Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Wykorzystanie tego protokołu do usunięcia zmienności między próbkami może zapewnić wgląd w różnicową regulację makrocząsteczek na podstawie rozbieżności między poziomami mRNA i białek w obrębie próbki. Użycie tej samej próbki do wyizolowania DNA, RNA i białka jest próbą zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji. Korzyści obejmują oszczędność czasu i zasobów w czasie pobierania próbek oraz analizy przekrojowej cennych i ograniczonych próbek.

Na początek wysiej 1 000 jaj robaków na jednej 10-centymetrowej płytce z odpowiednimi warunkami wzrostu. Inkubować w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Następnie umyj płytkę 5 mililitrami buforu M9 i przenieś 1 000 dorosłych robaków do probówki.

Odwirować robaki przy 1 000 g przez jedną minutę, wyrzucić supernatant i przenieść granulowane robaki z jednym mililitrem buforu M9 do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. Odwirować ponownie przy 845 g przez jedną minutę i wyrzucić większość supernatantu. Przechowuj granulowane robaki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez ponad cztery godziny.

Następnie usuń sklarowany sklarant z rozmrożonego osadu. Dodać jeden mililitr zimnego odczynnika GTCP, dobrze wymieszać pipetując w górę iw dół i umieścić próbkę na lodzie na 10 minut. Następnie dodaj 200 mikrolitrów zimnego chloroformu.

Potrząsaj energicznie probówką przez 15 sekund i pozostaw ją w temperaturze pokojowej na trzy minuty. Następnie odwirować probówkę o masie 13 500 g w czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Za pomocą mikropipety przenieś przezroczystą górną warstwę do nowej, wolnej od RNaz 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Przenieś mętną białą warstwę interfazową do nowej probówki oznaczonej B2 i przenieś różową warstwę z pozostałego osadu do nowej probówki oznaczonej B i umieść obie na lodzie. Wyraźne oddzielenie tych trzech warstw może być trudne. Zalecam przeniesienie mętnej warstwy interfazowej do własnej probówki, zamiast wytrącania DNA z tej warstwy z warstwy organicznej lub różowej.

Aby wyizolować RNA, najpierw dodaj 500 mikrolitrów 100% izopropanolu do probówki A, aby wytrącić RNA. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji odwirować probówkę o masie 13,500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie wyrzuć supernatant i dodaj jeden mililitr 75% etanolu do probówki A, aby umyć osad. Odwirować probówkę o masie 5,300 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na powietrzu przez pięć do 10 minut.

Dodaj 50 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, aby rozpuścić osad RNA i inkubuj osad w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby go rozpuścić. Na koniec użyj spektrofotometru do zmierzenia stężenia wyizolowanego RNA na poziomie 260 nanometrów i zidentyfikowania wszelkich zanieczyszczeń na głębokości 230 i 280 nanometrów. Aby wyizolować DNA, najpierw dodaj 300 mikrolitrów 100% etanolu do fazy organicznej w probówce B i do mętnej białej warstwy w probówce B2, aby wytrącić DNA, wymieszaj przez odwrócenie i pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na dwie do trzech minut.

Następnie odwirować probówki B i B2 w temperaturze 376 g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby osadzać DNA. Połączyć supernatant z probówek B i B2 w nowej dwumililitrowej probówce oznaczonej jako C i pozostawić na lodzie w celu późniejszej izolacji białka. Następnie przemyj osad DNA w probówce B2 jednym mililitrem 0,1-molowego cytrynianu sodu w 10% etanolu przez 30 minut.

Probówkę wirówkową B2 o masie 376 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Powtórz etap prania, a następnie ponownie zawieś granulat w 1,5 mililitra 75% etanolu i pozostaw w temperaturze pokojowej na 20 minut. Następnie odwirować probówkę B2 o masie 376 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia przez pięć do 10 minut.

Rozpuść osad w 150 mikrolitrach ośmiomililitrowego wodorotlenku sodu. Następnie odwirować próbkę o masie 376 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Na koniec za pomocą mikropipety przenieś supernatant zawierający DNA do nowej probówki.

Za pomocą spektrofotometru zmierz stężenie wyizolowanego DNA na głębokości 260 nanometrów oraz na głębokości 230 i 280 nanometrów. Aby wytrącić białko, najpierw dodaj do 1,5 mililitra 100% izopropanolu do różowego supernatantu w probówce C, wymieszaj przez kilkakrotne odwrócenie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odwirować probówkę C o masie 13 500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Odrzucić supernatant i przemyć osad dwoma mililitrami 0,3-molowego chlorowodorku guanidyny w 95% etanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie odwirować probówkę przy 5,300 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i powtórzyć etap mycia jak poprzednio. Przenieś granulkę białka do nowej 1,5-mililitrowej probówki oznaczonej C2 i dodaj do 1,5 mililitra 95% etanolu, odwiruj i pozostaw w temperaturze pokojowej na 20 minut.

Odwirować probówkę o masie 5,300 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie rozpuść granulat w 300 mikrolitrach 5% SDS w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 60 minut.

Na koniec odwirować probówkę o masie 13 500 g w temperaturze 17 stopni Celsjusza przez 10 minut. I przenieść supernatant zawierający białko do nowej probówki. Aby wykonać ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją.

Najpierw użyj jednego nanograma wyizolowanego RNA do przygotowania cDNA przez odwrotną transkrypcję. Aby sporządzić podstawową płytkę cDNA, dodaj 100 mikrolitrów od jednego do 100 rozcieńczeń każdej próbki cDNA do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki, uwzględnij odpowiednie kontrole, takie jak studzienki z samą wodą i seryjnie rozcieńczane próbki, w celu ustalenia wydajności startera dla każdego genu. Aby przygotować mieszankę wzorcową dla każdego zestawu starterów, dodaj do siedmiu mikrolitrów wody, barwnika cyjankowego interkalującego DNA i po pięć mikromolowców starterów do przodu i do tyłu.

Dodać siedem mikrolitrów mieszanki wzorcowej do odpowiednich dołków płytki RT-qPCR. Następnie dodaj trzy mikrolitry cDNA z płytki podstawowej i uruchom płytkę przy użyciu protokołu RT-qPCR odpowiedniego dla używanych starterów. Przeprowadzono analizę RT-qPCR izolowanych mRNA z czterech niezależnych próbek trzech szczepów robaków w celu potwierdzenia celów zidentyfikowanych za pomocą testu sekwencyjnego RNA.

Gen F07C4.12 był regulowany w górę w obu testach u robaków eat-2, ale jego regulacja w górę u robaków rsks-1 nie została wykryta w teście RT-qPCR. Ponadto, sekwencja RNA wykryła zmiany ekspresji mrp-1 w robakach eat-2 i rsks-1 zostały potwierdzone za pomocą RT-qPCR. Regulacja w górę lub w dół genów markerów organelli u zmutowanych robaków została również wykryta za pomocą analizy RT-qPCR.

Porównanie białka GTCp z białkiem ekstrahowanym przez RIPA u robaków oddzielonych stroną SDS i wybarwionych błękitem coomassie wykazało podobną jakość z lepszą rozdzielczością większych białek dla białek ekstrahowanych GTCp. Analiza Western blot wykazała podobny poziom białka w większości przypadków; jednak białka większe niż 75 kilodaltonów wykazywały niższe poziomy w białku ekstrahowanym przez RIPA. Porównanie docelowych poziomów mRNA i białek z czterech pojedynczych próbek trzech szczepów robaków wykazało niską zmienność poziomów mRNA przy większej zmienności na poziomie białka.

W kontekście izolacji DNA, wydajność jest w dużym stopniu zależna od biegłości w odzyskiwaniu mętnej warstwy interfazowej z warstwy organicznej lub różowej. Aby poprawić solubilizację białek z osadu, konieczne może być zwiększenie objętości buforu rozpuszczającego lub dodanie innych detergentów oprócz SDS. Zastosowanie tej metody może pomóc w prawidłowej identyfikacji przypadków, w których translacja mRNA do białka nie jest korelcyjna i może prowadzić do głębszego zbadania potranskrypcyjnych i potranslacyjnych mechanizmów regulacyjnych w różnych warunkach.

W naszym laboratorium protokół ten został wykorzystany do konserwacji cennych i ograniczonych czasowo próbek rdzeniowych. Co więcej, mogę sobie wyobrazić, że byłby to użyteczny protokół do przyjęcia w dziedzinie rytmu okołodobowego. Odczynnik GCTP i rozpuszczalniki stosowane w izolacji RNA stanowią zagrożenie i należy ich używać ostrożnie.