Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów
March 21st, 2019
Przedstawiamy procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w trójwymiarowej matrycy zewnątrzkomórkowej w celu uzyskania powtarzalnego formowania wzoru. Sześcienne urządzenie zawierające dwa różne hydrożele jest wykorzystywane do uzyskania wielokierunkowego obrazowania w celu tworzenia wzoru tkankowego.
Protokół ten wykorzystuje prostą metodę zwiększania niezawodności modelu 3D hodowli komórkowej bez użycia specjalnego sprzętu. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy przeprowadzić powtarzalny eksperyment z kulturą 3D, kontrolując początkowe warunki hodowli w urządzeniu do sześcianu. Po przygotowaniu sześciennej ramy z poliwęglanu o wymiarach pięć na pięć milimetrów, umieść ramkę na wstępnie schłodzonym szkiełku podstawowym i pojemniku na lód, a następnie za pomocą pipety dodaj 12 mikrolitrów podgrzanej 1,5% agarozy od górnej powierzchni sześciennej ramy do dolnej powierzchni.
Rozprowadź agarozę, aby uzyskać płaską powierzchnię i pozwól polimerowi utwardzić się. Użyj pęsety, aby przesunąć ramkę do krawędzi szkła i obróć ramkę tak, aby otwarta strona była skierowana w dół przed umieszczeniem ramy z powrotem na prowadnicy. Po wypełnieniu kolejnych dwóch powierzchni ramy większą ilością agarozy, jak właśnie pokazano, wrzuć agarozę do pojemnika z otwartej powierzchni, aby utworzyć ścianę agarozy z czwartej i piątej strony.
Aby ustawić początkowy kształt klastra komórkowego, wstrzyknij odpowiednią matrycę zewnątrzkomórkową dla interesującej nas hodowli komórkowej do hybrydowej przestrzeni hodowli kostki żelowej i umieść na kostce sfabrykowaną mikroformę. Następnie umieść kostkę w inkubatorze dwutlenku węgla na 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po utwardzeniu macierzy zewnątrzkomórkowej ostrożnie wyjmij mikropleśń, aby matryca nie uległa zniszczeniu.
W macierzy zewnątrzkomórkowej zostanie wykonana kieszeń w pożądanym kształcie formy. Aby załadować komórki, należy zagęścić eksperymentalną zawiesinę komórkową po odwirowaniu w odpowiednim eksperymentalnym pożywce do hodowli komórek i wstrzyknąć komórki do kieszeni w macierzy zewnątrzkomórkowej. Umieść kostkę w inkubatorze dwutlenku węgla na 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby komórki mogły wpaść do kieszeni macierzy zewnątrzkomórkowej, wypełniając przestrzeń utworzoną przez mikropleśń.
Pod koniec inkubacji umieścić kostkę w jednym dołku na 24-dołkowej płytce i dodać 100 mikrolitrów odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej do dołka. Wstrzyknąć dodatkową macierz zewnątrzkomórkową, aby zamknąć kieszeń i umieścić kostkę z powrotem w inkubatorze na 25 minut. Po utwardzeniu macierzy zewnątrzkomórkowej upuść około 10 mikrolitrów agarozy o temperaturze 20 stopni Celsjusza na górną powierzchnię do kostki, aby zamknąć powierzchnię i utwardzać kroplę przez 10 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie przykryj całą kostkę świeżą pożywką, aby zwiększyć ciśnienie osmotyczne w celu ułatwienia transferu składników odżywczych do komórek w kostce. W celu nieinwazyjnego rozpoznawania kształtów 3D za pomocą obserwacji wielokierunkowej, umieść płytkę na stoliku mikroskopu i uzyskaj obrazy każdej strony sześcianu za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii kontrastu fazowego, używając pęsety do obracania usługi sześcianu, która ma być obrazowana między ujęciami. W przypadku obrazowania immunofluorescencyjnego za pomocą obserwacji wielokierunkowej, najpierw odessać supernatant z dołka zawierającego kostkę i utrwalić kostkę w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Pod koniec utrwalania umyj kostkę dwa razy PBS przez 10 minut na pranie. Nieprzepuszczalność kostki za pomocą 0,5% trytonu x-100 i PBS przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie umyj kostkę trzy razy w PBS przez 10 minut na pranie, a następnie zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą koziej surowicy i buforu immunofluorescencyjnego na 60 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie wybarwić komórki odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym, które jest przedmiotem zainteresowania, zgodnie ze standardowymi protokołami barwienia przeciwciał. Następnie zobrazuj wszystkie sześć boków sześcianu pod mikroskopem laserowym lub fluorescencyjnym, jak pokazano poniżej. W tym reprezentatywnym eksperymencie wielokierunkowe obrazowanie hybrydowych kostek żelowych, hodowanych z normalnymi ludzkimi komórkami nabłonka oskrzeli, demonstruje generowanie początkowej hodowli komórek w kształcie cylindrycznego lub pryzmatycznego za pomocą kontrastu fazowego i obrazowania immunofluorescencyjnego kultur.
Pokazano barwienie immunologiczne normalnych ludzkich komórek nabłonka początkowo kontrolowanych do cylindrycznego kształtu w hybrydowym sześcianie żelowym, po wytworzeniu drzewa oskrzelowego. Gałęzie pokazują prostopadłość do osi cylindrycznej, co ujawnia obrazowanie wielowymiarowe. Ważne jest, aby wstrzyknąć dużą gęstość komórek do kieszeni macierzy zewnątrzkomórkowej, ponieważ niska gęstość komórek może spowodować pogorszenie jakości komórek po inkubacji.
Ten wzorzec metody polega na powtarzalnym tworzeniu wzoru komórkowego 3D z pomiarem ilościowym za pomocą obrazowania wielokierunkowego w celu zbadania mechanizmu rozwoju naczynia.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia metodę kontroli początkowego kształtu klastrów komórek w 3D macierzy pozakomórkowej, ułatwiającą powtarzalne formowanie wzorców. Wykorzystując kostkę urządzenia z dwoma różnymi żelami hydrolowymi, technika ta pozwala na wielokierunkowe obrazowanie w formowaniu wzorców tkankowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Inżynieria tkankowa
Tło
- 3D modele kultury komórek są niezbędne do badania rozwoju tkanek.
- Kontrola początkowych warunków kultury może zwiększyć wiarygodność eksperymentu.
- Żele hydrolowe są powszechnie stosowane w inżynierii tkankowej ze względu na ich biokompatybilność.
- Wielokierunkowe obrazowanie zapewnia kompleksowe wgląd w formowanie tkanek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody 3D kultury komórek bez wyspecjalizowanego sprzętu.
- Osiągnięcie spójnego formowania wzorców w klastrach komórek.
- Wykorzystanie kostki urządzenia dla zwiększonej zdolności obrażania.
Stosowane metody
- Przygotowanie kostkowego rama z poliwęglanu do kultury komórek.
- Zastosowanie podgrzanej agarozy do stworzenia płaskiej powierzchni.
- Sekwencyjne wypełnianie kostkowego rama agarozą do stworzenia ścianek.
- Wykorzystanie kleszczy do precyzyjnego manipulowania rama.
Główne wyniki
- Sukcesywne stworzenie stabilnego środowiska 3D kultury komórek.
- Powtarzalne formowanie wzorców obserwowane w klastrach komórek.
- Skuteczna stosowanie żeli hydrolowych dla wielokierunkowego obrażania.
- Zwiększona wiarygodność wyników eksperymentalnych w badaniach tkankowych.
Wnioski
- Metoda zapewnia prosty podejście do 3D kultury komórek.
- Kontrola początkowych warunków jest kluczowa dla reprodukowalności.
- Ta technika może być stosowana w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable 3D cell culture models are critical for early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D, yet reproducibility remains a major barrier. This hybrid gel cube device enables precise control of initial cell cluster shape and density, directly addressing variability in pattern formation and supporting robust hypothesis testing. Enhanced repeatability in 3D cultures strengthens predictive confidence and informs portfolio triage at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of self-organization mechanisms by minimizing initial condition variability.
- Supports functional target validation through repeatable 3D pattern formation.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing controlled manipulation of cell cluster geometry.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized 3D biological systems for downstream screening workflows.
- Improves assay reproducibility by controlling cell density and spatial distribution in ECM.
- Enables quantitative imaging outputs for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant tissue architecture for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing robust, repeatable preclinical data.
- Facilitates biomarker discovery through high-resolution, multi-directional imaging.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and assay development, providing a foundation for lead identification and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Reduces experimental noise in hypothesis testing and pathway analysis by standardizing initial 3D culture conditions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts suitable for high-content analysis.
- Analytics: Enables multi-directional imaging and quantitative measurement of 3D pattern formation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by replicating tissue-like structures.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, adaptable platform for diverse cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D culture studies.
- Operational Value: Standardizes workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and ECM handling.
- Needs access to basic cell culture and imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of cell density and mold fabrication protocols.
- Adaptable to various cell types and ECM compositions with protocol optimization.
- Dependent on high cell density for optimal pattern fidelity and viability.
