Name: Pomiar kortyzolu w futrze koali (Phascolarctos cinereus) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji kortyzolu z futra koali Phascolarctos cinereus przy użyciu metanolu, etanolu i izopropanolu. Ta technika umożliwia nieinwazyjną ocenę przewlekłego stresu u koali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez fundusze na badania start-upowe dla Edwarda Narayana przez Western Sydney University, School of Science and Health. Autorzy dziękują Jackowi Nakhoulowi za pomoc w przetwarzaniu próbek.

Ten projekt został przeprowadzony zgodnie z surowymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ludźmi. Etyka zwierząt została przyznana przez Western Sydney University (A12373). Dodatkowo, laboratoryjna ocena ryzyka oraz formularz bezpieczeństwa biologicznego i promieniowania zostały przedłożone i zaakceptowane przez Western Sydney University w celu bezpiecznego przeprowadzenia tych badań (B12366).
UWAGA: Próbki futra koali do tego projektu zostały pobrane z Adelaide Koala and Wildlife Hospital, znajdującego się przy 282 Anzac Highway, Plympton South Australia. Futro zostało pobrane od jednego z koali, który został przyjęty do szpitala i poddany eutanazji z powodu poważnych obrażeń. Martwy koala był przechowywany w zamrażarce w worku na zwłoki wkrótce po śmierci. Po wyjęciu martwego koali z worka na zwłoki, 1,2 g futra zostało ogolone z karku za pomocą standardowych maszynek do strzyżenia zwierząt. Futro było golone jak najbliżej skóry, tak aby skóra nie została przecięta. Po ogoleniu zmarłego koalę wkładano z powrotem do worka na zwłoki i umieszczano w zamrażarce. Futro umieszczono następnie w woreczku wykonanym z folii aluminiowej i przechowywano w temperaturze poniżej -20 °C. Podczas transportu futro było przechowywane w temperaturze otoczenia, a po przybyciu do laboratorium futro było przechowywane w temperaturze -80 °C.
1. Ekstrakcja kortyzolu z futra koala
<ol>
	<li>Wyjąć futro z magazynu w temperaturze -80 °C i odczekać, aż się rozmrozi.</li>
	<li>Zważyć futro na laboratoryjnej precyzyjnej wadze analitycznej.</li>
	<li>Umieść 60 mg futra w wstępnie zważonej i oznakowanej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i powtarzaj, aż 18 probówek zostanie napełnionych. 
	UWAGA: W tym badaniu walidacyjnym wykorzystano 18 podpróbek futer.</li>
	<li>Dodać 1 ml izopropanolu klasy 100% wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) do każdej probówki za pomocą pipety.</li>
	<li>Wirowanie próbek przez 30 s.</li>
	<li>Odcedzić każdą próbkę za pomocą sitka mikroprecyzyjnego o średnicy 0,5 mm, aby uzyskać oddzielenie cieczy od futra.</li>
	<li>Wyrzuć płyn do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Umieść każdą próbkę futra w oznakowanej plastikowej łódce do ważenia, a następnie umieść w eksykatorze próżniowym, pozostaw futro do wyschnięcia na 3 dni.</li>
	<li>Po całkowitym wyschnięciu każdą próbkę umieścić w oznakowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Umieść każdą próbkę w młynie perełkowym z 3 kulkami ze stali chromowej (3,2 mm) i sproszkowaj przez 2 minuty z prędkością 30 wstrząsów na sekundę.</li>
	<li>Odpipetować 1,5 ml pierwszej techniki ekstrakcji (100% etanol klasy analitycznej) do 6 probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierających próbkę futra.</li>
	<li>Wykonaj to samo dla 100% metanolu klasy analitycznej i 100% izopropanolu klasy analitycznej, aż do napełnienia osiemnastu probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zakryj każdą probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) ze stałymi pulsacjami za pomocą wytrząsarki przez 3 godziny.</li>
	<li>Pobrać i odcedzić próbki za pomocą sitka mikroprecyzyjnego o średnicy 0,5 mm.</li>
	<li>Przenieś płyn do nowej, oznaczonej pipetą probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, upewniając się, że futro zostało odpowiednio wyrzucone.</li>
	<li>Całkowicie suchy ekstrakt rozpuszczalnikowy pod strumieniem paryN2 pod dygestoriami.</li>
	<li>Rozpuść wysuszony ekstrakt próbki, używając 400 μl buforu do oznaczania (skład dostarczony w dostępnym w handlu zestawie kortyzolu; patrz tabela materiałów) i 100 μl 100% etanolu o czystości analitycznej. 
	UWAGA: Ekstrakty próbek można przechowywać w temperaturze -80 .</li>
</ol>
2. Kontrole wewnętrzne
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić kontrole, należy utworzyć pulę wyekstrahowanych próbek o wysokim poziomie hormonów. Aby stworzyć tę pulę, wybierz próbki od zwierząt, o których wiadomo, że są narażone na stresor. Na przykład, wybierz próbki od koali, które zostały uratowane przed traumą środowiskową, ponieważ zazwyczaj wykazują wysoki poziom hormonu kortyzolu6.
	<ol>
		<li>Aby sporządzić pulę ekstraktu, należy pobrać 20 μl ekstraktu z każdej próbki (n = 10), aż do uzyskania całkowitej objętości 200 μl. Pula ekstraktów może być przechowywana w temperaturze -80 C do czasu oznaczenia. Uruchom pulę w każdym teście jako niskie lub wysokie kontrole wewnętrzne (patrz krok 2.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do testu użyj puli, aby wytworzyć zapasy dla niskich i wysokich kontroli, które wiążą się odpowiednio na poziomie 70% (C1) i 30% (C2). Współczynnik rozcieńczenia dla 30% i 70% punktów wiązania należy uzyskać z wykresu równoległości ekstraktu w stosunku do wzorca kortyzolu (ryc. 1). Użyć buforu do oznaczania w celu rozcieńczenia puli próbek. Na przykład do rozcieńczenia 1:2 należy użyć 60 μl ekstraktu z puli i 60 μl buforu do oznaczania. 
	UWAGA: W przypadku ekstraktu metanolowego 30% punkt wiązania był czysty, podczas gdy 70% punkt wiązania wynosił około 1:2, jak pokazano na rysunku 1. W ten sposób zapewniono współczynnik rozcieńczenia dla kontroli wewnętrznych (odpowiednio C1 i C2) dla przebiegu w ramach testu.</li>
</ol>
3. Analiza kortyzolu w ekstraktach z futra koala
<ol>
	<li>Użyj komercyjnego zestawu kortyzolu (tabela materiałów) i ustaw 96-dołkową płytkę paskową, w tym próbki, kontrole, standardy kortyzolu, niespecyficzne dołki wiążące i maksymalne dołki wiążące, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy. Użyj arkusza układu tablic dostarczonego w broszurze zestawu, aby wyświetlić listę pozycji próbek, kontrolek i wzorców na mapie płyt. 
	UWAGA: Zaleca się, aby wszystkie próbki, kontrole i wzorce były uruchamiane w dwóch egzemplarzach, aby umożliwić dokładność wyników.</li>
	<li>Przygotuj próbki. Postępuj zgodnie z ekstrakcją hormonu futra (sekcja 1), aby uzyskać 100% futro koala ekstrahowane metanolem.</li>
	<li>Przygotuj odczynniki. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w komercyjnym zestawie kortyzolu, aby przygotować odczynniki, w tym (1) bufor testowy, (2) bufor do płukania i (3) wzorce (kompozycje podane w zestawie kortyzolu, tabela materiałów).</li>
	<li>Zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu kortyzolu, odpipetuj 50 μl próbek lub wzorców do dołków w płytce. Odpipetować 75 μl i 50 μl buforu testowego odpowiednio do studzienek niespecyficznego wiązania (NSB) i studzienek o maksymalnym wiązaniu (B0 lub zero wzorca).</li>
	<li>Dodać 25 μl sprzężonego kortyzolu do każdej studzienki za pomocą pipety powtarzalnej. Następnie odpipetować 25 μl przeciwciała kortyzolu do każdej studzienki, z wyjątkiem studzienek NSB. Delikatnie postukaj w boki płytki, aby upewnić się, że odczynniki są dobrze wymieszane.</li>
	<li>Przykryj płytkę zgrzewarką do płytek i potrząsaj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (na niskich obrotach) za pomocą wytrząsarki orbitalnej.</li>
	<li>Wyjąć zgrzewarkę do płytek i zassać płytkę studzienki, przemłukując każdą studzienkę 4 razy 300 μl buforu do płukania.</li>
	<li>Osusz talerz, stukając nim o czyste, chłonne ręczniki.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl substratu tetrametylobenzadiny (TMB) (skład dostarczony w zestawie kortyzolu, tabela materiałów) do każdej studzienki.</li>
	<li>Umieścić uszczelniacz płytek na płytce dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Odpipetować pipetą 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki.</li>
	<li>Umieścić płytkę studzienkową w czytniku płytek zdolnym do odczytu 450 nm.</li>
	<li>Aby obliczyć końcowe stężenie hormonu, należy określić końcowe stężenie kortyzolu w ng/mg próbki, mnożąc stężenie hormonu pg/ml przez końcową objętość ekstraktu (0,5 ml) i dzieląc przez masę próbki futra (60 mg).</li>
</ol>

<ol><li>Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecosystem+services+and+Australian+agricultural+enterprises%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Economics%22%5BJournal%5D)">Ecosystem services and Australian agricultural enterprises.</a> Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).</li>
<li>Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthropogenic+disturbances+jeopardize+biodiversity+conservation+within+tropical+rainforest+reserves%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).</li>
<li>Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+Areas+under+Threat%3A+Overlap+of+Climate+Change+and+Population+Pressures+on+the+World%27s+Biodiversity+Priorities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170615(2017).</li>
<li>MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+loss+with+persistent+human+disturbance+increases+vulnerability+to+ecosystem+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse.</a> Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).</li>
<li>Hrdina, F., Gordon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Koala+and+Possum+Trade+in+Queensland%2C+1906-1936%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Zoologist%22%5BJournal%5D)">The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936.</a> Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).</li>
<li>Narayan, E. J., Williams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+dynamics+of+physiological+impacts+of+environmental+stressors+on+Australian+marsupials%2C+focus+on+the+koala+%28Phascolarctos+cinereus%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Zoology%22%5BJournal%5D)">Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus).</a> BMC Zoology. 1 (1), (2016).</li>
<li>Woinarski, J., Burbidge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phascolarctos+cinereus%5BTitle%5D)+AND+%22The+IUCN+Red+List+of+Threatened+Species+2016%22%5BJournal%5D)">Phascolarctos cinereus.</a> The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).</li>
<li>Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+causes+of+Koalas+in+South+East+Queensland%2C+Australia%3A+a+17-year+retrospective+study+of+mortality+and+morbidity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity.</a> Scientific Reports. 7, 42587(2017).</li>
<li>Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+physiological+stress+and+wildlife+disease%3A+consequences+for+health+and+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22Wildlife+Research%22%5BJournal%5D)">The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation.</a> Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).</li>
<li>Whirledge, S., Cidlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids%2C+stree%2C+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Endocrinologica%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids, stree, and fertility.</a> Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109(2010).</li>
<li>Romero, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+stress+in+ecology%3A+lessons+from+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research.</a> Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).</li>
<li>McEwen, B. S., Wingfield, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+in+a+name%3F+Integrating+homeostasis%2C+allostasis+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress.</a> Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).</li>
<li>Wingfield, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparative+biology+of+environmental+stress%3A+behavioural+endocrinology+and+in+ability+to+cope+with+novel%2C+changing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments.</a> Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).</li>
<li>Chrousos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+disorders+of+the+stress+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stress and disorders of the stress system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).</li>
<li>Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+evaluation+of+physiological+stress+in+an+iconic+Australian+marsupial%3A+the+Koala+%28Phascolarctos+cinereus%29%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus).</a> General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).</li>
<li>Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+use+of+hair+cortisol+as+a+measure+of+chronic+stress+in+eastern+chipmunks+%28Tamias+striatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus).</a> Conservation Physiology. 2 (1), 055(2014).</li>
<li>Ashley, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticosteroid+concentrations+in+feces+and+hair+of+captive+caribou+and+reindeer+following+adrenocorticotropic+hormone+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge.</a> General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).</li>
<li>Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cortisol+concentration+as+a+noninvasive+measure+of+long-term+stress+in+free-ranging+grizzly+bears+%28Ursus+arctos%29%3A+considerations+with+implications+for+other+wildlife%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife.</a> Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).</li>
<li>Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+behavioral+adaptation+to+relocation+stress+in+differentially+reared+rhesus+monkeys%3A+hair+cortisol+as+a+biomarker+for+anxiety-related+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).</li>
<li>Di Francesco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qiviut+cortisol+in+muskoxen+as+a+potential+tool+for+informing+conservation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies.</a> Conservation Physiology. 5 (1), 052(2017).</li>
<li>Cattet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+long-term+stress+in+brown+bears+with+the+hair+cortisol+concentration%3A+a+biomarker+that+may+be+confounded+by+rapid+changes+in+response+to+capture+and+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling.</a> Conservation Physiology. 2 (1), 026(2014).</li>
<li>Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+analysis+of+cortisol+from+human+and+monkey+hair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50882(2014).</li>
<li>Carlitz, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Hair+Cortisol+Concentrations+to+Assess+the+Effect+of+Anthropogenic+Impacts+on+Wild+Chimpanzees+%28Pan+troglodytes%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes).</a> PLoS ONE. 11 (4), 0151870(2016).</li>
<li>Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cortisol%2C+tetrahydrocortisol%2C+tetrahydrocortisone%2C+corticosterone%2C+and+aldosterone+in+human+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).</li>
<li>Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cortisol+Study%3B+Facial+Hair+and+Nails%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroids+%26+Hormonal+Science%22%5BJournal%5D)">A Cortisol Study; Facial Hair and Nails.</a> Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177(2016).</li>
<li>Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+extraction%3A+get+the+best+out+of+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Medicine+Australia%22%5BJournal%5D)">Steroid extraction: get the best out of faecal samples.</a> Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).</li>
<li>Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endogenous+cortisol+concentrations+in+the+hair+of+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques.</a> General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).</li>
<li>Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+study+of+ethanol+in+non-polar+solute+using+hydrogen-bonded+model%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+and+Chemistry+of+Liquids%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model.</a> Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje szereg badań wykorzystujących różnorodne techniki wykrywania kortyzolu w futrze ssaków. Niniejsze badanie przedstawia wyniki wykrywania kortyzolu w futrze pobranym od dzikiego koali narażonego na aktualny stres antropogeniczny. W tym pionierskim badaniu wykorzystano futro do sprawdzenia, który z trzech powszechnie stosowanych rozpuszczalników najlepiej ekstrahuje kortyzol — wskaźnik stresu chronicznego — z futra koali. Wyniki wykazały, że 100% metanol był zalecanym rozpuszczalnikiem do ekstrakcji kortyzolu z teg...

Australijskie ekosystemy podtrzymują ludzkie życie poprzez dostarczanie usług, w tym żywności i włókien, wśród wielu innych dynamicznych interakcji1. Jak na ironię, to właśnie działalność człowieka jest dominującym motorem zakłóceń ekosystemów poprzez zmiany różnorodności biologicznej2. Fragmentacja siedlisk, znana jako proces dzielenia dużych ciągłych siedlisk na małe skrawki lądu, odizolowane od siebie, jest główną antropogeniczną zmianą różnorodności biologicznej zagrażającą australijskim ekosystemom2. Fragmentacja siedlisk modyfikuje strukturę i różnorodność składu gatunkowego na danym obszarze, zmniejszając w ten sposób obszar siedliska niezbędny tym gatunkom do utrzymania żywotnych populacji2. Rezultatem tego jest zwiększona konkurencja między gatunkami o zasoby, w tym pożywienie, paliwo, włókno i wodę3. Niszczenie australijskich ekosystemów poprzez zmiany różnorodności biologicznej ma katastrofalne konsekwencje dla wielu australijskich gatunków rodzimych1.
Najbardziej charakterystyczny gatunek torbacza w Australii, koala (Phascolarctos cinereus), zależy od tego, czy australijskie ekosystemy pozostaną zdrowe, aby przetrwać4. Wprowadzenie osadnictwa europejskiego spowodowało gwałtowny spadek australijskich populacji koali, ponieważ były one zabijane dla skór w pogoni za zyskiem w dużym handlu eksportowym5. Praktyka ta została zakazana w latach 80-tych, a populacje koali były wtedy w stanie ustabilizować się5. Jednak gwałtowny wzrost populacji ludzkiej spowodował, że gatunek ten konkuruje o większość swojego siedliska, a jego przetrwanie jest ponownie zagrożone6. Według Międzynarodowej Unii Ochrony Przyrody (IUCN) wszystkie populacje australijskich koali są wymienione jako zagrożone wyginięciem z tendencją spadkową populacji7. Wpis ten przypisuje się niepewności co do istotnych parametrów populacji i wyraźnej zmienności trendów populacji tego gatunku7. Jako najbardziej kultowe i endemiczne zwierzęta, koale w dużej mierze przynoszą korzyści australijskiej gospodarce poprzez turystykę (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Szacuje się, że turystyka związana z koalami wygenerowała około 9 000 miejsc pracy i wnosi do gospodarki od 1,1 do 2,5 miliarda dolarów (Biuro Środowiska i Dziedzictwa Nowej Południowej Walii 2018). Usunięcie któregokolwiek z gatunków może być katastrofalne w skutkach i można je zaobserwować w stałym spadku liczebności rodzimej australijskiej przyrody6. Dodatkowo, gospodarka Australii odczuje konsekwencje, jeśli populacje australijskich koali będą nadal spadać w tempie, w jakim są6.
Sugeruje się, że częstość występowania zgonów i chorób w odpowiedzi na fragmentację siedlisk jest wynikiem przewlekłego stresu8. Już teraz dwadzieścia cztery gatunki torbaczy zostały uznane za wymarłe w Australii z powodu fragmentacji siedlisk, przy czym koale podążają za podobnym trendem8. Złożoność fragmentacji siedlisk i systemów biologicznych jest synergiczna, ale można ją rozpakować poprzez analizę reakcji na stres6. Ogólnie rzecz biorąc, każde zakłócenie w naturalnym otoczeniu zwierzęcia aktywuje złożoną kaskadę zdarzeń neurohormonalnych, znaną jako reakcja "walcz lub uciekaj"9,10. Ta reakcja na stres jest procesem, który rozpoczyna się w mózgu, gdzie aktywowana jest oś podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA)11. Składnik mózgu zwany podwzgórzem uwalnia hormon uwalniający kortykotropinę (CRH), który następnie sygnalizuje przednie przysadki mózgowe do uwolnienia hormonu adrenokortykotropowego (ACTH)11. To z kolei stymuluje wydzielanie glikokortykosteroidów z rdzenia nadnerczy. Organizm krąży glikokortykosteroidy we krwi, co przekierowuje magazynowanie glukozy z glikogenu i mobilizuje glukozę ze zmagazynowanego glikogenu11. Ta kaskada zdarzeń neurohormonalnych jest reakcją wykorzystywaną przez zwierzę do radzenia sobie z nieprzewidywalnymi bodźcami11. Jednakże, gdy glikokortykosteroidy są uwalniane i utrzymują się na podwyższonym poziomie przez dłuższy czas, uważa się, że zwierzę doświadcza przewlekłego stresu12,13. Proces ten polega na przekierowaniu energii z dala od innych funkcji organizmu, ponieważ jest ona potrzebna do ciągłej produkcji glikokortykosteroidów13. W rezultacie, przewlekły stres może uniemożliwiać wzrost, reprodukcję i odporność, które są kluczowymi cechami sprawności fizycznej wymaganymi do przetrwania14.
Pomiar produkcji glukokortykosteroidów u zwierzęcia jest powszechnym wskaźnikiem używanym do określenia, czy zwierzę doświadcza stresu fizjologicznego, czy nie15. W tym celu glikokortykosteroidy można mierzyć w osoczu krwi, surowicy, ślinie, moczu lub kale16. Jednak dowody sugerują, że włosy są znacznie skuteczniejszym wskaźnikiem przewlekłego stresu, w przeciwieństwie do wyżej wymienionego16. Dzieje się tak, ponieważ uważa się, że włosy zawierają hormony przenoszone przez krew w fazie wzrostu; jest stosunkowo stabilny; a każdy kortyzol wykryty we włosach odzwierciedla stres fizjologiczny doświadczany w okresie wzrostu włosów, który może trwać od tygodni do miesięcy16. Co więcej, każde zbieranie kortyzolu powinno być nieinwazyjne, aby zminimalizować stres związany z wychwytywaniem i obchodzeniem się16. Jednak stres doświadczany podczas tego wydarzenia nie wpłynąłby na poziom glukokortykosteroidów w hair16. Przeprowadzono wiele badań, które badają biegłość w używaniu włosów do pomiaru długotrwałego stresu u wielu zwierząt i obejmują badania na reniferach, niedźwiedziach grizzly, rezusach, piżmowołach i niedźwiedziach brunatnych17,18,19,20,21. Kortyzol do włosów jest zwykle ekstrahowany przez pierwsze umycie próbki, aby upewnić się, że kortyzol pochodzący z potu i sebum osadzony na powierzchni włosów nie jest jednocześnie ekstrahowany z kortyzolem, a następnie sproszkowanie próbki w ubijaku do koralików22. Po umyciu próbkę należy wysuszyć, aby zapewnić całkowite odparowanie22. Na koniec, za pomocą rozpuszczalnika, próbkę można wyekstrahować i odtworzyć, aby ułatwić oznaczenie kortyzolu22. Najpowszechniejszym rozpuszczalnikiem używanym do ekstrakcji kortyzolu z futra jest metanol21,23; Istnieją jednak badania, które wykorzystują etanol i izopropanol w swoich technikach ekstrakcji kortyzolu. Na przykład badanie, w którym użyto etanolu, zakończyło się sukcesem w ekstrakcji kortyzolu z ludzkiego płynu owodniowego24. Ponadto badanie, w którym użyto izopropanolu, odniosło sukces w ekstrakcji kortyzolu z ludzkich włosów i paznokci25,26. Z tego powodu w badaniu przetestowano wszystkie trzy rozpuszczalniki (metanol, etanol i izopropanol), aby określić, który z nich był najbardziej skuteczny w ekstrakcji kortyzolu z próbek futra koala.
Głównym celem tego badania było wykorzystanie obecnych technik do walidacji optymalnej techniki ekstrakcji hormonów, która ma być stosowana jako nieinwazyjny pomiar kortyzolu z futra koali. Udało się to osiągnąć dzięki przetestowaniu trzech rozpuszczalników ekstrakcyjnych (metanolu, etanolu i izopropanolu). Postawiliśmy hipotezę, że metanol będzie optymalnym rozpuszczalnikiem używanym do ekstrakcji kortyzolu z futra koala, ponieważ jest to zalecany rozpuszczalnik do ekstrakcji za pomocą Arbor assay kortyzolu kits27.

<table><tbody><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>n/a</td><td>n/d</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Koraliki ze stali chromowej</td><td>n/a</td><td>n/d</td><td>3,2 mm x 3</td></tr><tr><td>Zestaw kortyzolu</td><td>Testy trzpieniowe</td><td>K003-H1W</td><td>Wyprodukowano w Michigan USA</td></tr><tr><td>DetectX Zestaw do testów immunologicznych enzymów kortyzolu</td><td>Testy Arbor</td><td>K003-H5</td><td>Używany po raz pierwszy do badania kortyzolu w futrze koala</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>nie</td><td>dotyczy nie dotyczy</td><td>Klasa HPLC</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>n/a</td><td>n/d</td><td>Metanol klasy HPLC</td></tr><tr><td></td><td>nie</td> dotyczy <td>n/d</td><td>Mikropipeta klasy HPLC</td></tr><tr><td></td><td>n/a</td><td></td> n<td>/a n/d</td></tr><tr><td>Mikrosito</td> precyzyjne <td>n/a</td> n<td>/d</td><td>0,5 mm</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Bio Radi</td><td>n/a</td> n/<td>a</td></tr><tr><td>Myjka do mikropłytek</td><td>Bio Radi</td><td>n/a</td><td>n/d</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Bio Line</td><td>n/a</td> n<td>/d</td></tr><tr><td>Plastikowa łódź wagowa</td><td>n/a</td> n<td></td><td>/a n/a</td></tr><tr><td>Zgrzewarka do płyt</td><td>n/a</td><td></td> n<td>/a n/d</td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>n/a</td> n<td></td><td>/a n/d</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>n/a n/a</td></tr></tbody></table>

pomiar kortyzolu w futrze koali (phascolarctos cinereus)

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Optymalne metody ekstrakcji hormonów używane do pomiaru stresu u zwierząt w różnych typach próbek nie zawsze są takie same. Kultowy australijski gatunek torbacza, koala (Phascolarctos cinereus), stoi w obliczu długotrwałego narażenia na stresory wywołane antropogenami, a ocena przewlekłego stresu w dzikich populacjach jest pilnie uzasadniona. Jednym z najskuteczniejszych sposobów pomiaru przewlekłego stresu jest analiza hormonu glikokortykosteroidowego kortyzolu we włosach lub sierści, ponieważ wspiera on reakcje fizjologiczne i behawioralne. To laboratoryjne badanie walidacyjne ma na celu przetestowanie obecnych technik w celu walidacji optymalnej metody ekstrakcji hormonów, która ma być stosowana jako nieinwazyjny pomiar kortyzolu w futrze koali. Uznaje się, że stosowanie nieinwazyjnych technik pomiaru hormonów stresu jest preferowane w stosunku do tradycyjnych, inwazyjnych technik ze względu na ich idealne praktyczne i etyczne stanowisko. Ponadto stosunkowo łatwiej jest pozyskać futro z koali niż pobrać próbki ich krwi. W badaniu wykorzystano próbki futra koala pozyskane z Adelaide Koala and Wildlife Hospital do przeprowadzenia szeregu technik ekstrakcji hormonów w celu walidacji optymalnej metody ekstrakcji kortyzolu. Wyniki wykazały, że 100% metanol zapewnia najbardziej optymalną ekstrakcję rozpuszczalnikiem w porównaniu ze 100% etanolem lub 100% izopropanolem w oparciu o wyniki równoległości. Podsumowując, ta metoda ekstrakcji kortyzolu z futra koali zapewniła wiarygodny nieinwazyjny test, który można wykorzystać do badania przewlekłego stresu u koali.

Wykrywanie interesujących metabolitów hormonów w analizie jest określane za pomocą równoległości. Wykorzystując krzywą równoległości, punkt 50% wiązania określa również czynnik rozcieńczenia próbki na krzywej wzorcowej (Rysunek 1). Jak pokazano na wykresie równoległości (Rysunek 1), ekstrakty w 100% etanolu i 100% izopropanolu nie wykazały równoległego przesunięcia względem wzorca kortyzolu. Natomiast ekstrakt w 100% metanolu wykazał równoległe przesunięcie względem wzorca kortyzolu. Wys...

Przedstawiamy protokół do określenia optymalnego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do pomiaru kortyzolu z futra koali. Rozpuszczalnikami stosowanymi w tym protokole są metanol, etanol i izopropanol. Określenie optymalnego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego pomoże w wiarygodnym pomiarze sierści w celu określenia wpływu przewlekłego stresu na koale.

Pomiar kortyzolu w futrze koali (Phascolarctos cinereus)

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

Jest to nowatorska metoda oceny hormonu glikokortykosteroidowego, kortyzolu, z futra koali. Stanowi nowy biomarker do oceny przewlekłego stresu u koali. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to bardzo czuła i powtarzalna metoda z dość krótkim czasem realizacji między przygotowaniem próbki a testem hormonalnym.Technika ta pozwala na ilościową ocenę przewlekłego stresu u koali, co jest bardzo przydatnym narzędziem zarządzania klinicznego. W tej procedurze pomaga mi Dylan Fox, doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij futro z magazynu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i pozwól mu rozmrozić się w temperaturze pokojowej.Następnie zważ futro na laboratoryjnej precyzyjnej wadze analitycznej. Umieść 60 miligramów futra w wstępnie zważonej i oznaczonej 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej i powtarzaj to, aż 18 probówek zostanie napełnionych. Za pomocą pipety dodaj jeden mililitr 100% izopropanolu klasy HPLC do każdej probówki.Wirować próbki przez 30 sekund. Każdą próbkę należy przecedzić przez mikroprecyzyjne sito o pojemności 0,5 mililitra, aby uzyskać oddzielenie cieczy od futra, a następnie wyrzucić płyn do pojemnika na odpady. Umieść każdą próbkę f

cortisol-measurement-in-koala-phascolarctos-cinereus-fur

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kortyzol (CORT) gromadzi się w rosnących łodygach włosów ludzi i naczelnych. Opisujemy metody ekstrakcji i analizy włosów CORT z dużą precyzją i czułością. Pomiar CORT włosów jest szczególnie dobrze przystosowany do oceny przewlekłego stresu w okresach od tygodni do miesięcy.

Ekstrakcja i analiza kortyzolu z włosów ludzkich i małpich

Istnieje potrzeba nieinwazyjnej oceny stresu. W artykule opisano prosty protokół wykorzystujący obrazowanie termiczne do wykrywania znaczącej reakcji temperatury okolicy oczu u dzikich sikorek modraszkich na łagodny ostry stresor.

Obrazowanie termowizyjne do nieinwazyjnego badania stresu u nieskrępowanych ptaków

Aktywność nadnerczy może być oceniona u koniowatych poprzez analizę kału pod kątem metabolitów kortykosteronu. Metoda ta oferuje nieinwazyjną opcję oceny długoterminowych wzorców zarówno u koni domowych, jak i wolno żyjących. Protokół ten opisuje zaangażowany test immunologiczny sprzężony z enzymem i związaną z nim walidację biochemiczną.

Analiza glikokortykosteroidów w kale: nieinwazyjne monitorowanie nadnerczy u koniowatych

Analiza stężenia kortyzolu we włosach stanowi alternatywę dla tradycyjnych pomiarów kortyzolu; jednakże, aby pobrać próbki włosów od Afroamerykanów, naukowcy muszą być kulturowo poinformowani i kompetentni. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie kulturowo poinformowanej techniki pobierania próbek włosów do analizy kortyzolu od Afroamerykanów.

Pobieranie próbek włosów do analizy kortyzolu we włosach u Afroamerykanów

Celem tego artykułu jest zidentyfikowanie zmian w poziomie stresu po wizycie w trzech różnych miejscach i opisanie metod stosowanych do identyfikacji poziomów stresu na podstawie pomiarów kortyzolu w ślinie, α-amylazy i psychologicznego narzędzia do samoopisu.

Pomiar poziomu stresu biofizycznego i psychicznego po wizycie w trzech miejscach o różnym poziomie natury

W tym badaniu prezentujemy protokół ekstrakcji kortyzolu z płetwy i szczęki jesiotra. Poziom kortyzolu w płetwach i szczękach badano dalej, porównując dwa rozpuszczalniki do mycia, a następnie testy ELISA. W ramach tego badania pilotażowo sprawdzono wykonalność kortyzolu w kości szczęki jako nowego wskaźnika stresu.

Ekstrakcja kortyzolu z matryc płetw jesiotra i szczęk

Ten protokół pokazuje, jak zapewnić praktyczne, znaczące wzbogacenie środowiska dla świń, które są trzymane na podłodze z rusztów w różnych etapach ich życia, oraz jak pobierać próbki śliny w sposób nieinwazyjny do pomiaru stężenia kortyzolu, jako biomarkera ostrego stresu.

Zapewnienie znaczącego wzbogacenia środowiska i pomiar kortyzolu w ślinie u świń trzymanych na podłodze rusztowej

Ten protokół opisuje metodę określania podstawowej i stymulowanej forskoliną lipolizy w pachwinowych poduszeczkach tłuszczowych uzyskanych z normalnej diety karmowej (NCD) lub diety wysokotłuszczowej (HFD) ± myszy dzikich karmionych kapsaicyną. Jako wskaźnik lipolizy mierzono uwalnianie glicerolu z pachwinowych poduszek tłuszczowych.

Pomiar lipolizy podstawowej i stymulowanej forskoliną w pachwinowych poduszeczkach tłuszczowych

Celem protokołu jest przygotowanie hydrolizatu keratyny z piór kurczaka metodą hydrolizy alkaliczno-enzymatycznej oraz sprawdzenie, czy dodanie hydrolizatu keratyny do bazy maści kosmetycznej poprawia funkcję bariery skórnej (zwiększając nawilżenie i zmniejszając przeznaskórkową utratę wody). Testy przeprowadza się na ochotnikach i ochotniczkach.

Przygotowanie hydrolizatu keratyny z piór kurczaka i jego zastosowanie w kosmetyce

Mitochondria zawierają kilka enzymów zależnych od flawin, które mogą wytwarzać reaktywne formy tlenu (ROS). Monitorowanie uwalniania ROS z poszczególnych miejsc w mitochondriach jest trudne ze względu na niepożądane reakcje uboczne. Przedstawiamy łatwą i niedrogą metodę bezpośredniej oceny natywnych wskaźników uwalniania ROS przy użyciu oczyszczonych flawoenzymów i fluorometrii mikropłytek.

Jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny

Poznaj metodę ekstrakcji kortyzolu z futra koali Phascolarctos cinereus przy użyciu metanolu, etanolu i izopropanolu. Ta technika umożliwia nieinwazyjną ocenę przewlekłego stresu u koali.

Pomiar kortyzolu w futrze koali (Phascolarctos cinereus)

Przeglądaj więcej filmów