Name: Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Naucz się izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z całej tkanki z wysoką czystością. Ta metoda umożliwia szczegółową charakterystykę morfologiczną i immunofenotypową w badaniach nad nowotworami mózgu i płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Richardowi Nowakowskiego i Florida State University Laboratory Animal Resources za dostarczenie i opiekę nad zwierzętami wykorzystanymi do opracowania tego protokołu, z szacunkiem. Dziękujemy Xia Liu, dr Rakesh Singh i Laboratorium Nauk Translacyjnych Uniwersytetu Stanowego Florydy za pomoc w pracach spektrometrii mas wykorzystywanych do charakteryzacji pęcherzyków, a także ośrodkowi FSU Biological Science Imaging Resource za wykorzystanie transmisyjnego mikroskopu elektronowego w tym badaniu. Na koniec dziękujemy dr Mandipowi Sachdevie (Florida A&M University) za przekazanie próbek guza wykorzystanych do opracowania tej metody. Badanie to było wspierane przez granty z Departamentu Zdrowia Florydy Ed and Ethel Moore Alzheimer's Disease Research Program, przyznane D.G.M. i J.M.O (6AZ11) oraz National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer R01CA204621 przyznanej DGM.

Całe mózgi zostały uzyskane za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Florydy. W sumie dwanaście mózgów myszy (po 3 mózgi z każdej grupy wiekowej: 2, 4, 6 i 8 miesięcy) z tła C57BL/6 J zostało użytych do ekstrakcji EV, jak wcześniej opisano16. Próbki guzów płuc zostały hojnie przekazane przez dr Mandipa Sachdevę za zgodą IACUC Uniwersytetu Rolniczego i Mechanicznego na Florydzie. Guzy płuc pochodziły z ludzkiej linii komórkowej gruczolakoraka H1975 wyhodowanej u nagich myszy z niedoborem odporności Balb/c nu/nu. W tym badaniu podkreślono dane z dwóch reprezentatywnych powtórzeń nowotworu.
UWAGA: Schematyczny przegląd metody izolacji i oczyszczania pęcherzyków znajduje się w Rysunek 1.
1. Dysocjacja tkanek i wirowanie różnicowe
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml buforu dysocjacyjnego (10 mg papainy; 5,5 mM L-cysteiny; 67 μM 2-merkaptoetanolu; 1,1 mM EDTA) w pożywce Hibernate-E na około 0,4-1,0 g tkanki. Należy pamiętać, że wszystkie roztwory stosowane do wzbogacania i oczyszczania pojazdów elektrycznych należy rozcieńczyć w ultraczystej filtrowanej wodzie.</li>
	<li>Dodać całą świeżą lub zamrożoną tkankę do buforu dysocjacyjnego w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i inkubować w ciepłej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 20 minut. W razie potrzeby tkankę można pociąć na mniejsze fragmenty przed inkubacją.</li>
	<li>Po inkubacji dodać inhibitory proteazy i fosfatazy, aby uzyskać końcowe stężenie 1x do buforu dysocjacyjnego zawierającego tkankę.</li>
	<li>Wlej roztwór zawierający tkankę do luźnego homogenizatora Dounce i delikatnie zdysocjuj tkankę, wykonując około 30 powolnych ruchów na próbkę. Liczba pociągnięć może być dostosowana w zależności od konsystencji tkanki.</li>
	<li>Przenieść zdysocjowaną tkankę w buforze do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek i pozostałych włóknistych lub spoistych fragmentów tkanki.</li>
	<li>Przenieść sklarowany osad do czystej probówki stożkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia i odrzucenia dużych zanieczyszczeń komórkowych.</li>
	<li>Przenieść supernatant ponownie do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 10 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia niepożądanych większych pęcherzyków lub małych ciał apoptotycznych. 
	nuta: W razie potrzeby ten osad można zachować do dodatkowych badań większych pęcherzyków.</li>
	<li>Zdekantować supernatant przez filtr 0,45 μm do czystej probówki do ultrawirówki o pojemności 12 ml. 
	nuta: Gęsto zwłókniałe próbki tkanek mogą nie być łatwe do przefiltrowania. Próbki te można przefiltrować przez sitko o średnicy 40 μm, a następnie przepuścić przez szeregowo mniejsze igły (18 G, 20 G, 22 G) przed przefiltrowaniem przez filtr 0,45 μm.</li>
	<li>Ultraodwirować próbkę o masie 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w celu uzyskania granulek małych pojazdów elektrycznych.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i pozostawić probówki ultrawirówki odwrócone do góry dnem na 5-10 minut, często stukając w celu usunięcia resztek cieczy ze ścianek probówek. Pozostały płyn można również zassać za pomocą zasysającej pipety próżniowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulat EV w 1,5 ml 0,25 M buforu sacharozy (10 mM Tris, pH 7,4). Ważne jest, aby na tym etapie zapewnić pełne ponowne zawieszenie pelletu. Aby to zrobić, przykryj rurki parafilmem przed wirowaniem EV do roztworu. Kołysz probówki ultrawirówki przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej przed ostatecznym wymieszaniem wirowym.</li>
	<li>Krótko odwirować probówki z prędkością nie większą niż 1 000 x g, aby odzyskać płynną zawiesinę na dnie probówki.</li>
	<li>Przejdź do poniższych etapów oczyszczania gradientu lub, jeśli to konieczne, przechowuj zawiesinę EV w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie gradientu gęstości
<ol>
	<li>Dodaj 1,5 ml 60% jodiksanolu (roztwór podstawowy w wodzie) do 1,5 ml buforu sacharozy/Tris zawierającego EV, aby uzyskać końcowy roztwór zawierający 30% jodiksanolu. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać roztwór. Należy zachować ostrożność, aby nie stracić roztworu w końcówce pipety, ponieważ wysokie stężenie jodiksanolu jest dość lepkie.</li>
	<li>Przenieść 30% roztwór buforowy jodiksanolu zawierający EV na dno probówki do ultrawirowania o pojemności 5,5 ml.</li>
	<li>Przygotować co najmniej 1,5 ml 20% i 10% roztworów jodiksanolu na próbkę w ultraczystej wodzie z 60% roztworu podstawowego jodiksanalu.</li>
	<li>Odmierz 1,3 ml 20% jodiksanolu i ostrożnie ułóż na dolnej warstwie gradientu za pomocą strzykawki i igły 18 G. Aby uniknąć mieszania warstw na granicy gęstości, należy utrzymywać skos igły w kontakcie z wnętrzem probówki do ultrawirówki tuż nad menisku i dodawać roztwór kroplami.</li>
	<li>Warstwę 1,2 ml 10% roztworu jodiksanolu nałożyć na warstwę 20% jodiksanolu przy użyciu tej samej techniki, co powyżej.</li>
	<li>Ostrożnie wyważyć i załadować probówki do ultrawirówki do wiader wirnika i odwirować w wirniku z łyżką obrotową o sile 268 000 x g przez 50 minut w temperaturze 4 °C. Ustawić prędkości przyspieszania i zwalniania wirówki na minimalne dozwolone szybkości, aby uniknąć rozerwania warstw gęstości.</li>
	<li>Oznaczyć dziesięć probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki, aby odpowiadały frakcjom od 1 do 10 gradientu gęstości. Frakcja 1 jest oznaczona jako najwyższa frakcja, która zostanie usunięta jako pierwsza, podczas gdy frakcja 10 to dolna frakcja usunięta jako ostatnia.</li>
	<li>Po zakończeniu ultrawirowania gradientowego delikatnie wyjmij rurki z kubełków wirnika i umieść je w stabilnym uchwycie. Widoczne pasmo pęcherzyków często będzie widoczne we fragmencie zainteresowania. Odpipetować dziesięć seryjnych frakcji o objętości 490 μl od góry gradientu do odpowiednich probówek. Na dnie probówki pozostanie niewielka ilość płynu, który prawdopodobnie zawiera zanieczyszczające białka. Próbkę tę można odrzucić lub zachować jako frakcję 11, jeśli jest to pożądane.</li>
	<li>Zmierz współczynniki załamania frakcji za pomocą refraktometru. Można to również przeprowadzić przy równoległym przebiegu gradientu kontrolnego, jeśli konieczne jest zachowanie próbki. Odpipetować 20-30 μl każdej frakcji zawierającej jodiksanol na powierzchnię refraktometru i oszacować gęstość, porównując współczynniki załamania światła ze znanymi gęstościami jodiksanolu. Należy pamiętać, że w razie potrzeby frakcje można przechowywać przez noc w roztworze zawierającym jodiksanol przed przejściem do następnego etapu mycia ultrawirówką.</li>
	<li>Przenieść każdą frakcję do czystej probówki do ultrawirowania o pojemności 12 ml. Dodać 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) do probówki i mieszać, pipetując powoli w górę i w dół. 
	nuta: PBS dodawany do próbek powinien być wolny od cząstek, zapewniony przez przefiltrowanie sterylnego PBS przez filtr 0,22 μm i przechowywanie w temperaturze pokojowej, aby uniknąć wytrącania się soli.</li>
	<li>Dodaj dodatkowe 6 ml 1x PBS na wierzch i ponownie dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Ultraodwirować probówki o masie 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w celu ponownego osadzenia małych pęcherzyków. Zdekantować supernatant i wysuszyć probówki przed lizą pęcherzyków do analizy białek (etap 3) lub ponownym zawieszeniem EV do analizy morfologicznej (etap 5).</li>
</ol>
3. Potwierdzenie białek EV w procesie lizy i immunoblot
UWAGA: Jeśli pożądane jest zachowanie całych pęcherzyków do charakterystyki morfologicznej lub aktywności biologicznej, badacze mogą przejść bezpośrednio do Kroku 5. We wstępnych eksperymentach lub przed analizą spektrometrii mas wszystkie odzyskane frakcje powinny być analizowane za pomocą immunoblot w celu potwierdzenia frakcji z białkami EV.
<ol>
	<li>Aby lizować EV do analizy białek, dodaj 40 μl silnego buforu do lizy (5% SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5% 2-merkaptoetanolu, 8 M mocznika) z dodatkiem inhibitora proteazy do osadu EV w probówce ultrawirówkowej. 
	nuta: Jeśli pożądane są warunki nieredukcyjne do wykrywania białek przez przeciwciała, zastąp ultraczystą wodę 2-merkaptoetanolem w silnym buforze do lizy.</li>
	<li>Zapewnić całkowite ponowne zawieszenie osadu i lizę EV w buforze, umieszczając parafilm na probówce ultrawirówkowej, energicznie wirując, a następnie kołysząc przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed końcowym wirem.</li>
	<li>Krótko odwirować przy 1 000 x g przez 30-60 s, aby odzyskać całą objętość próbki. Przenieść próbkę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze od -20 °C do -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Aby przygotować oczyszczone lizaty do analizy immunoblot, dodać 5x bufor próbki Laemmli (10% SDS, 250 mM Tris pH 6,8, 1 mg/ml błękitu bromofenolowego, 0,5 M DTT, 50% glicerolu, 5% 2-merkaptoetanolu) do próbek dla końcowego stężenia 1x, 
	nuta: Jeśli pożądane są warunki nieredukcyjne, zastąp naziemną telewizję cyfrową i 2-merkaptoetanol wodą ultraczystą.</li>
	<li>Jeśli pożądane są kontrole homogenatu całej tkanki, poddać lizę tkanki w silnym buforze do lizy zawierającym mocznik, opisanemu powyżej, za pomocą inhibitora proteazy, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut, aby odrzucić pozostałą macierz zewnątrzkomórkową, całe komórki lub nienaruszone resztki komórkowe. Dodać 5x bufor próbki Laemmli do homogenatu tkankowego, aby uzyskać końcowe stężenie 1x.</li>
	<li>Gotować bufor do próbek zawierający EV lub próbki homogenatu tkankowego w temperaturze 95 °C przez 5-10 minut, a następnie załadować równą objętość (z równoważnika 0,1-0,3 g wyjściowego materiału tkankowego; 1-2 μg oczyszczonego białka EV) frakcji 1-10 do 10% żelu SDS-PAGE. Załadować jednorodny tkankowy o równej masie. Większa objętość próbek może być potrzebna do wykrycia przez mniej czułe przeciwciała.</li>
	<li>Kontynuuj elektroforezę żelową i analizę Western blot zgodnie z wcześniejszymi szczegółami21, aby potwierdzić obecność białek EV w oczyszczonych lizatach i porównać względną obfitość EV we frakcjach. 
	nuta: Po powtarzalnym wykazaniu obecności białka EV we spójnych frakcjach, końcowe płukanie ultrawirujące opisane w kroku 2.12 może być ograniczone do interesujących frakcji gradientowych.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja białka EV
<ol>
	<li>Należy użyć testu fluorescencyjnego kompatybilnego z detergentem i mocznikiem, jeśli pożądane jest czułe oznaczanie ilościowe białek EV do dalszej analizy (patrz tabela materiałów). Należy zauważyć, że niektóre testy oparte na fluorescencji są kompatybilne z błękitem bromofenolowym obecnym w buforze próbki Laemmli, ułatwiając bezpośrednią lizę osadu EV (w kroku 2.12) w tym buforze, jeśli jest to preferowane.</li>
	<li>Jeśli używany jest wyżej wymieniony zestaw do oznaczania ilościowego białek na bazie fluorescencji, należy umieścić 1 μl próbki lub wzorca w co najmniej dwóch egzemplarzach na dostarczonej bibule filtracyjnej i kontynuować oznaczanie ilościowe białka zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
5. Charakterystyka morfologii EV
<ol>
	<li>Aby zbadać całe pęcherzyki po ostatnim płukaniu wirującym w kroku 2.12, dokładnie ponownie zawiesić granulat EV w wolnym od cząstek 1x PBS. Przechowywać EV w temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden tydzień do czasu przetworzenia, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania. 
	nuta: Korzystne jest posiadanie wcześniej potwierdzonych frakcji konsekwentnie zawierających wzbogacone białko EV za pomocą analizy immunoblot, aby ograniczyć analizy morfologiczne do frakcji będących przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Wykonaj analizę śledzenia nanocząstek na całych próbkach EV, aby określić stężenie i rozmiar pęcherzyków w preparatach, jak wcześniej szczegółowo opisano22.</li>
	<li>Scharakteryzuj morfologię EV i w razie potrzeby potwierdź pomiary wielkości pęcherzyków za pomocą mikroskopii elektronowej. Siatki EM można przygotować z zawiesin pęcherzyków zgodnie z Krokiem 5.123, lub alternatywnie można je przetworzyć jako preparaty blokowe24 z granulek zgodnie z Krokiem 2.12.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie w żelu i trawienie trypsyny do analizy spektrometrii mas
<ol>
	<li>Jeśli pożądane jest scharakteryzowanie proteomów EV za pomocą spektrometrii mas, należy załadować równą masę (co najmniej 10 μg białka) frakcji zawierających EV do wstępnie odlanego żelu poliakrylamidowego w celu oddzielenia i oczyszczenia białek. Preferowane są żele prefabrykowane dostarczane przez producenta, aby zmniejszyć poziom potencjalnie zanieczyszczających białek (np. keratyny) wprowadzanych do próbek.</li>
	<li>Zanurz próbkę w żelu poliakrylamidowym na głębokość co najmniej 0,5 cala w celu oczyszczenia białka, a następnie utrwal i zabarwij barwnikiem Coomassie, jak opisano wcześniej szczegółowo25.</li>
	<li>Pokrój pasy na 1 mm3 kostki do trawienia trypsyny, jak wcześniej szczegółowo19,26.</li>
	<li>Załadować 5 μl strawionej próbki peptydu do przyrządu LC-MS/MS w celu rozdzielenia na kolumnie analitycznej, a następnie analizy za pomocą spektrometrii mas zgodnie z parametrami określonymi szczegółowo16.</li>
</ol>

<ol><li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion%3A+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li>
<li>Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li>
<li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li>
<li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li>
<li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+and+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li>
<li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+communication+goes+viral%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li>
<li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer%3A+small+particle%2C+big+player%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+Oncology%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83(2015).</li>
<li>Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li>
<li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li>
<li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li>
<li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li>
<li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Forum+on+immunopathological+diseases+and+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li>
<li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging%2C+Enhancement+of+Vesicle+Production%2C+and+Noncanonical+NF-.%CE%BAB+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li>
<li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295(2016).</li>
<li>Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037(2012).</li>
<li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li>
<li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li>
<li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExtraPEG%3A+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978(2016).</li>
<li>Lötvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
<li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+in+exosomes%3A+a+novel+biomarker+in+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li>
<li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180(2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li>
<li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters+in+nanoscale+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li>
<li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncosomes+-+large+and+small%3A+what+are+they%2C+where+they+came+from%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wzbudzono duże zainteresowanie naukowe rolą, jaką małe pojazdy elektryczne odgrywają w mikrośrodowisku guza, a także w rozwoju, dojrzewaniu i funkcjonowaniu narządów. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to zapewnia zoptymalizowany przepływ pracy w zakresie ekstrakcji nienaruszonych EV z całego mózgu lub próbek guza. Chociaż tutaj po prostu pokazujemy zastosowanie tej techniki do EV pochodzących z guza płuc, metoda ta może być łatwo zaadaptowana do pracy na innych tkankach stałych, zapewniając możliwości dalszej charakterystyki...

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) obejmują egzosomy pochodzenia endosomalnego i małe mikropęcherzyki z błoną, które mają szerokie zainteresowanie biomedyczne. Małe EV składają się z niejednorodnej populacji pęcherzyków związanych z błoną o długości 50-250 nm, zawierających biologicznie aktywne białka, lipidy i kwasy nukleinowe, które, jak się uważa, odgrywają ważną rolę w wielu procesach chorobowych. Postęp badań w szczególności uwikłał te pęcherzyki w zaburzenia neurodegeneracyjne i prionowe, procesy zakaźne, stany autoimmunologiczne lub zapalne oraz wzrost i przerzuty guza1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Szybko rozwijające się badania biomedyczne nad znaczeniem EV w patogenezie choroby wywołały równoległe zainteresowanie opracowaniem powtarzalnych i rygorystycznych metod izolacji i oczyszczania tych pęcherzyków.
Historycznym i obecnym wyzwaniem w charakterystyce EV była niemożność pełnego oddzielenia małych subpopulacji EV. Wyzwanie to wynika w dużej mierze z naszej ograniczonej wiedzy na temat różnych mechanizmów molekularnych rządzących biogenezą różnych pęcherzyków. Nakładanie się rozmiaru, gęstości i ładunku biologicznego między subpopulacjami jeszcze bardziej komplikuje te różnice. Częścią tego wyzwania było również stosowanie bardzo różnych technik wzbogacania, co powodowało niespójność w dalszej analizie izolowanych pęcherzyków w laboratoriach i podważało globalne wysiłki na rzecz oświetlenia kategorycznych populacji EV.
Warto zauważyć, że większość charakterystyki EV została wykonana z kolekcji in vitro supernatantu do hodowli komórkowych, z nowszymi badaniami in vivo opisującymi techniki izolowania pęcherzyków z płynów ustrojowych zwierząt lub ludzi, w tym osocza, moczu i śliny. Chociaż EV są obecne w dużych ilościach w krążeniu, uznano również, że pęcherzyki te odgrywają ważną rolę w zdarzeniach komunikacyjnych między komórkami i są obecne w śródmiąższu tkanek komórkowych. W kontekście raka, śródmiąższowe EV mogą być szczególnie ważne w modulowaniu mikrośrodowiska guza dla wysiewu komórek rakowych i wzrostu przerzutów14,15. W związku z tym warto opracować i zoptymalizować techniki ekstrakcji pęcherzyków z próbek tkanek stałych. Metody te zapewnią środki do bezpośredniego badania EV pochodzących z narządów lub nowotworów pobranych z próbek klinicznych, w tym małych biopsji oraz częściowych lub pełnych resekcji narządów.
W tym badaniu, jak i w poprzednim raporcie opublikowanym przez nasze laboratorium16, staramy się rozwiązać kilka głównych problemów związanych z metodologią wzbogacania EV: 1) opisać powtarzalną technikę izolacji i oczyszczania pojazdów elektrycznych zgodnie z najwyższymi standardami obecnie akceptowanymi w tej dziedzinie; 2) próba wyizolowania małych subpopulacji EV silnie wzbogaconych w egzosomy pochodzące z endosomalów; oraz 3) zapewnienie protokołu ekstrakcji tych pęcherzyków z próbek tkanek stałych w celu dalszej charakterystyki.
Niedawno, Kowal i współpracownicy opisali stosunkowo mały gradient gęstości jodiksanolu do separacji i oczyszczania subpopulacji EV z większą skutecznością niż porównywalne gradienty gęstości sacharozy17. W cytowanym badaniu EV pochodzące z komórek dendrytycznych wychwycone we frakcji o stosunkowo niskiej gęstości, zgodnej z gęstością 1,1 g / ml, były wysoce wzbogacone w białka endosomalne, które uważa się za najbardziej zgodne z wysokim odsetkiem egzosomów obecnych w tej frakcji. Według autorów, te "bona fide" białka egzosomalne zawierały gen podatności na guz 101 (TSG101), synteninę-1, CD81, ADAM10, EHD4 i kilka białek aneksyny17. Później dostosowaliśmy tę technikę, aby zastąpić metodę dysocjacji tkanek opisaną przez Pereza-Gonzaleza i wsp18 i następujący po niej protokół wirowania różnicowego w celu wyizolowania całych EVs pochodzących z mózgu16. Wykazaliśmy również użyteczność tej metody w charakterystyce proteomów EV poprzez połączenie sekwencyjnego protokołu dla dalszej ilościowej i porównawczej spektrometrii mas białka pęcherzykowego, wcześniej opisanego przez nasze laboratorium19. Prace te były równoległe do tych z laboratorium Hilla, w którym EV zostały wzbogacone z kory czołowej mózgu20.
W tym badaniu rozwijamy tę technikę i rozszerzamy zastosowanie niedawno opublikowanego protokołu z naszego laboratorium na izolację EV z litych guzów płuc. Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie, w którym opisano protokół wzbogacania EV z próbek nowotworów ex vivo. Biorąc pod uwagę powszechne zainteresowanie pojazdami elektrycznymi jako nowymi biomarkerami diagnostycznymi i ich rolą w nowotworzeniu nowotworów, metoda ta prawdopodobnie okaże się cenna dla rosnącej liczby badaczy naukowych. Z klinicznego punktu widzenia śródmiąższowe EV mogą mieć dużą wartość diagnostyczną, szczególnie w próbkach, w których ocena histologiczna jest ograniczona. Mamy nadzieję, że opisana tutaj metoda stworzy podstawy dla powtarzalnej techniki zbierania EV ze świeżych lub mrożonych zwierzęcych lub ludzkich próbek chirurgicznych, torując drogę do przyszłych prac mających na celu odkrycie znaczącej roli, jaką te małe pęcherzyki mogą odgrywać w patogenezie choroby.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mikro; m filtr</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>12 ml ultrawirówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td> 5,5 ml ultrawirówki Beckman Coulter 344057 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Alix</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7129</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-Calnexin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11397</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CD63</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CD81</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9158</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Flotillin 2</td> Santa <td>Cruz</td><td>sc-25507</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-HSC70</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7298</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Syntenin-1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100336</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-TSG101</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7964</td><td></td></tr><tr><td>EZQ zestaw do oznaczania białka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-6-30 rotor&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5820715006</td><td></td></tr><tr><td>FEI CM120 Mikroskop elektronowy</td><td>TSS Mikroskopia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-królicza IgG (fragment Fab)</td><td>Genetex</td><td>27171</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor fosfatazy HALT (100x roztwór)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy HALT (100x roztwór)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 wirnik wahliwo-kubełkowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td> Ultrawirówka stołowa <td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-XP&nbsp;</td><td>Ultrawirówka Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-100</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>60% jodiksanol w sterylnym roztworze wodnym</td></tr><tr><td>Q Exactive HF Spektrometr masowy ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>królik anty-kozi IgG</td><td>Genetex</td><td>26741</td><td></td></tr><tr><td>królik anty-mysi IgG</td><td>Genetex</td><td>26728</td><td></td></tr><tr><td>Refracto 30PX (refraktometr)</td><td>Rotor Mettler Toledo</td><td>51324650</td><td></td></tr><tr><td>S-4-104</td><td>Eppendorf</td><td>5820759003</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti łyżka wahadłowa Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Krążące i śródmiąższowe małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są obiecującymi celami dla rozwoju nowych testów diagnostycznych lub prognostycznych biomarkerów i prawdopodobnie służą jako ważni gracze w postępie szerokiego spektrum chorób. Obecne badania koncentrują się na charakterystyce pęcherzyków wydzielanych z wielu typów komórek i tkanek, aby lepiej zrozumieć rolę EV w patogenezie stanów, w tym neurodegeneracji, zapalenia i raka. Jednak globalnie spójne i powtarzalne techniki izolowania i oczyszczania pęcherzyków pozostają w toku. Co więcej, metody ekstrakcji EV z tkanek stałych ex vivo są prawie nieopisane. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół ekstrakcji małych interesujących EV z całych świeżych lub zamrożonych tkanek, w tym próbek mózgu i guza, w celu dalszej charakterystyki. Wykazujemy zdolność adaptacyjną tej metody do wielu dalszych analiz, w tym mikroskopii elektronowej i immunofenotypowej charakterystyki pęcherzyków, a także ilościowej spektrometrii mas białek EV.

Schematyczny przegląd dysocjacji tkanek, wirowania różnicowego oraz oczyszczania pęcherzyków w gradiencie przedstawiono na Rysunku 1. Potwierdzenie morfologiczne i immunofenotypowe pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) oczyszczonych w gradiencie wyróżniono na Rysunku 2. Przedstawiono schemat powtarzalnych gęstości po ultrawirowaniu w gradiencie jodiksanolu 10-30%, w którym dwie odrębne populacje pęcherzyków migrują w górę do frak...

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z całych tkanek, w tym próbek mózgu i nowotworów. Metoda ta oferuje powtarzalną technikę ekstrakcji EV z tkanki stałej w celu dalszych analiz.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Protokół ten zapewnia rygorystyczną i powtarzalną technikę ekstrakcji i izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całych próbek tkanek do dalszych analiz ex-vivo. Dzięki jednemu z najwyższych możliwych obecnie poziomów czystości, metoda ta ułatwia bezpośrednią morfologię, immunofenotypową i głęboką charakterystykę pęcherzyków śródmiąższowych wydzielanych do różnych próbek tkanek, w tym guzów. Tutaj demonstrujemy izolację tkanek EV z próbek guzów mózgu i płuc.Jednak technika ta może być również stosowana do badań z wykorzystaniem różnorodnych, łagodnych lub innych próbek nowotworów. Na początek przygotuj 10 mililitrów buforu dysocjacyjnego w pożywce Hibernate-E na każde 0,4 do 1,0 grama tkanki. Dodaj całą świeżą lub zamrożoną tkankę do buforu w probówce o pojemności 50 mililitrów i inkubuj w ciepłej łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.Następnie dodaj inhibitory proteazy i fosfatazy, aby uzyskać końcowe stężenie 1x w buforze dysocjacyjnym. Wlej roztwór wraz z chusteczką do homogenizatora loose fits. Użyj około 30 powolnych pociągnięć na próbkę, aby delikatnie zdysocjować tkankę.Następnie przenieś zdysocjowaną tkankę i roztwór buforowy do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Wirować przy 500x g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby granulować komórki i pozostałe włókna lub spoiste fragmenty tkanek. Przenieś supernatant do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj przy 2 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby osadzać i odrzucać duże resztki komórkowe.Przenieś ten supernatant do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj przy 10 000x g i w czterech stopniach Celsjusza przez 40 minut, aby osadzać wszelkie niepożądane większe pęcherzyki lub małe ciała apoptotyczne. Zdekantować supernatant przez filtr 0,45 mikrometra do czystej 12-mililitrowej probówki do ultrawirówki. Następnie ultraodwiruj próbkę w temperaturze 100 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby granulować małe EV.Zdekantować supernatant i pozostawić probówki ultrawirówki odwrócone do góry dnem na pięć do 10 minut, często stukając w celu usunięcia resztek cieczy z boków probówek. Następnie ponownie zawieś osad EV w 1,5 mililitra 0,25 molowego buforu sacharozy. Przykryj probówki Parafilmem, a następnie przekręć EV do roztworu.Kołysz probówki ultrawirówkowe przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. A potem znowu wir. Krótko odwirować probówki z prędkością mniejszą niż 1 000 g, aby odzyskać płynną zawiesinę na dnie probówki.W razie potrzeby zawiesinę należy przechowywać przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw dodaj 1,5 mililitra 60% jodiksanolu do 1,5 mililitra sacharozy tris bufora, który zawiera EV, aby stworzyć końcowy roztwór zawierający 30% jodiksanolu. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać roztwór.Przenieś ten roztwór na dno 5,5 mililitrowej probówki do ultrawirówki. Następnie wymieszaj 60% bulion jodiksanolu z ultra czystą wodą, aby przygotować co najmniej 1,5 mililitra zarówno 20%, jak i 10% roztworu joduksanolu. Za pomocą strzykawki i igły o rozmiarze 18 odmierz 1,3 mililitra 20% roztworu jodu i ostrożnie ułóż go na wierzchu dolnego gradientu.Utrzymuj skos igły w kontakcie z wnętrzem rurki, tuż nad meniskiem i dodawaj roztwór kroplami, aby uniknąć mieszania warstw na granicy gęstości. Następnie nałóż 1,2 mililitra 10% roztworu jodiksanolu na warstwę 20%, stosując tę samą technikę. Ostrożnie wyważ i załaduj probówki ultrawirówki do wiader wirnika.Ustaw prędkości przyspieszania i zwalniania wirnika łyżki obrotowej na minimalne prędkości i wiruj przy 268 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 50 minut. Podczas wirowania próbki oznacz 10 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych dla każdej próbki, które będą odpowiadać frakcjom od jednego do 10 gradientu gęstości. Po zakończeniu wirowania delikatnie wyjmij probówki z wiader wirnika i umieść je w stabilnym uchwycie.Odpipetować 10 seryjnych frakcji po 490 mikrolitrów od góry gradientu do odpowiednich probówek. Za pomocą refraktometru zmierz współczynniki załamania frakcji. Następnie przenieś każdą frakcję do czystej 12-mililitrowej probówki do ultrawirowania.Dodaj pięć mililitrów 1x PBS do każdej probówki i powoli pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Dodaj dodatkowe sześć mililitrów 1x PBS na górę probówki i ostrożnie wymieszaj ponownie. Ultraodwiruj probówki przy 100 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby ponownie granulować małe pęcherzyki.Zdekantować supernatant i osuszyć probówki przed lizą pęcherzyków do analizy białek lub ponownym zawieszeniem EV do analizy morfologicznej. Aby zlizować EV do analizy białek, dodaj 40 mikrolitrów silnego buforu do lizy zawierającego inhibitor proteazy do granulek EV. Umieść Parafilm na każdej tubie i energicznie wiruj.Następnie kołysz rurkami przez 20 minut w temperaturze pokojowej i ponownie wiruj. Krótko odwirować próbkę o masie 1 000 g przez 30 do 60 sekund, aby odzyskać całą objętość próbki. Przenieś każdą próbkę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj ją w temperaturze od 20 do 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do dalszego przetwarzania.Aby przygotować oczyszczone lizaty do analizy immunoblot, dodaj 5x bufor próbki Laemmli do próbek, aby uzyskać końcowe stężenie 1x. Gotuj próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Następnie załaduj równą objętość ułamków od jednego do 10 do żelu stronicowego 10%SDS.Załadować jednorodną tkankę o równej masie. Wykonaj elektroforezę i analizę Western blot, aby potwierdzić obecność białek EV w oczyszczonych lizatach i porównać względną obfitość EV we frakcjach. W tym badaniu pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są ekstrahowane i oczyszczane z całej tkanki.Po ultraodwirowaniu gradientu od 10 do 30% jodiksanolu można zaobserwować populację lekkich EV migrujących do frakcji drugiej, podczas gdy populację gęstych EV można zaobserwować migrującą do frakcji piątej, w zależności od typu tkanki. Reprezentatywne immunobloty frakcji gradientowych wykazują skuteczną separację i oczyszczanie małych EV pochodzących z guza we frakcji piątej. Warto zauważyć, że próbki guzów płuc wydają się wzbogacone w gęste EV w porównaniu z lekkimi EV, które wcześniej zostały pobrane z całej tkanki mózgowej.Reprezentatywna analiza śledzenia nanocząstek i mikroskopia elektronowa pęcherzyków pochodzących z tkanek we frakcji zawierającej dominujące pęcherzyki wykazują wzbogacenie i konserwację całych pęcherzyków. Jest to zgodne ze znaną wielkością i budową małych pojazdów elektrycznych. Śródmiąższowe EV stanowią obiecujące cele dla rozwoju nowych testów biomarkerów diagnostycznych lub prognostycznych.Technika ta zapewnia naukowcom narzędzia do ekstrakcji i oczyszczania pęcherzyków do dalszego użytku. Po ekstrakcji całych lub zlizowanych EV tkanek można przeprowadzić szeroką charakterystykę pęcherzyków, w tym analizy proteomiczne, genomiczne i lipidomiczne. Ponadto próbki mogą być wykorzystywane do bardziej ukierunkowanych podejść.Pęcherzyki wyizolowane bezpośrednio z próbek tkanek mogą dostarczyć dalszych informacji na temat mechanizmów chorobowych, w tym genezy guza, i mogą stanowić ważne narzędzia diagnostyczne lub prognostyczne w przyszłości.

extraction-of-extracellular-vesicles-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ze świeżych lub zamrożonych tkanek. Wyizolowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe można wykorzystać do dalszej analizy w celu odkrycia ich znaczącej roli w patogenezie choroby.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek całych tkanek za pomocą wirowania różnicowego

Ten film demonstruje metodę oczyszczania opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nadających się do badań charakteryzacyjnych.

Oczyszczanie subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika oczyszczania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirowania w gradimencie gęstości

To jest protokół izolowania tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od wątroby. Protokół opisuje dwuetapowy proces obejmujący perfuzję kolagenazy, po której następuje różnicowe ultrawirowanie w celu wyizolowania EV tkanki wątroby.

Izolacja tkankowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wątroby

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy wzbogacanie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby za pomocą zoptymalizowanej metody różnicowego ultrawirowania.

Metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby

Tutaj prezentujemy protokół izolowania egzosomów pochodzących z śledziony myszy za pomocą kombinacji trawienia z kolagenazą typu I i ultrawirowania.

Izolacja i charakterystyka egzosomów pochodzących z tkanek śledziony myszy

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Naucz się izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z całej tkanki z wysoką czystością. Ta metoda umożliwia szczegółową charakterystykę morfologiczną i immunofenotypową w badaniach nad nowotworami mózgu i płuc.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Przeglądaj więcej filmów