+and+Behavioral+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy.</a> Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9 (2), (2016).</li>
<li>Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+polyacetylenes%2C+falcarinol+and+falcarindiol%2C+isolated+from+carrots+prevents+the+formation+of+neoplastic+lesions+in+the+colon+of+azoxymethane-induced+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats.</a> Food & Function. 8, 964-974 (2017).</li>
<li>Hervella, P., Parra, E., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+and+retention+of+chelated-copper+inside+hydrophobic+nanoparticles%3A+Liquid+cored+nanoparticles+show+better+retention+than+a+solid+core+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).</li>
<li>Hervella, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelation%2C+formulation%2C+encapsulation%2C+retention%2C+and+in+vivo+biodistribution+of+hydrophobic+nanoparticles+labelled+with+57Co-porphyrin%3A+Octyl+Amine+ensures+stable+chelation+of+cobalt+in+Liquid+Nanoparticles+that+accumulate+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors.</a> Journal of Controlled Release. , (2018).</li>
<li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li>
<li>Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoprecipitation+of+Polymethylmethacrylate+by+Solvent+Shifting%3A1+Boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries.</a> Langmuir. 25 (4), 1970-1979 (2009).</li>
<li>Karnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Platform+for+Controlled+Synthesis+of+Polymeric+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles.</a> Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).</li>
<li>Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+for+drug+delivery%3A+The+need+for+precision+in+reporting+particle+size+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Christensen, L. P., Brandt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+polyacetylenes+in+food+plants+of+the+Apiaceae+family%3A+Occurrence%2C+bioactivity+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41 (3), 683-693 (2016).</li>
<li>Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+Effects+of+Feeding+with+Carrots+or+%28-%29+-Falcarinol+on+Development+of+Azoxymethane-Induced+Preneoplastic+Lesions+in+the+Rat+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).</li>
<li>Jin, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antitumor+natural+compound+falcarindiol+promotes+cancer+cell+death+by+inducing+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22CellDeath+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress.</a> CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).</li>
<li>Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalke%2C+P+%22University+of+Southern+Denmark+%28SDU%29%22">University of Southern Denmark (SDU)</a>. , (2018).</li>
<li>Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalke%2C+PB+%226th+International+Pharmaceutical+Federation+Pharmaceutical+Sciences+World+Congress%22">6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress</a>. , Stockholm, Sweden. (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szczegółowy protokół wytwarzania nanocząstek pokrytych lipidami do dostarczania leku za pomocą prostej, szybkiej, powtarzalnej i skalowalnej metody szybkiego wstrzykiwania przesunięcia rozpuszczalnika był przestrzegany 27,28 i przedstawiono go w niniejszej pracy w odniesieniu do falkarindiolu. Kontrolując szybkość wstrzykiwania fazy organicznej do fazy wodnej i stosując lipidy powlekające o odpowiednich stężeniach do pokrycia rdzenia falkarindiolu, można było z p...

Nanocząstki pokryte lipidami cieszą się coraz większym zainteresowaniem ze względu na ich funkcję jako systemów dostarczania leków w terapii raka1. Nowotwory mają zmienione przeprogramowanie lipidowo-metaboliczne2 i zwiększone zapotrzebowanie na proliferację cholesterolu3. Wykazują nadekspresję LDLs1 i pobierają więcej LDL niż normalne komórki, do tego stopnia, że liczba LDL u pacjenta z rakiem może nawet spaść4. Wychwyt LDL sprzyja agresywnym fenotypom5, co prowadzi do proliferacji i inwazji raka piersi6. Obfitość receptorów LDL (LDLR) jest prognostycznym wskaźnikiem potencjału przerzutowego7. Zainspirowana LDL i jego wychwytem przez komórki nowotworowe, nowa strategia została nazwana: Spraw, aby lek wyglądał jak żywność dla raka8. Tak więc te nowe projekty dostarczania leków z nanocząsteczkami8,9,10 zostały zainspirowane stabilizowaną rdzeniem i lipidami konstrukcją naturalnych LDLs11 jako mechanizm dostarczania leków przeciwnowotworowych do komórek rakowych. Ten pasywny system dostarczania celowania wspiera kapsułkowanie, zwłaszcza leków hydrofobowych, które są zwykle podawane w postaci dawki doustnej, ale dostarczają tylko niewielką ilość leków do krwiobiegu, ograniczając w ten sposób ich oczekiwaną skuteczność12. Podobnie jak w przypadku liposomów ukrytych13, powłoka z glikolu polietylenowego (PEG) pomaga zmniejszyć odpowiedź immunologiczną i rozszerza krążenie w krwiobiegu w celu optymalnego wychwytu guza dzięki rzekomemu efektowi zwiększonej przenikania i zatrzymywania (EPR)14,15. Jednak oprócz w niektórych przypadkach niestabilności krążenia i niepożądanej dystrybucji w systemie16, niektóre przeszkody pozostają nierozwiązane, takie jak to, w jaki sposób i w jakim stopniu takie nanocząstki są pobierane przez komórki i jaki jest ich los wewnątrzkomórkowy. To właśnie w tym miejscu niniejsza praca dotyczy wychwytu nanocząstek przez konkretny hydrofobowy lek przeciwnowotworowy falcarindiol, przy użyciu technik obrazowania konfokalnego i epifluorescencyjnego.
Celem badania jest wytworzenie pokrytych lipidami nanocząsteczek falkarindiolu i zbadanie ich wewnątrzkomórkowego wychwytu w hMSC. W ten sposób potencjalnie stabilizując jego podawanie, pokonując wyzwania związane z dostarczaniem i poprawiając biodostępność. W ten sposób ocenia się nowy system dostarczania tego leku przeciwnowotworowego. Wcześniej falcarindiol był podawany doustnie w postaci oczyszczonego falkarindiolu o wysokim stężeniu jako suplement diety17. Istnieje jednak potrzeba bardziej ustrukturyzowanego podejścia do dostarczania tego obiecującego leku. W związku z tym zaprojektowano nanocząstki falkarindiolu, w których otoczkowaną monowarstwą fosfolipidów i cholesterolu znajduje się oczyszczony lek stanowiący rdzeń cząstki. Metoda szybkiego wstrzykiwania rozpuszczalnika, opracowana niedawno przez Needhama i wsp.8, jest używany w tym badaniu do enkapsulacji poliacetylenu falcarindiolu.
Metoda była wcześniej stosowana do wytwarzania nanocząsteczek lipidowych do enkapsulacji środków do obrazowania diagnostycznego18,19, a także molekuły testowe (trioleina)27 i leki (orlistat, stearynian niklosamidu)8,27,28. Jest to stosunkowo prosta technika, gdy jest przeprowadzana z odpowiednimi cząsteczkami. Tworzy nanocząsteczki, na granicy ich krytycznego zarodkowania (średnica ~20 nm), wysoce nierozpuszczalnych hydrofobowych substancji rozpuszczonych w rozpuszczalniku polarnym. Wymiana rozpuszczalnika odbywa się poprzez szybkie wstrzyknięcie roztworu organicznego do nadmiaru antyrozpuszczalnika (zwykle fazy wodnej w stosunku objętości organicznej do wodnej 1:9)20,21.
Konstrukcja składu nanocząsteczek daje wiele korzyści. Komponenty DSPC:Chol zapewniają bardzo szczelną, prawie nieprzepuszczalną, biokompatybilną i biodegradowalną monowarstwę. PEG zapewnia sterycznie stabilizujący interfejs, który działa jak tarcza przed opsonizacją przez układ odpornościowy, spowalniając wchłanianie przez układ siateczkowo-śródbłonkowy (wątroba i śledziona) i chroniąc przed jednojądrzastym układem fagocytów, zapobiegając ich zatrzymywaniu i degradacji przez układ odpornościowy, a tym samym zwiększając ich półczas krążenia we krwi22. Dzięki temu cząsteczki mogą krążyć, dopóki nie wynaczynią się w chorych miejscach, takich jak guzy, gdzie układ naczyniowy jest nieszczelny, co pozwala efektowi EPR spowodować bierną akumulację cząstek. Dodatkowo, płaszcz lipidowy pozwala na lepszą kontrolę nad rozmiarem nanocząstek poprzez kinetyczne uwięzienie rdzenia w jego krytycznym wymiarze jądra27,28. Lipidy indukują różne właściwości powierzchniowe (w tym celowanie peptydowe, które nie było jeszcze dostępne w tym projekcie), czysty rdzeń leku i niską polidyspersyjność22,27,28. Metodą stosowaną do analizy wielkości cząstek jest DLS, technika, która pozwala naukowcom mierzyć wielkość dużej liczby cząstek w tym samym czasie. Jednak ta metoda może zniekształcić pomiary do większych rozmiarów, jeśli nanocząstki nie są monorozproszone23. Problem ten jest również oceniany w przypadku płaszcza lipidowego. Więcej szczegółów na temat tych podstawowych projektów i ilościowe określenie wszystkich cech znajduje się w innych publikacjach27,28.
Lek zamknięty w nanocząsteczkach to falcarindiol, dietetyczny poliacetylen występujący w roślinach z rodziny Apiaceae. Jest to metabolit wtórny z alifatycznego typu poliacetylenów C17, w którym stwierdzono działanie prozdrowotne, w tym działanie przeciwzapalne, przeciwbakteryjne i cytotoksyczność wobec szerokiego zakresu linii komórek rakowych. Jego wysoka reaktywność jest związana ze zdolnością do interakcji z różnymi biomolekułami, działając jako bardzo reaktywny środek alkilujący przeciwko grupom merkapto i aminom24. Wcześniej wykazano, że falcarindiol zmniejsza liczbę zmian nowotworowych w okrężnicy17,25, chociaż mechanizmy biologiczne są nadal nieznane. Uważa się jednak, że oddziałuje z biomolekułami, takimi jak NF-κB, COX1, COX-2 i cytokinami, hamując ich progresję guza i procesy proliferacji komórek, prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego, stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i apoptozy17,26 w komórkach rakowych. Falcarindiol jest używany w tym badaniu jako przykładowy lek przeciwnowotworowy ze względu na jego potencjał przeciwnowotworowy i mechanizm, który jest obecnie badany, a także dlatego, że wykazuje obiecujące działanie przeciwnowotworowe. Wychwyt komórkowy nanocząstek jest badany w hMSC i obrazowany za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej i konfokalnej. Ten typ komórek został wybrany ze względu na jego duży rozmiar, dzięki czemu idealnie nadają się do mikroskopii.

<table><tbody><tr><td>Fiolka z szyjką 12 ml (przezroczyste szkło, gwint 15-425, 66 x 18,5 mm)</td><td>Microlab Aarhus A/S</td><td>ML 33154LP</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>EMD Millipore (VWR)</td><td>EM8.18760.1000</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Rathburn Chemicals Ltd.</td><td>RH1009</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>Mikroskop konfokalny <td>700000P</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss LSM510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grubość szkiełek nakrywkowych #1.5</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co</td><td>117650</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>Samodzielna budowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>DLS</td><td>Beckman Coulter</td><td>DelsaMAXpro 3167-DMP</td><td></td></tr><tr><td>DSPC (zapas chloroformu)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850365C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DSPE PEG 2000 (Chloroform)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>880120C</td><td></td></tr><tr><td>eVol XR</td><td>SGE nauki analityczne, Trajan Scientific Australia Pty Ltd.</td><td>2910200</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olymous IX81</td><td></td><td>z ręcznym inkubatorem TIRF i iXon EMCCD</td></tr><tr><td></td><td>Panasonic&nbsp;</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>Pchła magnetyczna</td><td>VWR Chemicals</td><td>15 x 4,5 mm</td><td>Kształt cylindryczny z powłoką PTFE</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>IKA</td><td>RT-10</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Media</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki PBS do hodowli komórkowych</td><td>VWR Chemicals</td><td>97062-732</td><td></td></tr><tr><td>Długopis/paciorkowiec</td><td>VWR Chemicals</td><td>97063-708</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Solanka (PBS, pH 7,4)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Rotavapor, B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>R-210</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próbek&nbsp;</td><td>Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC</td><td>SBHCONC/1</td><td></td></tr></tbody></table>

wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanocząsteczki są przedmiotem zwiększonego zainteresowania systemami dostarczania leków do terapii raka. Nanocząstki pokryte lipidami są inspirowane pod względem struktury i wielkości lipoproteinami o niskiej gęstości (LDL), ponieważ komórki rakowe mają zwiększone zapotrzebowanie na proliferację cholesterolu, co zostało wykorzystane jako mechanizm dostarczania leków przeciwnowotworowych do komórek rakowych. Ponadto, w zależności od składu chemicznego leku, kapsułkowanie leku może być korzystne, aby uniknąć degradacji leku podczas krążenia in vivo. Dlatego w tym badaniu projekt ten jest wykorzystywany do wytwarzania pokrytych lipidami nanocząstek leku przeciwnowotworowego falcarindiolu, zapewniając potencjalny nowy system dostarczania falkarindiolu w celu ustabilizowania jego struktury chemicznej przed degradacją i poprawy jego wychwytu przez nowotwory. Zaprojektowano nanocząstki falkarindiolu z monowarstwą fosfolipidów i cholesterolu otaczającą oczyszczony rdzeń cząsteczki leku. Jednowarstwowa powłoka lipidowa składa się z 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DSPC), cholesterolu (Chol) i 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[metoksy(glikolu polietylenowego)-2000] (DSPE PEG 2000) wraz z fluorescencyjnym znacznikiem DiI (stosunek molowy 43:50:5:2). Nanocząstki są wytwarzane przy użyciu metody szybkiego wstrzykiwania, która jest szybką i prostą techniką wytrącania nanocząstek za pomocą dobrego rozpuszczalnika w celu wymiany antyrozpuszczalnikowej. Polega ona na szybkim wstrzyknięciu roztworu etanolu zawierającego składniki nanocząstek do fazy wodnej. Wielkość fluorescencyjnych nanocząstek mierzy się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) przy długości fali 74,1 ± 6,7 nm. Wychwyt nanocząstek jest badany w ludzkich mezenchymalnych komórkach macierzystych (hMSC) i obrazowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej. Wychwyt nanocząstek obserwuje się w hMSC, co sugeruje potencjał takiego stabilnego systemu dostarczania leku dla falkarindiolu.

Wytworzono dwa różne typy nanocząsteczek: czyste nanocząsteczki falkarindiolu oraz nanocząsteczki falkarindiolu powlekane lipidami. Przebadano różne stężenia lipidów i cholesterolu. Jak pokazano w Tabeli 1, nanocząsteczki niepowlekane, utworzone w wodzie i zmierzone w PBS, miały średnicę 71 ± 20,3 nm przy indeksie polidyspersyjności (PDI) wynoszącym 0,571. Parametry te zmierzono za pomocą analizatora DLS. Powlekane lipidami nanocząsteczki falkarindiolu wykorzystane w eksp...

Ten artykuł opisuje enkapsulację falkarindiolu w pokrytych lipidami nanocząstkach o długości fali 74 nm. Komórkowy wychwyt nanocząstek przez ludzkie komórki macierzyste do kropelek lipidów jest monitorowany za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Nanocząstki są wytwarzane metodą szybkiego wstrzykiwania rozpuszczalnika, a ich rozmiar mierzy się za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła.

Wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Wytwarzanie nanocząstek pokrytych lipidami metodą szybkiego wstrzykiwania zapewnia stabilny system dostarczania leków do terapii przeciwnowotworowej. Technika ta jest prostą, szybką, skalowalną i powtarzalną techniką wytwarzania nanocząstek, która kapsułkuje leki hydrofobowe. Technika ta ma zastosowanie do wytwarzania nanocząstek diagnostycznych i terapeutycznych z materiałów hydrofobowych, które mogą być skutecznie stosowane w kilku stanach chorobowych.Ta technika wytwarzania, wraz z DLS, może być wykorzystana do badania zarodkowania i wzrostu materiałów hydrofobowych, takich jak lipidy, białka i polimery. Znajomość właściwości fizykochemicznych substancji leczniczej ma kluczowe znaczenie przed wytworzeniem nanocząstek. Należy również pamiętać o stosowaniu odpowiednich stężeń lipidów powlekających.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla ukazania prostoty techniki wytwarzania i udanego dostarczania leku w postaci nanocząstek do komórek. Podczas pracy z chloroformem i formaldehydem należy zachować ostrożność, a praca pod wyciągiem jest wymagana. Na początek dozuj 2,4 mililitra 250 mikromolowego roztworu podstawowego falcarindiolu rozpuszczonego w 70% etanolu w fiolce scyntylacyjnej.Za pomocą koncentratora próbek odparować frakcję ciekłą przez około cztery godziny w celu uzyskania suchego falkarindiolu. Za pomocą koncentratora próbek dostarczyć gaz na próbkę w temperaturze pokojowej w celu zagęszczenia próbki. Po wysuszeniu dodaj pokazane tutaj składniki do fiolki scyntylacyjnej w dygestorium, upewniając się, że po dodaniu każdego składnika oczyściłeś strzykawkę chloroformem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.Następnie należy natychmiast zamknąć fiolki zawierające lipidy, aby rozpuszczalnik nie wyparował, a tym samym zmodyfikować stężenie. Owinąć fiolkę folią aluminiową w celu ochrony DiI przed światłem i pozostawić próbkę na noc w eksykatorze w celu odparowania chloroformu. Następnego dnia rozpuść wysuszoną próbkę w absolutnym etanolu, aby uzyskać końcową objętość 1,2 mililitra.To rozwiązanie reprezentuje fazę organiczną. Weź szklaną fiolkę o pojemności 12 mililitrów i napełnij ją dziewięcioma mililitrami oczyszczonej wody. Następnie dodaj pchłę magnetyczną do fiolki zawierającej dziewięć mililitrów wody.Umieścić fiolkę na mieszadle magnetycznym i mieszać z prędkością 500 obr./min. Następnie podłącz szklaną strzykawkę o pojemności jednego mililitra do systemu dozującego i powoli wciągaj i wyjmuj chloroform ze szklanej strzykawki co najmniej 10 razy. Za każdym razem należy dozować chloroform do pojemnika na odpady.Czyszczenie strzykawki chloroformem pomaga uniknąć zanieczyszczenia. Teraz napełnij strzykawkę etanolem. Gruntowanie zastępuje stary rozpuszczalnik, a także usuwa wszelkie pęcherzyki powietrza.Za pomocą strzykawki odessać jeden mililitr fazy organicznej i włożyć strzykawkę do szklanej fiolki do połowy dziewięciomililitrowego oznaczenia wody. Utrzymuj go stabilnie w środku fiolki i wstrzykuj roztwór z prędkością 833 mikrolitrów na sekundę, naciskając przycisk dozowania na systemie dozowania. W ten sposób powstaje 10 mikrolitrów 50 mikromolowych nanocząstek falkarindiolu pokrytych lipidami w 10% etanolu.Stwierdzono, że ta prędkość wtrysku pozwala uzyskać najdrobniejsze nanocząstki o wąskim rozkładzie wielkości cząstek. Podczas wstrzykiwania ważne jest, aby upewnić się, że igła jest włożona pośrodku, stabilnie i prosto. Natychmiast po wstrzyknięciu wyjąć fiolkę z mieszadła i przenieść próbkę do kolby okrągłodennej o pojemności 50 mililitrów.Uderzyć kolbą do wyparki obrotowej i odparować jeden mililitr rozpuszczalnika organicznego w temperaturze pokojowej. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć nadmiernego tworzenia się pęcherzyków. Przenieść zawiesinę nanocząstek z kolby do innej szklanej fiolki o pojemności 12 mililitrów.Upewnij się, że objętość wynosi dziewięć mililitrów, a następnie podziel próbkę na dwie szklane fiolki o pojemności 12 mililitrów. Następnie dodaj 0,5 mililitra ultra czystej wody do jednej z fiolek i 0,5 mililitra soli fizjologicznej 10X buforowanej fosforanem do drugiej fiolki. Włącz cyfrowy przyrząd do rozpraszania światła i ustaw żądaną temperaturę na 20 stopni Celsjusza, aż się ustabilizuje.Następnie ustaw parametry instrumentu, jak pokazano tutaj. Napełnij plastikową kuwetę jednym mililitrem zawiesiny nanocząstek i rozpocznij pomiar. Podaj zmierzoną wielkość w zależności od użytego rozpuszczalnika.Wysiewaj około 50 000 komórek na sterylnych 1,5 szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na sześciodołkowej płytce, aby uzyskać gęstość komórek około 30%Następnie dodaj pożywkę hodowlaną, aby uzyskać końcową objętość trzech mililitrów w każdym dołku. Inkubować komórki przez 24 godziny w standardowych warunkach hodowli. Następnego dnia dodaj trzy mikrolitry roztworu nanocząstek, aby uzyskać końcowe stężenie falkarindiolu wynoszące pięć mikromolowych.Następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 24 godziny. Po 24 godzinach od zabiegu umyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie utrwal je w 4% formaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu należy przepuszczać komórki 0,1% Triton X-100 przez 30 minut.Następnie umyj je dwukrotnie PBS i zabarwij 250 mikrolitrami 300 nanomolowych DAPI przez pięć minut, chroniąc przed światłem. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym za pomocą kropli PBS. Obróć się do 150x subiektywnego i przenieś szkiełko na stolik szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD zwielokrotnioną elektronami.Obrazowanie komórek za pomocą kanału GFP-LP. Dodatkowo sprawdź wchłanianie nanocząstek do komórek, wykonując obrazy mikroskopii konfokalnej za pomocą obiektywu olejowego o 63-krotnym otworze olejowym i aperturze numerycznej 1,4. Obraz DiI przy użyciu lasera argonowego o długości nanometra 514 nanometrów i DAPI przy użyciu lasera dwufotonowego o długości fali 780 nanometrów.Niepowlekane nanocząstki falkarindiolu utworzone w wodzie i mierzone w PBS wykazały wysoką polidyspersyjność, ze wskaźnikiem PD wynoszącym 0,571. Wartość ta wskazuje na szeroki i nierównomierny rozkład wielkości cząstek. W przeciwieństwie do tego, pokryte lipidami nanocząstki falcarindiolu wytworzone w tym filmie miały 74,1 nanometra ze wskaźnikiem polidyspersyjności 0,182, co wskazywało na stosunkowo monodyspersyjny i równomierny rozkład wielkości cząstek.Jako pierwszą obserwację nanocząstek wewnątrz komórek, po 24 godzinach leczenia uzyskano obrazy mikroskopii epifluorescencyjnej. Nanocząstki zostały zwizualizowane jako białe, jasne kropki i można było postawić hipotezę, że nanocząstki znajdowały się wewnątrz komórek otaczających jądro. Aby sprawdzić, czy nanocząstki falkarindiolu dostały się do komórek, przeprowadzono również mikroskopię konfokalną na komórkach.Pokazano tutaj dużą liczbę nanocząstek, rozproszonych w cytoplazmie w każdej komórce. Wyniki te pokazują, że nanocząstki działają jak stabilny system dostarczania leków dla falkarindiolu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wstrzyknąć roztwór z odpowiednią prędkością wstrzykiwania, utrzymując siew stabilnie, w środku, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.Procedura ta może być stosowana w przypadku dowolnego leku hydrofobowego w celu sformułowania terapeutycznych nanocząstek lub w przypadku środków obrazujących w celu sformułowania nanocząstek diagnostycznych, które mogą być stosowane w różnych stanach chorobowych, takich jak rak. Technika ta umożliwiła przeprowadzenie dalszych badań nad mechanizmem, za pomocą którego nanocząstki są wychwytywane przez komórki, a także nad obrazowaniem żywych komórek oraz nad badaniem przeciwnowotworowego działania leku.

uptake-new-lipid-coated-nanoparticles-containing-falcarindiol-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Celem prezentacji jest zademonstrowanie wysoce powtarzalnej metody generowania implantów komórek macierzystych związanych z macierzą w ubytkach chrząstki, które można wizualizować za pomocą obrazowania MR. Komórki macierzyste są znakowane zatwierdzonymi przez FDA ferumoksydami, mieszane z agarozą, implantowane w ubytkach chrząstki i obrazowane za pomocą skanera MR 7T.

Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

Opisujemy technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych przy użyciu zatwierdzonego przez FDA superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), ferumoksytolu (Feraheme). Ta technika obrazowania komórkowego, wykorzystująca obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) do wizualizacji, jest łatwo dostępna w celu długoterminowego monitorowania i diagnozowania pomyślnych lub nieudanych przeszczepów komórek macierzystych u pacjentów.

Znakowanie komórek macierzystych za pomocą ferumoksytolu, zatwierdzonej przez FDA nanocząsteczki tlenku żelaza

Właściwości immunomodulacyjne ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wydają się coraz bardziej istotne dla zastosowań klinicznych. Korzystając z systemu kohodowli MSC i leukocytów krwi obwodowej wstępnie wybarwionych estrem sukcynimidylu barwnika fluorescencyjnego karboksyfluoresceiny sukcynimidylu (CFSE), opisano ocenę in vitro immunomodulacji MSC na proliferację leukocytów efektorowych i określone subpopulacje.

Ocena właściwości immunomodulacyjnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC)

Ten protokół opisuje skuteczny sposób monitorowania trwałości komórek i biodystrybucji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (haMSC) poprzez znakowanie fluorescencyjne na czerwono w modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego szczura (KOA) poprzez wstrzyknięcie dostawowe (IA).

In vivo (in vivo) Śledzenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura z fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem błonowym

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Ten protokół opisuje wszystkie procedury, od hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i pobierania supernatantu po ekstrakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą ultrawirowania.

Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8

Ten protokół ma na celu przedstawienie metody produkcji i oczyszczania biomimetyków pochodzących od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) dla terapii genowej. Nanowezykul jest ograniczony MSC-pochodnymi dwuwarstwowami lipidowymi i zawiera rekombinowane AAV przenoszące gen interesujący się w świetle. Ta nanowezykul oferuje ulepszony wektor dla in vivo dostarczania genów.

Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów

Poznaj metodę szybkiego wstrzykiwania do wytwarzania nanocząstek pokrytych lipidami z falkarindiolem dla terapii przeciwnowotworowej. Technika ta umożliwia skuteczne wychwytywanie przez ludzkie komórki mezenchymalne.

Wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

Przeglądaj więcej filmów