Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów
21 marca 2019
Przedstawiamy procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w trójwymiarowej matrycy zewnątrzkomórkowej w celu uzyskania powtarzalnego formowania wzoru. Sześcienne urządzenie zawierające dwa różne hydrożele jest wykorzystywane do uzyskania wielokierunkowego obrazowania w celu tworzenia wzoru tkankowego.
Protokół ten wykorzystuje prostą metodę zwiększania niezawodności modelu 3D hodowli komórkowej bez użycia specjalnego sprzętu. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy przeprowadzić powtarzalny eksperyment z kulturą 3D, kontrolując początkowe warunki hodowli w urządzeniu do sześcianu. Po przygotowaniu sześciennej ramy z poliwęglanu o wymiarach pięć na pięć milimetrów, umieść ramkę na wstępnie schłodzonym szkiełku podstawowym i pojemniku na lód, a następnie za pomocą pipety dodaj 12 mikrolitrów podgrzanej 1,5% agarozy od górnej powierzchni sześciennej ramy do dolnej powierzchni.
Rozprowadź agarozę, aby uzyskać płaską powierzchnię i pozwól polimerowi utwardzić się. Użyj pęsety, aby przesunąć ramkę do krawędzi szkła i obróć ramkę tak, aby otwarta strona była skierowana w dół przed umieszczeniem ramy z powrotem na prowadnicy. Po wypełnieniu kolejnych dwóch powierzchni ramy większą ilością agarozy, jak właśnie pokazano, wrzuć agarozę do pojemnika z otwartej powierzchni, aby utworzyć ścianę agarozy z czwartej i piątej strony.
Aby ustawić początkowy kształt klastra komórkowego, wstrzyknij odpowiednią matrycę zewnątrzkomórkową dla interesującej nas hodowli komórkowej do hybrydowej przestrzeni hodowli kostki żelowej i umieść na kostce sfabrykowaną mikroformę. Następnie umieść kostkę w inkubatorze dwutlenku węgla na 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po utwardzeniu macierzy zewnątrzkomórkowej ostrożnie wyjmij mikropleśń, aby matryca nie uległa zniszczeniu.
W macierzy zewnątrzkomórkowej zostanie wykonana kieszeń w pożądanym kształcie formy. Aby załadować komórki, należy zagęścić eksperymentalną zawiesinę komórkową po odwirowaniu w odpowiednim eksperymentalnym pożywce do hodowli komórek i wstrzyknąć komórki do kieszeni w macierzy zewnątrzkomórkowej. Umieść kostkę w inkubatorze dwutlenku węgla na 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby komórki mogły wpaść do kieszeni macierzy zewnątrzkomórkowej, wypełniając przestrzeń utworzoną przez mikropleśń.
Pod koniec inkubacji umieścić kostkę w jednym dołku na 24-dołkowej płytce i dodać 100 mikrolitrów odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej do dołka. Wstrzyknąć dodatkową macierz zewnątrzkomórkową, aby zamknąć kieszeń i umieścić kostkę z powrotem w inkubatorze na 25 minut. Po utwardzeniu macierzy zewnątrzkomórkowej upuść około 10 mikrolitrów agarozy o temperaturze 20 stopni Celsjusza na górną powierzchnię do kostki, aby zamknąć powierzchnię i utwardzać kroplę przez 10 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie przykryj całą kostkę świeżą pożywką, aby zwiększyć ciśnienie osmotyczne w celu ułatwienia transferu składników odżywczych do komórek w kostce. W celu nieinwazyjnego rozpoznawania kształtów 3D za pomocą obserwacji wielokierunkowej, umieść płytkę na stoliku mikroskopu i uzyskaj obrazy każdej strony sześcianu za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii kontrastu fazowego, używając pęsety do obracania usługi sześcianu, która ma być obrazowana między ujęciami. W przypadku obrazowania immunofluorescencyjnego za pomocą obserwacji wielokierunkowej, najpierw odessać supernatant z dołka zawierającego kostkę i utrwalić kostkę w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Pod koniec utrwalania umyj kostkę dwa razy PBS przez 10 minut na pranie. Nieprzepuszczalność kostki za pomocą 0,5% trytonu x-100 i PBS przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie umyj kostkę trzy razy w PBS przez 10 minut na pranie, a następnie zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą koziej surowicy i buforu immunofluorescencyjnego na 60 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie wybarwić komórki odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym, które jest przedmiotem zainteresowania, zgodnie ze standardowymi protokołami barwienia przeciwciał. Następnie zobrazuj wszystkie sześć boków sześcianu pod mikroskopem laserowym lub fluorescencyjnym, jak pokazano poniżej. W tym reprezentatywnym eksperymencie wielokierunkowe obrazowanie hybrydowych kostek żelowych, hodowanych z normalnymi ludzkimi komórkami nabłonka oskrzeli, demonstruje generowanie początkowej hodowli komórek w kształcie cylindrycznego lub pryzmatycznego za pomocą kontrastu fazowego i obrazowania immunofluorescencyjnego kultur.
Pokazano barwienie immunologiczne normalnych ludzkich komórek nabłonka początkowo kontrolowanych do cylindrycznego kształtu w hybrydowym sześcianie żelowym, po wytworzeniu drzewa oskrzelowego. Gałęzie pokazują prostopadłość do osi cylindrycznej, co ujawnia obrazowanie wielowymiarowe. Ważne jest, aby wstrzyknąć dużą gęstość komórek do kieszeni macierzy zewnątrzkomórkowej, ponieważ niska gęstość komórek może spowodować pogorszenie jakości komórek po inkubacji.
Ten wzorzec metody polega na powtarzalnym tworzeniu wzoru komórkowego 3D z pomiarem ilościowym za pomocą obrazowania wielokierunkowego w celu zbadania mechanizmu rozwoju naczynia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę kontrolowania początkowego kształtu skupisk komórkowych w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej, co umożliwia powtarzalne tworzenie wzorów. Dzięki zastosowaniu urządzenia w kształcie sześcianu z dwoma różnymi hydrożelami, technika ta pozwala na obrazowanie wielokierunkowe w procesie formowania wzorów tkankowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Inżynieria tkankowa
Wprowadzenie
- Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych są niezbędne do badania rozwoju tkanek.
- Kontrola początkowych warunków hodowli może zwiększyć wiarygodność eksperymentów.
- Hydrożele są powszechnie stosowane w inżynierii tkankowej ze względu na ich biozgodność.
- Obrazowanie wielokierunkowe zapewnia kompleksowy wgląd w proces formowania tkanek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody hodowli komórkowej 3D bez użycia specjalistycznego sprzętu.
- Osiągnięcie spójnego tworzenia wzorów w skupiskach komórkowych.
- Wykorzystanie urządzenia w kształcie sześcianu w celu usprawnienia możliwości obrazowania.
Zastosowane metody
- Przygotowanie poliwęglanowej ramki sześciennej do hodowli komórkowej.
- Nakładanie podgrzanej agarozy w celu stworzenia płaskiej powierzchni.
- Sekwencyjne wypełnianie ramki sześciennej agarozą w celu utworzenia ścianek.
- Wykorzystanie pęsety do precyzyjnej manipulacji ramką.
Główne wyniki
- Pomyślne stworzenie stabilnego środowiska 3D do hodowli komórkowej.
- Obserwacja powtarzalnego tworzenia się wzorów w skupiskach komórek.
- Efektywne wykorzystanie hydrożeli do obrazowania wielokierunkowego.
- Zwiększona wiarygodność wyników eksperymentalnych w badaniach nad tkankami.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia prosty sposób hodowli komórkowej 3D.
- Kontrola warunków początkowych jest kluczowa dla powtarzalności wyników.
- Technikę tę można zastosować w różnorodnych zastosowaniach z zakresu inżynierii tkankowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne modele hodowli komórkowych 3D są kluczowe dla wczesnego etapu odkryć oraz mechanistycznej redukcji ryzyka w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym, jednak powtarzalność pozostaje główną barierą. To hybrydowe urządzenie z kostką żelową umożliwia precyzyjną kontrolę kształtu i gęstości początkowych skupisk komórek, bezpośrednio niwelując zmienność w tworzeniu wzorców i wspierając solidną weryfikację hipotez. Zwiększona powtarzalność w hodowlach 3D wzmacnia pewność prognostyczną i pomaga w selekcji projektów w portfolio w kluczowych punktach zwrotnych procesu odkrywania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów samoorganizacji poprzez minimalizację zmienności warunków początkowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu dzięki powtarzalnemu tworzeniu wzorców 3D.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego, umożliwiając kontrolowaną manipulację geometrią skupisk komórek.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje standaryzowane biologiczne systemy 3D do późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Poprawia powtarzalność analiz poprzez kontrolę gęstości komórek oraz ich rozkładu przestrzennego w ECM.
- Umożliwia uzyskanie ilościowych wyników obrazowania w celu niezawodnej oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele in vitro do architektury tkanek istotnej dla przebiegu choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera rozwój z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez dostarczanie wiarygodnych i powtarzalnych danych przedklinicznych.
- Ułatwia odkrywanie biomarkerów dzięki zastosowaniu wielokierunkowego obrazowania o wysokiej rozdzielczości.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etapy wczesnego odkrywania i opracowywania testów, stanowiąc podstawę do identyfikacji związków wiodących oraz walidacji modeli przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Redukuje szum eksperymentalny podczas testowania hipotez i analizy szlaków poprzez standaryzację początkowych warunków hodowli 3D.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych odczytów odpowiednich do analizy wysokotreściowej.
- Analityka: Umożliwia obrazowanie wielokierunkowe i ilościowy pomiar tworzenia struktur 3D.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami przedklinicznymi poprzez replikację struktur tkankowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia skalowalną i adaptacyjną platformę dla różnych typów komórek i projektów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad kulturami 3D.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy i zwiększa powtarzalność wyników między zespołami.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez redukcję zmienności eksperymentalnej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badawczych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w trójwymiarowej hodowli komórek oraz pracy z ECM.
- Wymaga dostępu do podstawowej aparatury do hodowli komórkowej i obrazowania.
- Wymaga standaryzacji gęstości komórek i protokołów wytwarzania form w ramach różnych zespołów.
- Możliwość adaptacji do różnych typów komórek i składów ECM poprzez optymalizację protokołu.
- Zależność od wysokiej gęstości komórek w celu uzyskania optymalnej wierności wzoru i żywotności.
