Name: Nowy ludzki nabłonkowy enteroidalny model martwiczego zapalenia jelit (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę hodowli ludzkich enteroidów z komórek macierzystych jelita noworodkowego do badania martwiczego zapalenia jelit. Model ten pozwala na etyczne testowanie czynników terapeutycznych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Health Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Disease Grant (K08DK106450) oraz nagrodę Jay Grosfeld Award od American Pediatric Surgical Association dla C.J.H.

Uzyskano zgodę instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB #2013-15152) na pobieranie próbek tkanek od pacjentów poddawanych resekcji jelita w Szpitalu Dziecięcym Ann and Robert H. Lurie w Chicago, Chicago, IL. Wszystkie protokoły zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi i przepisami dotyczącymi dobrostanu człowieka. We wszystkich przypadkach wymagana była pisemna świadoma zgoda rodziców, którą uzyskano przed pobraniem próbki.
1. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór podstawowy pożywki hodowlanej do pobrania całych tkanek: 1 l zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 110 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 11 ml penicyliny-streptomycyny (stężenie końcowe 1%) i 1,1 ml insuliny sterylizowanej filtrem (stężenie końcowe 0,1%). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj bufor chelatujący #1: 30 ml pożywki hodowlanej (zgodnie z opisem w 1.1), 600 μl 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (końcowe stężenie 10 mM), 300 μl gentamycyny (stężenie końcowe 1%) i 60 μl amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj bufor chelatujący #2: 30 ml pożywki hodowlanej (zgodnie z opisem w 1.1), 300 μl 0,5 M EDTA (stężenie końcowe 5 mM), 300 μl gentamycyny (stężenie końcowe 1%) i 60 μl amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotowanie pożywki dla ludzkich minijelit: 41,4 ml DMEM/F-12, 5 ml FBS (końcowe 10%), 500 μL penicyliny-streptomycyny (końcowe stężenie 1%), 500 μL L-glutaminy (końcowe stężenie 1%), 500 μL gentamycyny (końcowe stężenie 1%), 100 μL amfoterycyny B (końcowe stężenie 0,2%), 500 μL 1 M kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowego (HEPES) (stężenie końcowe 10 mM), 500 μl 100x suplementu N-2 i 1 ml 50x suplementu B-27 minus witamina A, co daje całkowitą objętość 50 ml. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotowanie kompletnego ludzkiego podłoża dla minijelitów: 10 ml ludzkiego podłoża dla minijelita (przygotowanego w 1.4), 10 μl 100 μg/ml Wnt3a (stężenie końcowe 100 ng/mL), 10 μl 100 μg/ml Noggin (stężenie końcowe 100 ng/mL), 10 μL 1 mg/ml R-Spondyny (stężenie końcowe 1 μg/mL), 10 μL 500 μg/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) (stężenie końcowe 50 ng/ml), 10 μL 1 M N-acetylocysteiny (stężenie końcowe 1 mM), 10 μL 10 mM Y-27632 (stężenie końcowe 10 μM), 10 μL 500 μM A-83 (stężenie końcowe 500 nM), 10 μL 10 mM SB202190 (stężenie końcowe 10 μM), 100 μl 1 M nikotynamidu (stężenie końcowe 10 mM) i 1 μl 100 μM [leu] 15-gastryna 1 (stężenie końcowe 10 nM). Całkowita objętość 10 ml. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Roztwory należy zużyć w ciągu 48 godzin.</li>
</ol>
2. Izolacja krypty i poszycie z całej tkanki
<ol>
	<li>W momencie pobierania na salę operacyjną należy umieścić próbkę ludzkiej tkanki jelita cienkiego w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Umyj próbkę w zimnym DPBS, aż będzie wolna od stolca i krwi. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C w pożywce RPMI 1640 do czasu, aż będzie gotowa do izolacji krypty. 
	nuta: Tkanka nie może być przechowywana dłużej niż 24 godziny.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że próbka jest wolna od stolca i krwi. Za pomocą delikatnych nożyczek preparacyjnych usuń nadmiar tłuszczu lub klipsy chirurgiczne/zszywki itp. Zważyć próbkę. 
		nuta: Celuj w kawałek o wadze około 0,75-2,5 g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokrój próbkę na kawałki o długości 0,5 cm i umieść w 30 ml buforu chelatującego #1 (przygotowanego w kroku 1.2).
	<ol>
		<li>Wstrząsać na niskich obrotach przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przefiltruj tkankę przez sitko komórkowe 100 μm i przeprowadź przez nie przepływ odrzutów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj tkankę do 30 ml buforu chelatującego #2 (przygotowanego w kroku 1.3).
	<ol>
		<li>Wstrząsać na niskich obrotach przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przefiltruj tkankę przez sitko o średnicy 100 μm i przepuść przez nie odrzut</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrozić 500 ml matrycy błony podstawnej na lodzie do użycia w kroku 2.8.</li>
	<li>Dodaj chusteczkę do 10 ml zimnego DMEM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i energicznie wstrząsaj ręcznie przez 10 s.
	<ol>
		<li>Przefiltruj przez sitko o wielkości 100 μm i zbierz przez nie przepływ (etykieta #1). Trzymaj rurkę #1 na lodzie.</li>
		<li>Dodaj tkankę do kolejnych 10 ml zimnego DMEM w osobnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i energicznie wstrząsaj ręcznie przez 10 s.</li>
		<li>Przefiltruj przez sitko o wielkości 100 μm i zbierz przez nie (etykieta #2).</li>
		<li>Powtórz jeszcze dwa razy, aż pojawią się cztery stożkowe rurki z przepływem (oznaczone rurki #1-4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltruj roztwór probówki #1 przez sitko o pojemności 100 μm i przenieś przepływ do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (etykieta #1). Powtórz dla #2-4.
	<ol>
		<li>Odwirować 15 ml probówki #1-4 przy 200 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W okapie z przepływem laminarnym usuń supernatant z probówek #1-4 i wyrzuć. Należy unikać rozerwania chmury tkanki znajdującej się bezpośrednio nad osadem, nawet jeśli oznacza to pozostawienie części supernatantu.
	<ol>
		<li>Pipetując powoli, wymieszać granulki z pozostałościami supernatantu w probówkach #1-4.</li>
		<li>Przenieś mieszaninę z probówek #1-4 do jednej stożkowej probówki o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Odwirować stożkową probówkę o masie 200 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl matrycy membrany podstawnej. 
	UWAGA: Utrzymuj matrycę błony podstawnej na lodzie przez cały czas i szybko pracuj, aby przejść do kolejnych kroków. Produkt ten bardzo szybko polimeryzuje w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Nanieść 50 μl zawiesiny matrycy próbki/błony podstawnej na środek studzienki w płytce 24-dołkowej. Powinno to wyglądać w kształcie kopuły. 
		nuta: Zastosowanie schłodzonych końcówek pipet pomaga w płynniejszym przenoszeniu zawiesiny, minimalizując polimeryzację.</li>
		<li>Powtórz 9 razy, aby napełnić łącznie 10 dołków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację.</li>
	<li>Dodać 500 μl Human Minigut Media Complete (przygotowanego w kroku 1.5) do każdej studzienki. Wymieniaj co 2 dni.</li>
	<li>Zbierz enteroidy po 5-10 dniach, gdy uwidoczni się pączkowanie. Zobacz kroki 4 i 5, aby uzyskać instrukcje dotyczące zbierania.</li>
</ol>
3. Indukcja eksperymentalnego NEC
<ol>
	<li>Dodać 10 μl 5 mg/ml lipopolisacharydu (LPS) do 500 μl Human Minigut Media Complete (przygotowanego w kroku 1.5) do każdej studzienki w dniu 0. Wymieniaj co 2 dni aż do odbioru.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do zatapiania parafiny
<ol>
	<li>Delikatnie wyjmij nośnik.
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml PBS i delikatnie pipetować w górę iw dół, aby rozpuścić macierz błony podstawnej, uważając, aby nie doszło do lizy enteroidów.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę PBS/enteroid przy <300 x g przez 5 minut w celu osadzenia i usunięcia PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 4% paraformaldehydu, aby utrwalić w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wirować przy <300 x g przez 5 minut do osadzania, a następnie usunąć PBS.
	<ol>
		<li>Delikatnie przemyć 1 ml PBS i odwirować przy <300 x g przez 5 minut do osadzania, a następnie usunąć PBS.</li>
		<li>Powtórz krok 4.3.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stopić odpowiednią objętość żelu do przetwarzania tkanek (około 300 μl), umieszczając żądaną ilość w stożkowej probówce i ogrzewając ją w inkubatorze do suchej kąpieli w temperaturze 65 °C przez 3-10 minut do uzyskania płynu.
	<ol>
		<li>Dodaj żel do przetwarzania tkanek do granulki i delikatnie wymieszaj.</li>
		<li>Na szkiełku nakrywkowym umieść mały pierścień do klonowania.</li>
		<li>Odpipetować mieszaninę żelu do przetwarzania tkanek i enteroidów do pierścienia klonującego zamontowanego na szkiełku nakrywkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostawić mieszaninę żelu do przetwarzania tkanek i enteroidów do zestalenia się w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
	<ol>
		<li>Zanurz pierścień klonujący ze zestaloną mieszaniną w 70% etanolu w celu przygotowania do zatapiania parafiny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pobieranie enteroidów do ekstrakcji RNA i białek
<ol>
	<li>Delikatnie wyjmij Human Minigut Media Complete z każdej studzienki.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby rozpuścić matrycę błony podstawnej. Uważaj, aby nie rozdzielić enteroidów.
	<ol>
		<li>Umieść mieszaninę PBS/enteroidów w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Wirować przy <300 x g przez 5 minut do osadzania.</li>
		<li>Delikatnie usuń PBS, uważając, aby nie usunąć enteroidów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz krok serii 5.2 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Zamrażać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do ekstrakcji białka i/lub RNA.</li>
	<li>Przeprowadzić ekspresję genów i izolację białek enteroidów przy użyciu dobrze znanych technik qRT-PCR i Western Blotting.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li>
<li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li>
<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li>
<li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+%28NEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li>
<li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li>
<li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids%3A+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921(2018).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483(2015).</li>
<li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li>
<li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li>
<li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten nowatorski model enteroidów jelitowych ludzkich ex vivo służy jako użyteczna metoda do badania dysfunkcji bariery jelitowej w martwiczym zapaleniu jelit (NEC). Przedstawione tutaj metody przetwarzania enteroidów zostały zaadaptowane z poprzednich prac dr Misty Good, Michaela Helmratha i Jasona Wertheima 10,11,12.
Szczegóły dotyczące całego pobierania tkanek i czasu izolacji krypty są krytycznymi k...

Ludzkie enteroidy to trójwymiarowy system hodowli ex vivo generowany z komórek macierzystych wyizolowanych z krypt jelitowych próbek ludzkiej tkanki jelitowej. Ten przełomowy model został zapoczątkowany przez Hansa Cleversa i in. w 2007 roku po odkryciu komórek macierzystych Lgr5+ w kryptach jelita cienkiego u myszy1. Ich praca położyła podwaliny pod stworzenie ex vivo nabłonka jelitowego wielu typów komórek, które mogły być pasażowane bez znaczących zmian genetycznych lub fizjologicznych2. Od czasu tego odkrycia, enteroidy są wykorzystywane jako nowy model do badania prawidłowej fizjologii trawienia i patofizjologii chorób jelit, takich jak nieswoiste zapalenie jelit, interakcje gospodarz-patogen i medycyna regeneracyjna2.
Wykorzystanie enteroidów jako modelu ex vivo do badania patofizjologii jelit ma kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi technikami. Przez ostatnie kilkadziesiąt lat modele zwierzęce i nieśmiertelne linie komórkowe pochodzące z raka jelita były wykorzystywane do badania fizjologii jelit3,4,5. Hodowle jednokomórkowe nie reprezentują różnorodności typów komórek obecnych w normalnym nabłonku jelitowym, a tym samym brakuje im wzajemnych oddziaływań między komórkami i swoistości segmentowej w ekspresji białek, sygnalizacji i chorobie wywołanej przez patogen6. Komórki macierzyste w enteroidach różnicują się w główne typy komórek nabłonkowych, takie jak enterocyty, komórki Panetha, komórki kubkowe, komórki enteroendokrynne i inne3. Wykazują one polaryzację, pełnią funkcje transportu nabłonkowego i pozwalają na specyficzność segmentu jelitowego6. Ponieważ enteroidy mogą rekapitulować wiele typów komórek ludzkiego nabłonka jelitowego, są w stanie przezwyciężyć to uznane ograniczenie systemów opartych na komórkach rakowych. Z biegiem czasu pochodne linii komórkowych są subklonowane i ewoluują, wykazując większą różnorodność w ekspresji i lokalizacji białek3. Wręcz przeciwnie, enteroidy mogą być pasażowane bez znaczących zmian genetycznych lub fizjologicznych2. Chociaż istnieje wiele modeli zwierzęcych NEC, reakcja na uraz i interwencje terapeutyczne mogą być bardzo zróżnicowane w zależności od gatunku. W wyniku tych ograniczeń, terapie pochodzące z modeli zwierzęcych zawodzą w 90% przypadków, gdy są testowane w badaniach na ludziach z powodu różnic w toksyczności lub skuteczności3. Enteroidy służą jako obiecujące modele przedkliniczne, które mogą przezwyciężyć te niedobory, prowadząc do lepszego zrozumienia złożonej patofizjologii jelit, a tym samym do bardziej skutecznych i opłacalnych innowacji terapeutycznych. Istnieją również niedawne dowody na to, że wiek tkanki, z której powstaje enteroid, pozostaje biologicznie ważny7. Jest to szczególnie ważny szczegół dla naszego modelu, ponieważ enteroidy są generowane z tkanki noworodka, zachowując w ten sposób fizjologiczne znaczenie dla pacjentów z NEC.
Użyteczność enteroidów jako modeli ludzkich chorób wciąż rośnie, w nadziei na znalezienie lekarstw na ciężkie i wszechobecne stany. Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest wyniszczającą chorobą jelit noworodków, charakteryzującą się martwicą jelit i często prowadzi do perforacji ściany jelita, posocznicy i śmierci8. Ze względu na złożoną i wieloczynnikową patofizjologię NEC, dokładny mechanizm choroby nie został jeszcze w pełni wyjaśniony; Jednak zwiększona przepuszczalność jelit jest wyraźnie związana z procesem chorobowym<klasa SUP="xref">8. Biorąc pod uwagę, że badanie NEC i potencjalnych środków terapeutycznych jest etycznie trudne u ludzi, zwłaszcza dzieci, wysoce pożądane jest wykorzystanie biologicznie istotnego enteroidalnego modelu NEC przy użyciu ludzkiej tkanki noworodka. Do tej pory enteroidy odgrywają ograniczoną rolę w badaniu NEC. Protokół ten opisuje zastosowanie enteroidów pochodzących z próbek ludzkich tkanek jelitowych jako nowego modelu ex vivo do badania martwiczego zapalenia jelit.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>A-83</td><td>R& D Tocris</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Suplement ThermoFisher</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>B-27 bez witaminy A</td><td>ThermoFisher</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Matryca membrany podstawnej (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>MT-16-405-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gemini Bio-Pro</td><td>100-125</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma</td><td>G5013-1G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX ( L-glutamina)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278-5mL</td><td></td></tr><tr><td>[leu] 15-gastryna 1</td><td>Sigma</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy (HEPES)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems INC</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-5X10PAK</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin</td><td>PEPROTECH INC</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Żel do przetwarzania tkanek (Histogel)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-110-678</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R& Systemy D INC</td><td>5036-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

nowy ludzki nabłonkowy enteroidalny model martwiczego zapalenia jelit

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest wyniszczającą chorobą noworodków. Charakteryzuje się wieloma zmianami patofizjologicznymi w nabłonku jelit człowieka, co prowadzi do zwiększonej przepuszczalności jelit, upośledzenia restytucji i zwiększonej śmierci komórek. Chociaż istnieje wiele zwierzęcych modeli NEC, reakcja na uraz i interwencje terapeutyczne mogą być bardzo zróżnicowane w zależności od gatunku. Co więcej, z etycznego punktu widzenia trudno jest badać patofizjologię choroby lub nowe środki terapeutyczne bezpośrednio u ludzi, zwłaszcza u dzieci. W związku z tym wysoce pożądane jest opracowanie nowego modelu NEC z wykorzystaniem tkanki ludzkiej. Enteroidy to trójwymiarowe organoidy pochodzące z komórek nabłonka jelitowego. Idealnie nadają się do badania złożonych interakcji fizjologicznych, sygnalizacji komórkowej i obrony gospodarz-patogen. W tym manuskrypcie opisujemy protokół, w którym hoduje się ludzkie enteroidy po wyizolowaniu jelitowych komórek macierzystych od pacjentów poddawanych resekcji jelita. Komórki krypty są hodowane w pożywkach zawierających czynniki wzrostu, które zachęcają do różnicowania się w różne typy komórek natywnych dla ludzkiego nabłonka jelitowego. Komórki te są hodowane w syntetycznej, kolagenowej mieszance białek, które służą jako rusztowanie, naśladując zewnątrzkomórkową błonę podstawną. W rezultacie enteroidy rozwijają polaryzację wierzchołkowo-podstawno-boczną. Jednoczesne podawanie lipopolisacharydu (LPS) w pożywce powoduje reakcję zapalną w enteroidach, prowadząc do zmian histologicznych, genetycznych i ekspresji białek podobnych do tych obserwowanych w ludzkim NEC. Eksperymentalny model NEC wykorzystujący tkankę ludzką może stanowić dokładniejszą platformę do testowania leków i leczenia przed badaniami na ludziach, ponieważ staramy się znaleźć lekarstwo na tę chorobę.

Bezpośrednio po wysianiu, świeżo wyizolowane krypty jelitowe mają kształt wydłużonych prętów. W ciągu kilku godzin enteroidy przyjmą okrągły wygląd (Rycina 1a). W ciągu kolejnych kilku dni enteroidy zaczną formować sfery, co widoczne jest na Rycynie 1b. Pączkowanie powinno nastąpić między 5. a 10. dniem (Rycina 1c) i to właśnie w tym czasie należy pr...

Enteroidy wyłaniają się jako nowy model w badaniach nad chorobami ludzkimi. Protokół opisuje, w jaki sposób symulować enteroidalny model ludzkiego martwiczego zapalenia jelit za pomocą leczenia lipopolisacharydami (LPS) enteroidów generowanych z tkanki noworodka. Pobrane enteroidy wykazują zmiany zapalne podobne do tych obserwowanych w ludzkim martwiczym zapaleniu jelit.

Nowy ludzki nabłonkowy enteroidalny model martwiczego zapalenia jelit

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Enteroidy to trójwymiarowe organoidy pochodzące z komórek nabłonka jelitowego. Idealnie nadają się do badania złożonych interakcji fizjologicznych, sygnalizacji komórkowej i obrony patogenów gospodarza. Nasz protokół opisuje, w jaki sposób hodować ludzkie enteroidy po wyizolowaniu jelitowych komórek macierzystych od pacjentów poddawanych resekcji jelita.Jednoczesne podawanie lipopolisacharydu w naszych pożywkach hodowlanych powoduje reakcję zapalną w enteroidach, prowadzącą do zmian histologicznych, genetycznych i ekspresji białek, podobnych do tych obserwowanych w ludzkim martwiczym zapaleniu jelit. Biorąc pod uwagę, że badanie martwiczego zapalenia jelit i potencjalnych środków terapeutycznych jest etycznie trudne u ludzi, zwłaszcza dzieci, wysoce pożądane jest wykorzystanie tego nowatorskiego, biologicznie istotnego enteroidalnego modelu martwiczego zapalenia jelit przy użyciu ludzkiej tkanki noworodka. Główną zaletą tej techniki jest to, że enteroidy są w stanie podsumować wiele typów komórek ludzkiego nabłonka jelitowego i są w stanie przezwyciężyć uznane ograniczenia modeli zwierzęcych i systemów opartych na komórkach.W demonstracji procedury pomogą Christie Buonpane, rezydentka chirurgii i Carrie Yuan, technik laboratoryjny z naszego laboratorium. W momencie pobierania na salę operacyjną należy umieścić próbkę ludzkiej tkanki jelita cienkiego w zimnym DPBS. Umyj próbkę w zimnym DPBS, aż będzie wolna od krwi i stolca.Przechowuj próbkę w podłożu RPMI 1640 w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do izolacji krypty. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, sprawdź ponownie, czy próbka jest wolna od stolca i krwi. Za pomocą delikatnych nożyczek preparacyjnych usuń nadmiar tłuszczu lub klipsów chirurgicznych i zszywek.Zważ próbkę i celuj w kawałek o wadze około 0,75 do 2,5 grama. Następnie pokrój tkankę na 0,5 centymetra kawałki i umieść je w probówce zawierającej 30 mililitrów buforu chelatującego numer jeden. Wstrząsaj na niskich obrotach przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przefiltruj tkankę przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i odrzuć przepływ. Dodaj przefiltrowaną tkankę do probówki zawierającej 30 mililitrów buforu chelatującego numer dwa. Wstrząsaj na niskich obrotach przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przefiltruj tkankę przez filtr o średnicy 100 mikrometrów i odrzuć przepływ. Następnie rozmrozić 500 mikrolitrów matrycy błony podstawnej na lodzie do późniejszego wykorzystania. Dodaj trochę tkanki do 10 mililitrów zimnego DMEM w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów i energicznie potrząsaj ręcznie przez 10 sekund.Przefiltruj tę zawiesinę przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i zbierz przepływ. Trzymaj tę rurkę na lodzie. Dodaj trochę chusteczki do kolejnych 10 mililitrów zimnego DMEM w osobnej stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów i energicznie wstrząsaj ręcznie przez 10 sekund.Przefiltruj tę zawiesinę przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i zbierz przepływ. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, aż pojawią się cztery stożkowe rurki zawierające przepływ, oznaczone od jednego do czterech. Następnie przefiltruj roztwór w probówce numer jeden przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i przenieś przepływ do 15-mililitrowej stożkowej probówki, również oznaczonej numerem jeden.Powtórz ten proces dla probówek od drugiej do czterech. Odwirować 15-mililitrowe probówki w temperaturze 200 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. W okapie z przepływem laminarnym usunąć supernatant z każdej probówki i wyrzucić go.Należy unikać rozerwania chmury tkanki znajdującej się bezpośrednio nad osadem, nawet jeśli oznacza to pozostawienie części supernatantu. W każdej probówce powoli pipetować w górę i w dół, aby wymieszać osad z pozostałym supernatantem. Przenieś mieszaninę z każdej probówki do pojedynczej stożkowej probówki o pojemności dwóch mililitrów i odwiruj w temperaturze 200 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach wstępnie rozmrożonej matrycy membrany podstawnej. Użyj schłodzonej końcówki pipety, aby nałożyć 50 mikrolitrów tej zawiesiny na środek studzienki w płytce 24-dołkowej. Ta próbka powinna wyglądać na kopułę.Powtórz ten proces aplikacji dziewięć razy, aby wypełnić łącznie 10 studzienek. Przenieś 24-dołkową płytkę do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację. Następnie dodaj 500 mikrolitrów ludzkiego podłoża z minijelit do każdego dołka.Kontynuuj inkubację w tych samych warunkach, pamiętając o wymianie tej pożywki co dwa dni. Najpierw dodaj 10 mikrolitrów LPS w stężeniu pięciu miligramów na mililitr do 500 mikrolitrów ludzkiego podłoża minijelitowego kompletnego w każdym dołku płytki w dniu zero. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wymieniaj uzupełnione podłoże co dwa dni, aż do pobrania.Aby przygotować się do zatapiania parafiny, najpierw delikatnie usuń pożywkę, dodaj jeden mililitr PBS i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby rozpuścić matrycę błony podstawnej, uważając, aby nie zlizować enteroidów. Wirować z prędkością mniejszą niż 300 razy G przez pięć minut w celu osadzenia, a następnie usunąć PBS. Dodaj 4% paraformaldehydu i odstaw probówkę na godzinę do utrwalenia w temperaturze pokojowej.Wirować z prędkością mniejszą niż 300 razy G przez pięć minut, aby uzyskać granulki, a następnie usunąć paraformaldehyd. Delikatnie przemyć jednym mililitrem PBS i odwirować z prędkością mniejszą niż 300 razy G przez pięć minut. Następnie wyjmij PBS.Powtórz ten proces prania z PBS raz. Umieść żądaną ilość żelu do przetwarzania tkanek w stożkowej probówce i podgrzej go w inkubatorze do suchej kąpieli w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez trzy do 10 minut, aż stanie się płynny. Następnie dodaj stopiony żel do przetwarzania tkanek do granulki i delikatnie wymieszaj.Umieść mały pierścień klonujący w szkiełku nakrywkowym. Odpipetować żel do przetwarzania tkanek i mieszaninę enteroidów do pierścienia klonującego, który jest zamontowany na szkiełku nakrywkowym. Pozostawić żel do przetwarzania tkanek i mieszaninę enteroidów do zestalenia się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę.Następnie zanurz pierścień klonujący ze zestaloną mieszaniną w 70% etanolu, aby przygotować się do zatapiania parafiny. Bezpośrednio po posianiu świeżo izolowane krypty jelitowe wyglądają jak wydłużone pręciki. W ciągu kilku godzin enteroidy przybiorą okrągły wygląd.W ciągu najbliższych kilku dni enteroidy zaczną tworzyć kule. Pączkowanie powinno nastąpić od pięciu do 10 dni, kiedy to powinno nastąpić pobranie enteroidów. Rosnące enteroidy wykazują również polaryzację, zawierającą centralne światło, granicę wierzchołkową i domenę podstawną.Enteroidy wykazują również integralność strukturalną reprezentowaną przez solidny cytoszkielet aktynowy. Po kilku dniach w hodowli enteroidy leczone LBS doświadczają większej apoptozy i mają niższą wydajność niż grupa kontrolna. Jak zaobserwowano w ludzkim NEC w mysich modelach NEC, zwiększona ekspresja receptora toll like four występuje w enteroidach leczonych LPS w porównaniu z kontrolą.Enteroidy można również pobierać w celu ekstrakcji RNA i białek przy użyciu dobrze znanych technik qRT-PCR i western blott, ekspresji genów i izolacji białek.

a-novel-human-epithelial-enteroid-model-of-necrotizing-enterocolitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje rozwój choroby martwiczego zapalenia jelit w ludzkim modelu enteroidu noworodka, wywołanego leczeniem lipopolisacharydami. Model ten pomaga badać patofizjologię jelit.

Indukcja martwiczego zapalenia jelit w ludzkim nabłonkowym modelu enteroidalnym

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

Ten protokół opisuje model in vitro martwiczego zapalenia jelit (NEC), który może być wykorzystany do mechanistycznych badań nad patogenezą choroby. Posiada chip mikroprzepływowy wysiany enteroidami jelitowymi pochodzącymi z ludzkiego jelita noworodka, komórek śródbłonka i mikrobiomu jelitowego noworodka z ciężkim NEC.

Mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny

Ten protokół opisuje noworodkowy model mysiego nektyzującego enterokolitisu (NEC) oraz późniejsze izolację komórek odpornościowych z blaszki właściwej jelita cienkiego noworodków.

Model myszy noworodkowej nekrotyzującego enterokolitu i izolacji lamina propria w celu profilaktyki komórek odpornościowych

Komórki M w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z mieszykami, pokrywającym kępki Peyera, odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez komórki M in vivo. Metoda ta pozwala na zrozumienie funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Ludzki syncytialny wirus oddechowy (HRSV) może powodować ciężkie zapalenie oskrzelików u małych niemowląt. Część patogenezy ciężkiej choroby HRSV jest spowodowana odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Stymulacja pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych za pomocą HRSV zapewnia szybki i powtarzalny system modelowy do badania aktywacji szlaków zapalnych i infekcji.

Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Poznaj metodę hodowli ludzkich enteroidów z komórek macierzystych jelita noworodkowego do badania martwiczego zapalenia jelit. Model ten pozwala na etyczne testowanie czynników terapeutycznych in vitro.

Nowy ludzki nabłonkowy enteroidalny model martwiczego zapalenia jelit

Przeglądaj więcej filmów