Name: Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnej izolacji RNA, DNA i białka z próbek Caenorhabditis elegans. Protokół zmniejsza zmienność międzypróbkową i poprawia powtarzalność wyników badań molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.R.L. został sfinansowany z grantów NIH/NIA (R00 AG042494 i R01 AG051810), Glenn Foundation for Medical Research Award for Research for Research in Biological Mechanisms of Aging oraz Junior Faculty Grant od American Federation for Aging Research. Autorzy chcieliby podziękować Anicie Kumar i Shi Quan Wong za ich przydatne informacje zwrotne podczas pisania tego manuskryptu.

UWAGA: Każdy etap wytrącania makromolekuł jest wykonywany sekwencyjnie, po którym następują równoczesne płukanie; jednak zaleca się najpierw dokończenie izolacji RNA, ponieważ jest ona wewnętrznie niestabilna.
1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Wysiewaj 1 000 jaj robaków na 10 cm talerzu w odpowiednich warunkach wzrostu19. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 72 h. 
	nuta: Wybielaj dorosłe osoby niosące jaja w celu zebrania jaj, jak opisano wcześniej19.</li>
	<li>Umyj płytkę około 5 ml buforu M9 i zbierz 1 000 dorosłych robaków do probówki. 
	nuta: Bufor M9 składa się z 35 mM dwuzasadowego fosforanu sodu, 102 mM chlorku sodu, 22 mM jednozasadowego fosforanu potasu i 1 mM siarczanu magnezu w sterylnej wodzie19.</li>
	<li>Odwirować robaki przy 1 000 x g przez 1 minutę, wyrzucić supernatant i przenieść granulowane robaki z 1 ml buforu M9 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Ponownie odwirować przy 845 x g przez 1 minutę i wyrzucić większość supernatantu. Granulowane robaki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 4 godziny 
	nuta: Użycie mrożonego granulatu daje wyższy plon niż świeży pellet. W przypadku stosowania świeżego granulatu zaleca się serię cykli zamrażania/rozmrażania przy użyciu ciekłego azotu lub 95% etanolu na suchym lodzie w celu rozbicia naskórka robaka. Pozostawienie niewielkiej ilości M9 na granulce pomoże rozbić naskórek podczas zamrażania.</li>
</ol>
2. Izolacja nukleotydów i białek
<ol>
	<li>Usunąć jakikolwiek supernatant z rozmrożonego osadu i dodać 1 ml zimnego odczynnika GTCp. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Umieść próbkę na lodzie na 10 minut i od czasu do czasu mieszaj, odwracając ją do góry nogami. 
	ostrożność: Fenol jest, neurotoksyczny i wysoce toksyczny i może powodować oparzenia chemiczne i ślepotę. 
	nuta: Użyliśmy do 5 000 dorosłych robaków jako materiału wyjściowego przy zgłoszonych ilościach; każda objętość opiera się na użyciu 1 ml odczynnika GTCp. W przypadku korzystania z większej próbki może być konieczne zwiększenie skali.</li>
	<li>Do roztworu robaków i GTCp dodać 200 μl zimnego chloroformu. Trzymaj probówkę między palcami i energicznie potrząsaj przez 15 sekund. Pozostaw w temperaturze pokojowej (RT) na 3 min. 
	ostrożność: Chloroform jest toksycznym środkiem drażniącym, może powodować owrzodzenia skóry i inne uszkodzenia narządów oraz jest możliwym czynnikiem rakotwórczym.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 13 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Po tym wirowaniu powstają trzy warstwy: górna, przezroczysta faza wodna, dolna, różowa faza organiczna i mała, mętna interfaza, która zawiera lipidy i DNA.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety przenieś przezroczystą górną warstwę (fazę wodną) do nowej, wolnej od RNaz probówki do mikrowirówki (probówka A) o pojemności 1,5 ml, aby wyizolować RNA poprzez wytrącanie alkoholu (jak opisano w kroku 2.5) i przenieść różową warstwę (fazę organiczną) z pozostałego osadu do nowej probówki (probówki B) i umieścić ją na lodzie. 
	nuta: Różową fazę organiczną można zamrozić w temperaturze -80 °C do czasu wyizolowania DNA i białka z tej próbki. Większe próbki stworzą grubą białą warstwę między fazą wodną a organiczną. Ta frakcja zawiera DNA. Jeśli tę warstwę można usunąć bez naruszania innych faz, zrób to i umieść ją w osobnej tubie (probówce B2).</li>
	<li>Wyizoluj RNA w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Z klarownej fazy wodnej w probówce A wytrącić RNA za pomocą 500 μl 100% izopropanolu. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować probówkę A o sile 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
		nuta: Na dnie probówki powinna być widoczna mała biała osadka RNA.</li>
		<li>Zdekantować większą część supernatantu. Resztę usunąć za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą i wyrzucić supernatant. 
		nuta: Rozmiar igły nie jest ważny; Jednak większy rozstaw igieł zapewni większą kontrolę, aby nie zakłócać śrutu. Mikropipeta może być użyta, jeśli igły nie są dostępne.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 75% etanolu do probówki A, aby umyć osad. Wirować probówkę o wymiarach 5 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć supernatant z osadu przez dekantację i użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą, jak opisano w kroku 2.5.2, i wyrzucić go.</li>
		<li>Pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 5–10 minut, ale nie pozwól jej przeschnąć. Użyj 50 μl wody wolnej od RNaz, aby rozpuścić osad RNA, zanim stanie się całkowicie przezroczysty. 
		nuta: Jest to wystarczająca objętość początkowa dla 1,000–3,000 robaków, ale może być konieczne dostosowanie w zależności od ilości użytego materiału wyjściowego.</li>
		<li>Inkubować osad w temperaturze 55–60 °C przez 10 minut, aby go rozpuścić.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie i czystość za pomocą spektrofotometru. Zapisać absorbancję przy 260 nm dla stężenia RNA oraz przy 230 i 280 nm w celu zidentyfikowania wszelkich zanieczyszczeń.</li>
		<li>Oczyść RNA w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń, takich jak pozostałości fenolu lub DNA, albo poprzez oczyszczanie kolumny, albo poprzez późniejsze płukanie etanolem i obróbkę DNazą. 
		nuta: W tym momencie RNA jest gotowe do wysłania do analizy RNAseq lub może być użyte do wytworzenia cDNA do wykorzystania w RT-qPCR (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 3.1). RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu dalszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizoluj DNA w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Z różowej fazy organicznej w probówce B i próbki w probówce B2, jeśli występuje, wytrącić DNA, dodając 300 μl 100% etanolu i wymieszać przez inwersję. Pozostaw probówkę (rurki) w pozycji RT na 2–3 minuty.</li>
		<li>Odwirować probówki B i B2 o masie 375 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia DNA.</li>
		<li>Przenieść supernatant z probówek B i B2, wlewając go do nowej probówki C o pojemności 2 ml i pozostawić na lodzie w celu późniejszej izolacji białka. Przemyć osad DNA w probówce B lub B2 1 ml 0,1 M cytrynianu sodu w 10% etanolu przez 30 minut. Probówki B i B2 o masie 375 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. 
		nuta: Sód wiąże się ze szkieletem DNA, dzięki czemu DNA łatwiej wytrąca się w cytryninie sodu i etanolu, umożliwiając usunięcie zanieczyszczeń przez wirowanie z niską prędkością.</li>
		<li>Powtórz etap prania zgodnie z opisem w kroku 2.6.3. Ponownie zawiesić osad w 1,5 ml 75% etanolu i pozostawić go w temperaturze pokojowej na 20 minut, od czasu do czasu mieszając przez wywrócenie do góry nogami.</li>
		<li>Probówkę B i B2 przy 375 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzuć supernatant i pozostaw do wyschnięcia na 5–10 minut.</li>
		<li>Rozpuścić osad w 150 μl 8 mM wodorotlenku sodu. W razie potrzeby dostosuj do żądanego pH za pomocą HEPES. Wirować próbkę w temperaturze 375 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety przenieś supernatant (DNA) do nowej probówki. Zmierzyć stężenie i określić czystość za pomocą spektrofotometru. Zapisać absorbancję przy 260 nm dla stężenia DNA oraz przy 230 i 280 nm w celu zidentyfikowania wszelkich zanieczyszczeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizoluj białko w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Aby wytrącić białko, dodaj do 1,5 ml 100% izopropanolu do różowego supernatantu w probówce C, wymieszaj przez kilkakrotne odwrócenie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Probówka wirówkowa C o masie 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i przemyć osad 2 ml 0,3 M chlorowodorku guanidyny w 95% etanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Probówkę C odwirować przy 5 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Powtórz krok prania zgodnie z opisem w kroku 2.7.3 2x.</li>
		<li>Przenieś granulkę białka do nowej probówki o pojemności 1,5 ml (probówka C2) i dodaj do 1,5 ml 95% etanolu. Wiruj i pozostaw w temperaturze RT przez 20 minut.</li>
		<li>Probówkę wirówkową C2 o stężeniu 5 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej. Rozpuścić osad w 300 μl 5% SDS w temperaturze 50 °C przez 60 min. 
		UWAGA: Do całkowitego rozpuszczenia osadu białkowego może być wymagany dłuższy czas inkubacji. W przeszłości granulat był inkubowany do 6 godzin bez utraty jakości.</li>
		<li>Probówkę wirówkową C2 o sile 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 17 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie przy użyciu preferowanego testu ilościowego białka, który jest zgodny z detergentem. 
		nuta: Białko jest gotowe do użycia w SDS-PAGE i western blotting. Może być przechowywany w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. W przypadku innych technik, takich jak LC-MS/MS, detergent będzie musiał zostać dializowany.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena poziomów mRNA i białka
<ol>
	<li>RT-qPCR (Protokół RT-qPCR)
	<ol>
		<li>Przygotować cDNA przez odwrotną transkrypcję z 1 ng RNA, stosując następujący protokół termocyklera: torowanie (5 min w 25 °C), odwrotna transkrypcja (20 min w 46 °C) i inaktywacja RT (1 min w 95 °C).</li>
		<li>Przygotuj podstawową płytkę cDNA, dodając 100 μl rozcieńczeń 1:100 każdej próbki cDNA do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki. Uwzględnij odpowiednie kontrole, takie jak studzienki bez matrycy/tylko z wodą oraz seryjnie rozcieńczane próbki od 1:25 do 1:400 (pochodzące z połączonego cDNA ze wszystkich analizowanych próbek), aby umożliwić krzywą standardową ustalenie wydajności startera dla każdego analizowanego genu. 
		nuta: Format ten może być używany z 96-dołkowym mikrodozownikiem, który umożliwia przeniesienie wszystkich próbek z płytki na płytkę RT-qPCR i złagodzenie zmian w pipetowaniu między studzienkami. Odpowiednią mieszankę wzorcową (np. SYBR + startery) można następnie dodać do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście zmniejsza liczbę błędów wprowadzanych podczas ręcznego pipetowania każdej próbki, co jeszcze bardziej zmniejsza zmienność.</li>
		<li>Dodać 3 μl cDNA z płytki podstawowej do dołków płytki RT-qPCR.</li>
		<li>Przygotuj mieszankę wzorcową dla każdego zestawu starterów, który zawiera 1x supermix zawierający barwnik cyjaninowy interkalujący DNA, po 5 μM starterów do przodu i do tyłu oraz wodę do 7 μl na próbkę. Dodać 7 μl do odpowiednich dołków płytki RT-qPCR i lekko zamieszać, aby wymieszać. 
		nuta: Dołącz próbki do pomiaru genów porządkowania, aby użyć ich jako odniesienia do normalizacji wyników20.</li>
		<li>Uruchomić płytkę przy użyciu protokołu RT-qPCR, który jest odpowiedni dla używanych starterów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western blot 
	nuta: Szczegółowe informacje na temat zachodnich plam można znaleźć w Mahmood and Yang21.
	<ol>
		<li>Przygotować próbki do SDS-PAGE, łącząc 20 μg białka z równą objętością 2x bufor do próbek Laemmli i gotować w temperaturze 95 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Załaduj próbki do żelu tris-glicynowego o stężeniu 4%–15% i uruchom je pod napięciem 150 V przez 1 godzinę lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do dna żelu.</li>
		<li>Przenieść białka z żelu do membrany nitrocelulozowej pod napięciem 25 V przez 30 minut w półsuchym aparacie transferowym.</li>
		<li>Potwierdź prawidłowy transfer, barwiąc membranę barwnikiem Ponceau S.</li>
		<li>Dokładnie zmyć plamę z membrany solą fizjologiczną buforowaną tris (TBS) z 0,01% polisorbatem 20 (TBS-T).</li>
		<li>Zatkać membranę 5% mlekiem beztłuszczowym w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować błonę w przeciwciałie pierwszorzędowym w odpowiednim rozcieńczeniu zgodnie z zaleceniami dostawcy. Pozostaw na noc na bujaku w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj membranę 3x, po 5 minut, za pomocą TBS-T.</li>
		<li>Inkubować błonę w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym w odpowiednim rozcieńczeniu zgodnie z zaleceniami dostawcy. Pozostaw go na bujaku na 1 godzinę w RT.</li>
		<li>Umyj membranę 3x, po 5 minut, za pomocą TBS-T.</li>
		<li>Zobrazuj i określ ilościowo western blot przy użyciu preferowanych metod.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rotroff, D. M., Motsinger-Reif, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+Integrative+Multiomics+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Genomics%22%5BJournal%5D)">Embracing Integrative Multiomics Approaches.</a> International Journal of Genomics. 2016, 1715985(2016).</li>
<li>Chen, R., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promise+of+personalized+omics+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+System+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Promise of personalized omics to precision medicine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: System Biology and Medicine. 5 (1), 73-82 (2013).</li>
<li>Anderson, L., Seilhamer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+selected+mRNA+and+protein+abundances+in+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 533-537 (1997).</li>
<li>Harvald, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+Analyses+of+Starvation+Responses+Reveal+a+Central+Role+for+Lipoprotein+Metabolism+in+Acute+Starvation+Survival+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Multi-omics Analyses of Starvation Responses Reveal a Central Role for Lipoprotein Metabolism in Acute Starvation Survival in C. elegans.</a> Cell Systems. 5 (1), (2017).</li>
<li>Griffin, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+profiling+of+gene+expression+at+the+transcriptome+and+proteome+levels+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Complementary profiling of gene expression at the transcriptome and proteome levels in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics. 1 (4), 323-333 (2002).</li>
<li>Greenbaum, D., Colangelo, C., Williams, K., Gerstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+protein+abundance+and+mRNA+expression+levels+on+a+genomic+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale.</a> Genome Biology. 4 (9), 117(2003).</li>
<li>Lapierre, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TFEB+orthologue+HLH-30+regulates+autophagy+and+modulates+longevity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The TFEB orthologue HLH-30 regulates autophagy and modulates longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 4, 2267(2013).</li>
<li>Doherty, C. J., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+global+gene+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Circadian control of global gene expression patterns.</a> Annual Reviews Genetics. 44, 419-444 (2010).</li>
<li>Goya, M. E., Romanowski, A., Caldart, C. S., Benard, C. Y., Golombek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+identified+in+Caenorhabditis+elegans+by+in+vivo+long-term+monitoring+of+a+bioluminescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms identified in Caenorhabditis elegans by in vivo long-term monitoring of a bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (48), E7837-E7845 (2016).</li>
<li>Dalvin, L. A., Fautsch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Circadian+Rhythm+Gene+Expression+With+Reference+to+Diurnal+Pattern+of+Intraocular+Pressure+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Analysis of Circadian Rhythm Gene Expression With Reference to Diurnal Pattern of Intraocular Pressure in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (4), 2657-2663 (2015).</li>
<li>Narayanan, A., Jacobson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+studies+of+protein+regulation+by+post-translational+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation.</a> Current Opinion in Structural Biology. 19 (2), 156-163 (2009).</li>
<li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26 (4), 399-422 (2016).</li>
<li>Cech, T. R., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA+revolution-trashing+old+rules+to+forge+new+ones%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones.</a> Cell. 157 (1), 77-94 (2014).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li>
<li>Triant, D. A., Whitehead, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Extraction+of+High-Quality+RNA+and+DNA+from+Small+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heredity%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Extraction of High-Quality RNA and DNA from Small Tissue Samples.</a> Journal of Heredity. 100 (2), 246-250 (2009).</li>
<li>Liu, X., Harada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Isolation+from+Mammalian+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Isolation from Mammalian Samples.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+solubilization+of+proteins+after+TRIzol+extraction+of+RNA+and+DNA+from+patient+material+following+prolonged+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage.</a> Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).</li>
<li>Kopec, A. M., Rivera, P. D., Lacagnina, M. J., Hanamsagar, R., Bilbo, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+solubilization+of+TRIzol-precipitated+protein+permits+Western+blotting+analysis+to+maximize+data+available+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized solubilization of TRIzol-precipitated protein permits Western blotting analysis to maximize data available from brain tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 280, 64-76 (2017).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Research Community. (2006).</li>
<li>Hoogewijs, D., Houthoofd, K., Matthijssens, F., Vandesompele, J., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+validation+of+a+set+of+reliable+reference+genes+for+quantitative+sod+gene+expression+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection and validation of a set of reliable reference genes for quantitative sod gene expression analysis in C. elegans.</a> BMC Molecular Biology. 9 (1), 9(2008).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Peach, M., Marsh, N., MacPhee, D. J. Protein solubilization: Attend to the choice of lysis buffer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeach%2C+M+%22Protein+Electrophoresis%3A+Methods+and+Protocols%22">Protein Electrophoresis: Methods and Protocols</a>. Kurien, B. T., Scofield, R. H. , Humana Press. 37-47 (2012).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).</li>
<li>Pan, K. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mRNA+translation+extends+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mRNA translation extends lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 6 (1), 111-119 (2007).</li>
<li>Gaudet, P., Livstone, M. S., Lewis, S. E., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic-based+propagation+of+functional+annotations+within+the+Gene+Ontology+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic-based propagation of functional annotations within the Gene Ontology consortium.</a> Briefings in Bioinformatics. 12 (5), 449-462 (2011).</li>
<li>Broeks, A., Gerrard, B., Allikmets, R., Dean, M., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologues+of+the+human+multidrug+resistance+genes+MRP+and+MDR+contribute+to+heavy+metal+resistance+in+the+soil+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Homologues of the human multidrug resistance genes MRP and MDR contribute to heavy metal resistance in the soil nematode Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 15 (22), 6132-6143 (1996).</li>
<li>Hadwiger, G., Dour, S., Arur, S., Fox, P., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Monoclonal+Antibody+Toolkit+for+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Monoclonal Antibody Toolkit for C. elegans.</a> PLoS One. 5 (4), e10161(2010).</li>
<li>Kostich, M., Fire, A., Fambrough, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+molecular-genetic+characterization+of+a+LAMP%2FCD68-like+protein+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Identification and molecular-genetic characterization of a LAMP/CD68-like protein from Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Science. 113 (14), 2595(2000).</li>
<li>Firestein, B. L., Rongo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLG-1+is+a+MAGUK+similar+to+SAP97+and+is+required+for+adherens+junction+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">DLG-1 is a MAGUK similar to SAP97 and is required for adherens junction formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (11), 3465-3475 (2001).</li>
<li>Heschl, M. F., Baillie, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+hsp70+multigene+family+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22DNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of the hsp70 multigene family of Caenorhabditis elegans.</a> DNA. 8 (4), 233-243 (1989).</li>
<li>Yoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+perturbation+of+protein+handling+activates+genes+encoding+mitochondrial+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones.</a> Journal of Cell Science. 117 (18), 4055(2004).</li>
<li>Takahashi, M., Iwasaki, H., Inoue, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+Genetic+Analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+26S+Proteasome+Subunits+by+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reverse Genetic Analysis of the Caenorhabditis elegans 26S Proteasome Subunits by RNA Interference.</a> Biological Chemistry. 383, 1263(2002).</li>
<li>Le Bot, N., Tsai, M. C., Andrews, R. K., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAC-1%2C+a+regulator+of+microtubule+length+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">TAC-1, a regulator of microtubule length in the C. elegans embryo.</a> Current Biology. 13 (17), 1499-1505 (2003).</li>
<li>McQuary, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+S6K+Mutants+Require+a+Creatine-Kinase-like+Effector+for+Lifespan+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">C. elegans S6K Mutants Require a Creatine-Kinase-like Effector for Lifespan Extension.</a> Cell Reports. 14 (9), 2059-2067 (2016).</li>
<li>Larance, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Proteomics+Analysis+of+the+Response+to+Starvation+in+C.+elegans+%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans .</a> Molecular and Cell Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+energy+metabolism+contributes+to+the+extended+life+span+of+calorie-restricted+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enhanced energy metabolism contributes to the extended life span of calorie-restricted Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 31414-31426 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metody izolacji biomolekuł, takich jak DNA, RNA i białka, są często optymalizowane bez technicznego nakładania się lub kombinacji. Jest to szczególnie niekorzystne, gdy próbki są trudne do uzyskania, co może prowadzić do pobierania próbek w tych samych warunkach w różnym czasie. W zależności od szlaków komórkowych, kontrpróby zebrane w różnym czasie mogą generować zmienność. Niniejszy manuskrypt oferuje procedurę pozwalającą obejść tę przeszkodę, umożliwiając jednoczesną izolację i oczyszczanie każdej biomolekuły z tej samej próbki robaków, zmniejszając różnice wprowadzone przez różne techniki izolacji, czas pobierania próbek lub nierówne zbiory. Kontrolowanie tych zmiennych nie tylko oszczędza czas i zasoby, ale także ułatwia odtwarzalność. W tym miejscu demonstrujemy podejście kombinatoryczne, które pozwala uniknąć pogorszenia jakości RNA i białka, aczkolwiek ze zmiennymi wynikami w przypadku DNA. Preparaty można dodatkowo zoptymalizować za pomocą procedur czyszczenia DNA. Zademonstrowaliśmy to podejście, wykorzystując materiał z nicieni C. elegans i komórek HeLa.
Wcześniejsze prace badające transkryptom i proteom zwierząt N2 WT oraz mutantów eat-2 i rsks-1 dały wgląd w różne szlaki, w tym mechanizmy wydłużające życie 4,34,35,36. W celu zbadania mechanizmu ograniczenia kalorii w przedłużaniu życia, analiza znakowania stabilnych izotopów przez/z aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC) wykazała, że robaki eat-2 mają ogólną regulację w dół globalnej syntezy białek 36. Przedstawione tutaj dane są zgodne z tym odkryciem, nawet jeśli poziomy mRNA tych samych celów są znacznie podwyższone. Inna grupa miała na celu zidentyfikowanie efektorów długowieczności, w których pośredniczy S6K, a tym samym przeprowadziła proteomiczne badanie przesiewowe robaków rsks-1 34. Na podstawie danych RNAseq znalezionych w obecnym badaniu zidentyfikowaliśmy co najmniej trzy geny, które potwierdzają białka zidentyfikowane na podstawie tego badania; Odkryto, że MRP-1 i homologi CPA i neuroliginy (F07C4.12) ulegają zróżnicowanej ekspresji w robakach rsks-1 w porównaniu z WT N234.
Dane wygenerowane przy użyciu tej metody są zgodne z wcześniejszymi badaniami multiomicznymi. Poziomy mRNA dziewięciu celów wykorzystano do przewidywania poziomów białka w każdej próbce. Spośród tych celów wiele miało przewidywalne poziomy białka na podstawie poziomów mRNA. Niemniej jednak wystąpiły znaczące rozbieżności między poziomami mRNA i białka. Co ważne, przedstawiony tutaj protokół pozwala naukowcom na pewną ocenę i interpretację tych różnic poprzez usunięcie zmienności między próbkami poprzez zebranie mRNA i białka z tej samej próbki. Ponadto porównaliśmy poziomy mRNA z poziomami białka pobranymi z tej samej próbki lub pobranymi z podobnej, ale innej próbki zebranej za pomocą RIPA. Wykazaliśmy, że w przypadku wielu celów w próbce ekstrahowanej za pomocą RIPA występowały znacznie niższe poziomy białka. Bez kontroli zmienności między próbkami niemożliwe byłoby ustalenie, czy różnica ta wynikała ze zróżnicowanej regulacji mRNA i białka.
Ważne jest, aby pamiętać, że istnieją protokoły zoptymalizowane specjalnie dla tych różnych makrocząsteczek, więc jeśli analiza przekrojowa nie jest ostatecznym celem eksperymentu, wówczas należy zastosować te metody. Stosowanie GTCp do izolowania DNA i białka powoduje, że stają się one mniej rozpuszczalne, co wymaga odtworzenia DNA w słabej zasadzie, takiej jak NaOH, i rozpuszczania białka w buforze z detergentem o wysokim stężeniu z ogrzewaniem, co wiąże się z ryzykiem niepełnej rozpuszczalności. Dodatkowo GTCp zawiera tiocyjanian guanidyny i kwaśny fenol, który inaktywuje enzymy, takie jak proteazy, ale z czasem powoli rozkłada białko, chyba że zostanie zamrożony. To od badacza będzie zależało, czy obejście tych ograniczeń będzie warte zachodu.
Co ważne, podczas pracy z RNA, techniką sterylną, zaleca się trzymanie próbki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej, oraz stosowanie dostępnego na rynku odczynnika odkażającego w celu utrzymania RNA w stanie nienaruszonym. Warto zauważyć, że większe próbki będą wymagały na początek więcej GTCp, przy czym każdy rozpuszczalnik ekstrakcyjny będzie również musiał zostać zwiększony. Protokół ten nie wymaga żadnej ręcznej homogenizacji próbek robaka lub komórek, gdy używana jest odpowiednia ilość GTCp. W kontekście izolacji DNA, wydajność jest w dużym stopniu zależna od biegłości w odzyskiwaniu warstwy organicznej (różowej). Wreszcie, aby poprawić rozpuszczalność białek podczas izolacji, może być konieczne zwiększenie objętości buforu do rozpuszczania lub dodanie innych detergentów oprócz SDS. Rzeczywiście, białka z dorosłej populacji robaków zamiast mieszanki dorosłych osobników, larw i jaj są znacznie łatwiejsze do rozpuszczenia.
Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie tego protokołu zapewnia zintegrowane podejście do izolacji biomolekuł i ułatwia interpretację korelacji lub jej braku między poziomami mRNA i białek, które mogą powstać w wyniku oddzielnego zbierania biomolekuł z różnych próbek. Zastosowanie tej metody może pomóc naukowcom w prawidłowym zidentyfikowaniu przypadków, w których translacja mRNA na białko nie jest skorelowana i może prowadzić do głębszego zbadania potranskrypcyjnych i potranslacyjnych mechanizmów regulacyjnych w różnych warunkach.

Multiomika, podejście analityczne, które wykorzystuje kombinację omiki, takiej jak genom, proteom, transkryptom, epigenom, mikrobiom lub lipidom, staje się coraz bardziej popularne podczas przetwarzania dużych zbiorów danych w celu charakterystyki choroby1,2. Coraz więcej dowodów pokazuje, że ograniczenie podejścia do pojedynczego "ome" zapewnia niekompletną analizę molekularną (zrecenzowaną przez Rotroffa i Motsingera-Reif1). Generowane są duże zbiory danych, szczególnie w przypadku wykonywania badań przesiewowych przy użyciu technik o wysokiej przepustowości, ale w celu nakreślenia pełnego obrazu lub zidentyfikowania najistotniejszych celów preferowane są podejścia multiomiczne. Jednak przy zastosowaniu podejść multiomicznych często obserwuje się rozbieżności między poziomem mRNA a poziomem białka3,4,5,6. Warto zauważyć, że mRNA i białko używane do równoległych analiz transkryptomicznych i proteomicznych z sekwencjonowaniem RNA (RNAseq) i chromatografią cieczową z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) są często uzyskiwane z podobnie traktowanych próbek z różnych powtórzeń, potencjalnie wprowadzając różnice między tymi samymi warunkami3,4,5,6. Harvald i in. przeprowadzili eleganckie badanie przebiegu głodu C. elegans, w którym porównali transkryptom i proteom robaków typu dzikiego (WT) z transkryptomem i proteomem zmutowanych robaków hlh-30, które nie mają ważnego czynnika transkrypcyjnego w długowieczności7. Warto zauważyć, że RNA i białko zostały zebrane z tych samych replik warunków, a więc nie z tej samej próbki. Ich odkrycia wskazują na niską korelację między poziomami mRNA a poziomami białka w każdym punkcie czasowym (r = 0,559 do 0,628). W rzeczywistości ich mapa cieplna utworzyła cztery klastry: Klaster I miał duży spadek poziomu mRNA, ale niewielki lub żaden spadek odpowiadających mu poziomów białka, Klaster II miał niewielki lub żaden wzrost poziomu mRNA, ale wzrost poziomu białka, Klaster III miał wzrost poziomu mRNA, ale spadek poziomu białka, a Klaster IV miał wzrost poziomu mRNA, ale tylko subtelną zmianę poziomu białka4. Ponadto taka zmienność między próbkami może być wprowadzona w przypadkach, gdy próbki tego samego stanu nie są pobierane dokładnie w tym samym czasie. Na przykład mRNA i białka regulowane przez cykl okołodobowy zmieniają się w zależności od pory dnia8,9, a dokładniej ekspozycji C. elegans na światło9; Ekspresja tych białek okołodobowych może być opóźniona do 8 godzin po indukcji ekspresji genów10. Niemniej jednak rozpowszechnienie tej obserwacji niekoniecznie oznacza, że jest ona błędna; W rzeczywistości może się to okazać pouczające. Białko i mRNA są w stałym stanie dynamicznym między powstawaniem a degradacją. Co więcej, białka są często modyfikowane potranslacyjnie w celu zwiększenia stabilności lub wywołania ich degradacji11. Na przykład ich status ubikwitynacji może prowadzić do aktywacji lub kierowania do proteasomu lub lizosomu w celu degradacji12. Dodatkowo, niekodujące RNA odgrywają ważną rolę w regulacji ekspresji genów na etapie transkrypcji i posttranskrypcji13. W związku z tym pojawia się pytanie, jak ograniczyć zmienne, aby potwierdzić, że rozbieżności, które obserwujemy w tych badaniach nad nicieniami, są prawdziwe.
Tutaj proponujemy metodę, która usuwa zmienną międzypróbkową, umożliwiając analizę różnych makrocząsteczek z tej samej próbki. Celem tego protokołu jest zaoferowanie metody konsekwentnego izolowania DNA, RNA i białka z pojedynczej próbki C. elegans (określanej również jako robaki) w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji. Dodatkowe korzyści płynące z używania tej samej próbki obejmują oszczędność czasu i zasobów podczas pobierania próbek, ułatwienie analizy przekrojowej cennych i ograniczonych próbek, w tym szczepów, które są trudne do uprawy i utrzymania, oraz uzyskanie wglądu w różnicową regulację makrocząsteczek w oparciu o zmiany mRNA i poziomów białka w obrębie próbki.
Ta metoda jest odpowiednia do oceny ekspresji genów i poziomów białek z pojedynczej próbki robaków, co pozwala na bardziej wszechstronną ocenę wielu poziomów przetwarzania molekularnego. Odczynnik do tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu (GTCp)14, powszechnie stosowana substancja chemiczna do izolacji RNA, jest używana do ekstrakcji kwasów nukleinowych i białek z robaków, a następnie wytrącania, mycia i rozpuszczania każdego z nich. Ten protokół jest kompilacją różnych protokołów15,16 z niewielkimi modyfikacjami, zaprojektowanymi z naciskiem na C. elegans, ale udało nam się również wyizolować RNA, białko i DNA z osadu komórek HeLa, wykonując te same kroki. Chociaż nie został tutaj przetestowany, ten protokół prawdopodobnie będzie działał również na tkankach17,18.

<table><tbody><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN&reg; TGX bez plam i handlu; Żele białkowe</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CePAS7-s</td><td>DHSB- U z Iowa</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>CeTAC1-s</td><td>, DHSB- U z Iowa</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>DLG1-s,</td><td>DHSB- U z Iowa</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>GRP78</td>, <td>Novus Bio.</td><td>NBp1-06274</td><td></td></tr><tr><td>HRP Goat Anti-Mouse</td><td>Li-Cor</td><td>926-80010</td><td></td></tr><tr><td>HRP Goat Anti-Rabbit</td><td>Li-Cor</td><td>92680011</td><td></td></tr><tr><td>HSP60-s</td><td>DHSB-U stanu Iowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LMP1-s</td><td>DHSB- U stanu Iowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRP-1</td><td>Abcam</td><td>ab24102</td><td></td></tr><tr><td>Neuroligina 3</td><td>Abcam</td><td>ab172798</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-aktyna</td><td>Millipore</td><td>MAB1501R</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System obrazowania</td><td>BIORAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td>Zagrożenie dla zdrowia, Drażniące, Toksyczne</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>ThermoSci</td><td>20279</td><td></td></tr><tr><td>DC Test białka</td><td>BIORAD</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Epoch 2</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 proof)</td><td>Fisher</td><td>04-355-223</td><td>Łatwopalne, zagrażające zdrowiu</td></tr><tr><td>komórki HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>BSL2</td></tr><tr><td>iScript Odwrotna transkrypcja Supermix</td><td>BIORAD</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodozownik Hydra: Matrix Hydra</td><td>Robbins/ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A516-4</td><td>Łatwopalny, Zagrożenie dla zdrowia</td></tr><tr><td>< silny> bufor M9</silny>: 3 g KH2PO4 6 g Na2HPO4 5 g NaCl Dodać H2O do 1 litra. Sterylizuj w autoklawie. Po ostygnięciu roztworu dodać 1 ml sterylnego 1 M MgSO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (2x)</td><td>BIORAD</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Aparat NanoDrop One</td><td>ThermoSci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE</td><td>BIORAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60744</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>IDT</td><td></td><td>25 nmole DNA Oligo ze standardowym odsalaniem</td></tr><tr><td>dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA GGCAGTTGAG-3') R (5'-CACGTCCGTT AACCTCTCCC-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT GTCAACCCAG-3') R (5'-TCGTCAGGGT TGATTCCACG-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA ACGTGCTAAG-3') R (5'-GAGCAGTTGA GGTCCTTCCC-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT CGACGAGCGA-3') R (5'-CAACACCTCC TCCTGGAACG-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lmp-1: F (5'-ACAACAAC CGGACTCACG-3') R (5'-ATCGAGCTCC CACTCTTTGG-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC AAAGTTCCTC-3') R (5'-TGAGCACCTT GATCTCGTCG-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pas-7: F (5'-GTACGCTCAA AAGGCTGTCG-3') R (5'-CTGAATCGGC ATTGGCTCAC-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC GCTTGTTCTG-3') R (5'- AGTTCCAGTG CGGAGCATAC-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT GAAGGACTGT-3') R (5'-TGGCAATAGC TCCTCCGTTG-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>HK</silny> Aktyna: F (5'-CTACGAACTT CCTGACGGACAAG-3') R (5'-CCGGCGGACT CCATACC-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>HK</silny> cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT GGAGTTGTTC-3') R (5'-TCCGTAGATT GATTCACCAC-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>HK</silny> nhr-23: F (5'-CAGAAACACT GAAGAACGCG-3') R (5'-CGATCTGCAG TGAATAGCTC-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>HK</silny> ama-1: F (5'-TGGAACTCTG GAGTCACACC-3') R (5'-CATCCTCCTT CATTGAACGG-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>HK</silny> cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA GGAAGATTACG-3') R (5'-CTCGGACATT CTCGAATGAAG-3')</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT TCATCACTCAT-3') R (5'-ACACCGTCGA GAAGCTGTAGA-3')LightCycler</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>96 qPCR Maszyna</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8,0) 1 mM EDTA 1% Triton X-100 0,2% SDS 140 mM NaCl 1 tabletka inhibitora proteazy Roche na 20 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Supermix</td><td>BIORAD</td><td>1725274</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Max Sens Substrate</td><td>ThermoSci</td><td>34095</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do transferu Trans-Blot</td><td>BIORAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer Pack</td><td>BIORAD</td><td>170-4159</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Zagrożenie dla zdrowia (skóra, oczy)</td></tr><tr><td>< silne>Szczepy robaków:</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 (typ dziki</td>)<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eat-2 (MAH95)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rsks-1 (VB633)</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Pojedyncza próbka biologiczna zawiera mnóstwo informacji, a obecnie powszechną praktyką jest jednoczesne badanie kilku makromolekuł, aby uzyskać pełny obraz wielu poziomów przetwarzania molekularnego i zmian między różnymi warunkami. Protokół ten przedstawia metodę izolowania DNA, RNA i białka z tej samej próbki nicienia Caenorhabditis elegans w celu usunięcia zmienności wprowadzonej, gdy te biomolekuły są izolowane z powtórzeń podobnie traktowanych, ale ostatecznie różnych próbek. Kwasy nukleinowe i białko ekstrahuje się z nicieni metodą ekstrakcji kwasem tiocyjanian-fenol-chloroform guanidyny, a następnie wytrąca, przemywania i rozpuszczania każdego z nich. Pokazujemy udaną izolację RNA, DNA i białka z pojedynczej próbki z trzech szczepów nicieni i komórek HeLa, z lepszymi wynikami izolacji białek u dorosłych zwierząt. Dodatkowo, białko ekstrahowane tiocyjanianem guanidyny-fenolem-chloroformem z nicieni poprawia rozdzielczość większych białek, z lepszymi wykrywalnymi poziomami, co obserwuje się za pomocą immunoblottingu, w porównaniu z tradycyjną ekstrakcją białka RIPA.
Przedstawiona tutaj metoda jest przydatna podczas badania próbek przy użyciu podejścia multiomicznego, szczególnie do badania proteomu i transkryptomu. Techniki, które jednocześnie oceniają multiomikę, są atrakcyjne, ponieważ uważa się, że sygnalizacja molekularna leżąca u podstaw złożonych zjawisk biologicznych zachodzi na uzupełniających się poziomach; jednak coraz częściej można zaobserwować, że zmiany poziomów mRNA nie zawsze odzwierciedlają tę samą zmianę poziomu białka i że czas pobrania jest istotny w kontekście regulacji okołodobowych. Ta metoda usuwa wszelkie różnice między próbkami podczas oznaczania różnych zawartości w tej samej próbce (śródpróbce).

Przeanalizowano próbki RNA, DNA i białek, a w niniejszym opracowaniu przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane z izolacji RNA i białek. Dodatkowo porównano próbkę białka pobraną metodą GTCp z powszechnie stosowaną metodą lizy RIPA22. W naszym eksperymencie wykorzystano cztery niezależne powtórzenia dla każdego z nicieni typu dzikiego (WT, N2) oraz dwie linie mutantów długowiecznych, eat-2 i rsks-123,24.
Ilość i jakość RNA oraz DNA
Stężenie RNA po resuspensji w 50 µL wody wynosiło od 0,2 do 2 µg/µL, przy zastosowaniu około 3000 dorosłych nicieni jako materiału wyjściowego. Stosunki absorbancji świadczące o czystości wynosiły od 2,0 do 2,2 dla A260/A280 oraz od 1,9 do 2,5 dla A260/A230 (Tabela 1), co wskazuje na pomyślną ekstrakcję RNA bez zanieczyszczeń składnikami GTCp, takimi jak fenol czy chlorowodorek guanydyny.
Ekstrakcja DNA przebiegła pomyślnie, jednak uzyskana jakość była zmienna. Stężenie DNA po resuspensji w 150 µL NaOH wynosiło od 0,04 do 1,1 µg/µL. Stosunki absorbancji wahały się od 1,8 do 2,1 dla A260/A280 oraz od 0,9 do 1,6 dla A260/A230 (Tabela 1), co wskazuje na pomyślną ekstrakcję DNA; niektóre próbki były jednak zanieczyszczone składnikami GTCp, takimi jak fenol lub chlorowodorek guanydyny. W przypadku konieczności izolacji DNA należy zachować szczególną ostrożność podczas oddzielania warstwy środkowej podczas separacji faz GTCp; może być wymagane przeprowadzenie większej liczby przemyć.
RT-qPCR wybranych celów
Izolacja RNA z czterech niezależnych próbek każdego szczepu nicieni przebiegła pomyślnie i materiał został przekazany do analizy RNAseq, a następnie przeprowadzono analizę RT-qPCR przy użyciu supermieszanki zawierającej barwnik cyjaninowy. Cele analizowane metodą RT-qPCR wybrano z dużego zbioru danych RNAseq na podstawie genów o największej różnicy w regulacji, wspólnych dla obu mutantów w porównaniu z nicieniami typu WT. Wybranym, wspólnie nadregulowanym celem był F07C4.1225, homolog ludzkiej neuroliginy 3, izoformy b. Do dodatkowej analizy włączono również gen różnicowo regulowany pomiędzy oboma mutantami, mrp-126, który był nadregulowany u nicieni eat-2, ale niedoregulowany u nicieni rsks-1. Zmiany ekspresji mrp-1 potwierdzono za pomocą RT-qPCR; jednak nadregulacja F07C4.12 u nicieni rsks-1, przewidziana przez analizę RNAseq, nie została stwierdzona w badaniu RT-qPCR (Rysunek 1).
Zbadano również dodatkowe cele z przeciwciałami zwalidowanymi dla nicieni. Obejmowały one kilka markerów organelli scharakteryzowanych w pracy Hadwiger et al.27. Liczba tych markerów wykazywała różnicową ekspresję na poziomie mRNA u nicieni mutantów. Jak pokazano na Ryc. 1, lmp-128 oraz dlg-129 były nadmiernie ekspresjonowane u nicieni eat-2; hsp-430, hsp-7030 oraz lmp-1 były nadmiernie ekspresjonowane u nicieni rsks-1; hsp-6031 oraz pas-732 wykazywały obniżoną ekspresję u nicieni eat-2; hsp-60 oraz tac-133 wykazywały obniżoną ekspresję u nicieni rsks-1.
Przygotowanie białek metodą symultaniczną w porównaniu z metodą RIPA
Aby potwierdzić wydajność i jakość białka otrzymanego metodą GTCp opisaną powyżej, porównaliśmy ją z białkiem pozyskanym przy użyciu bardziej tradycyjnej metody lizy RIPA22. Przy zastosowaniu tej samej ilości materiału wyjściowego, mianowicie wyłącznie osobników dorosłych (około 10 000 nicieni) lub mieszanej populacji osobników dorosłych, larw i jaj (około 130 000 nicieni), całkowita ilość białka pozyskanego metodą GTCp była mniejsza po resuspensji w jednakowych objętościach końcowych (Tabela 1); jednakże ekstrakcja z populacji składającej się wyłącznie z osobników dorosłych była bardziej skuteczna niż z populacji mieszanej. Dodatkowo jakość białek była zbliżona, choć białko ekstrahowane metodą GTCp wykazało lepszą rozdzielczość większych białek przy równym obciążeniu całkowitym białkiem, co wykazano w barwieniu Coomassie na Rysunku 2. Rzeczywiście, cele oceniane za pomocą western blotu na Rysunku 3 wykazały w większości przypadków podobne poziomy; jednak białka większe niż 75 kDa wykazywały niższe poziomy w białku ekstrahowanym metodą RIPA w porównaniu do białka ekstrahowanego metodą GTCp (Rysunek 3A, prawa ścieżka; Rysunek 3B, żółty słupek).
Opisana tutaj metoda ekstrakcji została oceniona również w linii komórkowej ssaków HeLa. Dla odniesienia, ilość białka wyekstrahowanego za pomocą buforu RIPA z zwartego osadu sześciu milionów komórek HeLa (osad o objętości ~25 µL) była porównywalna z ilością wyekstrahowaną z mieszanej populacji 130 000 nicieni (zwarty osad o objętości ~75 µL), lub stanowiła około połowy ilości wyekstrahowanej z 10 000 dorosłych nicieni (osad osadzony grawitacyjnie o objętości ~100 µL), co przedstawiono w Tabeli 1. Wykazaliśmy, że wydajność ekstrakcji białek (Tabela 1) oraz rozdzielczość większych białek (Rysunek 2) były niższe w przypadku GTCp w porównaniu do białek wyekstrahowanych buforem RIPA w komórkach HeLa, co sugeruje, że technika ta sprawdza się lepiej w populacji dorosłych nicieni. Niepełna solubilizacja osadu białkowego z białek HeLa wyekstrahowanych za pomocą GTCp może być ograniczeniem tej metody w komórkach ssaków.
Cele immunoblottingu analizowane metodą RT-qPCR
Następnie zbadano poziomy białek produktów genów analizowanych metodą RT-qPCR, aby ustalić, czy poziomy mRNA korelują z poziomami białek. Jak widać na Rysunku 3, średnie zmiany ekspresji białek korelowały ze średnimi zmianami ekspresji mRNA dla wielu celów; jednak niektóre poziomy białek nie odzwierciedlały zmian w poziomach mRNA. Często poziomy mRNA w nicieniach eat-2 były wyższe niż w pozostałych szczepach, ale poziomy białek dla tego samego celu były takie same lub niższe niż w pozostałych szczepach. Najbardziej udergającą obserwacją były bardzo wysokie poziomy mRNA dlg-1 w nicieniach eat-2 , co nie przełożyło się na większą ilość białka; w rzeczywistości poziomy białka dlg-1 były niższe w porównaniu z pozostałymi szczepami (Rysunek 3).
Wreszcie, poziomy w białku ekstrahowanym za pomocą GTCp oraz w białku ekstrahowanym za pomocą RIPA wykazały uderzającą różnicę. RNA ekstrahowano w ten sam sposób dla obu próbek; jednak w podobnej, lecz oddzielnej próbce pobranej podczas lizy RIPA odnotowano wyraźnie obniżone poziomy białek, szczególnie tych o masie większej niż 75 kDa (Rycina 3A, prawa kolumna; Rycina 3B, żółty słupek).
Porównanie poziomu mRNA i białka w obrębie próbki
Jednym z celów tego protokołu było ustalenie, czy zaobserwowana zmienność na poziomie mRNA i białek była rzeczywista, czy też mogła być artefaktem wynikającym z różnic między próbkami. Na Rysunku 4 porównano podzbiór celów w obrębie pojedynczych próbek. Każda poszczególna próbka jest przedstawiona za pomocą kropki w tym samym odcieniu i kolorze, gdzie próbka 1 ma najciemniejszy odcień, a próbka 4 najjaśniejszy odcień szarości (WT), niebieskiego (eat-2) lub czerwonego (rsks-1). W większości próbek odnotowano niską zmienność poziomów mRNA, przy większej zmienności na poziomie białek, co jest potencjalną wadą półilościowej analizy western blot. Analizując położenie kolorowych kropek w parach mRNA i białek, kolejność od najwyższego do najniższego poziomu często była niezgodna; na przykład w WT kolejność mRNA dla hsp-60 wynosiła: próbka 4, 3, 2, 1, natomiast poziomy białek były: 1, 2, 3, 4. Zatem różnice między poziomami mRNA i białek w obrębie jednej próbki z pewnością istnieją, jednak przedstawiona metoda pozwala użytkownikom wyeliminować czas pobrania jako możliwe źródło zaobserwowanych różnic.
<img alt="Tabela z wynikami stężeń RNA, DNA i białek; porównanie danych dotyczących stosunku RNA/DNA i stężeń." src="/files/ftp_upload/59178/59178table1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Stężenia i stosunki absorbancji. Stężenia RNA i DNA oraz stosunki czystości zmierzono za pomocą spektrofotometru. Stężenia białek określono za pomocą kolorymetrycznego testu ilościowego białek. Kolor szary, niebieski i czerwony wyróżniają próbki wykorzystane do RT-qPCR i western blot. Kolor żółty wskazuje próbki użyte do porównania ekstrakcji białek metodą GTCp z metodą RIPA lub białek nicieni z białkami HeLa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/Table_1.xlsx">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
<img alt="Porównanie poziomów mRNA; wykres słupkowy; WT, eat-2, rsks-1; analiza ekspresji; znormalizowane dane." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ekspresja genów metodą RT-qPCR. Analiza RT-qPCR dla mRNA otrzymanego tą metodą, potwierdzająca cele zidentyfikowane na podstawie danych RNAseq, oraz dla genów markerów organelli. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe; n = 4. Stężenie mRNA określono na podstawie krzywej standardowej dla każdego zestawu starterów. Wszystkie poziomy mRNA znormalizowano do średniej z zestawu sześciu genów housekeeping użytych jako geny referencyjne, do których należą act-1, cdc-42, ama-1, nhr-23, pmp-3 oraz cyn-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej SDS-PAGE, rozdział białek według masy cząsteczkowej w kDa z próbek nicieni i komórek HeLa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Porównanie białek wyekstrahowanych za pomocą buforu GTCp oraz RIPA z nicieni i komórek HeLa. Całkowite białko z nicieni typu dzikiego (WT) lub komórek HeLa, pozyskane metodą lizy GTCp lub RIPA, rozdzielone za pomocą SDS-PAGE i barwione błękitem Coomassie. Każda ścieżka zawiera 25 µg całkowitego białka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Western blot i wykres słupkowy przedstawiające poziomy białek w różnych szczepach genetycznych, znormalizowane względem β-actin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Poziomy białek u nicieni. (A) Western blot analizowanych cel badawczych RT-qPCR oraz (B) analiza densytometryczna intensywności sygnału. Każda ścieżka zawiera 20 µg całkowitego białka wyekstrahowanego metodą GTCp z nicieni typu dzikiego (WT), mutantów eat-2 lub rsks-1. Przedstawiony obraz jest reprezentacją czterech niezależnych powtórzeń dla każdego szczepu nicieni. β-actin (na dole) służył jako kontrola równego załadunku dla każdego celu; pokazano tylko jeden reprezentatywny zestaw. Prawa ścieżka zawiera 20 µg całkowitego białka wyekstrahowanego buforem RIPA z nicieni mutantów rsks-1. (B) Odpowiednie intensywności sygnału zostały ilościowo określone przy użyciu programu ImageJ. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe; n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza ekspresji genów, poziomy mRNA i białek; wykres porównawczy: WT, geny docelowe eat-2, rsks-1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59178/59178fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Porównanie poziomów mRNA i białek w obrębie próbek. Zestawiono poziomy mRNA i białek z pojedynczych próbek dla podzbioru celów dla każdego szczepu. Kolory odpowiadają oznaczeniom w Tabeli 1. Kolor szary/czarny oznacza WT, niebieski eat-2, a czerwony rsks-1. mRNA i białko tego samego celu są sparowane obok siebie i rozdzielone według szczepu nicieni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59178/59178fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Wykorzystanie tego protokołu do usunięcia zmienności między próbkami może zapewnić wgląd w różnicową regulację makrocząsteczek na podstawie rozbieżności między poziomami mRNA i białek w obrębie próbki. Użycie tej samej próbki do wyizolowania DNA, RNA i białka jest próbą zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji. Korzyści obejmują oszczędność czasu i zasobów w czasie pobierania próbek oraz analizy przekrojowej cennych i ograniczonych próbek.Na początek wysiej 1 000 jaj robaków na jednej 10-centymetrowej płytce z odpowiednimi warunkami wzrostu. Inkubować w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Następnie umyj płytkę 5 mililitrami buforu M9 i przenieś 1 000 dorosłych robaków do probówki.Odwirować robaki przy 1 000 g przez jedną minutę, wyrzucić supernatant i przenieść granulowane robaki z jednym mililitrem buforu M9 do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. Odwirować ponownie przy 845 g przez jedną minutę i wyrzucić większość supernatantu. Przechowuj granulowane robaki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez ponad cztery godziny.Następnie usuń sklarowany sklarant z rozmrożonego osadu. Dodać jeden mililitr zimnego odczynnika GTCP, dobrze wymieszać pipetując w górę iw dół i umieścić próbkę na lodzie na 10 minut. Następnie dodaj 200 mikrolitrów zimnego chloroformu.Potrząsaj energicznie probówką przez 15 sekund i pozostaw ją w temperaturze pokojowej na trzy minuty. Następnie odwirować probówkę o masie 13 500 g w czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Za pomocą mikropipety przenieś przezroczystą górną warstwę do nowej, wolnej od RNaz 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.Przenieś mętną białą warstwę interfazową do nowej probówki oznaczonej B2 i przenieś różową warstwę z pozostałego osadu do nowej probówki oznaczonej B i umieść obie na lodzie. Wyraźne oddzielenie tych trzech warstw może być trudne. Zalecam przeniesienie mętnej warstwy interfazowej do własnej probówki, zamiast wytrącania DNA z tej warstwy z warstwy organicznej lub różowej.Aby wyizolować RNA, najpierw dodaj 500 mikrolitrów 100% izopropanolu do probówki A, aby wytrącić RNA. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji odwirować probówkę o masie 13,500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie wyrzuć supernatant i dodaj jeden mililitr 75% etanolu do probówki A, aby umyć osad. Odwirować probówkę o masie 5,300 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na powietrzu przez pięć do 10 minut.Dodaj 50 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, aby rozpuścić osad RNA i inkubuj osad w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby go rozpuścić. Na koniec użyj spektrofotometru do zmierzenia stężenia wyizolowanego RNA na poziomie 260 nanometrów i zidentyfikowania wszelkich zanieczyszczeń na głębokości 230 i 280 nanometrów. Aby wyizolować DNA, najpierw dodaj 300 mikrolitrów 100% etanolu do fazy organicznej w probówce B i do mętnej białej warstwy w probówce B2, aby wytrącić DNA, wymieszaj przez odwrócenie i pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na dwie do trzech minut.Następnie odwirować probówki B i B2 w temperaturze 376 g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby osadzać DNA. Połączyć supernatant z probówek B i B2 w nowej dwumililitrowej probówce oznaczonej jako C i pozostawić na lodzie w celu późniejszej izolacji białka. Następnie przemyj osad DNA w probówce B2 jednym mililitrem 0,1-molowego cytrynianu sodu w 10% etanolu przez 30 minut.Probówkę wirówkową B2 o masie 376 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Powtórz etap prania, a następnie ponownie zawieś granulat w 1,5 mililitra 75% etanolu i pozostaw w temperaturze pokojowej na 20 minut. Następnie odwirować probówkę B2 o masie 376 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia przez pięć do 10 minut.Rozpuść osad w 150 mikrolitrach ośmiomililitrowego wodorotlenku sodu. Następnie odwirować próbkę o masie 376 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Na koniec za pomocą mikropipety przenieś supernatant zawierający DNA do nowej probówki.Za pomocą spektrofotometru zmierz stężenie wyizolowanego DNA na głębokości 260 nanometrów oraz na głębokości 230 i 280 nanometrów. Aby wytrącić białko, najpierw dodaj do 1,5 mililitra 100% izopropanolu do różowego supernatantu w probówce C, wymieszaj przez kilkakrotne odwrócenie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odwirować probówkę C o masie 13 500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Odrzucić supernatant i przemyć osad dwoma mililitrami 0,3-molowego chlorowodorku guanidyny w 95% etanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie odwirować probówkę przy 5,300 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i powtórzyć etap mycia jak poprzednio. Przenieś granulkę białka do nowej 1,5-mililitrowej probówki oznaczonej C2 i dodaj do 1,5 mililitra 95% etanolu, odwiruj i pozostaw w temperaturze pokojowej na 20 minut.Odwirować probówkę o masie 5,300 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie rozpuść granulat w 300 mikrolitrach 5% SDS w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 60 minut.Na koniec odwirować probówkę o masie 13 500 g w temperaturze 17 stopni Celsjusza przez 10 minut. I przenieść supernatant zawierający białko do nowej probówki. Aby wykonać ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją.Najpierw użyj jednego nanograma wyizolowanego RNA do przygotowania cDNA przez odwrotną transkrypcję. Aby sporządzić podstawową płytkę cDNA, dodaj 100 mikrolitrów od jednego do 100 rozcieńczeń każdej próbki cDNA do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki, uwzględnij odpowiednie kontrole, takie jak studzienki z samą wodą i seryjnie rozcieńczane próbki, w celu ustalenia wydajności startera dla każdego genu. Aby przygotować mieszankę wzorcową dla każdego zestawu starterów, dodaj do siedmiu mikrolitrów wody, barwnika cyjankowego interkalującego DNA i po pięć mikromolowców starterów do przodu i do tyłu.Dodać siedem mikrolitrów mieszanki wzorcowej do odpowiednich dołków płytki RT-qPCR. Następnie dodaj trzy mikrolitry cDNA z płytki podstawowej i uruchom płytkę przy użyciu protokołu RT-qPCR odpowiedniego dla używanych starterów. Przeprowadzono analizę RT-qPCR izolowanych mRNA z czterech niezależnych próbek trzech szczepów robaków w celu potwierdzenia celów zidentyfikowanych za pomocą testu sekwencyjnego RNA.Gen F07C4.12 był regulowany w górę w obu testach u robaków eat-2, ale jego regulacja w górę u robaków rsks-1 nie została wykryta w teście RT-qPCR. Ponadto, sekwencja RNA wykryła zmiany ekspresji mrp-1 w robakach eat-2 i rsks-1 zostały potwierdzone za pomocą RT-qPCR. Regulacja w górę lub w dół genów markerów organelli u zmutowanych robaków została również wykryta za pomocą analizy RT-qPCR.Porównanie białka GTCp z białkiem ekstrahowanym przez RIPA u robaków oddzielonych stroną SDS i wybarwionych błękitem coomassie wykazało podobną jakość z lepszą rozdzielczością większych białek dla białek ekstrahowanych GTCp. Analiza Western blot wykazała podobny poziom białka w większości przypadków; jednak białka większe niż 75 kilodaltonów wykazywały niższe poziomy w białku ekstrahowanym przez RIPA. Porównanie docelowych poziomów mRNA i białek z czterech pojedynczych próbek trzech szczepów robaków wykazało niską zmienność poziomów mRNA przy większej zmienności na poziomie białka.W kontekście izolacji DNA, wydajność jest w dużym stopniu zależna od biegłości w odzyskiwaniu mętnej warstwy interfazowej z warstwy organicznej lub różowej. Aby poprawić solubilizację białek z osadu, konieczne może być zwiększenie objętości buforu rozpuszczającego lub dodanie innych detergentów oprócz SDS. Zastosowanie tej metody może pomóc w prawidłowej identyfikacji przypadków, w których translacja mRNA do białka nie jest korelcyjna i może prowadzić do głębszego zbadania potranskrypcyjnych i potranslacyjnych mechanizmów regulacyjnych w różnych warunkach.W naszym laboratorium protokół ten został wykorzystany do konserwacji cennych i ograniczonych czasowo próbek rdzeniowych. Co więcej, mogę sobie wyobrazić, że byłby to użyteczny protokół do przyjęcia w dziedzinie rytmu okołodobowego. Odczynnik GCTP i rozpuszczalniki stosowane w izolacji RNA stanowią zagrożenie i należy ich używać ostrożnie.

combined-nucleotide-and-protein-extractions-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

W tym artykule opisujemy zoptymalizowaną procedurę ekstrakcji i analizy prostaglandyn i innych eikozanoidów z C. elegans za pomocą LC-MS/MS.

Ekstrakcja i analiza prostaglandyn w Caenorhabditis elegans

Celem przedstawionej tutaj metody jest zbadanie agregacji białek podczas normalnego starzenia się w modelowym organizmie C. elegans. Protokół stanowi potężne narzędzie do badania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów, które tworzą się wraz z wiekiem i do określenia, w jaki sposób zmiany w proteostazie wpływają na agregację białek.

Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans

Ten artykuł przedstawia metody generowania, oczyszczania i ilościowego oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans.

Oczyszczanie i analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Ta metoda opisuje protokół wysokoprzepustowego przygotowania ekstraktu białkowego z próbek Caenorhabditis elegans i późniejszej koimmunoprecypitacji.

Preparat ekstraktu białkowego i koimmunoprecypitacja z Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Prezentowany tutaj jest opis prostej i stosunkowo szybkiej izolacji genomowego DNA Caenorhabditis elegans od jednego lub kilku zwierząt przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu tkanek. Otrzymany preparat gDNA jest odpowiednią matrycą do PCR.

Ekstrakcja genomowego DNA Caenorhabditis elegans na małą skalę

Obecny protokół opisuje metody suplementacji lipidów w kulturach płynnych i na płytkach dla Caenorhabditis elegans, w połączeniu z badaniami podłużnymi i analizą transkrypcji genów z dużej ilości lub kilku robaków i tkanek robaków.

Suplementacja lipidów w celu długowieczności i analizy transkrypcji genów w Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę jednoczesnej izolacji RNA, DNA i białka z próbek Caenorhabditis elegans. Protokół zmniejsza zmienność międzypróbkową i poprawia powtarzalność wyników badań molekularnych.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów