Wysokoprzepustowe przesiewanie sideroforów z próbek środowiskowych: tkanek roślinnych, gleb masowych i gleb ryzosferowych

Siderofory to biomolekuły chelatujące metale o niskiej masie cząsteczkowej biorące udział w obiegu żelaza w środowisku. Protokół ten pozwala na szybką, wysokoprzepustową ocenę aktywności sideroforów w próbkach glebowych i roślinnych. Dotychczasowe metody wykrywania sideroforów eliminowały kluczowe środowisko, w jakim znajduje się społeczność drobnoustrojów.

Nasza technika pozwala na wykrycie w obrębie stosunkowo nienaruszonej społeczności mikrobiologicznej i siedliska, w którym się ona znalazła. Ponieważ dostępność żelaza ma kluczowe znaczenie dla wydajności rolnictwa, w tym protokole można go wykorzystać do zbadania roli drobnoustrojów w modulowaniu dostępności żelaza dla roślin. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do oceny wpływu praktyk zarządzania gospodarstwem na zdrowie gleby i społeczności produkujące siderofory, a także rozwój takich społeczności w czasie.

Na początek umyj kwasem wszystkie szklane naczynia w 100-milimolowym kwasie solnym 100 milimolowym kwasie azotowym przez co najmniej dwie godziny przed użyciem w teście CAS. Przygotuj aluminiową formę do pieczenia wypełnioną piaskiem laboratoryjnym i przykryj ją folią aluminiową. Autoklaw w temperaturze 121 stopni Celsjusza na 30 minut i odstawić.

Przygotuj HDTMA, dodając 0365 gramów do 20 mililitrów podwójnie dejonizowanej wody i umieść roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ułatwić rozpuszczanie. Dodaj 0302 gramy CAS do 25 mililitrów podwójnie dejonizowanej wody, delikatnie mieszając sterylnym mieszadłem magnetycznym. Następnie dodaj pięć mililitrów jednego molowego sześciowodnego chlorku żelaza do 25 mililitrów roztworu CAS, kontynuując delikatne mieszanie.

Teraz powoli dodaj 20 mililitrów roztworu HDTMA do roztworu kompleksu żelaza CAS, delikatnie mieszając. Przygotuj roztwór buforowy, rozpuszczając 15,12 grama RUR w 375 mililitrach podwójnie dejonizowanej wody, delikatnie mieszając. Dostosuj pH do 6,8 za pomocą pięciomolowego wodorotlenku sodu.

Następnie dodaj wodę, aby zwiększyć objętość do 450 mililitrów. Teraz dodaj pięć gramów agarozy do roztworu. Roztwór buforowy PIPES i złożony roztwór żelaza CAS należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Ostrożnie dodać całość złożonego roztworu żelaza CAS do całości buforu PIPES w komorze bezpieczeństwa biologicznego po autoklawie każdego z nich. Umieść zmieszany roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza. Teraz umieść sterylną łódeczkę z odczynnikiem w sterylnym piasku w komorze bezpieczeństwa biologicznego i podgrzej do 50 stopni Celsjusza.

Przenieś agar z kompleksem żelaza CAS na łódź, a następnie szybko podwielokrotn 100 mikrolitrów do każdej studzienki przezroczystej, płaskodennej, sterylnej 96-dołkowej mikropłytki. Przygotować 800-mikromolowy wzorzec pioverdyny we wcześniej przygotowanym zmodyfikowanym podłożu M9. Rozcieńczyć roztwór w roztworach 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 i 6,25 mikromolowych.

Dodaj EDTA do 500 mililitrów wcześniej przygotowanej zmodyfikowanej pożywki M9, aby przygotować 3,2-milimolowy wzorzec EDTA. Rozcieńczyć ten roztwór do roztworów o objętości 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 i 6,25 mikromolowych. Aby wygenerować krzywą wzorcową, dodaj 100 mikrolitrów każdego stężenia pioverdyny i EDTA do oddzielnych studzienek 96-dołkowej mikropłytki zawierającej 100 mikrolitrów pożywki agarowej z kompleksem żelaza CAS.

Wykonaj zduplikowane replikacje techniczne każdego stężenia. Dodaj także puste studzienki z tylko M9. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz absorbancję po jednej, sześciu i 24 godzinach inkubacji w temperaturze 22 stopni Celsjusza i użyj pomiarów absorbancji do wygenerowania krzywych wzorcowych. Umyj sprzęt do pobierania próbek podwójnie dejonizowaną wodą z filtrem 22 mikronów, a następnie 70% etanolem i wytrzyj ręcznikami papierowymi.

Płukanie należy wykonać przed pobraniem próbki oraz pomiędzy próbkami, aby zachować sterylność techniki i ograniczyć zanieczyszczenie krzyżowe. Po wycięciu tkanek roślinnych i wykopaniu małej bryły korzeniowej z roślin na polu, umieść bryłę korzeniową w osobnej oznakowanej plastikowej torbie w celu oddzielenia próbki w środowisku laboratoryjnym. Umieścić wszystkie próbki bezpośrednio na lodzie i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przetworzenia próbek do testu produkcji sideroforu.

Oddziel próbki gleby związane z korzeniami na masową, luźno związaną glebę ryzosferową i ściśle związaną glebę ryzosferową. W tym celu wyjmij bryły korzeniowe z worków i delikatnie strząśnij ziemię z bryły korzeniowej. Strząśnięta gleba wraz z ziemią pozostałą w worku składa się na glebę luzem.

Jest to luźno związana gleba ryzosferowa. Wygeneruj ściśle związaną glebę ryzopferową, zapuszczając korzenie ze ściśle związaną próbką i umieszczając je w probówce wirówkowej. Dodaj 30 mililitrów podwójnie dejonizowanej wody i wiruj przez dwie do trzech minut.

Usuń korzenie, aby uzyskać ściśle związane rozcieńczenie gnojowicy glebowej ryzosfery. Homogenizować każdą próbkę gleby w worku na próbki, mieszając i obracając glebę tak bardzo, jak to możliwe, bez otwierania worka. Po dokładnym wymieszaniu każdej próbki, podwielokrotność i zawiesić dwa gramy każdej próbki gleby w 20 mililitrach zmodyfikowanej pożywki M9 w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.

Rozcieńczyć próbkę, a następnie zamknąć probówkę sterylną zatyczką piankową, aby umożliwić napowietrzenie. W przypadku ściśle związanych próbek ryzosfery dodaj dwa mililitry zawiesiny glebowej ryzosfery do 20 mililitrów zmodyfikowanej pożywki M9 w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Rozcieńczyć próbkę, a następnie zamknąć probówkę sterylną zatyczką piankową, aby umożliwić napowietrzenie.

Aby przygotować próbkę tkanki, wysterylizuj powierzchniowo korzeń, pęd i ziarno 70% etanolem. Maceruj dwa gramy świeżej tkanki w 20 mililitrach zmodyfikowanego podłoża M9 za pomocą blendera na wysokich obrotach przez 30 sekund. Następnie przenieś próbkę do sterylnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej, rozcieńcz i zamknij probówkę sterylną zatyczką piankową.

Aby wzbogacić produkcję sideroforu poprzez ograniczenie żelaza, inkubuj 50-mililitrowe probówki wirówkowe w temperaturze pokojowej i wstrząsaj z prędkością 160 obr./min. Po 24, 48 i 72 godzinach od rozpoczęcia hodowli wzbogacającej należy usunąć jedną mililitrową podpróbki z probówek wzbogacających przy użyciu sterylnej techniki. Odwirować podpróbki w temperaturze 10 000 razy G przez jedną minutę w dwumililitrowych probówkach wirówkowych w celu granulacji komórek.

Stosując technikę sterylną, dodać 100 mikrolitrów supernatantu do 100 mikrolitrowego roztworu agaru z kompleksem żelaza CAS w dwóch lub trzech powtórzeniach na mikropłytce. Dodaj również 100 mikrolitrów sterylnej pożywki M9 jako ślepe próby. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Każda płytka powinna być szczelnie zamknięta i przykryta folią przed umieszczeniem w inkubatorze. Zawiesić pozostały supernatant i osad dla każdej próbki we własnej sterylnej dwumililitrowej probówce wirówkowej. Dodaj 400 mikrolitrów sterylnego glicerolu do każdej probówki sklarowanej nad osadem i ponownie zawiesić osad, aby utworzyć zapasy glicerolu.

Zamroź bulion w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszej analizy. Zmierz absorbancję po sześciu, 24, 48 i 72 godzinach przy długości fali 420 nanometrów. Mieszaninę pioverdyny biosyntetyzowaną przez Pseudomonas fluorescens wykorzystano jako wzorzec do interpretacji i ilościowego określenia absorbancji próbek w próbkach równoważności pioverdyny w mikromolach.

Zależność między absorbancją przy 420 nanometrach a początkowym stężeniem pioverdyny pokazano tutaj. Aktywność sideroforu po 72-godzinnym wzbogaceniu oceniano po 48 godzinach inkubacji w celu określenia wpływu genotypu i rodzaju próbki na izolację sideroforu. Aktywność sideroforów w masowych próbkach gleby była stosunkowo niska i nie wykazywała różnic między genotypem pszenicy, z którego pobrano próbki gleby luzem.

Jednak wzbogacenie luźno związanej gleby wyizolowanej z genotypu 725 wykazało większą produkcję sideroforu w porównaniu z luźno związaną glebą z Madsen i 727, ale nie z Lewjain. I odwrotnie, produkcja sideroforów w wzbogaceniach z ciasno związanej gleby nie miała dużego wpływu na genotyp. Wzbogacanie tkanki zbożowej dawało stosunkowo niską produkcję sideroforu niezależnie od genotypu.

Wzbogacenie tkanki pędów Lewjain miało znacznie niższą produkcję sideroforów niż inne genotypy, a 725 kultur tkankowych pędów skutkowało bardziej zmienną produkcją sideroforów. Największą różnicę w aktywności sideroforów zaobserwowano w kulturach wzbogacających tkankę korzeniową, gdzie 725 miało ponad 200% większą aktywność sideroforów niż wszystkie inne genotypy. Jednym z najbardziej obciążających aspektów realizacji protokołu jest utrzymanie warunków aseptycznych podczas wykonywania wielu kroków w celu wygenerowania mikropłytki z agarem żelaznym CAS i testowania próbek pod kątem aktywności sideroforu.

Szeroki wachlarz technik chromatograficznych opartych na kulturach lub DNA może być zastosowany zarówno do rzeczywistej studzienki mikromiareczkowej, jak i do kultury zakonserwowanej glicerolem w celu dalszych testów biochemicznych lub charakterystyki genetycznej i modelowania metabolicznego. Korzystając z tego protokołu, aktywność sideroforów może być później powiązana z konkretnymi organizmami odpowiedzialnymi za tę aktywność lub następnie ukierunkowana jako mechanizm większych skutków ekologicznych. Protokół ten można łatwo zmodyfikować w celu oceny produkcji sideroforów w kulturach wzbogacających wygenerowanych z próbek pobranych z innych elementów środowiska, w tym powietrza, wody i osadów.