Name: Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Poznaj metodę kontroli kształtu klastrów komórkowych 3D w hybrydowym sześcianie żelowym bez specjalistycznego sprzętu. Technika umożliwia powtarzalne wzorce i wielokierunkowe obrazowanie w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana finansowo przez JSPS KAKENHI (18H04765) oraz Program do Rozpowszechniania Tenure Track System, MEXT, Japonia.

1. Produkcja hybrydowego urządzenia do kostki żelowej
<ol>
	<li>Przygotuj sześcienną ramę z poliwęglanu (PC) za pomocą procesu obróbki skrawaniem lub drukarki 3D. Wielkość ramki PC zależy od wielkości próby. W tym badaniu użyliśmy ramy o grubości 5 mm z każdej strony, aby gałęzie miały wystarczająco dużo miejsca na wydłużenie podczas hodowli.</li>
	<li>Umieść ramę komputera na wstępnie schłodzonym szkiełku podstawowym lub innej gładkiej powierzchni w pojemniku na lód (<0 °C) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Dodać pipetą 12 μl wstępnie podgrzanej 1,5% agarozy (w/v) z górnej powierzchni ramy sześciennej na dolną powierzchnię. Pogłaszcz pipetę tak, aby agaroza rozprowadziła się, tworząc płaską powierzchnię (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>W ciągu kilku minut agaroza zostanie wyleczona. Podnieś ramkę komputera, przesuwając ją do krawędzi szklanego szkiełka za pomocą pęsety. Należy pamiętać, że pionowe podnoszenie ramy ze szkiełka może spowodować oderwanie się agarozy od ramy sześciennej ze względu na siłę adhezji między agarozą a szkiełkiem podstawowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Obróć sześcienną ramę tak, aby była otwarta stroną zadrukowaną do dołu, a następnie ponownie umieść ją na szkiełku podstawowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Powtarzaj kroki 1.3–1.5, aż trzy powierzchnie zostaną wypełnione agarozą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Aby utworzyć ścianę agarozy na czwartej i piątej ścianie, wrzuć agarozę z otwartej powierzchni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Gdy na piątej ścianie uformuje się ściana agarozowa, przygotowanie HGC jest zakończone.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie mikroform za pomocą fotolitografii lub obróbki skrawaniem
<ol>
	<li>Wytwarzanie metodą fotolitografii
	<ol>
		<li>Oczyść płytkę krzemową (Si) za pomocą czyszczenia ultradźwiękowego acetonem, alkoholem izopropylowym (IPA), a następnie wodą destylowaną (DI) przez 5 minut każda. Po przedmuchiwaniu azotem wafla Si azotem, odwadniać w piecu w temperaturze 140 °C przez 20 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A(i)).</li>
		<li>Warstwa protektorowa, taka jak LOR i Az, jest odporna na płytkę Si (2,000 obr./min, 30 s) za pomocą wirownika w żółtym świetle. Natychmiast po wirowaniu podgrzej wafel na gorącej płycie w temperaturze 90 °C przez 3 minuty (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A(ii)). Pożądana grubość warstwy protektorowej wynosi ponad 1 μm, dzięki czemu proces podnoszenia można łatwo przeprowadzić, ale dokładna grubość nie jest konieczna.</li>
		<li>Umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C, a następnie zalaminuj gruby ujemny arkusz fotorezystu o żądanej grubości na warstwie protektorowej za pomocą wałka ręcznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A(iii))</li>
		<li>Pięć minut po laminowaniu umieść wafel na nakładce maski w celu ekspozycji na promieniowanie UV. Ustaw fotomaskę z żądanym wzorem na arkuszu, odpornij i naświetlaj światłem UV przez odpowiedni czas. Czas naświetlania zależy od grubości fotorezystu i intensywności światła UV. Następnie umieść wafel na płycie grzejnej do pieczenia po ekspozycji w temperaturze 60 °C przez 5 minut, a następnie piecz w temperaturze 90 °C przez 10 minut. (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A(iv))</li>
		<li>Rozwinąć ujemny fotorezyst, zanurzając płytkę w octanie eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA), aż nienaświetlony obszar zostanie całkowicie rozpuszczony (około 20 minut) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A (v)).</li>
		<li>Rozpuść warstwę protektorową za pomocą IPA do czyszczenia ultradźwiękowego, aby usunąć mikrostrukturę. Po oderwaniu mikrostruktury od płytki, spłucz wodą DI za pomocą czyszczenia ultradźwiękowego przez 10 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A(vi)).</li>
		<li>Zanurz formę w 30 μl polimeru MPC na 30 minut w temperaturze pokojowej (około 20 °C), aby całkowicie ją wysuszyć. Rysunek 2B pokazuje sfabrykowaną formę pryzmatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonanie formy cylindrycznej
	<ol>
		<li>Wytwarzaj stalową formę cylindryczną o pożądanym rozmiarze w procesie obróbki. Alternatywnie użyj dostępnej w handlu stali nierdzewnej. (W tym badaniu użyto butli o φ 600 μm.)</li>
		<li>Zanurzyć stalową cylinder w 30 μl polimeru MPC na 30 minut w temperaturze pokojowej (około 20 °C) w celu całkowitego wysuszenia.</li>
		<li>Przygotować ciekły polidimetylosiloksan (PDMS) mieszając żywicę bazową i jej katalizator (patrz tabela materiałów) w stosunku 10:1, a następnie odgazowując za pomocą systemu odgazowywania próżniowego przez 20 minut. Następnie wlej PDMS do płytki 12-dołkowej.</li>
		<li>Ustaw stalowy cylinder prostopadle do powierzchni bazy pomiarowej i przymocuj do liniowego stolika z tak, aby można go było prostopadle wstawić w nieutwardzoną powierzchnię PDMS w 12-dołkowej płytce umieszczonej na tej samej powierzchni odniesienia, przesuwając stolik z. Inkubować PDMS ze stalowym cylindrem w piecu przez 20 minut w temperaturze 90 °C w celu utwardzenia. Przyciąć PDMS tak, aby utworzył powierzchnię boczną, tak aby pipeta mogła zostać włożona w następujący proces (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kontrolowanie początkowego kształtu klastra komórek w hydrożelu
<ol>
	<li>Wstrzyknąć odpowiedni ECM dla pożądanej hodowli komórkowej, takiej jak kolagen i sztuczna błona podstawna, do HGC, aby wypełnić przestrzeń hodowlaną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Ustaw wyprodukowaną mikroformę na HGC bezpośrednio lub pośrednio za pomocą odpowiedniego uchwytu, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3B. Następnie umieścić HGC w inkubatorze CO2 na 25 minut w temperaturze 37 °C w celu utwardzenia.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij mikroformę, aby ECM nie uległ pogorszeniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Kieszeń, jako pożądany kształt formy, zostanie wyprodukowana w ECM.</li>
	<li>Zbierz komórki z hodowanej szalki za pomocą trypsyny-EDTA lub jej odpowiednika, w zależności od typu komórek. Następnie odwirować komórki, aby uzyskać wysoce skoncentrowane komórki (w przypadku hodowli NHBE należy zastosować 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować komórki przez 3 minuty, a następnie zneutralizować pożywką zawierającą FBS i odwirować przy 300 x g przez 4 minuty).</li>
	<li>Po odwirowaniu usuń pożywkę sklarowaną nad osadem, aby skondensować komórki i wstrzyknąć wysoce skoncentrowane komórki (3,0 ×10 4 komórki/μl dla komórek NHBE) do kieszeni w ECM (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Inkubować HGC z komórkami w inkubatorze CO2 przez 20 minut w temperaturze 37 °C, tak aby komórki wpadły do kieszeni ECM w celu wypełnienia przestrzeni utworzonej przez mikroformy. Jeśli na górnej powierzchni znajduje się nadmiar podłoża lub komórek, ostrożnie usuń je za pomocą pipety.</li>
	<li>Umieść HGC na 24-dołkowej płytce i dodaj 100 μl odpowiedniego podłoża (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3E). W przypadku komórek NHBE należy użyć mieszaniny 1:1 dostępnej na rynku specjalistycznej pożywki dla NHBE i komórek śródbłonka (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wstrzyknąć dodatkowy ECM w celu zamknięcia kieszeni w ECM, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 25 minut.</li>
	<li>Schłodzić podgrzaną 1,5% agarozę do temperatury pokojowej (około 20 °C). Upuść około 10 μl agarozy na górną powierzchnię HGC, aby zamknąć powierzchnię i zapobiec wypadnięciu ECM z HGC podczas hodowli i obrazowania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3F). Następnie inkubować HGC przez kolejne 20 minut w temperaturze 37 °C, aby utwardzić agarozę.</li>
	<li>Dodaj pożywkę, aby pokryć cały HGC, aby ciśnienie osmotyczne mogło pomóc w zapewnieniu odżywiania komórkom wewnątrz HGC.</li>
</ol>
4. Obrazowanie wielokierunkowe
<ol>
	<li>Nieinwazyjne rozpoznawanie kształtów 3D poprzez wielokierunkową obserwację
	<ol>
		<li>Umieść naczynie hodowlane lub płytkę studzienkową zawierającą HGC pod mikroskopem i ustaw HGC w ramie kamery. Następnie uzyskaj przykładowy obraz za pomocą jasnego pola lub kontrastu fazowego.</li>
		<li>Podnieś i obróć HGC, aby położyć inną powierzchnię w dół.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 4.1.1 i 4.1.2, aż uzyskasz obrazy ze wszystkich sześciu stron.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie immunofluorescencyjne metodą obserwacji wielokierunkowej
	<ol>
		<li>W celu utrwalenia należy nałożyć 4% paraformaldehydu na próbkę nad HGC w temperaturze pokojowej (około 20 °C) przez 20 minut, a następnie dwa płukania PBS przez 10 minut każde</li>.
		<li>Przepuszczać HGC z PBS zawierającym 0,5% Triton X-100 przez 10 min w temperaturze 4 °C, a następnie przemywać 3x przez 10 minut PBS.</li>
		<li>Inkubować HGC z 10% surowicą kozią w buforze IF-buffer (0,2% Triton X-100, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej i 0,05% Tween-20 w PBS) przez 60 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania pierwotnego etapu blokowania.</li>
		<li>Do barwienia określonej cząsteczki użyj odpowiedniego przeciwciała. Aby zaobserwować kolektywną geometrię komórek, Alexa Fluor 488 Phalloidin może być używana do barwienia aktyny.</li>
		<li>Umieść HGC na naczyniu ze szklanym dnem pod mikroskopem laserowym lub fluorescencyjnym i wykonaj skanowanie z sześciu stron, aby uzyskać cały obraz próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-+cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+epithelial+sheet+morphology+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).</li>
<li>Tawk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mirror-symmetric+cell+division+that+orchestrates+neuroepithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis.</a> Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).</li>
<li>Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li>
<li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+or+not+tube%3A+Remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Huisken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. , 1007-1009 (2004).</li>
<li>Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+in+Cube%3A+In+Vitro+3D+Culturing+Platform+with+Hybrid+Gel+Cubes+for+Multidirectional+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).</li>
<li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+Scale+Imaging+by+Fine+Spatial+Alignment+of+Multi-Scanning+Data+with+Gel+Cube+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device.</a> Applied Sciences. 8 (235), (2018).</li>
<li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li>
<li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+Tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li>
<li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li>
</ol>

Autorzy wraz z Uniwersytetem Prefektury Osaka i Instytutem Technologii Kyushu złożyli wniosek patentowy na hybrydowe urządzenie do kostki żelowej, a firma Nippon Medical and Chemical Instruments Co. Ltd z Japonii niedawno skomercjalizowała kostkę. Firma nie miała wpływu na żaden z opisanych projektów, procesów i metod.

Metoda przedstawiona w tym artykule jest prosta i może być wykonywana bez użycia zaawansowanego technologicznie sprzętu. Jednocześnie można uzyskać precyzyjny wynik kontroli kształtu klastra komórkowego w przestrzeni 3D hydrożelu. Po wstępnej kontroli komórki mogą rosnąć w HGC w takim samym stopniu, w jakim są hodowane na szalce. Obrazowanie wielokierunkowe odbywa się poprzez obracanie próbki za pomocą HGC przy użyciu dowolnego systemu mikroskopowego, co znacznie poprawia jakość obrazowania. Wybór materiałów na ramę HGC ...

Znaczenie kultury 3D, która lepiej naśladuje środowiska biologiczne niż kultura 2D, jest znacznie podkreślone w hodowli komórek/tkanek1,2,3. Interakcja między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) dostarcza ważnych wskazówek dotyczących morfogenezy4,5. Wiele formacji tkankowych może powstać tylko w środowiskach 3D, takich jak proces składania6,7, invagination8 i formacja rurkowa9,10. Jednak liczne trudności powstrzymują badaczy przed przejściem do eksperymentów 3D z eksperymentów 2D na talerzu. Jedną z głównych trudności w eksperymentach 3D jest kwestia obrazowania próbek 3D. W porównaniu z eksperymentami planarnymi, uzyskanie odpowiednich obrazów 3D jest nadal w wielu przypadkach wyzwaniem. W szczególności uzyskanie odpowiedniego obrazu 3D jest trudnym zadaniem, gdy wielkość próbki osiąga zakres milimetrowy ze względu na dużą głębię ogniskowej soczewek o małym powiększeniu. Na przykład głębia ogniskowej osiąga ponad 50 μm, gdy używany jest obiektyw o powiększeniu 10x, podczas gdy rozmiar pojedynczej komórki jest zwykle mniejszy niż 10 μm. Aby poprawić jakość obrazowania, opracowywane są zaawansowane technologicznie systemy mikroskopowe (np. mikroskopia dwufotonowa11 i light-sheet microscopy system12), ale ich dostępność jest ograniczona ze względu na ich wysoką cenę. Jako alternatywę opracowaliśmy wcześniej urządzenie do hybrydowej kostki żelowej (HGC)13. Urządzenie składa się z dwóch rodzajów hydrożeli: agarozy jako żelu podporowego oraz ECM takiego jak kolagen lub Matrigel jako żel hodowlany. HGC pozwala nam pobrać próbkę podczas hodowli i obrócić kostkę w celu uzyskania obrazowania wielokierunkowego, co rozwiązuje problem głębokości ogniskowej14.
Kolejną trudnością w eksperymentach 3D jest ich niska powtarzalność wynikająca ze słabej sterowalności środowisk 3D. W przeciwieństwie do hodowli płaskiej na plastikowym naczyniu, zmiany w początkowych warunkach hodowli łatwo występują w przestrzeni 3D otoczonej miękkim materiałem. Znaczna różnica w wynikach eksperymentu pogarsza poniższą analizę i maskuje mechanizmy leżące u jej podstaw. Opracowano wiele technologii inżynieryjnych w celu przestrzennego wyrównania pojedynczych komórek, takich jak bioprinting15,16, tkanie włókien17 i rusztowanie18, ale wymagają one skomplikowanego przetwarzania wstępnego lub specjalnie zaprojektowanego sprzętu. W przeciwieństwie do tego, opracowaliśmy metodologię osiągania wyrównania komórek 3D w klasie HGC<sup="xref">19.
W tym protokole zilustrowaliśmy prostą procedurę z powszechnie używanym sprzętem do kontrolowania początkowego kształtu klastra komórek 3D w HGC. Po pierwsze, zademonstrowano proces produkcji HGC. Następnie mikroformy wytworzone za pomocą fotolitografii lub procesu obróbki skrawaniem umieszczono w HGC w celu wytworzenia kieszeni o dowolnym kształcie w ECM. Następnie, bardzo gęste komórki po odwirowaniu zostały wstrzyknięte do kieszeni w celu kontrolowania początkowego kształtu klastra komórek w HGC. Precyzyjnie kontrolowane skupisko komórek może być obrazowane z wielu kierunków dzięki HGC. Normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE) wykorzystano do zademonstrowania kontroli początkowego kształtu klastra komórkowego i obrazowania gałęzi z wielu kierunków w celu poprawy jakości obrazowania.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>Corning&nbsp; Inc.</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Octan 2-metoksy-1-metyloetylu</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td><td>130-10505</td><td>PGMEA, CAS: 108-65-6&nbsp;</td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td><td>161-20141</td><td>CAS: 30525-89-4</td></tr><tr><td>Agaroza, niska temperatura żelowania&nbsp; Bioodczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 falloidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>AZ1512</td> Zestaw pocisków <td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Specjalistyczne podłoże do komórek NHBE</td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej (10 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pocisków EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Specjalistyczne podłoże do komórek śródbłonka</td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF co.</td><td></td><td>Polimer MPC</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu Matrigel zredukowany matryca błony podstawnej</td><td>Corning&nbsp; Inc.</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (10%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50197Z</td><td></td></tr><tr><td>Normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli</td><td>Lonza</td><td>CC-2541</td><td></td></tr><tr><td>SILPOT 184 W/C</td><td>Dow Corning Co.</td><td>3255981</td><td>Żywica bazowa i katalizator do PDMS</td></tr><tr><td>SUEX D300</td><td></td><td>DJ MicroLaminates, Inc</td><td>Gruby ujemny fotorezystor (grubość: 300 mm)</td></tr><tr><td>Triton X-100 (1%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

wstępna kontrola klastrów komórkowych 3d w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

Znaczenie hodowli 3D in vitro jest znacznie podkreślone w hodowli komórek/tkanek. Jednym z jego ograniczeń jest jednak brak powtarzalności eksperymentalnej. Wytwarzanie niewielu powtarzalnych wyników tworzenia wzorców pogarsza analizę mechanizmów leżących u podstaw samoorganizacji. Zmniejszenie zmienności w początkowych warunkach hodowli, takich jak gęstość i rozmieszczenie komórek w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia powtarzalności hodowli 3D. W tym artykule przedstawiamy prostą, ale solidną procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w macierzy zewnątrzkomórkowej 3D w celu uzyskania wysoce powtarzalnych formacji wzorcowych. Mikroforma o pożądanym kształcie została wytworzona za pomocą fotolitografii lub procesu obróbki skrawaniem i utworzyła kieszeń 3D w ECM zawartą w hybrydowym kostce żelowej (HGC). Wysoce skoncentrowane komórki zostały następnie wstrzyknięte do kieszeni, tak aby kształt klastra komórek pasował do wyprodukowanego kształtu formy. Zastosowany HGC pozwolił na wielokierunkowe skanowanie poprzez jego rotację, co umożliwiło obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i uchwycenie całej struktury tkanki, mimo że zastosowano soczewkę o małym powiększeniu. Do zademonstrowania metodologii wykorzystano normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli.

Do zaprezentowania opisanej metodologii oraz kontroli początkowej zbiorczej geometrii komórek w celu uzyskania odpowiednio kształtu cylindra i pryzmatu w środowisku ECM wykorzystano normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE). Przedstawiono wyniki obrazowania wielokierunkowego uzyskane za pomocą kontrastu fazowego oraz barwienia falloidyną dla kształtu cylindra (Rysunek 4A,B) oraz kształtu pryzmatu (Rysunek 4C</stro...

Przedstawiamy procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w trójwymiarowej matrycy zewnątrzkomórkowej w celu uzyskania powtarzalnego formowania wzoru. Sześcienne urządzenie zawierające dwa różne hydrożele jest wykorzystywane do uzyskania wielokierunkowego obrazowania w celu tworzenia wzoru tkankowego.

Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Protokół ten wykorzystuje prostą metodę zwiększania niezawodności modelu 3D hodowli komórkowej bez użycia specjalnego sprzętu. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy przeprowadzić powtarzalny eksperyment z kulturą 3D, kontrolując początkowe warunki hodowli w urządzeniu do sześcianu. Po przygotowaniu sześciennej ramy z poliwęglanu o wymiarach pięć na pięć milimetrów, umieść ramkę na wstępnie schłodzonym szkiełku podstawowym i pojemniku na lód, a następnie za pomocą pipety dodaj 12 mikrolitrów podgrzanej 1,5% agarozy od górnej powierzchni sześciennej ramy do dolnej powierzchni.Rozprowadź agarozę, aby uzyskać płaską powierzchnię i pozwól polimerowi utwardzić się. Użyj pęsety, aby przesunąć ramkę do krawędzi szkła i obróć ramkę tak, aby otwarta strona była skierowana w dół przed umieszczeniem ramy z powrotem na prowadnicy. Po wypełnieniu kolejnych dwóch powierzchni ramy większą ilością agarozy, jak właśnie pokazano, wrzuć agarozę do pojemnika z otwartej powierzchni, aby utworzyć ścianę agarozy z czwartej i piątej strony.Aby ustawić początkowy kształt klastra komórkowego, wstrzyknij odpowiednią matrycę zewnątrzkomórkową dla interesującej nas hodowli komórkowej do hybrydowej przestrzeni hodowli kostki żelowej i umieść na kostce sfabrykowaną mikroformę. Następnie umieść kostkę w inkubatorze dwutlenku węgla na 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po utwardzeniu macierzy zewnątrzkomórkowej ostrożnie wyjmij mikropleśń, aby matryca nie uległa zniszczeniu.W macierzy zewnątrzkomórkowej zostanie wykonana kieszeń w pożądanym kształcie formy. Aby załadować komórki, należy zagęścić eksperymentalną zawiesinę komórkową po odwirowaniu w odpowiednim eksperymentalnym pożywce do hodowli komórek i wstrzyknąć komórki do kieszeni w macierzy zewnątrzkomórkowej. Umieść kostkę w inkubatorze dwutlenku węgla na 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby komórki mogły wpaść do kieszeni macierzy zewnątrzkomórkowej, wypełniając przestrzeń utworzoną przez mikropleśń.Pod koniec inkubacji umieścić kostkę w jednym dołku na 24-dołkowej płytce i dodać 100 mikrolitrów odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej do dołka. Wstrzyknąć dodatkową macierz zewnątrzkomórkową, aby zamknąć kieszeń i umieścić kostkę z powrotem w inkubatorze na 25 minut. Po utwardzeniu macierzy zewnątrzkomórkowej upuść około 10 mikrolitrów agarozy o temperaturze 20 stopni Celsjusza na górną powierzchnię do kostki, aby zamknąć powierzchnię i utwardzać kroplę przez 10 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie przykryj całą kostkę świeżą pożywką, aby zwiększyć ciśnienie osmotyczne w celu ułatwienia transferu składników odżywczych do komórek w kostce. W celu nieinwazyjnego rozpoznawania kształtów 3D za pomocą obserwacji wielokierunkowej, umieść płytkę na stoliku mikroskopu i uzyskaj obrazy każdej strony sześcianu za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii kontrastu fazowego, używając pęsety do obracania usługi sześcianu, która ma być obrazowana między ujęciami. W przypadku obrazowania immunofluorescencyjnego za pomocą obserwacji wielokierunkowej, najpierw odessać supernatant z dołka zawierającego kostkę i utrwalić kostkę w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Pod koniec utrwalania umyj kostkę dwa razy PBS przez 10 minut na pranie. Nieprzepuszczalność kostki za pomocą 0,5% trytonu x-100 i PBS przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie umyj kostkę trzy razy w PBS przez 10 minut na pranie, a następnie zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą koziej surowicy i buforu immunofluorescencyjnego na 60 minut w temperaturze pokojowej.Następnie wybarwić komórki odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym, które jest przedmiotem zainteresowania, zgodnie ze standardowymi protokołami barwienia przeciwciał. Następnie zobrazuj wszystkie sześć boków sześcianu pod mikroskopem laserowym lub fluorescencyjnym, jak pokazano poniżej. W tym reprezentatywnym eksperymencie wielokierunkowe obrazowanie hybrydowych kostek żelowych, hodowanych z normalnymi ludzkimi komórkami nabłonka oskrzeli, demonstruje generowanie początkowej hodowli komórek w kształcie cylindrycznego lub pryzmatycznego za pomocą kontrastu fazowego i obrazowania immunofluorescencyjnego kultur.Pokazano barwienie immunologiczne normalnych ludzkich komórek nabłonka początkowo kontrolowanych do cylindrycznego kształtu w hybrydowym sześcianie żelowym, po wytworzeniu drzewa oskrzelowego. Gałęzie pokazują prostopadłość do osi cylindrycznej, co ujawnia obrazowanie wielowymiarowe. Ważne jest, aby wstrzyknąć dużą gęstość komórek do kieszeni macierzy zewnątrzkomórkowej, ponieważ niska gęstość komórek może spowodować pogorszenie jakości komórek po inkubacji.Ten wzorzec metody polega na powtarzalnym tworzeniu wzoru komórkowego 3D z pomiarem ilościowym za pomocą obrazowania wielokierunkowego w celu zbadania mechanizmu rozwoju naczynia.

initial-3d-cell-cluster-control-hybrid-gel-cube-device-for-repeatable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Prezentujemy protokoły trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji została opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycji typu Michaela oraz mechanizmów wolnorodnikowych inicjowanych światłem), a także dla szeregu technik oceny zachowania enkapsulowanych komórek.

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Zgłaszamy urządzenie i nową metodę badania komórek i embrionów. Pojedyncze komórki są precyzyjnie uporządkowane w układach mikrownękowych. Ich uwięzienie w 3D jest krokiem w kierunku środowisk 3D spotykanych w warunkach fizjologicznych i umożliwia orientację organelli. Kontrolując kształt komórki, ta konfiguracja minimalizuje zmienność zgłaszaną w standardowych testach.

Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Ten artykuł przedstawia proste podejście do dostarczania nieciągłych gradientowych naprężeń statycznych na koncentrycznym hydrożelu wypełnionym komórkami w celu regulacji wyrównania komórek w inżynierii tkankowej.

Gradient Strain Chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek.

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Sferoidy komórkowe były uważane za jeden z potencjalnych modeli w dziedzinie zastosowań biologicznych. W tym artykule opisano protokoły skalowalnego generowania sferoid komórkowych za pomocą urządzenia do montażu akustycznego 3D, które zapewnia wydajną metodę solidnego i szybkiego wytwarzania jednolitych sferoid komórkowych.

Trójwymiarowe akustyczne urządzenie montażowe do masowej produkcji sferoid komórkowych

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Poznaj metodę kontroli kształtu klastrów komórkowych 3D w hybrydowym sześcianie żelowym bez specjalistycznego sprzętu. Technika umożliwia powtarzalne wzorce i wielokierunkowe obrazowanie w inżynierii tkankowej.

Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów (Wideo) | JoVE Journal

Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów

Przeglądaj więcej filmów