Name: Badanie interakcji RNA kinazy białkowej aktywowanej RNA podczas cyklu komórkowego ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji interaktorów RNA kinazy PKR w skali genomowej przy użyciu komórek ssaków. Technika ta wykorzystuje formaldehydową retikulację i immunoprecypitację do badania regulacji potranskrypcyjnej ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki i Technologii Informacyjnych i Komunikacyjnych rządu koreańskiego (NRF-2016R1C1B2009886).

1. Przygotowanie roztworu i komórek
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu
	<ol>
		<li>W przypadku pożywki do hodowli komórkowych należy przygotować pożywkę do hodowli komórek HeLa, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM). 
		UWAGA: Do pożywki do hodowli komórkowych można dodawać antybiotyki, ale nie używamy antybiotyków.</li>
		<li>W przypadku 0,1% paraformaldehydu rozpuść 4% (w/v) paraformaldehydu w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z ogrzewaniem na płycie grzejnej i rozcieńczyć do uzyskania 30 ml 0,1% (v/v) paraformaldehydu, dodając 1x PBS. 
		UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności w dygestoriach i uważaj, aby nie zagotować roztworu paraformaldehydu. Chronić 0,1% roztwór przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Roztwór zużyć w ciągu jednego miesiąca. 
		UWAGA: pH końcowego 0,1% (v/v) roztworu paraformaldehydu powinno wynosić około 7.</li>
		<li>Przygotuj bufor do lizy fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) dodecylosiarczan sodu (SDS) i 0,1% (w/v) deoksycholan sodu. Dodaj potrójnie destylowaną wodę (TDW) do 40 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj bufor płuczący fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) SDS i 0,1% (w/v) deoksycholan sodu. Dodaj TDW do 40 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj 4x bufor PK: 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA i 4% (v/v) SDS. Dodaj TDW do 40 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować bufor elucyjny fCLIP: 20 ml 4x buforu PK, 21 g mocznika i 8,5 ml TDW. Przygotuj świeże.</li>
		<li>Przygotować bufor elucyjny RNA: 0,3 M NaOAc i 2% (w/v) SDS. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotuj 2x barwnik ładujący RNA: 0,025% (w/v) błękit bromofenolowy, 0,025% (w/v) cyjanol ksylenowy, 5 mM EDTA, 0,05% (w/v) SDS i 95% (v/v) formamid. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować 1x bufor TBE: 0,089 M tris-boranu i 0,002 M EDTA. Przygotować 500 ml buforu do KZM</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek z zatrzymaniem fazy S lub M
	<ol>
		<li>Zasiewaj ~ 750 000 lub ~ 1 000 000 komórek HeLa odpowiednio dla próbek zatrzymanych w fazie S lub M. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
		<li>Potraktować komórki 2 mM tymidyny i inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyj komórki dwa razy PBS. Dodać świeżą pożywkę i inkubować przez 9 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W przypadku komórek z zatrzymaną fazą S potraktuj komórki 2 mM tymidyną. W przypadku komórek z zatrzymaną fazą M należy potraktować komórki nokodazolem w stężeniu 100 ng/ml. Inkubować przez 15 godzin w temperaturze 37 °C i zbierać komórki. 
		UWAGA: Jednorodność próbek cyklu komórkowego można sprawdzić za pomocą FACS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sieciowanie formaldehydu i immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Pobieranie komórek
	<ol>
		<li>W przypadku próbki w fazie S zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. W przypadku próbki w fazie M postukaj w bok naczynia do hodowli komórkowej, aby odłączyć komórki zatrzymane w fazie M i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. 
		UWAGA: Aby zwiększyć jednorodność ogniw z zatrzymaniem fazy M, nie należy używać skrobaka do komórek.</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 380 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić z 1 ml zimnego PBS i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s. Całkowicie usunąć supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sieciowanie formaldehydu
	<ol>
		<li>Dodaj 750 μl 0,1% paraformaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki.</li>
		<li>Dodać 250 μl 1 M glicyny i inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze pokojowej w celu wygaszenia reakcji. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s. Całkowicie usunąć supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić za pomocą 1 ml PBS. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s i usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawiesić za pomocą 400 μl buforu do lizy fCLIP uzupełnionego 0,2% (v/v) inhibitorem proteazy i 2% (v/v) inhibitorem RNazy. Inkubować na lodzie przez 10 minut i poddać sonizacji za pomocą ultradźwięków.</li>
		<li>Dodaj 11 μl 5 M NaCl, aby dostosować stężenie NaCl do ~150 mM. Krótko przemieszać i odwirować przy 21,130 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Zachować 40 μl supernatantu w nowej probówce wirówkowej jako próbkę wejściową. Próbkę wejściową należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunoprecypitacja
	<ol>
		<li>Dodaj 20 μl kulek białka A do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Umyj kulki 400 μl buforu do lizy fCLIP. Odwirować kulki w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Usunąć supernatant i ostrożnie dodać 400 μl buforu do lizy fCLIP. Delikatnie ponownie zawieś koraliki, odwracając je 3 ~ 4 razy.</li>
		<li>Powtórz krok prania trzy razy. Po ostatnim umyciu całkowicie usunąć supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić kulki w 300 μl buforu do lizy fCLIP. Dodaj 8,3 μl 5 M NaCl, aby dostosować stężenie NaCl do ~150 mM. Dodać 10 μl przeciwciała PKR i inkubować przez 3 godziny na rotatorze w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować kulki w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 min. Usunąć supernatant i dodać 400 μl buforu płuczącego fCLIP. Delikatnie ponownie zawieś koraliki, odwracając je 3 ~ 4 razy.</li>
		<li>Powtórz krok prania dwa razy. Po ostatnim przemyciu całkowicie usunąć supernatant. 
		UWAGA: Nigdy nie używaj miksera wirowego. Delikatnie odwróć rurkę rękami.</li>
		<li>Dodać 300 μl lizatu i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 4 °C na rotatorze. 
		UWAGA: Dłuższy czas inkubacji może skutkować zwiększonym wiązaniem tła.</li>
		<li>Odwirować kulki w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 min. Usunąć supernatant i dodać 400 μl buforu płuczącego fCLIP. Delikatnie ponownie zawieś koraliki, odwracając je 3 ~ 4 razy.</li>
		<li>Powtórz krok prania trzy razy. Po ostatnim umyciu całkowicie usunąć supernatant.</li>
		<li>Dodać 300 μl buforu elucyjnego fCLIP. Inkubować w termomieszalniku przez 3 godziny w temperaturze 25 °C w celu wypłukania PKR z kulek. 
		UWAGA: Przygotować bufor elucyjny fCLIP na świeżo.</li>
		<li>Odwirować przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej i przenieść supernatant do czystej silikonowanej probówki. 
		UWAGA: Probówka do mikrowirówki jest również w porządku, ale preferowana jest rurka silikonowana, aby zapobiec parowaniu podczas etapu sieciowania (krok 2.3.12).</li>
		<li>Dodać 300 μl proteinazy K (20 mg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 65 °C. 
		UWAGA: Użyj termomiksera z podgrzewaną pokrywą, aby uniknąć parowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja RNA
	<ol>
		<li>Dodać 580 μl chloroformu kwasowo-fenolowego i wirować przez 30 s. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wirować przez 30 s i wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Przenieś wierzchnią warstwę do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1/10 objętości 3 M NaOAc, 0,5 μl współprecypitentu (np. Glycoblue) i równą objętość izopropanolu. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Wytrącić granulki przez odwirowanie z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C przez 1 h. 
		UWAGA: Jeśli nie zaobserwowano osadów RNA/DNA, dodaj dodatkowe 0,5 μl współrecipitantu i odwiruj przez dodatkowe 1 godzinę. Kontynuuj ten krok, aż zaobserwujesz osady RNA/DNA.</li>
		<li>Usunąć sklarowany osad i dodać 1 ml 75% alkoholu etylowego. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Powtórz krok prania jeszcze raz. Całkowicie usunąć supernatant i wysuszyć osad w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 42 μl TDW, 5 μl buforu DNazy I, 1 μl inhibitora RNazy i 2 μl DNazy I. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodać 150 μl TDW i 200 μl chloroformu kwasowo-fenolowego. Wir przez 30 s. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
		<li>Przenieś wierzchnią warstwę do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 μl 3 M NaOAc, 0,5 μl współrecipitantu i 1 ml 100% alkoholu etylowego. Inkubować przez noc w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Wytrącić granulki i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5.</li>
		<li>Ponownie zawiesić w odpowiedniej ilości TDW.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania
<ol>
	<li>Usuwanie rRNA
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić granulki RNA z kroku 2.4.10 za pomocą 28 μl TDW. 
		UWAGA: Maksymalna ilość całkowitego RNA powinna być mniejsza niż 5 μg.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z procedurami zawartymi w przewodniku referencyjnym zestawu do usuwania rRNA, aby usunąć rRNA.</li>
		<li>Oczyść RNA zubożone w rRNA, dodając 160 μl kulek magnetycznych.
		<ol>
			<li>Wymieszać pipetując ~15 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
			<li>Przymocuj rurkę do pręta magnetycznego i usuń supernatant.</li>
			<li>Dodaj 300 μl 80% alkoholu etylowego, gdy kulki są nadal przymocowane do pręta magnetycznego i inkubuj przez 30 sekund.</li>
			<li>Zastąp alkohol etylowy świeżym roztworem o pojemności 300 μl. Suszyć koraliki na pasku magnetycznym na powietrzu przez 12 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Ponownie zawiesić kulki w 12 μl TDW i wymieszać pipetując 15 razy.</li>
			<li>Przymocuj koraliki do pręta magnetycznego i przenieś supernatant do czystej probówki do PCR.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zuboż pofragmentowane rybosomalne RNA (rRNA) zgodnie z procedurami dostarczonymi przez zestaw do zubożania rRNA.</li>
		<li>Oczyść RNA, dodając 110 μl kulek magnetycznych i powtarzając kroki od 3.1.3.1 do 3.1.3.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie RNA i ligacja adaptora
	<ol>
		<li>Na RNA zubożone w rRNA dodaj 2 μl 10x buforu, 1 μl inhibitora RNazy i 2 μl antarktycznej fosfatazy alkalicznej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 65 °C przez 5 minut w celu inaktywacji fosfatazy.</li>
		<li>Dodać 3 μl 10x buforu PNK, 1,5 μl inhibitora RNazy, 1,5 μl enzymu T4 PNK, 0,8 μl r-ATP i 1,7 μl TDW. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 50 minut.</li>
		<li>Dodać 1,5 μl 10 mM ATP i inkubować w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 40 minut.</li>
		<li>Zatrzymać reakcję, dodając 170 μl buforu elucyjnego RNA.</li>
		<li>Dodać 200 μl chloroformu kwasowo-fenolowego i wirować przez 30 s. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
		<li>Przenieś wierzchnią warstwę do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 μl 3 M NaOAc, 0,5 μl współrecipitantu i 1 ml 100% alkoholu etylowego. Inkubować przez noc w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Wytrącić granulki RNA i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5. Ponownie zawiesić w 4,5 μl TDW i dodać 9 μl 2x barwnika ładującego RNA.</li>
		<li>Podgrzewać próbkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut i nabrać 10% żelu Urea-PAGE.</li>
		<li>Uruchom żel pod napięciem 370 V przez 40 minut 
		UWAGA: Przed załadowaniem próbki należy wstępnie uruchomić żel pod napięciem 370 V przez 90 minut.</li>
		<li>Przetnij żel w obszarze nukleotydów ~100 – 500 i rozbij żel.</li>
		<li>Dodać 700 μl 0,3 M NaCl i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze.</li>
		<li>Przenieść roztwór do kolumny i odwirować z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Przenieść eluat do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1/10 objętości 3 M NaOAc, 0,5 μl współprecypitu i równą objętość izopropanolu. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwiązanie adaptera 3'
	<ol>
		<li>Wytrącić granulki RNA i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5.</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulki RNA w 6,5 μl TDW i dodać 1 μl adaptera 10 μM 3'.</li>
		<li>Przenieść roztwór do probówki do PCR i inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 minuty.</li>
		<li>Dodaj 1 μl 10x buforu ligacyjnego, 0,5 μl inhibitora RNazy i 1 μl ligazy T4 RNA 2. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę, w temperaturze 25 °C przez 6 godzin i w temperaturze 22 °C przez 6 godzin.</li>
		<li>Dodać 12 μl barwnika ładującego 2x RNA i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Żel oczyścić RNA zligowane przez adaptor 3', jak opisano w 3.2.9 do 3.2.13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwiązanie adaptera 5'
	<ol>
		<li>Wytrącić granulki RNA i przemyć 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5.</li>
		<li>Ponownie zawieś granulki RNA w 4,2 μl TDW i dodaj 1 μl adaptera 5 μM 5'.</li>
		<li>Przenieść roztwór do probówki do PCR i inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 minuty.</li>
		<li>Dodać 0,8 μl 10x buforu ligazy, 0,4 μl inhibitora RNazy, 0,8 μl 10 mM ATP, 0,8 μl ligazy T4 RNA 1. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę, w temperaturze 25 °C przez 6 godzin i w temperaturze 22 °C przez 6 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja i amplifikacja PCR
	<ol>
		<li>Na 5' ligafikowanych adaptorowo RNA dodaj 1 μl 4 μM startera do odwrotnej transkrypcji. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 2 minuty i natychmiast schłodzić do temperatury 4 °C.</li>
		<li>Dodaj 4 μl buforu 5x FS, 4 μl 2,5 mM dNTP, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę i w temperaturze 70 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Przygotuj amplifikację PCR
		<ol>
			<li>Wymieszaj 1 μl produktu RT, 1 μl 25 μM startera RPI, 1 μL 25 μM startera RP1, 10 μL 5x buforu HF, 4 μL 2,5 mM dNTP, 32,5 μl TDW i 0,5 μl polimerazy o wysokiej wierności.</li>
			<li>Uruchom program PCR dla 11 ~ 13 cykli. 
			UWAGA: Program dla PCR to: 98 °C przez 30 s dla gorącego startu, 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s dla amplifikacji i 72 °C przez 5 min. Krok amplifikacji powtarza się przez 11-13 cykli.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oczyść produkty PCR za pomocą 40 μl kulek magnetycznych i wykonując kroki 3.1.3.1 do 3.1.3.6, ale używając 10 μl TDW do elucji DNA.</li>
		<li>Dodaj 2 μl 10x barwnika ładującego DNA. Załadować próbkę na 6% żel akrylowy i pracować pod napięciem 200 V przez 30 minut.</li>
		<li>Bejcować złotem Sybr (0,01% (v/v) w 1x buforze TBE) przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odbarwić w 1x bufor TBE przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przeciąć żel w obszarze nukleotydów ~200 – 700 i rozbić żel.</li>
		<li>Dodać 700 μl 0,3 M NaCl i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w celu wymycia DNA.</li>
		<li>Załaduj wszystko do kolumny i wiruj z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Przenieść eluat do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1/10 objętości 3 M NaOAc, 0,5 μl współprecypitu i równą objętość izopropanolu. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Wytnij granulki DNA i przemyj 75% alkoholem etylowym, jak opisano w krokach 2.4.4 do 2.4.5. Zawiesić ponownie w 20 μl TDW.</li>
		<li>Przeanalizuj próbkę za pomocą sekwencera.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza RNA oddziałujących z PKR za pomocą qRT-PCR
<ol>
	<li>Metoda 1: Losowa odwrotna transkrypcja heksameru
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić granulki RNA z kroku 2.4.10 za pomocą 8,5 μl TDW i przenieść roztwór do probówki PCR.</li>
		<li>Dodaj 0,5 μl 100 μM losowych heksamerów i 4 μl 2,5 mM mieszanki dNTP.</li>
		<li>Podgrzewać roztwór w temperaturze 65 °C przez 5 minut i natychmiast inkubować na lodzie przez co najmniej 1 minutę.</li>
		<li>Przygotuj mieszaninę reakcyjną: 4 μl 5x buforu SSIV, 1 μl 100 mM DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy (200 U/μL). Dodać mieszaninę reakcyjną do roztworu RNA.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 23 °C przez 10 min, w temperaturze 50 °C przez 10 min i w temperaturze 80 °C przez 10 min.</li>
		<li>Analizuj cDNA za pomocą systemu PCR w czasie rzeczywistym. 
		UWAGA: Program dla PCR w czasie rzeczywistym to: 95 °C przez 3 minuty dla gorącego startu, 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 10 s dla amplifikacji oraz 95 °C przez 30 s, 65 °C przez 30 s i 95 °C przez 30 s dla stopienia. Krok amplifikacji powtarza się przez 40 cykli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda 2: Odwrotna transkrypcja specyficzna dla nici
	<ol>
		<li>Przygotuj główną mieszankę starterów odwrotnych: Wymieszaj równe ilości specyficznych dla genu starterów odwrotnej transkrypcji zawierających sekwencję promotora CMV, a następnie ~20 nukleotydów sekwencji specyficznych dla genu. 
		UWAGA: Łączne stężenie wszystkich starterów RT specyficznych dla genu wynosi 4 μM.</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulki RNA z kroku 2.4.10 za pomocą 8,5 μl TDW i przenieść roztwór do probówki PCR.</li>
		<li>Dodać 0,5 μl 4 μM głównej mieszanki starterów do odwrotnej transkrypcji i 4 μl 2,5 mM mieszanki dNTP.</li>
		<li>Podgrzewać roztwór w temperaturze 65 °C przez 5 minut i natychmiast inkubować na lodzie przez co najmniej 1 minutę.</li>
		<li>Przygotować roztwór reakcyjny, mieszając 4 μl 5x buforu SSIV, 1 μl 100 mM DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy (200 U/μL). Dodać roztwór reakcyjny do mieszaniny RNA i startera.</li>
		<li>Inkubować roztwór w temperaturze 50 °C przez 10 minut i w temperaturze 80 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Analizuj cDNA za pomocą systemu PCR w czasie rzeczywistym. 
		UWAGA: Program do PCR w czasie rzeczywistym jest taki sam jak ten opisany w Metodzie 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li>
<li>Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon-inducible+double-stranded+RNA-activated+protein+kinase+self-associates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).</li>
<li>Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAX%2FPACT-PKR+stress+response+pathway+promotes+p53+sumoylation+and+activation%2C+leading+to+G%281%29+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest.</a> Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).</li>
<li>Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+differentially+regulates+insulin+receptor+substrates+1+and+2+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).</li>
<li>Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappa+B+Activation+by+Double-Stranded-RNA-Activated+Protein+Kinase+%28PKR%29+Is+Mediated+through+NF-kappa+B-Inducing+Kinase+and+Ikappa+B+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).</li>
<li>Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deletion+of+PKR+abrogates+TNF-induced+activation+of+IkappaBalpha+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22JNK%2C+Akt+and+cell+proliferation+but+potentiates+p44%2Fp42+MAPK+and+p38+MAPK+activation.+Oncogene%22%5BJournal%5D)">Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase.</a> JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).</li>
<li>Dabo, S., Meurs, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR+and+its+role+in+stress%2C+signaling+and+HCV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection.</a> Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).</li>
<li>Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+68%2C000-Mr+Protein-Kinase+Is+Highly+Autophosphorylated+and+Activated+yet+Significantly+Degraded+during+Poliovirus+Infection+-+Implications+for+Translational+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation.</a> Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).</li>
<li>Bando, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+RNA+dependent+protein+kinase+%28PKR%29+is+involved+in+the+extrastriatal+degeneration+in+Parkinson%27s+disease+and+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease.</a> Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).</li>
<li>Onuki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-dependent+protein+kinase+is+involved+in+tunicamycin-induced+apoptosis+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease.</a> The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).</li>
<li>Peel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+cell+stress+kinase+PKR+in+Alzheimer%27s+disease+and+human+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice.</a> Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).</li>
<li>Peel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%2C+PKR%2C+binds+preferentially+to+Huntington%27s+disease+%28HD%29+transcripts+and+is+activated+in+HD+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue.</a> Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).</li>
<li>Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upstream+signaling+pathways+leading+to+the+activation+of+double-stranded+RNA-dependent+serine%2Fthreonine+protein+kinase+in+beta-amyloid+peptide+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity.</a> Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+PKR+complexes+with+TRBP+in+Immunometabolic+regulation+and+eIF2alpha+phosphorylation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity.</a> Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).</li>
<li>Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+interferon-induced+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+activity+by+Sindbis+virus+infection+and+heat-shock+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress.</a> Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).</li>
<li>Youssef, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+for+snoRNAs+in+PKR+activation+during+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).</li>
<li>Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+Phosphorylation-resistant+Eukaryotic+Initiation+Factor+2+a-Subunit+Mitigates+Heat+Shock+Inhibition+of+Protein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).</li>
<li>Benkirane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+potential+of+TAR+RNA+binding+protein+TRBP+and+its+regulatory+interaction+with+RNA-dependent+protein+kinase+PKR%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR.</a> The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).</li>
<li>Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+by+a+mutant+of+the+IFN-inducible+dsRNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase.</a> Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKR+is+activated+by+cellular+dsRNAs+during+mitosis+and+acts+as+a+mitotic+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator.</a> Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+human+tarbp2+reveals+cellular+microRNA+targets+and+cell-cycle+function+of+TRBP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP.</a> Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).</li>
<li>Zhu, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PKR+promotes+network+excitability+and+enhanced+cognition+by+interferon-gamma-mediated+disinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition.</a> Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).</li>
<li>Dagon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%2C+PKR%2C+down-regulates+CDC2%2Fcyclin+B1+and+induces+apoptosis+in+non-transformed+but+not+in+v-mos+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells.</a> Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAU1+binding+3%27+UTR+IRAlus+complements+nuclear+retention+to+protect+cells+from+PKR-mediated+translational+shutdown%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown.</a> Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28A+is+a+suppressor+of+ER-associated+translation+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li>
<li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKR+Senses+Nuclear+and+Mitochondrial+Signals+by+Interacting+with+Endogenous+Double-Stranded+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs.</a> Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).</li>
<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li>
<li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li>
<li>Kim, B., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fCLIP-seq+for+transcriptomic+footprinting+of+dsRNA-binding+proteins%3A+Lessons+from+DROSHA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Dhir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+double-stranded+RNA+triggers+antiviral+signalling+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans.</a> Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Proces przygotowania próbek z zatrzymaną fazą S lub M przedstawiono na rysunku 1. Aby zatrzymać komórki w fazie S, zastosowaliśmy metodę podwójnego bloku tymidyny, w której dwukrotnie potraktowaliśmy komórki tymidyną z 9-godzinnym uwalnianiem pomiędzy nimi, aby zapewnić wysoką skuteczność zatrzymania (Figura 1A). W celu zatrzymania fazy M potraktowaliśmy komórki raz tymidyną, a następnie uwalnialiśmy 9 godzin, a następnie zastosowaliśmy nokodazol w celu zablokow...

Kinaza białkowa aktywowana RNA (PKR), znana również jako eukariotyczny czynnik inicjacji 2-alfa kinaza 2 (EIF2AK2), jest dobrze scharakteryzowaną kinazą białkową, która przekazuje informacje dostarczane przez RNA. Należy do rodziny kinaz kinazy alfa (eIF2α) podjednostki inicjacji translacji eukariotycznej 2 (eIF2α) i fosforyluje eIF2α w serynie 51 w odpowiedzi na infekcję, aby stłumić globalną translację1. W tym kontekście, PKR jest aktywowany przez wirusowe dwuniciowe RNA (dsRNA), które stanowią platformę do dimeryzacji PKR i autofosforylacji2. Oprócz eIF2α, PKR może również fosforylować p53, substrat receptora insuliny 1, inhibitor κB i kinazę N-końcową c-Jun (JNK) w celu regulacji aktywności wielu szlaków transdukcji sygnału3,4,5,6.
PKR został pierwotnie zidentyfikowany jako kinaza, która fosforylowała eIF2α podczas infekcji wirusem polio, rozpoznając dsRNA wirusa polio7,8. Coraz częściej stwierdza się, że PKR odgrywa wieloaspektową rolę poza odpowiedzią immunologiczną, a jego nieprawidłowa aktywacja lub nieprawidłowe działanie jest implikowane w wielu chorobach człowieka. Aktywowany/ufosforylowany PKR (pPKR) jest często obserwowany podczas apoptozy i jest powszechną cechą pacjentów z chorobami zwyrodnieniowymi, szczególnie chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Huntingtona, Parkinsona i choroba Alzheimera9,10,11,12,13. Ponadto PKR jest aktywowany w różnych warunkach stresowych, takich jak stres metaboliczny i szok cieplny14,15,16,17. Z drugiej strony, hamowanie PKR powoduje zwiększoną proliferację komórek, a nawet transformację złośliwą18,19. Funkcja PKR jest również ważna w prawidłowym funkcjonowaniu mózgu i podczas cyklu komórkowego, ponieważ poziom pPKR jest podwyższony podczas fazy M20,21,22. W tym kontekście, pPKR tłumi globalną translację i dostarcza wskazówek do kluczowych systemów sygnalizacji mitotycznej, które są wymagane do prawidłowego podziału komórki20. Co więcej, przedłużona aktywacja PKR powodowała zatrzymanie cyklu komórkowego fazy G2/M w komórkach jajnika chomika chińskiego23. W związku z tym fosforylacja PKR jest regulowana przez pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego, aby zapewnić szybką dezaktywację podczas przejścia M/G121.
Pomimo szerokiego zakresu funkcji PKR, nasze zrozumienie aktywacji PKR jest ograniczone z powodu braku ustandaryzowanego, wysokoprzepustowego eksperymentalnego podejścia do wychwytywania i identyfikacji dsRNA, które mogą aktywować PKR. Wcześniejsze badania wykazały, że PKR może wchodzić w interakcje z dsRNA utworzonymi przez dwa odwrócone powtórzenia Alu (IRAlus)20,24, ale możliwość istnienia dodatkowych komórkowych dsRNA, które mogą aktywować PKR podczas cyklu komórkowego lub w warunkach stresu w komórkach ludzkich, nie została zbadana. Konwencjonalne podejście do identyfikacji interaktorów RNA białka wiążącego RNA (RBP) wykorzystuje światło UV do sieciowania kompleksów RNA-RBP25,26,27. W niedawnym badaniu zastosowano to podejście do sieciowania UV w systemie mysim i stwierdzono, że małe jąderkowe RNA mogą regulować aktywację PKR podczas stresu metabolicznego16. Wykorzystując wysoką skuteczność sieciowania formaldehydu, przedstawiliśmy alternatywną metodę identyfikacji RNA oddziałujących z PKR podczas cyklu komórkowego w komórkach HeLa28. Podobne podejście zastosowano do badania innych dsRBP, takich jak Staufen i Drosha29,30,31. Odkryliśmy, że PKR może wchodzić w interakcje z różnymi typami niekodujących RNA, takimi jak krótki przeplatany element jądrowy (SINE), długi przeplatany element jądrowy (LINE), endogenny element retrowirusowy (ERV), a nawet alfa-satelitarne RNA. Ponadto wykazaliśmy, że PKR może wchodzić w interakcje z mitochondrialnymi RNA (mtRNA), które tworzą międzycząsteczkowe dsRNA poprzez komplementarną interakcję między ciężką i lekką nicią RNAs28. Niedawna publikacja dodatkowo potwierdziła nasze dane, że niektóre mtRNA istnieją w formie dupleksu i mogą aktywować czujniki dsRNA, takie jak białko 5 związane z różnicowaniem czerniaka, w celu indukcji interferonów32. Co ważniejsze, ekspresja i subkomórkowa lokalizacja mtRNA są modulowane podczas cyklu komórkowego i przez różne stresory, co może być ważne dla ich zdolności do regulowania aktywacji PKR28.
W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół dla niedawno opracowanej metody sieciowania i immunoprecypitacji formaldehydu (fCLIP) do wychwytywania i analizowania RNA oddziałujących z PKR podczas cyklu komórkowego. Przedstawiono metodę przygotowania próbek zatrzymania cyklu komórkowego przy użyciu tymidyny i nokodazolu. Następnie przedstawiamy proces fCLIP do izolacji RNA związanych z PKR oraz metodę przygotowania wysokoprzepustowej biblioteki sekwencjonowania w celu identyfikacji tych RNA. Ponadto określamy szczegółowe procedury analizy RNA związanych z PKR za pomocą qRT-PCR. W szczególności przedstawiamy specyficzną dla nici procedurę odwrotnej transkrypcji w celu analizy nici mtRNA. Opisany protokół jest zoptymalizowany pod kątem komórek HeLa i PKR, ale kluczowe etapy, takie jak przygotowanie próbki cyklu komórkowego, fCLIP i analiza qRT-PCR specyficzna dla nici, można łatwo zmodyfikować w celu zbadania komórkowych dsRNA lub identyfikacji interaktorów RNA innych dsRBP.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 7,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówki 1,7 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10% Nonidet-p40 (NP-40)</td><td>Biosolution</td><td>BN015</td><td></td></tr><tr><td>10X bufor ładujący DNA</td><td>TaKaRa</td><td>9157</td><td></td></tr><tr><td>15 mL rurka stożkowa</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>adapter 3'</td><td></td><td></td><td>5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3</td></tr> <tr><td>M Octan sodu pH 5,5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5'</td><td></td><td></td><td>adapter 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA UCN NNN-3'</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka stożkowa</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform kwasowo-fenolowy, pH 4,5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Koraliki magnetyczne oczyszczanie</td></tr><tr><td>Antarktyda fosfataza alkaliczna</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Anty-DGCR8</td><td></td><td></td><td>Wykonane w domu</td></tr><tr><td>Anti-PKR (D7F7)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKR (Milli)</td><td>Millipore EMD</td><td>07-151</td><td></td></tr><tr><td>ATP (100 mM)</td><td>GE Healthcare</td><td>GE27-2056-01</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa błękitu bromofenolowego</td><td>Sigma-aldrich</td><td>B5525</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza</td> <td>alkaliczna jelitowa cielęciaTaKaRa</td><td>2250A</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek 25 cm 2-pozycyjny</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>CMV sekwencja</td><td></td><td></td> promotora <td>5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Zmodyfikowane</td></tr> <tr><td>podłoże orła Dulbecco</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>mieszanina dNTP (2,5 mM)</td><td>TaKaRa</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absolutny, klasa ACS</td><td>Alfa-Aesar</td><td>A9951</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Merck</td><td>M-TMS-013-BKR</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Merck</td><td>104008</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-basic</td><td>GB0235</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue coprecipitant (15 mg / ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>8.18766.1000</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext zestaw do deplecji rRNA</td><td>New England Biolabs</td><td>E6318</td><td>Zestaw do usuwania rRNA</td></tr><tr><td>Nokodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Normalna technologia sygnalizacji komórek</td><td>IgG królika</td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>PCR forward primer (RP1)</td><td></td><td></td><td>5'-AAT GAT ACG GCG ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'</td></tr><tr><td>Starter odwrócony indeks PCR (RPI)</td><td></td><td></td><td>5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'PCR</td></tr> <tr><td>probówki z płaską nakrętką, 0,2 ml</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka z solą fizjologiczną (PBS)</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Polimeraza</td></tr> <tr><td>o wysokiej wiernościMikrowirówka PlateFuge z odchylanym wirnikiem</td><td>Benchmark</td><td>c2000</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa (PNK)</td><td>TaKaRa</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR Sekwencja</td> startera <td>Sigma-Aldricha</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR: CO1 Ciężki</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów qPCR: CO1 Światło</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-TTGAGGTTGCGTCTGTTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów qPCR: CO2 Ciężki</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów qPCR: CO2 Światło</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów qPCR: CO3 Ciężki</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: CO3 Światło</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: CYTB Ciężki</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: CYTB Światło</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: GAPDH</td><td></td><td></td><td>Do przodu/do tyłu: 5&prime;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: ND1 Ciężki</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: ND1 Światło</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: ND4 Ciężki</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: ND4 Światło</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: ND5 Ciężki</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: ND5 Światło</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: ND6 Ciężki</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja startera qPCR: ND6 Światło</td><td></td><td></td><td>do przodu/do tyłu: 5&prime;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Losowy heksamer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana Dnaza I (bez rnazy) (5 U/&mu; L)</td><td>TaKaRa</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor rnazy (40 U/&mu; L)</td> <td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania rRNA Ribo-Zero</td><td>Illumina</td><td>MRZH116</td><td>Zestaw do usuwania rRNA</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FINEPCR, ROTATOR AG</td><td>D1.5-32</td><td></td></tr><tr><td>RT sekwencja starterów: CO1 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGTCTGTTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: CO1 Light</td><td></td><td></td><td>5&-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: CO2 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: CO2 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: CO3 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: CO3 Światło</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: CYTB Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: CYTB Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: GAPDH</td><td></td><td></td><td>5&PRIME;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: ND1 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGATGATAAGGGGGGAGAGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: ND1 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTCAACTACGCCCTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: ND4 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTCAGATGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: ND4 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: ND5 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGTGAGGTGATGATG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: ND5 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCCATCCACCTTTA-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: ND6 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTGAGGTCTTGGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Sekwencja starterów RT: ND6 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Silikonowany polipropylen 1,5 ml G-tube</td><td>Bio Plas</td><td>4167SLS50</td><td></td></tr><tr><td>Dedecylosiarczan sodu</td><td>Biosesang</td><td>S1010</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SUPERaza w inhibitorze Rnazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III odwrotna transkryptaza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080093</td><td>Odwrotna transkryptaza do przygotowania biblioteki</td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza SuperScript IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18090010</td><td>Odwrotna transkryptaza dla qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBR złoty kwas nukleinowy gl barwienie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza 1 RNA T4 (Ligaza ssRNA)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza RNA 2, obcięta KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf ThermoMixer C z ThermoTop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Bufor tris-boran-EDTA (TBE)</td><td>TaKara</td><td>T9122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink Białko A kulki sefarozy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22810</td><td>Kulki białka A</td></tr><tr><td>Ultradźwięki</td><td>Bioruptor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Bio-basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>Ksylenowy cyjanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-32P-ATP (10 &mu; Ci/&mu; L, 3,3 i mu; M)</td> <td>PerkinElmer</td><td>BLU502A100UC</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie interakcji rna kinazy białkowej aktywowanej rna podczas cyklu komórkowego ssaków

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Kinaza białkowa aktywowana RNA (PKR) jest członkiem białek wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i rozpoznaje dwuniciową strukturę drugorzędową wirusowych RNA. Po związaniu z wirusowymi dwuniciowymi RNA (dsRNA), PKR ulega dimeryzacji, a następnie autofosforylacji. Fosforylowany PKR (pPKR) staje się aktywny i indukuje fosforylację podjednostki alfa eukariotycznego czynnika inicjacji 2 (eIF2α) w celu zahamowania globalnej translacji. Coraz więcej dowodów sugeruje, że PKR może być aktywowany w warunkach fizjologicznych, takich jak cykl komórkowy lub w różnych warunkach stresu bez infekcji. Jednak nasza wiedza na temat aktywatorów RNA PKR jest ograniczona ze względu na brak ustandaryzowanej metody eksperymentalnej do wychwytywania i analizowania dsRNA oddziałujących z PKR. Tutaj przedstawiamy protokół eksperymentalny mający na celu specyficzne wzbogacenie i analizę RNA związanych z PKR podczas cyklu komórkowego przy użyciu komórek HeLa. Wykorzystujemy wydajną aktywność sieciującą formaldehydu do wiązania kompleksów PKR-RNA i izolowania ich poprzez immunoprecypitację. Współimmunoprecypitowane RNA PKR mogą być następnie dalej przetwarzane w celu wygenerowania biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jedną z głównych klas komórkowych dsRNA oddziałujących z PKR są mitochondrialne RNA (mtRNA), które mogą istnieć jako międzycząsteczkowe dsRNA poprzez komplementarną interakcję między ciężką i lekką nicią RNA. Aby zbadać nici tych dupleksowych mtRNA, przedstawiamy również protokół qRT-PCR specyficznego dla nici. Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem analizy RNA związanych z PKR, ale można go łatwo zmodyfikować w celu badania komórkowych dsRNA lub interaktorów RNA innych białek wiążących dsRNA.

Schemat procesu zatrzymywania komórek HeLa w fazie S lub M cyklu komórkowego przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku próbki zatrzymanej w fazie M pod mikroskopem można wyraźnie zobaczyć komórki o okrągłym kształcie (Rysunek 2A). Aby ocenić efektywność zatrzymania cyklu komórkowego, można przeanalizować zawartość jądrową komórek za pomocą FACS (Rysunek 2B). Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne dane z testu wydajności immu...

Prezentujemy eksperymentalne podejścia do badania interakcji RNA dwuniciowych białek wiążących RNA, aktywowanych przez RNA (PKR) podczas cyklu komórkowego ssaków przy użyciu komórek HeLa. Metoda ta wykorzystuje formaldehyd do sieciowania kompleksów RNA-PKR i immunoprecypitacji w celu wzbogacenia RNA związanych z PKR. Te RNA mogą być dalej analizowane za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości lub qRT-PCR.

Badanie interakcji RNA kinazy białkowej aktywowanej RNA podczas cyklu komórkowego ssaków

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Protokół ten zapewnia metodę identyfikacji interaktorów RNA białka wiążącego RNA PKR w sposób obejmujący cały genom. Pomaga nam to lepiej zrozumieć potranskrypcyjną regulację ekspresji genów przez białko wiążące RNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona skuteczne sieciowanie formaldehydu w celu utrwalenia RNazy związanej z białkami wiążącymi RNA i wzbogacenia ich poprzez immunoprecypitację.Aktywowany PKR obserwuje się u pacjentów z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona i Alzheimera. Identyfikacja dwuniciowej RNazy oddziałującej z PKR pomoże nam lepiej zrozumieć patogenezę tych chorób zwyrodnieniowych. Metoda ta może być stosowana do badania interakcji RNA z dowolnymi białkami wiążącymi RNA.W szczególności uważamy, że metoda ta jest przydatna do badania białek, które rozpoznają ustrukturyzowaną RNazę, takich jak dwuniciowa RNaza. Należy sprawdzić jednorodność próbki zatrzymanej w cyklu przed pobraniem komórek. Ponadto kluczowe znaczenie ma optymalizacja skuteczności immunoprecypitacji przy użyciu najlepszego dostępnego przeciwciała.Na początek zasiej 750 000 lub milion komórek HeLa, aby uzyskać próbki z zatrzymaną fazą S lub M. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Potraktuj komórki dwumilimolową tymidyną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin.Umyj komórki dwa razy PBS. Następnie dodaj świeże podłoże i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dziewięć godzin. W przypadku komórek zatrzymanych w fazie S należy potraktować komórki dwumilimolową tymidyną.W przypadku komórek z zatrzymaną fazą M należy potraktować komórki 100 nanogramami na mililitr nokodazolu. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 godzin. W przypadku próbki z fazą S należy zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do 15-mililitrowej stożkowej probówki.W przypadku próbki w fazie M postukaj w bok naczynia do hodowli komórkowej, aby odłączyć komórki zatrzymane w fazie M i przenieś je do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 380 g w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki jednym mililitrem zimnego PBS.Przenieś komórki do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 sekund i całkowicie usunąć supernatanty. Aby przeprowadzić sieciowanie formaldehydu, najpierw dodaj 750 mikrolitrów 0,1% paraformaldehydu do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby utrwalić komórki.Następnie dodaj 250 mikrolitrów jednomolowej glicyny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 10 minut, aby wygasić reakcję. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 sekund. Całkowicie usunąć supernatanty.Następnie ponownie zawiesić z jednym mililitrem PBS. Odwirować komórki w temperaturze 10 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 sekund i usunąć supernatant. Zawiesić za pomocą 400 mikrolitrów buforu do lizy fCLIP uzupełnionego o 0,2% objętości inhibitora proteazy i dwuprocentowego inhibitora RNazy.Inkubować na lodzie przez 10 minut i sonikować za pomocą ultradźwięków. Następnie dodaj 11 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu, aby dostosować stężenie chlorku sodu do 150 milimoli i krótko wirować. Następnie odwirować w temperaturze 21, 130 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.Przenieść supernatanty do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Aby przeprowadzić immunoprecypitację, najpierw dodaj 20 mikrolitrów kulek białka A do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Następnie umyj kulki 400 mikrolitrami buforu do lizy fCLIP.Odwirować kulki w temperaturze 1 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę. Następnie usuń supernatant, ostrożnie dodaj 400 mikrolitrów buforu do lizy fCLIP i delikatnie ponownie zawieś kulki, odwracając je trzy do czterech razy. Powtórz krok prania trzy razy.Po ostatnim myciu należy całkowicie usunąć supernatanty. Ponownie zawiesić kulki w 300 mikrolitrach buforu do lizy fCLIP. Dodaj 8,3 mikrolitra pięciomolowego chlorku sodu, aby dostosować stężenie chlorku sodu do 150 milimolów.Dodaj 10 mikrolitrów przeciwciała aktywowanego kinazą białkową RNA i inkubuj na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie odwirować kulki w temperaturze 1 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę. Usuń supernatant, dodaj 400 mikrolitrów buforu myjącego fCLIP i delikatnie zawieś kulki, odwracając je trzy do czterech razy.Powtórz krok prania dwa razy. Po ostatnim myciu należy całkowicie usunąć supernatanty. Następnie dodaj 300 mikrolitrów lizatu i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze przez trzy godziny.Następnie odwirować kulki w temperaturze 1 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę. Usuń supernatant, dodaj 400 mikrolitrów buforu myjącego fCLIP i delikatnie zawieś kulki, odwracając je trzy do czterech razy. Powtórz krok prania trzy razy.Po ostatnim umyciu całkowicie usunąć supernatant. Następnie dodać 300 mikrolitrów buforu elucyjnego fCLIP. Inkubować w ThermoMixerze w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby wymyć kinazę białkową aktywowaną RNA z kulek.Odwirować przy 1 000 g w temperaturze pokojowej i przenieść supernatanty do czystej silikonowanej probówki. Na koniec dodaj 300 mikrolitrów proteinazy K i inkubuj przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Skuteczność zatrzymania cyklu komórkowego komórek HeLa w fazie S lub M badano za pomocą FACS.Przeciwciało D7F7 wykazało wyższą zdolność do wytrącania kinazy białkowej aktywowanej RNA. Analiza Western blot wytrąconego immunologicznie PKR lub całkowitego lizatu HeLa wykazała tylko jedno silne prążko odpowiadające wielkości PKR, co wskazuje, że przeciwciało D7F7 jest wysoce specyficzne w rozpoznawaniu PKR. Zastosowanie różnych przeciwciał PKR o różnej skuteczności immunoprecypitacji skutkowało różnym rozkładem klas odczytów sekwencjonowania mapy.Po udanym usunięciu rRNA obserwowano zmniejszenie sygnału radioizotopowego dla koimmunoprecypitowanej RNazy PKR. Próbka RNA z koimmunoprecypitacją PKR wykazała silne wzbogacenie mitochondrialnej RNazy w porównaniu z kontrolami negatywnymi. Odwrotna transkrypcja specyficzna dla nici została wykorzystana do odróżnienia mitochondrialnej RNazy ciężkiej i lekkiej, które były równoimmunoprecypitowane z PKR dla komórek zatrzymanych w fazie S lub M.Najbardziej krytycznym krokiem w przygotowaniu próbki zatrzymania cyklu komórkowego jest dwukrotne umycie komórek PBS i pobranie tylko pastelu komórek w celu uzyskania jednorodności, w przeciwnym razie próbka byłaby upośledzona. W przypadku procesu etycznego najbardziej krytycznymi etapami są sieciowanie formaldehydu i ilość. Po tej procedurze wyluzowane RNA mogą być analizowane za pomocą northern blot, qRT PCR lub sekwencjonowania wysokoprzepustowego.Eksperymenty te mogą zidentyfikować typ i względną ilość RNazy związanej z PKR. Technika ta może być zastosowana do badania i identyfikacji interaktorów RNA białek wiążących RNA, co poszerzy naszą wiedzę na temat potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów, w której pośredniczą białka wiążące RNA. Formaldehyd jest niebezpieczny, dlatego z utrwalaniem, roztworem i początkowym buforem do płukania należy obchodzić się ostrożnie.

studying-rna-interactors-protein-kinase-rna-activated-during

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Zgłaszamy dwa protokoły synchronizacji komórek, które dostarczają kontekstu do badania zdarzeń związanych z określonymi fazami cyklu komórkowego. Pokazujemy, że to podejście jest przydatne do analizy regulacji określonych genów w niezakłóconym cyklu komórkowym lub po ekspozycji na czynniki wpływające na cykl komórkowy.

Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Poznaj metodę identyfikacji interaktorów RNA kinazy PKR w skali genomowej przy użyciu komórek ssaków. Technika ta wykorzystuje formaldehydową retikulację i immunoprecypitację do badania regulacji potranskrypcyjnej ekspresji genów.

Badanie interakcji RNA kinazy białkowej aktywowanej RNA podczas cyklu komórkowego ssaków

Przeglądaj więcej filmów