Name: Wysokoprzepustowe przesiewanie sideroforów z próbek środowiskowych: tkanek roślinnych, gleb masowych i gleb ryzosferowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego przesiewania sideroforów w próbkach glebowych i roślinnych. Ta technika umożliwia szybką ocenę aktywności mikroorganizmów w cyklu żelaza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Kalyani Muhunthan za pomoc w procedurach laboratoryjnych, Lee Opdahlowi za zbiór genotypów pszenicy, Washington State Concord Grape Research Council, oraz Washington State University Center for Sustaining Agriculture and Natural Resources za grant BIOAg na wsparcie tej pracy. Dodatkowe fundusze zostały zapewnione przez USDA/NIFA za pośrednictwem projektu Hatch 1014527.

UWAGA: Lokalizacja terenu: Uniwersytet Stanowy w Waszyngtonie, Farma Patologii Roślin (46°46'38.0"N 117°04'57.4"W). Nasiona wysiano za pomocą sadzarki mechanicznej 19 października 2017 r. Każdy genotyp pszenicy został posadzony w rzędach, w odległości około 1 metra od siebie, aby uniknąć nakładania się systemu korzeniowego. Próbki roślin i gleby pobrano 9 sierpnia 2018 r., kiedy rośliny były gotowe do zbioru. Próbki pobrano z trzech powtórzeń czterech genotypów pszenicy: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
1. Przygotowanie zmodyfikowanego podłoża M9
<ol>
	<li>Do przygotowania roztworu soli M9 należy użyć odczynników Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) i NH4Cl (1 g/20 mL).</li>
	<li>Użyć 18 g MgSO4∙7H2O w 100 ml podwójnie dejonizowanej wody (ddH2O) do przygotowania 0,75 M MgSO4∙7H2O.</li>
	<li>Zrobić 1 M CaCl2∙2H2O, dodając 14,7 g CaCl2∙2H2O ze 100 ml ddH2O.</li>
	<li>Przygotować roztwór buforowy, rozpuszczając 6,048 g RUR w 156 ml ddH2O, mieszając. Doprowadzić pH do 6,8 za pomocą 5 M NaOH.</li>
	<li>Przygotować 20% glukozy (jednowodnej dekstrozy) rozpuszczając 20 g glukozy w 100 ml ddH2O.</li>
	<li>Przygotuj roztwory i indywidualnie autoklawuj wszystko oprócz glukozy. Filtrować, sterylizować roztwór glukozy w celu dodania do pożywki M9 po autoklawowaniu (0,22 μm).</li>
	<li>Przygotować zmodyfikowaną pożywkę M9, mieszając 156 ml roztworu buforowego PIPES, 40 ml roztworu soli M9, 20 μl roztworu CaCl2·2H2O, 266 μL MgSO4·7H2O i 4 ml 20% roztworów glukozy razem w komorze bezpieczeństwa biologicznego, stosując technikę sterylną.</li>
	<li>W celu zakonserwowania zmodyfikowanego M9 należy zamknąć pojemnik, przykryć folią aluminiową w celu ochrony przed promieniowaniem UV i umieścić w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża CAS-Fe-Agar
<ol>
	<li>Umyj kwasem wszystkie naczynia szklane w 100 mM HCl/100 mM HNO3 przez co najmniej 2 godziny przed użyciem w teście CAS.</li>
	<li>Przygotuj aluminiową formę do pieczenia wypełnioną piaskiem laboratoryjnym i przykryj ją folią aluminiową. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 30 minut i odstawić.</li>
	<li>Przygotować HDTMA (bromek heksadecylotrimetyloamoniowy) dodając 0,0365 g do 20 mlddH2O i umieścić roztwór w temperaturze 37 °C w celu ułatwienia rozpuszczania.</li>
	<li>Przygotować 10 mM HCl i wytworzyć 1 mM FeCl3·6H2O, używając 10 mM HCl jako rozpuszczalnika. Dodaj 0,0302 g CAS do 25 ml ddH2O, delikatnie mieszając sterylnym mieszadłem magnetycznym. Następnie dodać 5 ml 1 mM FeCl3·6H2O (w 10 mM HCl) do 25 ml roztworu CAS, kontynuując delikatne mieszanie (roztwór zmienia kolor na ciemnoczerwonawo-).</li>
	<li>Powoli dodawać 20 ml roztworu HDTMA, delikatnie mieszając, do roztworu Fe-CAS (w ten sposób powstaje ciemnoniebieski roztwór).</li>
	<li>Przygotować roztwór buforowy, rozpuszczając 15,12 g RUR w 375 ml ddH2O, delikatnie mieszając. Doprowadzić pH do 6,8 za pomocą 5 M NaOH. Dodaj wodę, aby zwiększyć objętość do 450 ml. Do roztworu dodać 5 g agarozy. Roztwór buforowy PIPES i roztwór CAS-Fe należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 min.</li>
	<li>Ostrożnie dodać całość roztworu CAS-Fe do całości buforu PIPES w komorze bezpieczeństwa biologicznego po autoklawowaniu każdego z nich.</li>
	<li>Umieścić zmieszany roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C. 
	UWAGA: Świeżo przygotuj wszystkie odczynniki w pożywce CAS-Fe-Agar przed każdym testem, ponieważ długotrwałe przechowywanie w temperaturze 50 °C powoduje wytrącanie się kompleksu CAS-Fe, a chłodzenie powoduje zestaloną pożywkę.</li>
	<li>Umieścić sterylną łódeczkę z odczynnikiem w sterylnym piasku w komorze bezpieczeństwa biologicznego i podgrzać do 50 °C. Przenieść CAS-Fe-Agar do łodzi, a następnie szybko poddzielić 100 μl do każdej studzienki w przezroczystej, płaskodennej, sterylnej 96-dołkowej mikropłytce.</li>
</ol>
3. Przygotowanie wzorca pioverdyny/EDTA
<ol>
	<li>Preparat z pioverdyny
	<ol>
		<li>Przygotować 800 μM wzorca pioverdyny (mieszanina kwasu bursztynowego, 2-hydroksyglutaramidu i formy sukcynamindy pioverdyny – patrz Tabela Materiałów), w uprzednio przygotowanym zmodyfikowanym podłożu M9.</li>
		<li>Rozcieńczyć ten roztwór do roztworów 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 i 6,25 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wzorca EDTA
	<ol>
		<li>Dodać 0,594 g disodowego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA: C10H14N2Na2O8,2H 2O) do 500 ml uprzednio przygotowanej zmodyfikowanej pożywki M9 w celu przygotowania wzorca 3200 μM EDTA.</li>
		<li>Rozcieńczyć ten roztwór do roztworów 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 i 6,25 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie krzywej standardowej
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl każdego stężenia pioverdyny i EDTA do oddzielnych studzienek 96-dołkowej mikropłytki zawierającej 100 μl pożywki agarowej CAS-Fe. Wykonaj zduplikowane replikacje techniczne każdego stężenia. Dodaj również puste studzienki z samym M9 (bez EDTA lub pioverdyny).</li>
		<li>Za pomocą czytnika mikropłytek zmierzyć absorbancję (przy 420 nm i 665 nm) po 1, 6 i 24 godzinach inkubacji w temperaturze 22 °C, a następnie użyć pomiarów absorbancji do wygenerowania krzywych wzorcowych. 
		UWAGA: W przypadku pomiarów 420 nm należy odjąć absorbancję ślepych prób od absorbancji studzienek zawierających pioverdynę lub EDTA. Dla długości fali 665 nm odjąć absorbancję studzienek zawierających pioverdynę lub EDTA od absorbancji ślepych prób. Następnie log10 (μM pioverdyna lub EDTA) jest regresji w stosunku do pomiarów absorbancji. Aby ułatwić interpretację wyników próbki, należy użyć absorbancji jako osi x i logarytmu10 (μM pyoverdine lub EDTA) jako osi y.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek środowiskowych: gleby i tkanek roślinnych
<ol>
	<li>Umyć sprzęt do pobierania próbek (łopaty i nożyczki) filtremddH2O o o grubości 0,22 μm, a następnie 70% etanolem, a następnie przetrzeć ręcznikiem papierowym przed pobraniem próbek i między próbkami, aby zachować sterylną technikę i zmniejszyć zanieczyszczenie krzyżowe.</li>
	<li>Usuń tkanki roślinne (ziarna i pędy) z roślin na polu i umieść je w oznakowanej plastikowej torbie do przechowywania, pozostawiając wystarczającą ilość ścierniska, aby ułatwić wyrwanie pożądanych próbek gleby i korzeni.</li>
	<li>Wykop małą bryłę korzeniową o głębokości około 15 cm i szerokości 23 cm i umieść ją w oddzielnej, oznakowanej plastikowej torbie w celu przygotowania próbki w środowisku laboratoryjnym. Ten krok jest podobny do metod McPhersona i wsp.27.</li>
	<li>Umieścić wszystkie próbki (ziarna, pędy, glebę luzem i bryły korzeniowe w oddzielnych workach) bezpośrednio na lodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia próbek do oznaczenia produkcji sideroforu.</li>
	<li>Oddziel próbki gleby związane z korzeniami na masową, luźno związaną glebę ryzosferową i ściśle związaną glebę ryzosferową.
	<ol>
		<li>Wyjmij bryły korzeniowe z worków. Delikatnie strząśnij ziemię z bryły korzeniowej. Strząśnięta ziemia wraz z ziemią pozostałą w worku tworzy ziemię "luzem".</li>
		<li>Użyj gumowego młotka, aby dodatkowo usunąć ziemię z bryły korzeniowej. Jest to luźno związana gleba ryzosferowa.</li>
		<li>Wygeneruj ściśle związaną glebę ryzosferyczną, zapuszczając korzenie ze ściśle związaną próbką i umieszczając je w probówce wirówkowej. Dodaj 30 ml ddH2O i mieszaj przez 2-3 minuty. Usuń korzenie, aby uzyskać ściśle związane rozcieńczenie gnojowicy glebowej ryzosfery.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie kultur wzbogacających siderofory i test produkcji syderoforu CAS-Fe
UWAGA: Wszystkie naczynia szklane powinny być umyte kwasem przed rozpoczęciem testów.
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki gleby (dla każdego z trzech rodzajów próbek gleby)
	<ol>
		<li>Homogenizować każdą próbkę gleby w worku na próbki, mieszając i obracając glebę tak bardzo, jak to możliwe, bez otwierania worka. 
		UWAGA: Pomaga to zmniejszyć naturalną zmienność przestrzenną gleby i jest zgodne z normalnymi procedurami pobierania próbek gleby. Inne metody mogą być stosowane do homogenizacji próbek środowiskowych, w zależności od potrzeb i w zależności od projektu eksperymentalnego.</li>
		<li>Po dokładnym wymieszaniu każdej próbki, podwielokrotność i zawiesić 2,0 g każdej gleby w 20 ml zmodyfikowanej pożywki M9, a następnie rozcieńczyć 10-3 do całkowitej objętości 20 ml w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml ze sterylną zatyczką piankową, aby umożliwić napowietrzenie.</li>
		<li>W przypadku ściśle związanych próbek ryzosfery dodać 2 ml zawiesiny glebowej ryzosfery do 20 ml zmodyfikowanej pożywki M9, a następnie rozcieńczyć 10-3 do całkowitej objętości 20 ml w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml ze sterylną zatyczką piankową, aby umożliwić napowietrzenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki tkanki (korzeń, pęd i ziarno)
	<ol>
		<li>Powierzchnię wysterylizuj próbkę 70% etanolem. Macerować 2,0 g świeżej tkanki w 20 ml zmodyfikowanego podłoża M9 za pomocą blendera na wysokich obrotach przez 30 sekund. Przenieść próbkę do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie rozcieńczyć 10-3 do całkowitej objętości 20 ml w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml ze sterylną zatyczką piankową, aby umożliwić napowietrzenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbogacenie produkcji syderoforu poprzez ograniczenie Fe
	<ol>
		<li>Inkubować probówki wirówkowe o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej i wstrząsać z prędkością 160 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Testy agarowe CAS-Fe do wykrywania produkcji sideroforów w próbkach środowiskowych
<ol>
	<li>Po 24, 48 i 72 godzinach od rozpoczęcia hodowli wzbogacającej należy usunąć 1 ml podpróbek z probówek wzbogacających przy użyciu sterylnej techniki i odwirować przy 10 000 x g przez 1 minutę w probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml w celu granulacji komórek.</li>
	<li>Zebrać oddzielony supernatant. Stosując technikę sterylną, dodać 100 μl supernatantu do 100 μl roztworu CAS-Fe-Agar w dwóch lub trzech powtórzeniach na mikropłytce. Dodać również 100 μl sterylnej pożywki M9 (jako ślepe próby). Następnie inkubować płytkę w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Zawiesić pozostały sklarat i osad dla każdej próbki (nie dodawany do płytki do mikromiareczkowania) we własnej, sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Dodać 400 μl sterylnego glicerolu do każdej probówki z supernatantem i ponownie zawiesić osad, aby utworzyć zapas glicerolu. Zamrozić materiał w temperaturze -80 °C do późniejszych analiz. 
	UWAGA: Ten krok można zmodyfikować w celu wygenerowania zapasów glicerolu zgodnie z dowolnym preferowanym protokołem wewnętrznym.</li>
	<li>Zmierz absorbancję po 6, 24, 48 i 72 godzinach, przy długości fali 420 nm.</li>
	<li>Użyj krzywych wzorcowych wygenerowanych z pioverdyny lub EDTA, aby zinterpretować pomiary absorbancji próbki pod względem ekwiwalentów pioverdyny. 
	UWAGA: Pioverdyna została uznana za wyższy standard w porównaniu z EDTA (vide infra), więc EDTA nie została użyta do interpretacji wyników w obecnym badaniu.</li>
</ol>

<ol><li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li>
<li>Hider, R. C., Kong, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of siderophores.</a> Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).</li>
<li>Saha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+siderophores+and+their+potential+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">Microbial siderophores and their potential applications: a review.</a> Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).</li>
<li>Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+rhizobacteria+%28PGPR%29%3A+emergence+in+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology%2C+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture.</a> World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).</li>
<li>Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetics%2C+Siderophore+Production%2C+and+Iron+Scavenging+Potential+of+Root+Zone+Soil+Bacteria+Isolated+from+%27Concord%27+Grape+Vineyards%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards.</a> Microbial Ecology. , Accepted (2018).</li>
<li>Li, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opportunistic+human+fungal+pathogen+Candida+albicans+promotes+the+growth+and+proliferation+of+commensal+Escherichia+coli+through+an+iron-responsive+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway.</a> Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).</li>
<li>Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity%2C+Abundance%2C+and+Localization+of+Quorum+Sensing+Receptors+in+Vibrio+harveyi%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li>
<li>O'Brien, S., Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+multispecies+social+interactions+in+shaping+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenicity+in+the+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Fems+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung.</a> Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).</li>
<li>Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cheating+on+Cheaters+Stabilizes+Cooperation+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Current Biology. 28 (13), (2018).</li>
<li>Popat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+modification+via+a+quorum+sensing+molecule+influences+the+social+landscape+of+siderophore+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).</li>
<li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li>
<li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago%5BTitle%5D)+AND+%22Aerobiologia%22%5BJournal%5D)">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li>
<li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li>
<li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-CAS%2C+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li>
<li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li>
<li>Wang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diisonitrile+Natural+Product+SF2768+Functions+As+a+Chalkophore+That+Mediates+Copper+Acquisition+in+Streptomyces+thioluteus%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus.</a> Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).</li>
<li>Retamal-Morales, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+arsenic-binding+siderophores+in+arsenic-tolerating+Actinobacteria+by+a+modified+CAS+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).</li>
<li>Desai, A., Archana, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDesai%2C+A+%22Role+of+Siderophores+in+Crop+Improvement%22">Role of Siderophores in Crop Improvement</a>. , (2011).</li>
<li>Dertz, E. A., Raymond, K. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDertz%2C+EA+%22Comprehensive+coordination+chemistry+II%22">Comprehensive coordination chemistry II</a>. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).</li>
<li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7, 9(2017).</li>
<li>Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+plant+and+rhizospheric+microbiota+as+stable+interactomes%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes.</a> Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).</li>
<li>Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+transcriptome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+exposed+to+beneficial+Bacillus+subtilis+FB17+rhizobacteria+revealed+genes+for+bacterial+recruitment+and+plant+defense+independent+of+malate+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux.</a> Planta. 238 (4), 657-668 (2013).</li>
<li>Sasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wheat+gene+encoding+an+aluminum-activated+malate+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.</a> The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).</li>
<li>Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+Structure%2C+Species+Variation%2C+and+Potential+Functions+of+Rhizosphere-Associated+Bacteria+of+Different+Winter+Wheat+%28Triticum+aestivum%29+Cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).</li>
<li>Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li>
<li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil%2C+Rhizosphere%2C+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932(2018).</li>
<li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li>
<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+from+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podstawowym rezultatem tych prac jest opracowanie nowej metodologii, która może być wykorzystana do szybkiego wzbogacenia mikroorganizmów wytwarzających siderofory przy jednoczesnym ilościowym pomiarze produkcji/aktywności sideroforów w próbce środowiskowej. Metodologia jest szybka, prosta i opłacalna, a wyniki pokazują, w jaki sposób można ją wykorzystać do wykrywania aktywności sideroforów w złożonych i nowych typach próbek (np. glebie i tkance roślinnej). Protokół prowadzi również do produkcji zapasów glicero...

Siderophores są ważnymi biomolekułami zaangażowanymi głównie w chelatację żelaza dla biodostępności, ale z szerokim wachlarzem dodatkowych celów w ekosystemach lądowych i wodnych, począwszy od mikrobiologicznego wykrywania kworum, sygnalizacji do mikrobiologicznych gospodarzy roślin, promowania wzrostu roślin, współpracy i konkurencji w złożonych społecznościach mikroorganizmów1,2. Siderofory można ogólnie sklasyfikować ze względu na ich miejsca aktywne i cechy strukturalne, tworząc cztery podstawowe typy: karboksylany, hydroksylat, katecholan i typy mieszane3,4. Wiele mikroorganizmów jest zdolnych do wydalania więcej niż jednego rodzaju sideroforu5, a w złożonych społecznościach zdecydowana większość organizmów biosyntetyzuje receptory błonowe, aby umożliwić wychwyt jeszcze szerszej gamy sideroforów1,6. Ostatnie prace wskazują, że siderofory są szczególnie ważne na poziomie społeczności, a nawet w komunikacji między królestwami i transferach biogeochemicznych7,8,9,10,11.
Sulfonian azurolu chromu (CAS) jest używany od ponad 30 lat jako czynnik chelatujący do wiązania żelaza (Fe) w taki sposób, że dodanie ligandów (tj. sideroforów) może spowodować dysocjację kompleksu CAS-Fe, tworząc łatwą do zidentyfikowania zmianę koloru w medium12. Gdy CAS jest związany z Fe, barwnik pojawia się jako królewski niebieski kolor, a gdy kompleks CAS-Fe dysocjuje, podłoże zmienia kolor w zależności od rodzaju liganda użytego do oczyszczania klasy Fe13. Początkowe, płynne podłoże założone przez Schwyna i Neilandsa w 1987 roku, zostało zmodyfikowane na wiele sposobów, aby dostosować się do zmieniających się celów mikrobiologicznych14, nawyki i ograniczenia wzrostu15, a także różne metale oprócz Fe, w tym aluminium, mangan, kobalt, kadm, nikiel, lit,16, copper17, a nawet arsenic18.
Wiele ludzkich patogenów, jak również mikroorganizmy wspomagające wzrost roślin (PGPM) zostały zidentyfikowane jako organizmy wytwarzające siderofory3,19,20, a ważne ryzosfery i endofityczne PGPM często mają pozytywny wynik testu na produkcję sideroforu4. Tradycyjna metoda płynna na bazie żelaza została zaadaptowana do badania mikromiareczkowego izolatów w uprawie do produkcji sideroforów21. Jednak techniki te nie uwzględniają znaczenia społeczności mikrobiologicznej jako całości (mikrobiomu) we współpracy i potencjalnej regulacji produkcji sideroforów w glebach i systemach roślinnych22. Z tego powodu opracowaliśmy wysokoprzepustową ocenę produkcji sideroforów z danego środowiska na poziomie społeczności, opartą na tradycyjnym teście CAS, ale z replikacją, łatwością pomiaru, wiarygodnością i powtarzalnością w teście mikropłytkowym.
W tym badaniu przedstawiono opłacalny, wysokoprzepustowy test CAS-Fe do wykrywania produkcji sideroforów, aby ocenić wzbogacenie produkcji sideroforów z złożonych próbek (np. homogenatów gleby i tkanki roślinnej). Masywną, luźno związaną i ściśle związaną glebę ryzosferową (pod względem sposobu wiązania gleby z korzeniem) uzyskano wraz z tkankami ziarna, pędów i korzeni z czterech różnych genotypów pszenicy (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725 i PI561727. Postawiono hipotezę, że fundamentalne różnice w genotypach pszenicy mogą skutkować różnicami w rekrutacji i selekcji społeczności produkujących siderofory. Szczególnie interesująca jest różnica między zbiorowiskami drobnoustrojów związanymi z linią izogeniczną PI561725, która jest tolerancyjna na aluminium, ponieważ posiada ALMT1 (Aluminium-activated Malate Transporter 1), w porównaniu z linią wrażliwą na aluminium PI561727 izogeniczną, która posiada niereagującą na aluminium formę genu, almt123,24,25,26. Głównym celem badań było opracowanie prostej, szybkiej metody ilościowej oceny produkcji sideroforów w kulturach wzbogacających siderofory o złożonych typach próbek, przy jednoczesnym zachowaniu kultur do przyszłych prac.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Apex</td><td>LF451320014</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa forma</td><td></td><td></td><td></td>do pieczenia</tr><tr><td>Folia aluminiowa Chlorek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amonu, granulowany</td> Autoklaw i sterylizator <td>Fiesher Scientific</td><td>152315A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Fiesher Scientific</td><td>171428</td><td></td></tr><tr><td>CAS (Chrome Azurol S)</td> <td>Chem-Impex Int'l Inc)</td> <td>000331-27168</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat dekstrozy (glukoza), krystaliczny proszek</td><td>Fiesher Scientific</td><td>1521754</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sól disodowa, dwuwodzian, Crystal</td><td>J.T.Baker</td><td>JI2476</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol, bezwodny</td><td>Baker Analizowany</td><td>C22634</td><td></td></tr><tr><td>HDTMA (Cetyltrimetyloamoniak Odczynnik bromkowy</td><td>World</td><td>FZ0941</td><td></td></tr><tr><td>Kwas chlorowodorkowy</td><td>ACROS Organic</td><td>B0756767</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO czytnik płytek</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek żelaza (III), 99%</td> <td>ACROS Organiczny</td><td>A0342179</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjny dygestoria</td><td>Inkubator laboratoryjny Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fiesher Scientific</td><td>27855</td><td></td></tr><tr><td>Kwas azotowy, (69-70)%</td><td>J.T.Baker</td><td>72287</td><td></td></tr><tr><td>Bufor PIPES, 98,5%</td> <td>ACROS Organiczny</td><td>A0338723</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, dibaisc, proszek</td><td>J.T.Baker</td><td>J48594</td><td></td></tr><tr><td>Pioverdyna</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>078M4094V</td><td></td></tr><tr><td>Piasek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SI-600R Shaker</td><td>Lab Companion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, granulowany</td><td>Fiesher Scientific</td><td>136539</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, granulki</td><td>J.T.Baker</td><td>G48K53</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu, dwuzasadowy siedmiowodny, 99%</td><td>ACROS Organiczny</td><td>A0371705</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe przesiewanie sideroforów z próbek środowiskowych: tkanek roślinnych, gleb masowych i gleb ryzosferowych

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderofory (związki chelatujące metale o niskiej masie cząsteczkowej) są ważne w różnych zjawiskach ekologicznych, począwszy od biogeochemicznego obiegu żelaza (Fe) w glebach, a skończywszy na konkurencji patogenów, promowaniu wzrostu roślin i sygnalizacji między królestwami. Ponadto siderofory mają również znaczenie komercyjne w bioługowaniu i biowietrzeniu minerałów i rud zawierających metale. Szybki, opłacalny i solidny sposób ilościowej oceny produkcji sideroforów w złożonych próbkach jest kluczem do identyfikacji ważnych aspektów ekologicznych konsekwencji aktywności sideroforów, w tym nowych mikroorganizmów wytwarzających siderofory. Przedstawiona metoda została opracowana w celu oceny aktywności sideroforów w zbiorowiskach mikrobiomu w takcie, w próbkach środowiskowych, takich jak gleba lub tkanki roślinne. Próbki homogenizowano i rozcieńczano w zmodyfikowanym podłożu M9 (bez Fe), a kultury wzbogacające inkubowano przez 3 dni. Produkcję sideroforu oceniano w próbkach po 24, 48 i 72 godzinach (h) przy użyciu nowatorskiego 96-dołkowego testu agarowego CAS (sulfonian azurolu chromu) z mikropłytkami, będącego adaptacją tradycyjnie żmudnej i czasochłonnej metody kolorymetrycznej oceny aktywności sideroforów, przeprowadzanej na poszczególnych hodowanych izolatach drobnoustrojów. Zastosowaliśmy naszą metodę do 4 różnych genotypów/linii pszenicy (Triticum aestivum L.), w tym Lewjain, Madsen i PI561725, i PI561727 powszechnie uprawianych na północno-zachodnim wybrzeżu Pacyfiku. Na produkcję sideroforów wyraźny wpływ miał genotyp pszenicy, a także obserwowane specyficzne typy tkanek roślinnych. Z powodzeniem wykorzystaliśmy naszą metodę do szybkiego badania przesiewowego pod kątem wpływu genotypu roślin na produkcję sideroforów, która pełni kluczową funkcję w ekosystemach lądowych i wodnych. Wyprodukowaliśmy wiele powtórzeń technicznych, które pozwoliły uzyskać bardzo wiarygodne różnice statystyczne w glebach i tkankach roślinnych. Co ważne, wyniki pokazują, że proponowana metoda może być wykorzystana do szybkiego zbadania produkcji sideroforów w złożonych próbkach z wysokim stopniem wiarygodności, w sposób, który pozwoli na zachowanie społeczności do późniejszych prac nad identyfikacją taksonów i funkcjonalnych genów.

Mieszanina piowerdyny biosyntetyzowana przez Pseudomonas fluorescens została wykorzystana jako standard do interpretacji i ilościowego oznaczenia absorbancji (przy 420 nm) próbek w przeliczeniu na równoważniki piowerdyny w µM. Rysunek 1 przedstawia zależność między absorbancją (420 nm) a stężeniem początkowym piowerdyny (Log10 moliarność w µM). EDTA nie zapewnił odpowiedniego standardu, ponieważ próbki wykazywały wyższe pomiary absorbancji...

Przedstawiamy protokół szybkiego badania próbek środowiskowych pod kątem potencjału sideroforu, przyczyniającego się do biodostępności i obrotu mikroelementów w systemach lądowych.

Wysokoprzepustowe przesiewanie sideroforów z próbek środowiskowych: tkanek roślinnych, gleb masowych i gleb ryzosferowych

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Siderofory to biomolekuły chelatujące metale o niskiej masie cząsteczkowej biorące udział w obiegu żelaza w środowisku. Protokół ten pozwala na szybką, wysokoprzepustową ocenę aktywności sideroforów w próbkach glebowych i roślinnych. Dotychczasowe metody wykrywania sideroforów eliminowały kluczowe środowisko, w jakim znajduje się społeczność drobnoustrojów.Nasza technika pozwala na wykrycie w obrębie stosunkowo nienaruszonej społeczności mikrobiologicznej i siedliska, w którym się ona znalazła. Ponieważ dostępność żelaza ma kluczowe znaczenie dla wydajności rolnictwa, w tym protokole można go wykorzystać do zbadania roli drobnoustrojów w modulowaniu dostępności żelaza dla roślin. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do oceny wpływu praktyk zarządzania gospodarstwem na zdrowie gleby i społeczności produkujące siderofory, a także rozwój takich społeczności w czasie.Na początek umyj kwasem wszystkie szklane naczynia w 100-milimolowym kwasie solnym 100 milimolowym kwasie azotowym przez co najmniej dwie godziny przed użyciem w teście CAS. Przygotuj aluminiową formę do pieczenia wypełnioną piaskiem laboratoryjnym i przykryj ją folią aluminiową. Autoklaw w temperaturze 121 stopni Celsjusza na 30 minut i odstawić.Przygotuj HDTMA, dodając 0365 gramów do 20 mililitrów podwójnie dejonizowanej wody i umieść roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ułatwić rozpuszczanie. Dodaj 0302 gramy CAS do 25 mililitrów podwójnie dejonizowanej wody, delikatnie mieszając sterylnym mieszadłem magnetycznym. Następnie dodaj pięć mililitrów jednego molowego sześciowodnego chlorku żelaza do 25 mililitrów roztworu CAS, kontynuując delikatne mieszanie.Teraz powoli dodaj 20 mililitrów roztworu HDTMA do roztworu kompleksu żelaza CAS, delikatnie mieszając. Przygotuj roztwór buforowy, rozpuszczając 15,12 grama RUR w 375 mililitrach podwójnie dejonizowanej wody, delikatnie mieszając. Dostosuj pH do 6,8 za pomocą pięciomolowego wodorotlenku sodu.Następnie dodaj wodę, aby zwiększyć objętość do 450 mililitrów. Teraz dodaj pięć gramów agarozy do roztworu. Roztwór buforowy PIPES i złożony roztwór żelaza CAS należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 30 minut.Ostrożnie dodać całość złożonego roztworu żelaza CAS do całości buforu PIPES w komorze bezpieczeństwa biologicznego po autoklawie każdego z nich. Umieść zmieszany roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza. Teraz umieść sterylną łódeczkę z odczynnikiem w sterylnym piasku w komorze bezpieczeństwa biologicznego i podgrzej do 50 stopni Celsjusza.Przenieś agar z kompleksem żelaza CAS na łódź, a następnie szybko podwielokrotn 100 mikrolitrów do każdej studzienki przezroczystej, płaskodennej, sterylnej 96-dołkowej mikropłytki. Przygotować 800-mikromolowy wzorzec pioverdyny we wcześniej przygotowanym zmodyfikowanym podłożu M9. Rozcieńczyć roztwór w roztworach 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 i 6,25 mikromolowych.Dodaj EDTA do 500 mililitrów wcześniej przygotowanej zmodyfikowanej pożywki M9, aby przygotować 3,2-milimolowy wzorzec EDTA. Rozcieńczyć ten roztwór do roztworów o objętości 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 i 6,25 mikromolowych. Aby wygenerować krzywą wzorcową, dodaj 100 mikrolitrów każdego stężenia pioverdyny i EDTA do oddzielnych studzienek 96-dołkowej mikropłytki zawierającej 100 mikrolitrów pożywki agarowej z kompleksem żelaza CAS.Wykonaj zduplikowane replikacje techniczne każdego stężenia. Dodaj także puste studzienki z tylko M9. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz absorbancję po jednej, sześciu i 24 godzinach inkubacji w temperaturze 22 stopni Celsjusza i użyj pomiarów absorbancji do wygenerowania krzywych wzorcowych. Umyj sprzęt do pobierania próbek podwójnie dejonizowaną wodą z filtrem 22 mikronów, a następnie 70% etanolem i wytrzyj ręcznikami papierowymi.Płukanie należy wykonać przed pobraniem próbki oraz pomiędzy próbkami, aby zachować sterylność techniki i ograniczyć zanieczyszczenie krzyżowe. Po wycięciu tkanek roślinnych i wykopaniu małej bryły korzeniowej z roślin na polu, umieść bryłę korzeniową w osobnej oznakowanej plastikowej torbie w celu oddzielenia próbki w środowisku laboratoryjnym. Umieścić wszystkie próbki bezpośrednio na lodzie i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przetworzenia próbek do testu produkcji sideroforu.Oddziel próbki gleby związane z korzeniami na masową, luźno związaną glebę ryzosferową i ściśle związaną glebę ryzosferową. W tym celu wyjmij bryły korzeniowe z worków i delikatnie strząśnij ziemię z bryły korzeniowej. Strząśnięta gleba wraz z ziemią pozostałą w worku składa się na glebę luzem.Jest to luźno związana gleba ryzosferowa. Wygeneruj ściśle związaną glebę ryzopferową, zapuszczając korzenie ze ściśle związaną próbką i umieszczając je w probówce wirówkowej. Dodaj 30 mililitrów podwójnie dejonizowanej wody i wiruj przez dwie do trzech minut.Usuń korzenie, aby uzyskać ściśle związane rozcieńczenie gnojowicy glebowej ryzosfery. Homogenizować każdą próbkę gleby w worku na próbki, mieszając i obracając glebę tak bardzo, jak to możliwe, bez otwierania worka. Po dokładnym wymieszaniu każdej próbki, podwielokrotność i zawiesić dwa gramy każdej próbki gleby w 20 mililitrach zmodyfikowanej pożywki M9 w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.Rozcieńczyć próbkę, a następnie zamknąć probówkę sterylną zatyczką piankową, aby umożliwić napowietrzenie. W przypadku ściśle związanych próbek ryzosfery dodaj dwa mililitry zawiesiny glebowej ryzosfery do 20 mililitrów zmodyfikowanej pożywki M9 w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Rozcieńczyć próbkę, a następnie zamknąć probówkę sterylną zatyczką piankową, aby umożliwić napowietrzenie.Aby przygotować próbkę tkanki, wysterylizuj powierzchniowo korzeń, pęd i ziarno 70% etanolem. Maceruj dwa gramy świeżej tkanki w 20 mililitrach zmodyfikowanego podłoża M9 za pomocą blendera na wysokich obrotach przez 30 sekund. Następnie przenieś próbkę do sterylnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej, rozcieńcz i zamknij probówkę sterylną zatyczką piankową.Aby wzbogacić produkcję sideroforu poprzez ograniczenie żelaza, inkubuj 50-mililitrowe probówki wirówkowe w temperaturze pokojowej i wstrząsaj z prędkością 160 obr./min. Po 24, 48 i 72 godzinach od rozpoczęcia hodowli wzbogacającej należy usunąć jedną mililitrową podpróbki z probówek wzbogacających przy użyciu sterylnej techniki. Odwirować podpróbki w temperaturze 10 000 razy G przez jedną minutę w dwumililitrowych probówkach wirówkowych w celu granulacji komórek.Stosując technikę sterylną, dodać 100 mikrolitrów supernatantu do 100 mikrolitrowego roztworu agaru z kompleksem żelaza CAS w dwóch lub trzech powtórzeniach na mikropłytce. Dodaj również 100 mikrolitrów sterylnej pożywki M9 jako ślepe próby. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza.Każda płytka powinna być szczelnie zamknięta i przykryta folią przed umieszczeniem w inkubatorze. Zawiesić pozostały supernatant i osad dla każdej próbki we własnej sterylnej dwumililitrowej probówce wirówkowej. Dodaj 400 mikrolitrów sterylnego glicerolu do każdej probówki sklarowanej nad osadem i ponownie zawiesić osad, aby utworzyć zapasy glicerolu.Zamroź bulion w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszej analizy. Zmierz absorbancję po sześciu, 24, 48 i 72 godzinach przy długości fali 420 nanometrów. Mieszaninę pioverdyny biosyntetyzowaną przez Pseudomonas fluorescens wykorzystano jako wzorzec do interpretacji i ilościowego określenia absorbancji próbek w próbkach równoważności pioverdyny w mikromolach.Zależność między absorbancją przy 420 nanometrach a początkowym stężeniem pioverdyny pokazano tutaj. Aktywność sideroforu po 72-godzinnym wzbogaceniu oceniano po 48 godzinach inkubacji w celu określenia wpływu genotypu i rodzaju próbki na izolację sideroforu. Aktywność sideroforów w masowych próbkach gleby była stosunkowo niska i nie wykazywała różnic między genotypem pszenicy, z którego pobrano próbki gleby luzem.Jednak wzbogacenie luźno związanej gleby wyizolowanej z genotypu 725 wykazało większą produkcję sideroforu w porównaniu z luźno związaną glebą z Madsen i 727, ale nie z Lewjain. I odwrotnie, produkcja sideroforów w wzbogaceniach z ciasno związanej gleby nie miała dużego wpływu na genotyp. Wzbogacanie tkanki zbożowej dawało stosunkowo niską produkcję sideroforu niezależnie od genotypu.Wzbogacenie tkanki pędów Lewjain miało znacznie niższą produkcję sideroforów niż inne genotypy, a 725 kultur tkankowych pędów skutkowało bardziej zmienną produkcją sideroforów. Największą różnicę w aktywności sideroforów zaobserwowano w kulturach wzbogacających tkankę korzeniową, gdzie 725 miało ponad 200% większą aktywność sideroforów niż wszystkie inne genotypy. Jednym z najbardziej obciążających aspektów realizacji protokołu jest utrzymanie warunków aseptycznych podczas wykonywania wielu kroków w celu wygenerowania mikropłytki z agarem żelaznym CAS i testowania próbek pod kątem aktywności sideroforu.Szeroki wachlarz technik chromatograficznych opartych na kulturach lub DNA może być zastosowany zarówno do rzeczywistej studzienki mikromiareczkowej, jak i do kultury zakonserwowanej glicerolem w celu dalszych testów biochemicznych lub charakterystyki genetycznej i modelowania metabolicznego. Korzystając z tego protokołu, aktywność sideroforów może być później powiązana z konkretnymi organizmami odpowiedzialnymi za tę aktywność lub następnie ukierunkowana jako mechanizm większych skutków ekologicznych. Protokół ten można łatwo zmodyfikować w celu oceny produkcji sideroforów w kulturach wzbogacających wygenerowanych z próbek pobranych z innych elementów środowiska, w tym powietrza, wody i osadów.

high-throughput-siderophore-screening-from-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Test bioreporterowy całej komórki z Burkholderia sartisoli RP037-mChe został opracowany do wykrywania frakcji zanieczyszczenia organicznego (tj. fluoru) dostępnego do degradacji bakteryjnej po aktywnym transporcie przez grzybnię wypełniającą pory wypełnione powietrzem w systemie modelowym nienasyconym wodą.

Podejście bioreporterowe oparte na całej komórce do oceny transportu i biodostępności zanieczyszczeń organicznych w systemach nienasyconych wodą

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Testy interakcji międzykulturowych przedstawione w tym protokole są niedrogie, mają wysoką przepustowość i są proste. Testy te można wykorzystać do obserwacji interakcji mikrobiologicznych w kokulturze, identyfikacji wzorców interakcji i scharakteryzowania potencjału hamującego badanego szczepu drobnoustrojów przeciwko patogenom ludzkim i środowiskowym.

Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

Ten protokół przedstawia przepływ pracy dla sub-mm wizualizacji 2D wielu labilnych nieorganicznych składników odżywczych i zanieczyszczeń rozpuszczonych za pomocą gradientów dyfuzyjnych w cienkich warstwach (DGT) w połączeniu z obrazowaniem spektrometrii mas. Pobieranie próbek substancji rozpuszczonych i analiza chemiczna o wysokiej rozdzielczości są szczegółowo opisane w celu ilościowego mapowania substancji rozpuszczonych w ryzosferze roślin lądowych.

Dwuwymiarowa wizualizacja i kwantyfikacja labilnych, nieorganicznych składników odżywczych roślin i zanieczyszczeń w glebie

Tutaj prezentujemy protokół badania różnorodności biologicznej gleby w poszukiwaniu szczepów grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów. Najpierw izoluje się szczepy grzybów, które mogą rosnąć na kwasach humusowych lub lignocelulozie. Ich aktywność jest następnie testowana zarówno w testach enzymatycznych, jak i na zanieczyszczeniach, takich jak węglowodory i tworzywa sztuczne.

Izolacja i badania przesiewowe pod kątem różnorodności biologicznej gleby pod kątem grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów

Izolacja odpornych na metale ciężkie mikroorganizmów ze źródeł geotermalnych jest gorącym tematem dla rozwoju biosystemów bioremediacji i monitorowania środowiska. Badanie to zapewnia metodologiczne podejście do izolowania i identyfikacji bakterii tolerujących metale ciężkie z gorących źródeł.

Bioprospekcja mikroorganizmów ekstremofilnych w celu rozwiązania problemu zanieczyszczenia środowiska

Ten protokół dostarcza zarówno jakościowych, jak i ilościowych analiz całkowitej liczby sideroforów, pioverdyny i pyocheliny z Pseudomonas aeruginosa.

Analiza jakościowa i ilościowa produkcji sideroforów z Pseudomonas aeruginosa

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj metodę wysokoprzepustowego przesiewania sideroforów w próbkach glebowych i roślinnych. Ta technika umożliwia szybką ocenę aktywności mikroorganizmów w cyklu żelaza.

Wysokoprzepustowe przesiewanie sideroforów z próbek środowiskowych: tkanek roślinnych, gleb masowych i gleb ryzosferowych

Przeglądaj więcej filmów