Model interfejsu krew-mózg człowieka do badania przekraczania barier przez patogeny lub leki oraz ich interakcji z mózgiem
9 kwietnia 2019
Tutaj prezentujemy protokół opisujący ustawienie systemu hodowli z porowatej membrany poliestrowej BBB (bariera krew-mózg) w celulonowym systemie hodowli w celu oceny transportu biomolekuł lub czynników zakaźnych przez ludzki BBB i ich fizjologicznego wpływu na sąsiednie komórki mózgowe.
Ten model interfejsu krew-mózg jest przydatny do badania transferu cząsteczek do układu nerwowego. Jak również do badania drobnoustrojów dotrzeć do zakażonego guza bólu mózgu. Dodanie mini mózgu do tej bariery krew-mózg lub modelu BBB pozwala na badanie naszych patogenów i cząsteczek, które powodują zachowanie bariery krew-mózg w mózgu.
Demonstracją procedury będzie Florian Bakao, doktorant z mojego laboratorium. Aby skonfigurować urządzenie do wstawiania mini hodowli z membraną poliestrową BBB mózgu, rozcieńczyć komórki do pięć razy 10 do czwartej komórki na stężenie intezy niekompletnej pożywki komórek śródbłonka i dodać odpowiednią objętość komórek do każdej wkładki do hodowli z membrany poliestrowej na płytce 12-dołkowej. Następnie umieść wkładki i inkubator do hodowli komórkowych, aż komórki osiągną 100% zbieżność.
Trzymaj 12-dołkową płytkę z jednym mililitrem poli-D-lizyny przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Następnie jeden mililitr lamininy na studzienkę przez noc. Zastąp lamininę jednym mililitrem pożywki z komórek śródbłonka uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą lub FBS.
Umieść to miejsce w inkubatorze na godzinę. Aby przygotować mini ziarno, delikatnie trypsynizuj astrocyty ludzkich neuronów w klonowaniu CHME pięciu komórek. Powiąż granulki komórkowe z kompletną pożywką komórkową śródbłonka.
Po policzeniu 3,6 razy 10 do piątego neuronu i astrocytów do 0,4 razy 10 do piątego klonu CHME, pięć komórek na studzienkę ma 12-dołkową płytkę. I wysiej 12-dołkową płytkę. Aby skonstruować mini mózg BBB, 24 godziny po wysiewie zastąp zużytą pożywkę świeżą, kompletną pożywką komórkową śródbłonka i przenieś wkładki hodowli z błony poliestrowej pokrytej mikronaczyniowymi komórkami śródbłonka mózgu na mini komórki mózgowe.
Następnie umieść urządzenie BBB many brain w inkubatorze. Aby potwierdzić przepuszczalność śródbłonka mózgu w kształcie litery BBB, dodaj 1,5 mililitra bufora transportowego na studzienkę do nowej płytki 12-dołkowej. I odwróć każdy filtr do góry nogami, aby ostrożnie usunąć pożywkę bez wpływu na barierę komórkową śródbłonka.
Umieść każdy filtr w jednej studzience płyty wypełnionej buforem transportowym i dodaj 0,5 mililitra żółtego Lucyfera do każdej studzienki. Następnie umieść płytkę w inkubatorze na 10 minut przed przeniesieniem filtrów do nowej 12-dołkowej płytki wypełnionej buforem transportowym. Po skonfigurowaniu urządzenia z wieloma mózgami BBB, jak pokazano, dodaj 3500 jednostek platformowych francuskiego szczepu wirusa neurotroficznego wirusa żółtej gorączki rozcieńczonego i 50 mikrolitrów pożywki z komórkami śródbłonka 2% FPS, bardzo ostrożnie, na wierzchu przedziału luminalnego.
Zaszczep kontrolny mini mózg BBB za pomocą 50 mikrolitrów 2% pożywki z komórek śródbłonka FBS bez wirusa. Następnie umieść w inkubatorze na 24 godziny urządzenie do wystawiania wirusa na krew-mózg wielu mózgów. Następnego dnia usuń wkładki, aby określić przepuszczalność komórek śródbłonka i towarzysza, tak jak pokazano.
Zachowaj jeden mililitr próbki z każdej studzienki, aby określić miano wirusa w środkowej komorze. Delikatnie pod wkładką, aby uniknąć przeciekania komory oświetleniowej do komór abluminalnych. Aby zbadać transport neuronu ukierunkowanego biomolekularnie przez barierę krew-mózg, dodaj interesującą biocząsteczkę do wkładek i włóż płytkę z powrotem do inkubatora hodowli komórkowych.
Po 24 godzinach zdalnie wstawia się i określa przepuszczalność śródbłonka. Następnie wybarwić wiele komórek mózgowych odpowiednim przeciwciałem w celu wykrycia obecności interesującej nas biocząsteczki w mini mózgu. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu wyrażają wszystkie podzbiory odbiorników, transporterów Efflux lub transporterów, które są kluczowymi białkami istotnymi dla ich funkcji biologicznych.
Niektóre francuskie szczepy wirusa neurotropikalnego wirusa żółtej febry mogą przekroczyć barierę krew-mózg w ciągu 24 godzin. Wirusy następnie namnażają się przez następne dwa dni poprzez namnażanie się wirusa wewnątrz komórek mózgowych. Co więcej, ekspresja specyficznych biomarkerów wirusowych jest stymulowana, gdy ta neuroinwazyjna populacja wirusów jest seryjnie pasażowana na mini komórkach mózgowych i ściśle koreluje z wiremią.
Po dodaniu do limitu cząsteczki penetrującej komórki przedziału, Neuro-Tag Neurovita przekracza barierę krew-mózg i jest w stanie celować w ludzkie neurony. Cząsteczka penetrująca komórkę neuro tag Delta neurovita przenika przez barierę komórkową śródbłonka, ale mniej skutecznie celuje w ludzkie neurony. Po dodaniu do małego środkowego przedziału, penetrująca komórki cząsteczka Neuro-Tag Neurovita przekracza barierę krew-mózg i jest w stanie zregenerować aksony ludzkich neuronów po zranieniu.
W przeciwieństwie do cząsteczki penetrującej komórki Neuro-Tag Neurovita Delta, nieaktywna forma Neurovita. Neuro-Tag Neurovita, zastosowana po zaszczepieniu w aksonie drapiącym komórki, wyzwala neuroochronę uszkodzonych neuronów i regenerację strefy X. Wyłącznie ze względu na dobre praktyki.
nie nadużywaj przejść I-komórkowych. Staraj się zachować pozory pożywki i regionów i sprawdź, czy nie ma mykoplazmy. Interakcje między mini mózgiem a lekami są drobnoustrojami będącymi przedmiotem zainteresowania, które mogą być dalej badane za pomocą transkryptu, który chemizuje to lub klasycznej biologii zwanej technikami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje stworzenie modelu minimózgu z ludzką barierą krew-mózg (BBB) z wykorzystaniem wkładów hodowlanych z porowatej membrany poliestrowej w celu zbadania transportu biomolekuł i czynników zakaźnych do ośrodkowego układu nerwowego. Celem badania jest ocena efektów fizjologicznych w przyległych komórkach mózgowych, co pozwala na uzyskanie wglądu w interakcje między BBB a różnymi patogenami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Choroby zakaźne
Wstęp
- Bariera krew-mózg jest kluczowa dla ochrony mózgu, stanowiąc jednocześnie wyzwanie dla dostarczania leków oraz dostępu patogenów.
- Model mini-mózgu umożliwia badanie interakcji między ludzkimi neuronami a BBB.
- Podejście to pozwala na ocenę przenikalności oraz wpływu fizjologicznego różnych cząsteczek.
Cel badania
- Ocena transportu biomolekuł i wirusów przez barierę krew-mózg (BBB).
- Zrozumienie wpływu patogenów na komórki neuronalne.
- Opracowanie wiarygodnego modelu do przyszłych testów leków i badań neurobiologicznych.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano system hodowli komórkowej z zastosowaniem wkładek z membran poliestrowych w płytce 12-dołkowej.
- Model biologiczny obejmował ludzkie komórki śródbłonka mikro naczyniowego mózgu w połączeniu z ludzkimi neuronami i astrocytami.
- Kluczowe etapy obejmowały hodowlę komórek do osiągnięcia konfluencji, aplikację czynników wirusowych oraz pomiar przepuszczalności śródbłonka.
- Układ poddano inkubacji, a w określonych odstępach czasu przeprowadzono różnorodne analizy w celu oceny wyników.
Główne wyniki
- Badanie potwierdziło, że niektóre wirusy mogą przekraczać barierę krew-mózg i namnażać się w komórkach mózgu.
- Cząsteczki przenikające przez błony komórkowe wykazały zdolność do regeneracji aksonów i wspomagania neuroprotekcji.
- Eksperymenty walidacyjne wykazały bezpośrednią korelację między wiremią a ekspresją specyficznych biomarkerów.
Wnioski
- Niniejsze badanie pozwala na lepsze zrozumienie dynamiki BBB oraz oddziaływań z patogenami.
- Wyniki wspierają opracowanie strategii terapeutycznych celujących w interfejs naczyniowo-neuronalny.
- Wnioski mają zastosowanie w potencjalnych interwencjach w chorobach dotykających mózg.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model BBB-Minibrain wypełnia krytyczną lukę we wczesnym etapie opracowywania leków neuroterapeutycznych, umożliwiając predykcyjną ocenę przenikania przez barierę krew-mózg oraz stopień angażowania celu. Ten istotny dla człowieka system in cellulo wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów na leki oraz badania nad patogenami przed testami in vivo, co jest zgodne z priorytetami przemysłowymi w zakresie pewności translacyjnej i ograniczenia wykorzystania zwierząt. Kompatybilność modelu ze standardowymi schematami hodowli komórkowych ułatwia jego integrację z procesami poszukiwawczymi w celu walidacji celów i opracowywania testów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych dotyczących dostarczania leków do OUN oraz oddziaływań patogenów z mózgiem.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system oparty na ludzkich komórkach do oceny specyficzności celu oraz mechanizmów transportu przez barierę.
- Wartość prognostyczna: Wspiera wczesne decyzje typu go/no-go poprzez korelację przenikania przez barierę z efektami funkcjonalnymi w neuronach, takimi jak neuroprotekcja lub regeneracja aksonów.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie ilościowych odczytów transportu molekularnego przez barierę oraz następujących po nim efektów komórkowych w przedziale minibrain.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje standaryzowane wkłady oraz ściśle określone testy przepuszczalności (np. Lucifer yellow), aby zapewnić spójność i skalowalność analizy.
- Gotowość do przesiewania: Kompatybilność z formatami wysokoprzepustowego obrazowania (high-content screening) w celu oceny bibliotek związków neuroaktywnych lub cząstek wirusowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zachowuje istotność fenotypową ludzkich neuronów, astrocytów i komórek mikrogleju, wspierając odczyty zgodne z biomarkerami w zakresie neuroinwazji lub neuroprotekcji.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia obserwację amplifikacji patogenu i ekspresji biomarkerów po przekroczeniu bariery, co pozwala na ocenę kandydatów na leki przeciwwirusowe lub neuroprotekcyjne.
- System istotny dla przebiegu choroby: Modeluje interakcje jednostki naczyniowo-nerwowej, które mają zastosowanie w kontekście chorób neurodegeneracyjnych, zakaźnych i neurozapalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
System BBB-Minibrain wpisuje się w proces wczesnego odkrywania leków, szczególnie po identyfikacji celu i przed optymalizacją związku wiodącego, zapewniając platformę o znaczeniu dla człowieka do oceny ekspozycji mózgu i modulacji celu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów transportu przez bariery oraz efektów neuronalnych wywołanych przez leki lub patogeny.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzowaną ocenę penetracji związków lub wirusów z ilościowym odczytem efektów w komórkach mózgowych.
- Analityka: Dostarcza mierzalne wyniki, w tym przepuszczalność śródbłonka, akumulację wewnątrzkomórkową oraz zmiany fenotypowe w neuronach (np. regeneracja neurytów, ekspresja markerów).
- Badania translacyjne: Łączy dane o przepuszczalności z funkcjonalnymi odpowiedziami komórek mózgowych, wspierając dopasowanie biomarkerów i potwierdzenie mechanizmu działania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zaprojektowany do wielokrotnego zastosowania w różnych projektach dzięki standaryzowanym technikom hodowli komórkowych i kriozachonanym liniom komórkowym, co zmniejsza obciążenie związane z rewalidacją.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie dostarczania leków do OUN i oddziaływania na cel poprzez modelowanie interakcji bariera-mózg u ludzi.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje dostępne techniki hodowli komórkowych i standardowy sprzęt laboratoryjny, co minimalizuje potrzebę specjalistycznego przeszkolenia.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza zależność od modeli zwierzęcych w ramach wczesnego screeningu przenikania przez BBB, co poprawia zgodność etyczną i przepustowość badań.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie zweryfikowanego dostarczenia do mózgu i aktywności specyficznej dla celu.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w hodowli ludzkich komórek, w tym w utrzymywaniu kultur komórek śródbłonka, neuronów, astrocytów oraz mikrogleju.
- Wymaga zastosowania wkładów z porowatej membrany poliestrowej oraz standardowej infrastruktury płytek 12-dołkowych kompatybilnych z inkubatorami i systemami obrazowania.
- Konieczna jest standaryzacja gęstości zasiewu komórek, składu pożywek oraz czasu przeprowadzania testów przepuszczalności we wszystkich zespołach badawczych.
- Adaptacja do alternatywnych modeli chorób może wymagać walidacji stabilności fenotypu komórek i integralności bariery podczas przedłużonej hodowli.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalną zmienność pierwotnych źródeł komórek oraz konieczność rutynowego testowania pod kątem obecności mycoplasma w celu zapewnienia wiarygodności danych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Human Cerebral Microvascular Endothelial Cell (hCMEC)/D3 Insert Coating and Blood Brain Barrier (BBB) Preparation
2:48
BBB-Minibrain Endothelial Permeability Validation
3:38
BBB Crossing and Multiplication of Yellow Fever Viruses in the Minibrain and Biomolecule BBB Crossing and Brain Cell Targeting
5:22
Results: Representative BBB-Minibrain Testing of Neuroinvasive Variants and Biomolecule Properties
7:19
Conclusion
