Name: Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj protokół hybrydyzacji in situ dla zarodków Astyanax mexicanus, który umożliwia wizualizację ekspresji genów z minimalnym tłem. Metoda upraszcza złożony proces i zapewnia powtarzalność wyników w badaniach biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować członkom laboratorium Grossa za pomocne komentarze do tego manuskryptu. Pragniemy podziękować czterem uczniom szkół średnich, którzy korzystali z tego protokołu podczas letnich staży w 2017 i 2018 roku, w tym Christine Cao, Michaelowi Wardenowi, Aki Li i Davidowi Nwankwo. HL był wspierany przez UC Biology STEM Fellowship latem 2017 roku. Prace te były wspierane przez granty z National Science Foundation (DEB-1457630 dla JBG) oraz National Institutes of Dental and Craniofacial Research (NIH; DE025033 do JBG).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Cincinnati (Protokół #10-01-21-01).
1. Fiksacja
<ol>
	<li>Wyizoluj żądaną liczbę zarodków Astyanax mexicanus ze zbiornika hodowlanego i utrwal ~50 zarodków na raz. Jeśli zarodki są duże i stare, może być konieczne utrwalenie 25 na raz, aby zapewnić równomierne utrwalenie.</li>
	<li>W zależności od wieku zarodka należy zastosować metodę znieczulenia zatwierdzoną przez IACUC. W przypadku starszych zarodków z funkcjonującym układem nerwowym należy złożyć zarodki w ofierze poprzez przedawkowanie środka znieczulającego. W związku z tym umieść zarodki w roztworze ~1% tricainy (buforowanym do pH 7,4), aby zminimalizować ból i dyskomfort dla organizmu.</li>
	<li>Gdy zarodki przestaną reagować na dotyk, zastąp wodę systemową zawierającą trikainę i dodaj ~1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Usuń roztwór PBS i dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Utrwalać zarodki przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: PFA jest niebezpieczny (tj. jest łatwopalny i działa drażniąco na skórę i płuca), należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
</ol>
2. Odwodnienie
<ol>
	<li>Aby odwodnić zarodki, usuń roztwór utrwalający i spłucz 1 ml PBS. Umieścić fiolki zawierające zarodki pod kątem (od 30° do 45°) na wytrząsarce platformowej podczas płukania. Kontynuuj mycie zarodków dwukrotnie, po 5 minut na pranie.</li>
	<li>Jeśli zarodki nadal mają kosmówkę, umieść wszystkie 50 zarodków na szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 25 mm i ostrożnie odizoluj je od kosmówki za pomocą dwóch zestawów kleszczyków zegarmistrzowskich (np. kleszczy #5) pod mikroskopem. 
	UWAGA: Podczas czynności opisanych poniżej i przez pozostałą część protokołu należy ostrożnie usunąć cały płyn z poprzedniego kroku za pomocą czystych, szklanych pipet Pasteura przed dodaniem następnego roztworu</li>
	<li>Odwodnić zarodki w serii coraz bardziej skoncentrowanych płukań metanolem (MeOH) opisanych poniżej. Rozcieńczenia opierają się na całkowitej objętości 1 ml z 500 μl roztworu znajdującego się w każdej szklanej fiolce o pojemności 4 ml. Wszystkie etapy suszenia należy wykonać w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce platformowej.
	<ol>
		<li>Ostrożnie usunąć roztwór PBS. Dodać 25% roztwór MeOH (250 μL MeOH + 750 μL PBS). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut.</li>
		<li>Ostrożnie usuń 25% roztwór MeOH. Dodać 50% roztwór MeOH (500 μL MeOH + 500 μL PBS). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut.</li>
		<li>Ostrożnie usuń 50% roztwór MeOH. Dodać 75% roztwór MeOH (750 μL MeOH + 250 μL PBS). Delikatnie potrząsaj wytrząsarką platformową przez 5 minut.</li>
		<li>Ostrożnie usuń 75% roztwór MeOH. Dodać 100% roztwór MeOH (1 ml MeOH). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W tym momencie należy przechowywać odwodnione zarodki, w razie potrzeby, w szklanych fiolkach w temperaturze -20 °C (przez długi czas). Alternatywnie przejdź bezpośrednio do dnia 1 protokołu.</li>
</ol>
3. Dzień 1: Nawodnienie
<ol>
	<li>Pobrać odwodnione zarodki z zamrażarki w temperaturze -20 °C (lub przejść bezpośrednio od kroku 2.5).</li>
	<li>Posortuj zarodki za pomocą pipety Pasteura. Można sortować na podstawie morfotypu (tj. jaskini i/lub powierzchni) oraz liczby genów ocenianych w każdym eksperymencie. Zwykle nie ma więcej niż 12 zarodków w jednej fiolce po posortowaniu. Aby utrzymać porządek, użyj kolorowej taśmy laboratoryjnej, aby oznaczyć fiolki i pipety dla każdego genu. Zarodki pozostaną w tej samej fiolce przez cały czas trwania protokołu. 
	UWAGA: Umieść końcówkę pipety Pasteura w 100% EtOH, aby wysterylizować ją między użyciami.</li>
	<li>Ustawić łaźnię wodną z wytrząsaniem na temperaturę 70 °C, aby można ją było użyć w późniejszym etapie. Ostrożnie pobrać MeOH z fiolek z posortowanymi zarodkami i zastąpić 500 μl nowego 100% MeOH. Umyć krótko (~1 min) na wytrząsarce platformowej.</li>
	<li>Nawadniaj zarodki w rosnącym stężeniu 1x PBS za pomocą Tween 20 (PBT, patrz poniżej) na wytrząsarce platformowej. Rozcieńczenia oparto na końcowej objętości rozcieńczenia 1 ml z 500 μl w każdej fiolce.
	<ol>
		<li>Dodać 25% roztwór PBT (250 μl PBT, 750 μl MeOH). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut.</li>
		<li>Ostrożnie usuń 25% roztwór PBT. Dodać 50% roztwór PBT (500 μl PBT, 500 μl MeOH). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut.</li>
		<li>Ostrożnie usuń 50% roztwór PBT. Dodać 75% roztwór PBT (750 μl PBT, 250 μL MeOH). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut.</li>
		<li>Ostrożnie usuń 75% roztwór PBT. Dodaj 100% roztwór PBT (1 ml PBT). Delikatnie potrząsaj na wytrząsarce platformowej przez 5 minut. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dzień 1: Trawienie i utrwalanie
<ol>
	<li>Przygotować roztwór proteinazy K (PK), dodając 1 μl PK (20 mg/ml) do 2 ml PBT.</li>
	<li>W oczekiwaniu na kolejne kroki, należy uzyskać zamrożone porcje hybrydyzacyjnych (Hyb- i Hyb+; patrz Plik Uzupełniający 2 i Plik Uzupełniający 3) oraz PFA z przechowywania w temperaturze -20 °C.
	<ol>
		<li>Pozwól PFA rozmrozić się w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieścić porcje Hyb- i Hyb+ w obracającej się łaźni wodnej o temperaturze 70 °C. Umieść wszystkie odczynniki i fiolki w małej "uszczelce" z siatkowym dnem, wewnątrz pływającego aparatu do kąpieli wodnej. Umożliwia to łatwe dodawanie i wyjmowanie probówek i fiolek z obracającej się łaźni wodnej o temperaturze 70 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie dodać roztwór farmakokinetyczny do fiolki (fiolek) zarodków, upewniając się, że wszystkie tkanki są całkowicie pokryte roztworem. Trawić zarodki przez ~12 min w roztworze roboczym PK na platformie shaker. 
	UWAGA: Długość trawienia może być zmieniana przez badacza, aby zapewnić optymalne wyniki.</li>
	<li>Delikatnie odciągnąć roztwór farmakokinetyczny i na krótko zalać fiolkę PBT, aby rozcieńczyć pozostałą farmakokinetykę.</li>
	<li>Odciągnąć roztwór PBT i zastąpić go 500 μl nowego PBT. Pozostaw roztwór do spłukania na wytrząsarce platformy przez 5 minut.</li>
	<li>Odciągnąć PBT i zastąpić 500 μl rozmrożonego 4% PFA. Pozostawić zarodki do inkubacji przez 20 minut na wytrząsarce platformowej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odciągnąć 4% PFA i na krótko zalać fiolkę PBT, aby rozcieńczyć pozostały PFA. Odbierz PBT i zastąp go 500 μl świeżego PBT. Pozwól zarodkom płukać się przez 5 minut na wytrząsarce platformowej. Powtórz ten krok jeszcze 4 razy.</li>
</ol>
5. Dzień 1: Prehybrydyzacja
<ol>
	<li>Umieścić 500 μl wstępnie podgrzanego roztworu Hyb- do fiolki. Ostrożnie umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C (wewnątrz uszczelek), nie wstrząsając, na 5 minut.</li>
	<li>Pobrać roztwór Hyb- i zalać fiolkę 500 μl wstępnie podgrzanego roztworu Hyb+. Umieścić fiolkę z powrotem w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C z potrząsaniem (40 obr./min). Inkubować przez 4 godziny lub przez noc. 
	UWAGA: 4-godzinna inkubacja zapewni kompletny protokół in situ, który będzie trwał łącznie 4 dni. Tutaj ten krok jest przedstawiony jako inkubacja przez noc, w wyniku której powstanie protokół trwający łącznie 5 dni.</li>
</ol>
6. Dzień 2: Hybrydyzacja
<ol>
	<li>Umieścić porcję Hyb+ z zamrażarki o temperaturze -20 °C w gorącej łaźni wodnej na 5 minut.</li>
	<li>Pobrać Hyb+ z fiolki i zastąpić 500 μl wstępnie podgrzanego Hyb+. Do tego roztworu ostrożnie dodać 2 μl sondy RNA do każdej fiolki. Delikatnie zakręcić fiolką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie sondy.</li>
	<li>Roztwór Hyb+ (z dodaną sondą) inkubować w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 70 °C przez noc, wstrząsając z prędkością 40 obr. 
	UWAGA: Można ponownie użyć roztworu Hyb+ (z sondą). W tym celu należy pobrać Hyb+ z sondą z pierwszego uruchomienia z zamrażarki o temperaturze -20 °C i umieścić go w gorącej łaźni wodnej na 5 minut. Zastąp Hyb+ z protokołu dnia 1 na Hyb+ z sondą i pozostaw na noc do inkubacji w gorącej kąpieli wodnej.</li>
</ol>
7. Dzień 3: Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotuj probówki do mikrowirówek oznaczone jako Hyb+ z sondą RNA "genu zainteresowania". Przygotuj serię rozcieńczeń, które zostaną użyte w dniu 3.
	<ol>
		<li>Używając 6 oddzielnych probówek, przygotować następującą serię rozcieńczeń Hyb- i soli fizjologicznej cytrynianu sodu (SSC, 0 do 100%) w objętości 1 ml i umieścić je w łaźni wodnej wytrząsającej o temperaturze 70 °C: Probówka 1 = 100% Hyb- (1 ml Hyb-): Probówka 2 = 25% 2x SSC (250 μL 2x SSC, 750 μL Hyb-); Probówka 3 = 50% 2x SSC (500 μL 2x SSC, 500 μL Hyb-); Probówka 4 = 75% 2x SSC (750 μL 2x SSC, 250 μL Hyb-); Probówka 5 = 100% 2x SSC (1 ml 2x SSC); Probówka 6 = 100% 0,2x SSC (2 ml 0,2x SSC). 
		UWAGA: Zachowaj czujność na stężenie SSC, ponieważ zmienia się ono z 2x na 0,2x.</li>
		<li>Używając 4 oddzielnych probówek, przygotować następujące serie rozcieńczeń PBT i SSC w objętości 1 ml i umieścić w RT: Probówka 1 = 25% PBT (250 μL PBT, 750 μL 0,2x SSC); Rurka 2 = 50% PBT (500 μL PBT, 500 μL 0,2x SSC); Rurka 3 = 75% PBT (750 μL PBT, 250 μL 0,2x SSC); Probówka 4 = 100% PBT (1 ml PBT).</li>
		<li>Przygotować probówkę z 2 ml buforu kwasu maleinowego zawierającego roztwór roboczy Tween 20 (MABT).</li>
		<li>Przygotować dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml z roztworem blokującym. Do każdej probówki dodać 0,2 g odczynnika blokującego do 10 ml MABT (patrz plik uzupełniający 4). Umieść obie probówki na mieszadle nutacyjnym (lub wytrząsarce platformowej) do całkowitego rozpuszczenia w roztworze (do 3 godzin).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Dzień 3: Usunięcie sondy
<ol>
	<li>Odciągnąć roztwór Hyb+ (z sondą) szklaną pipetą Pasteura i umieścić go w sterylnej, oznakowanej probówce do mikrowirówki. Zachowaj tę probówkę w zamrażarce w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości (jeśli etykietowanie sondą się powiedzie).</li>
	<li>Ostrożnie dodać 500 μl ciepłych rozcieńczeń SSC/Hyb- (wskazanych poniżej). Inkubować w każdym z poniższych roztworów przez 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C.
	<ol>
		<li>Inkubować sekwencyjnie ze 100% Hyb- (1 ml Hyb-), 25% 2x SSC (250 μL z 2x SSC, 750 μL Hyb-), 50% 2x SSC (500 μL z 2x SSC, 500 μL Hyb-), 75% 2x SSC (750 μL z 2x SSC, 250 μL Hyb-), 100% 2x SSC (1 ml z 2x SSC), 100% 0,2x SSC (2 ml 0,2x SSC).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonując ostatni krok, inkubuj w każdym z poniższych roztworów przez 10 minut każde. W RT na wytrząsarce platformowej odbywają się wszystkie następujące inkubacje: 25% PBT (250 μL PBT, 750 μL 0,2x SSC), 50% PBT (500 μL PBT, 500 μL 0,2x SSC), 75% PBT (750 μL PBT, 250 μL 0,2x SSC), 100% PBT (1 ml PBT).</li>
	<li>Po 10 minutach inkubacji usunąć 100% PBT i dodać 500 μl MABT do każdej fiolki. Powtórz ten krok dwa razy przez 5 minut.</li>
</ol>
9. Dzień 3: Blokowanie
<ol>
	<li>Usunąć MABT z każdej fiolki i zalać wstępnie zmieszanym roztworem blokującym z jednej z probówek (przygotowanych w kroku 7.1.4). Umieścić fiolkę na mieszadle nutacyjnym na ~4 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 2 μl fragmentów Anti-DIG-AP Fab do drugiej fiolki z 10 ml roztworu blokującego (przygotowanego w kroku 7.1.4) i krótko odwirować.</li>
	<li>Napełnić każdą fiolkę prawie całkowicie roztworem blokującym (~5 ml) i umieścić na mieszalniku nutującym na noc w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
10. Dzień 4: Płukanki MABT
<ol>
	<li>Przygotować fiolkę z 10% normalną surowicą kozią (NGS) w MABT (dodać 100 μl NGS do 900 μL MABT).</li>
	<li>Pobrać roztwór blokujący z każdej fiolki i dodać 500 μl mieszaniny NGS/MABT do każdej fiolki. Pozostawić zarodki do inkubacji przez 25 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce platformowej.</li>
	<li>Zastąp mieszaninę NGS/MABT 500 μl 100% MABT. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce platformy. Wykonuj to płukanie jeszcze 11 razy w ciągu dnia co 30 minut.</li>
	<li>Napełnić fiolkę 100% MABT i umieścić na noc w mieszalniku nutującym w lodówce lub komorze typu walk-in w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
11. Dzień 5: Wizualizacja sondy
<ol>
	<li>Przygotować 50 ml porcji buforu fosfatazy alkalicznej (AP) (patrz plik uzupełniający 5). Połącz następujące elementy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml owiniętej folią aluminiową, aby ograniczyć ekspozycję na światło: 5 ml 1 M Tris (pH 9,5), 5 ml 50 mM MgCl2, 5 ml 1% Tween 20, 5 ml 1 M NaCl, 30 ml ddH2O.</li>
	<li>Usunąć MABT i zastąpić 1 ml buforu AP (probówka owinięta folią). Pozwól mu myć się przez 5 minut. Zrób to dwukrotnie, aby zapewnić całkowite usunięcie MABT.</li>
	<li>Usunąć bufor AP i zastąpić 1 ml buforu AP 3,5 μl 5-bromo-4-chloro-3'-indolilofosforanu (BCIP) i 4,5 μl nitro-niebieskiego tetrazolu (NBT). Zastępować świeżo przygotowanym buforem AP/NBT/BCIP raz na godzinę, aż do zakończenia reakcji. Uważnie monitoruj, sprawdzając co 15 minut, aby reakcja barwienia zachodziła aż do osiągnięcia pożądanego poziomu zabarwienia. Jeśli osad zacznie się tworzyć, wymień roztwór wcześniej.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję barwienia, płucząc zarodki w świeżym 100% buforze AP (bez NBT/BCIP) przez 5 minut. Kontynuuj płukanie w PBT, aż do osiągnięcia optymalnych poziomów sygnału (przy minimalnej ilości barwienia tła). Kontynuować płukanie próbek zwiększającymi się rozcieńczeniami PBT w buforze AP w następujący sposób: 25% PBT (250 μl PBT, 750 μl buforu AP), płukać przez 5 minut; 50% PBT (500 μL PBT, 500 μL AP Buffer), płukać przez 5 min; 75% PBT (750 μL PBT, 250 μL buforu AP), płukać przez 5 min.</li>
	<li>Opłucz zarodki w ~5 ml 100% PBT na mieszadle nutującym, aż do osiągnięcia pożądanego minimalnego zabarwienia tła. Kilkakrotnie zamień na świeży PBT. Może to potrwać do kilku dni.</li>
	<li>Po zakończeniu płukania umyj zarodki w 500 μl sterylnego PBS na wytrząsarce platformowej. Wykonaj to płukanie dwukrotnie przez 5 minut. Po umyciu PBS należy utrwalić próbki w 500 μl 4% PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce platformowej. Alternatywnie, utrwalić przez noc w 1 ml 4% PFA w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zastąp utrwalacz świeżym, sterylnym PBS. Wykonaj to płukanie co najmniej dwa razy przez 5 minut. Umieść zarodki w ~4 ml w 100% sterylnego PBS i przechowuj przez długi czas w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
12. Obrazowanie
<ol>
	<li>Uzupełnić płytkę obrazową na szalce Petriego, używając 3% agarozy i buforu TAE. 
	UWAGA: Ilości zależą od tego, ile talerzy jest potrzebnych. Talerze mogą być wielokrotnie używane. Zaleca się, aby płytka prostokątna forma została umieszczona na szalce Petriego podczas stygnięcia żelu w celu stworzenia wgłębienia do przechowywania zarodków na szalce.</li>
	<li>Umieścić zarodki na płytce w PBS. 
	UWAGA: Najlepiej jest delikatnie wysypywać zarodki na płytkę zamiast je pipetować, ponieważ stwierdzono, że przyklejają się do wnętrza plastikowych pipet.</li>
	<li>Użyj mikroskopii świetlnej, aby uwidocznić każdy zarodek. Użyj sondy, aby manewrować zarodkami do pożądanej pozycji.</li>
	<li>Zrób zdjęcie, gdy zarodek znajdzie się w pożądanej pozycji. Należy pamiętać, że ważne jest, aby zrobić zdjęcia zarodków w ciągu kilku tygodni od zakończenia barwienia, aby uniknąć potencjalnej degradacji plamy.</li>
</ol>

<ol><li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%3A+Application+to+neurobiology%22">In situ hybridization: Application to neurobiology</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1987).</li>
<li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li>
<li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cranial+patterning+in+the+direct%E2%80%90developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li>
<li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li>
<li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li>
<li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060(2017).</li>
<li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B1-chemokine%2C+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2C+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li>
<li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+%28Adcyap1%29+and+its+receptor+subtypes+%28Adcyap1r1%2C+Adcyap1r2%2C+and+Adcyap1r3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li>
<li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li>
<li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li>
<li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809(2007).</li>
<li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764(2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na podatność RNA na degradację, jednym z najbardziej krytycznych etapów protokołu jest sterylna synteza sondy RNA. Jeśli jednak sonda zostanie starannie wygenerowana i zapewni dobre wyniki, może być ponownie wykorzystana w kolejnych reakcjach barwienia. Drugim kluczowym krokiem jest staranna produkcja wszystkich odczynników używanych w całym protokole. Ponieważ protokół ten obejmuje kilka dni i wiele małych kroków, ważne jest, aby wszystkie odczynniki były dokładnie produkowane i przechowywane w sterylny sposó...

Hybrydyzacja in situ jest powszechną metodą barwienia utrwalonych tkanek w celu wizualizacji wzorców ekspresji genów1. Technika ta jest stosowana od lat w innych tradycyjnych systemach modelowych 2 i nietradycyjnych3, dla różnych badań biologicznych. Jednak do pomyślnego wykonania tej procedury konieczne jest wykonanie kilku kroków i odczynników. Dla badaczy, którzy nigdy nie stosowali tej techniki, zainicjowanie procesu może być onieśmielające ze względu na wiele związanych z nim kroków. Co więcej, długotrwały charakter tej procedury sprzyja błędom technicznym, które mogą być trudne do rozwiązania. 
Ogólnym celem tego artykułu jest przedstawienie prostej i nieskomplikowanej metody, która sprawi, że ta technika hybrydyzacji stanie się dostępna dla szerokiego grona odbiorców. Aby ograniczyć wprowadzanie błędów, prezentujemy proste podejście, które zapewnia wysokiej jakości barwienie ekspresji genów i minimalizuje niespecyficzny sygnał tła. Procedura ta jest podobna do innych podejść opracowanych w tradycyjnych systemach modelowych, takich jak Danio rerio4. W tym przypadku staramy się ułatwić staranne wdrożenie każdego kroku za pomocą listy kontrolnej do pobrania (Plik Uzupełniający 1), aby promować staranne wdrożenie protokołu. Uzasadnieniem takiego postępowania jest ułatwienie organizacji przez wiele etapów związanych z tą procedurą. Ten artykuł jest odpowiedni dla badaczy zainteresowanych przeprowadzeniem pełnej hybrydyzacji in situ w rozwijających się zarodkach, ale jeszcze nie wykonali tej procedury. Zaletą wybranego podejścia dla badaczy Astyanax jest to, że zostało ono przetestowane i sprawdzone zarówno na rybach jaskiniowych, jak i powierzchniowych, co ułatwia porównawcze analizy ekspresji. Przedstawiona metoda może być wykorzystana przez badaczy w badaniach nad Astyanaxem i innymi systemami.

<table><tbody><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>VWR</td><td>89130-888</td><td></td></tr><tr><td>1000 ml Jednostka filtracyjna</td><td>VWR</td><td>89220-698</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Pipeta</td> serologiczna <td>VWR-Greiner</td><td>82050-278</td><td></td></tr><tr><td>25 ml</td><td>VWR</td><td>89130-890</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Jednostka filtrująca</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 5 ml</td><td>VWR</td><td>89130-886</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowy</td><td>VWR-Falcon</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Jednostka filtracyjna</td><td>VWR</td><td>89220-696</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Digoxigenin-AP, fragmenty Fab</td><td>Sigma-Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8503-1G</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Roztwór blokujący</td><td>Sigma-Roche</td><td>11 096 176 001</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A104-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Zestaw do etykietowania DIG RNA (SP6/T7)</td><td>Sigma-Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>probówki Eppendorf</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher-Decon</td><td>04-355-223</td><td>1 Gal</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Szklane fiolki do depilacji</td><td>VWR</td><td>66011-041</td> 1 Pipety <td>szklane Dr</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td><td>284000ACS</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu krystaliczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Sigma</td><td>M0375-100g</td><td>100g</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>4L</td></tr><tr><td>Woda molekularna (bez RNaz)</td><td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>granulki NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Podłoże NBT w proszku</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34035</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Mikser nutujący</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127-500g</td><td>500 g</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>20L</td></tr><tr><td>Proteinaza K (200mg/10ml)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Pipety plastikowe</td><td>VWR-SAMCO</td><td>14670-147</td><td></td></tr><tr><td>RNAzywa</td><td>Sigma</td><td>R2020-250mL</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna z wytrząsaniem 12 l</td><td>VWR</td><td>10128-126</td><td>12 L</td></tr><tr><td>Standardowa wytrząsarka analogowa</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Millipore-OmniPur</td><td>9210-500GM</td><td>500 g</td></tr><tr><td>tRNA Drożdże</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>15401011</td><td>25 mg</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50mL</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek litu (LiCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203637-10G</td><td>10 g</td></tr></tbody></table>

wholemount hybrydyzacja in situ dla zarodków astyanax

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

W ostatnich latach opublikowano szkic genomu ślepej meksykańskiej ryby jaskiniowej (Astyanax mexicanus), ujawniający tożsamość sekwencji tysięcy genów. Wcześniejsze badania nad tym wyłaniającym się systemem modelowym opierały się na kompleksowych badaniach całego genomu, które zidentyfikowały liczne loci cech ilościowych (QTL) związane z różnymi fenotypami związanymi z jaskiniami. Jednak zdolność do łączenia genów będących przedmiotem zainteresowania z dziedziczną podstawą zmian fenotypowych pozostaje poważnym wyzwaniem. Jedną z technik, która może ułatwić głębsze zrozumienie roli rozwoju w ewolucji troglomorficznej, jest hybrydyzacja in situ w całości wierzchowanej. Technika ta może być wykorzystana do bezpośredniego porównania ekspresji genów między formami jaskiniowymi i powierzchniowymi, nominacji genów kandydujących leżących u podstaw ustalonego QTL, identyfikacji genów będących przedmiotem zainteresowania na podstawie badań sekwencjonowania nowej generacji lub opracowania innych podejść opartych na odkryciach. W niniejszym raporcie przedstawiamy prosty protokół, wsparty elastyczną listą kontrolną, który może być szeroko zaadaptowany do użytku znacznie wykraczającego poza prezentowany system badania. Mamy nadzieję, że ten protokół może służyć jako szerokie źródło informacji dla społeczności Astyanax i nie tylko.

W niniejszym raporcie przedstawiamy prostą i bezpośrednią metodę znakowania embrionów Astyanax w celu przeprowadzenia wysokiej jakości analizy ekspresji genów. Technikę tę można zrealizować w ciągu czterech lub pięciu dni, a każdy główny etap procedury został przedstawiony na schemacie z kodowaniem kolorystycznym (Rysunek 1). Po zakończeniu procesu zabarwione embriony powinny wykazywać ciemnofioletowy znak chromatyczny w tkankach wykazujących ekspres...

Ten protokół umożliwia wizualizację ekspresji genów u embrionalnych ryb jaskiniowych Astyanax. Podejście to zostało opracowane w celu maksymalizacji sygnału ekspresji genów, przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego barwienia tła.

Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Nasz protokół in situ jest istotny, ponieważ zapewnia prosty sposób wizualizacji wzorców ekspresji genów przy minimalnym barwieniu tła. Ta technika sprawia, że skomplikowany i długotrwały protokół jest stosunkowo łatwy do wykonania. Sugestie dotyczące konfiguracji na stole laboratoryjnym i listy kontrolne sprawiają, że ten protokół jest jeszcze łatwiejszy do prawidłowego wykonania i odtworzenia.Chociaż przedstawione tutaj techniki są specyficzne dla Astyanax mexicanus, prawdopodobnie można je dostosować do innych systemów osób o porównywalnych rozmiarach z niewielkimi zmianami w protokole. Po pierwsze, użyj kolorowej taśmy laboratoryjnej, aby oznaczyć fiolki i pipety dla każdego genu. Za pomocą pipety Pasteura posortuj zarodki.Zwykle nie ma więcej niż 12 zarodków w jednej fiolce, po posortowaniu. Następnie ustaw wytrząsającą kąpiel wodną na 70 stopni Celsjusza. Ostrożnie wyciągnij metanol z fiolek posortowanych zarodków i zastąp go 500 mikrolitrami świeżego 100% metanolu.Myj zarodki krótko przez około minutę na wytrząsarce platformowej. Następnie należy ponownie nawodnić zarodki w rosnącym stężeniu 1x PBS za pomocą Tween 20 na wytrząsarce platformowej, jak opisano w protokole tekstowym. Na początek umieść małą uszczelkę z siatkowym dnem w obrotowej łaźni wodnej, która została podgrzana do 70 stopni Celsjusza.Umieść porcje buforu hybrydyzacyjnego minus i buforu hybrydyzacyjnego plus w uszczelce. Delikatnie dodać przygotowany roztwór farmakokinetyczny do fiolek z zarodkami, upewniając się, że wszystkie tkanki są całkowicie pokryte roztworem. Przenieść fiolki do wytrząsarki platformowej i pozwolić im trawić się w roztworze roboczym proteinazy K przez około 12 minut.Następnie delikatnie odciągnąć roztwór farmakokinetyczny i na krótko zalać fiolkę PBT, aby rozcieńczyć pozostałą farmakokinetykę. Zastąp roztwór PBT 500 mikrolitrami świeżego PBT i pozwól roztworowi spłukiwać się na wytrząsarce platformy przez pięć minut. Następnie zastąp roztwór PBT 500 mikrolitrami rozmrożonego 4% PFA. Pozwól zarodkom inkubować na platformie wytrząsającej w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Aby rozpocząć wstępną hybrydyzację, dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego minus roztwór do fiolek zawierających zarodki. Ostrożnie umieścić fiolki w uszczelce w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza, nie wstrząsając przez pięć minut. Następnie odciągnąć roztwór buforu hybrydyzacyjnego minus i zalać fiolki 500 mikrolitrami wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego plus roztworu.Umieścić fiolki z powrotem w uszczelce w łaźni wodnej i inkubować, wstrząsając przez cztery godziny lub przez noc. Aby rozpocząć hybrydyzację, należy wyciągnąć bufor hybrydyzacyjny plus z fiolek i zastąpić go 500 mikrolitrami świeżego, wstępnie podgrzanego bufora hybrydyzacyjnego plus. Ostrożnie dodaj dwa mikrolitry sondy RNA do każdej fiolki i delikatnie obracaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie sondy.Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez noc, wstrząsając z prędkością 40 obr./min. Na początek przygotuj probówki do mikrowirówek oznaczone buforem hybrydyzacyjnym plus sondą RNA interesującego genu, jak opisano w protokole tekstowym. Ustaw dwie 15-mililitrowe stożkowe probówki i dodaj 0,2 grama odczynnika blokującego i 10 mililitrów MABT.Umieścić obie probówki na mieszadle nutującym, aż odczynnik całkowicie rozpuści się w roztworze. Za pomocą szklanej pipety Pasteura odbierz bufor hybrydyzacyjny i roztwór sondy i umieść go w sterylnie oznakowanej probówce do mikrowirówki. Przechowuj tę probówkę w zamrażarce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.Ostrożnie dodać 500 mikrolitrów ciepłego roztworu soli fizjologicznej, cytrynianu sodu i buforu hybrydyzacyjnego minus rozcieńczenia. Inkubować w sekwencyjnych roztworach przez 10 minut w łaźni wodnej wytrząsającej, a następnie w temperaturze pokojowej na wytrząsarce platformowej, jak opisano w protokole tekstowym. Po ostatniej inkubacji zastąp 100% PBT z każdej fiolki 500 mikrolitrami MABT.Powtórz ten proces dwa razy przez pięć minut każdy. Najpierw wyjmij MABT z każdej fiolki i zalej ją wstępnie zmieszanym roztworem blokującym z jednej z 15-mililitrowych stożkowych probówek. Umieścić obie fiolki w mieszalniku nutującym na cztery godziny w temperaturze pokojowej.Dodać dwa mikrolitry fragmentów przeciwciała do drugiej probówki przygotowanego roztworu blokującego i krótko odwirować. Następnie napełnij każdą fiolkę prawie całkowicie roztworem blokującym i umieść je na noc w mikserze nutującym w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na początek przygotuj fiolkę z 10% NGS w MABT.Zastąp roztwór blokujący w każdej fiolce 500 mikrolitrami tego roztworu NGS. Inkubować w temperaturze pokojowej na platformie wiertniczej przez 25 minut. Następnie zastąp mieszaninę NGS 500 mikrolitrami 100% MABT.Inkubować na wytrząsarce platformowej w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powtórz to płukanie jeszcze 11 razy w ciągu dnia, co 30 minut. Następnie napełnij każdą fiolkę 100% MABT i umieść je na noc w mikserze nutującym w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Najpierw zastąp MABT w każdej fiolce jednym mililitrem buforu AP i pozwól mu myć przez pięć minut. Powtórz to pranie dwukrotnie, aby całkowicie usunąć MABT. Następnie zastąp bufor AP jednym mililitrem świeżego bufora AP zawierającego 3,5 mikrolitra BCIP i 4,5 mikrolitra MBT.Zastąp to świeżą mieszaniną buforu AP zawierającego BCIP i MBT co godzinę, aż do zakończenia reakcji, upewniając się, że ściśle monitorujesz reakcję i sprawdzaj co 15 minut, aż do osiągnięcia pożądanego poziomu zabarwienia. Zatrzymaj reakcję barwienia, przepłukując zarodki w rosnącym stężeniu 1X PBT w buforze AP, jak opisano w protokole. Opłucz zarodki w około pięciu mililitrach 100% PBT na mieszadle nutującym, aż do osiągnięcia pożądanego minimalnego zabarwienia tła.Po zakończeniu płukania umyj zarodki w 500 mikrolitrach sterylnego PBS na wytrząsarce platformowej i utrwal próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po wypłukaniu zarodków umieść je w czterech mililitrach w 100% sterylnego PBS i w razie potrzeby przechowuj je przez długi czas w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W tym badaniu embrionalne próbki Astyanax są znakowane w celu przeprowadzenia wysokiej jakości analizy ekspresji genów.Proces ten został z powodzeniem wdrożony zarówno w przypadku ryb jaskiniowych Pakon, jak i zarodków ryb powierzchniowych. Zarodki ryb jaskiniowych oznaczone pod kątem ekspresji Sox9 wykazują wyraźne oznakowanie w rozwijających się łukach skrzelowych i płetwie piersiowej. Należy zauważyć, że barwienie jest praktycznie nieobecne w woreczku żółtkowym lub rozwijających się somitach na boku.Podobnie, ekspresja Tfap2a jest widoczna w częściach rozwijającej się głowy jako wczesna migracja komórek grzebienia nerwowego wzdłuż grzbietowego obszaru bocznego zarodka. Trzeci gen prezentowany dla zarodków ryb jaskiniowych, Phf20a, jest widoczny w częściach mezodermy somatycznej i tylnej głowy, które są przeznaczone do powstania tkanki kostnej. Powierzchniowe zarodki ryb znakowane jako CXCR wykazują dodatnie oznakowanie w izolowanych obszarach głowy i boku, a także w kilku pojedynczych komórkach pokrywających woreczek żółtkowy.Gen Adcyap1a ulega ekspresji w regionach ośrodkowego układu nerwowego, w tym w komórkach przysadki mózgowej. Zwróć uwagę na wysoce specyficzną ekspresję w sparowanych obustronnych skupiskach komórek na grzbietowej stronie zarodka, a także na większy obszar ekspresji w linii środkowej. Ostatni gen badany pod kątem zarodków ryb jaskiniowych, Sox10, jest widoczny jako wczesny marker grzebienia nerwowego po lewej i prawej stronie zarodka grzbietowego.Po zakończeniu in situ zazwyczaj obrazujemy nasze wyniki za pomocą mikroskopii świetlnej. Najlepiej zrobić to w ciągu dwóch tygodni po zakończeniu, aby uniknąć degradacji plam.

wholemount-in-situ-hybridization-for-astyanax-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

W niniejszym filmie zaprezentowano immunohistochemię w preparatach całych (whole mount immunohistochemistry), czyli metodę pozwalającą na wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji antygenu w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Jane Dodd i Toma Jessella.

Metoda barwienia przeciwciałami całych preparatów u kurczaka

Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Łącząc metody hybrydyzacji in situ i histologii całego RNA, ekspresja genów może być powiązana z decyzjami dotyczącymi losu komórki w rozwijającym się zarodku.  Metody te zostały dostosowane do morskich zwierząt spodoustych i ułatwiają wykorzystanie tych zwierząt jako organizmów modelowych do badań biomedycznych, toksykologicznych i porównawczych.

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Zarodek Xenopus laevis nadal jest wyjątkowo przydatny w badaniach nad wczesnym rozwojem, ze względu na jego duży rozmiar i łatwość manipulacji.   Przewidziano uproszczony protokół hybrydyzacji całego montażu in situ, który można wykorzystać do identyfikacji określonych narządów w tym modelowym systemie.

Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Węzeł i płytka struny grzbietowej są przejściowymi organizatorami sygnalizacji w rozwoju mysich embrionów, które można wizualizować za pomocą kilku technik. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wykonać dwie techniki badania ich struktury i morfogenezy: 1) skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM); i 2) immunofluorescencja całej góry (WMIF).

Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

Prezentowany tutaj jest protokół do analizy hybrydyzacji RNA in situ u ryb danio pręgowanych oraz testu tworzenia probówek w indukowanych pluripotencjalnych komórkach śródbłonka pochodzących od pacjenta w celu zbadania roli endoglinu w tworzeniu naczyń krwionośnych.

Hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w iPSC-EC w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym

Poznaj protokół hybrydyzacji in situ dla zarodków Astyanax mexicanus, który umożliwia wizualizację ekspresji genów z minimalnym tłem. Metoda upraszcza złożony proces i zapewnia powtarzalność wyników w badaniach biologii rozwoju.

Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax

Przeglądaj więcej filmów