Name: Konwekcja wzmocniła dostarczanie optogenetycznego wektora wirusowego związanego z adenowirusem do kory mózgowej makaka rezusa pod nadzorem obrazów MRI online (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę konwekcji wzmocnionej z obrazowaniem MRI do dostarczania wektorów wirusowych do kory mózgowej makaka rezusa. Technika umożliwia szeroko zakresową manipulację aktywnością neuronalną w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez American Heart Association postdoctoral fellowship (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Reorganization and Plasticity to Accelerate Injury Recovery (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940 oraz przez Centrum Obrazowania Neurologicznego UCSF. Prace te były również wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka im. Eunice Kennedy Shiver w Narodowym Instytucie Zdrowia w ramach Nagrody Numer K12HD073945, Waszyngtońskie Narodowe Centrum Badań nad Naczelnymi (WaNPCR, P51 OD010425) oraz Centrum Neurotechnologii (CNT, Centrum Badań Inżynieryjnych Narodowej Fundacji Nauki w ramach grantu EEC-1028725). Dziękujemy Camilo Diaz-Botia, Timowi Hansonowi, Viktorowi Kharazii, Danielowi Silversmithowi, Karen J. MacLeod, Julianie Milani i Blakely Andrews za pomoc w eksperymentach oraz Nan Tian, Jiwei He, Peterowi Ledochowitschowi, Michelowi Maharbizowi i Toni Haun za pomoc techniczną.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski, San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i są zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych. Poniższą procedurę przeprowadzono na dwóch dorosłych samcach makaków rezusów w wieku 8 i 7 lat, o wadze odpowiednio 17,5 kg i 16,5 kg (małpa G i małpa J).
UWAGA: Stosuj standardowe techniki aseptyczne do wszystkich zabiegów chirurgicznych.
1. Obrazowanie podstawowe
<ol>
	<li>Uspokoić i zaintubować zwierzę i utrzymać znieczulenie ogólne pod izofluranem (stężenie zmieniało się od 0 do 5% w zależności od potrzeb, w zależności od parametrów życiowych, takich jak częstość oddechów i tętno). Monitoruj temperaturę zwierzęcia, tętno, nasycenie tlenem, reakcje elektrokardiograficzne i ciśnienie parcjalne CO2 na końcu oddechu przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Umieść zwierzę w ramce stereotaktycznej zgodnej z MR (patrz tabela materiałów), w której będzie przebywać przez cały zabieg. Podłącz zwierzę do przenośnego aparatu izofluranowego kompatybilnego z rezonansem magnetycznym i przetransportuj je do skanera MRI (3 T).</li>
	<li>Uzyskaj standardowe obrazy anatomiczne MR T1 (kąt odwrócenia = 9°, czas powtórzenia = 256 x 256 x 45, rozmiar matrycy = 192 x 192 x 80, grubość warstwy = 1 mm) i T2 (kąt odwrócenia = 130°, czas powtórzenia/czas echa = 52,5, rozmiar matrycy = 256 x 256 x 45, grubość warstwy = 1 mm) jako punkt odniesienia i do planowania chirurgicznego.</li>
	<li>Odzyskaj zwierzę ze znieczulenia i przetransportuj je do pomieszczenia dla zwierząt.</li>
	<li>Użyj uzyskanych obrazów T1 i T2, aby określić umiejscowienie kraniotomii. Lokalizację kraniotomii można precyzyjnie określić, dopasowując obszar kory mózgowej będący przedmiotem zainteresowania z MR z atlasem mózgu makaków (Paxinos, Huang, Petride, Toga 2nd Edition). Ponadto te obrazy wyjściowe mogą zapewnić oszacowanie lokalizacji wlewu wirusa. Pokazane tutaj obszary korowe to M1 i S1.</li>
</ol>
2. Implantacja komory kompatybilnej z MR
<ol>
	<li>Uspokoić i zaintubować zwierzę i utrzymać znieczulenie ogólne ze standardowym monitorowaniem znieczulenia, jak w 1.1.</li>
	<li>Umieść zwierzę w ramie stereotaktycznej zgodnej z MR, w której pozostanie przez cały okres implantacji komory i dostarczania wektora wirusowego. Podłącz zwierzę do przenośnej maszyny do izofluranu kompatybilnej z rezonansem magnetycznym.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie strzałkowe około 2 cm od linii środkowej o długości około 5 cm za pomocą skalpela.</li>
	<li>Usuń leżącą pod spodem tkankę miękką z czaszki za pomocą podnośników (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wykonać kraniotomię kołową (o średnicy 2,5 cm), aby pokryć wcześniej zaplanowane trajektorie wstrzyknięć za pomocą trepanacji (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Obniż punkt środkowy trepanacji poza krawędź trepaniny. Utwórz wgłębienie w środku planowanej kraniotomii wystarczająco głęboko w czaszce, aby zakotwiczyć trepanację za pomocą regulowanego punktu centrującego trepanacji. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć całkowitej penetracji przez głębokość czaszki, ponieważ może to spowodować uszkodzenie leżącej poniżej tkanki nerwowej.</li>
		<li>W razie potrzeby należy okresowo przepłukiwać obszar solą fizjologiczną, aby utrzymać wilgotność tkanek przez cały czas kraniotomii.</li>
		<li>Po wykonaniu środka opuść trepanację na czaszkę i obracaj trepanację zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, jednocześnie wywierając nacisk w dół, aż będzie można usunąć kościaną osłonę za pomocą kleszczy. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia leżącej pod spodem tkanki za pomocą trefiny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciągnij cienki szew (rozmiar 6-0) przez oponę twardą w środku kraniotomii i unieś oponę twardą, delikatnie pociągając szew od powierzchni mózgu, tworząc namiot w środku kraniotomii.</li>
	<li>Następnie nakłuj oponę twardą blisko środka namiotu za pomocą cienkich nożyczek okulistycznych, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. Następnie przetnij oponę twardą od środka do krawędzi kraniotomii i kontynuuj wzdłuż krawędzi cienkimi nożyczkami okulistycznymi.</li>
	<li>Zamontuj cylindryczną, wykonaną na zamówienie komorę kompatybilną z CED MR (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1; patrz sekcja 4, aby uzyskać instrukcje produkcji) do czaszki na szczycie kraniotomii, aby zapewnić podparcie kaniuli podczas infuzji CED, tak aby krzywizna kołnierza komory dobrze pokrywała się z krzywizną czaszki.</li>
	<li>Przymocuj implanty do czaszki za pomocą plastikowych i akrylu dentystycznego lub kilku tytanowych.</li>
</ol>
3. Dostarczanie wektorów wirusowych
<ol>
	<li>Wkrótce po wszczepieniu komory zgodnej z MR i włożeniu siatki iniekcyjnej kaniuli (Rysunek 1A-B, Rysunek Uzupełniający 1) do komory, napełnij siatkę solą fizjologiczną (0,9% NaCl) w celu wizualizacji miejsc wstrzyknięć za pomocą obrazów anatomicznych MR i wypełnij jamy komory mokrą, sterylną wchłanialną żelatyną, aby utrzymać wilgoć w mózgu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Przykryj skórę i cylinder sterylną obłożą do nacinania przeciwbakteryjnego, aby zachować sterylność cylindrów podczas transportu i infuzji MR. Umieścić kapsułkę z witaminą E w taki sposób, aby oznaczyć górną część siatki do wstrzykiwań w celu uzyskania pozytywnej identyfikacji.</li>
	<li>Podczas gdy zwierzę pozostaje zaintubowane, odłącz rurkę dotchawiczą od obwodu znieczulającego i ponownie podłącz ją do przenośnego urządzenia do izofluranu kompatybilnego z rezonansem magnetycznym i przetransportuj zwierzę do skanera MRI.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy T1 (kąt odwrócenia = 9°, czas powtarzania/czas echa = 668,6, rozmiar matrycy = 192 x 192, grubość warstwy = 1 mm, 80 warstw), aby obliczyć odległość od górnej części siatki iniekcyjnej i powierzchni kory mózgowej. Kapsułka z witaminą E jest wyraźnie widoczna na obrazach T1 i powinna być używana jako marker górnej części siatki iniekcyjnej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Użyj linijki w oprogramowaniu do obrazowania MR, aby zmierzyć odległość między górną krawędzią siatki iniekcyjnej a powierzchnią kory mózgowej.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy T2 (kąt odwrócenia = 130°, czas powtarzania/czas echa = 52,5, rozmiar matrycy = 256 x 256, grubość warstwy = 1 mm, 45 warstw), aby określić optymalne prowadnice kaniuli dla każdego miejsca w oparciu o docelowe miejsce infuzji (ryc. 2B-C). Jak wspomniano wcześniej, siatka kaniuli jest wypełniona solą fizjologiczną, która jest najlepiej widoczna na obrazach T2. Korzystając z oprogramowania do obrazowania MR, przewiń płaszczyznę czołową i strzałkową, aby znaleźć docelowe miejsce infuzji.</li>
	<li>Po rozmrożeniu wektora wirusowego przez kilka godzin w temperaturze pokojowej, wymieszaj wektor wirusowy ze środkiem kontrastowym MR gadoteridol (stosunek 250:1; 2mM Gd-DTPA, patrz tabela materiałów) za pomocą pipety lub mieszania wirowego. 
	nuta: Przedstawiona technika została przetestowana dla wektorów AAV z promotorem CamKIIa napędzającym ekspresję C1V1 skondensowaną z EYFP (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, miano: 2,5 x 1012 cząsteczek wirusa/ml; patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Załaduj zmieszanego wirusa do wysokociśnieniowej rurki dożylnej o pojemności 0,2 ml (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Stwórz sterylne pole poza skanerem MR do przygotowania linii do infuzji wirusa.</li>
	<li>Za pomocą wysokociśnieniowego przewodu dożylnego podłącz długi przedłużacz (około 3-5 metrów, w zależności od położenia pompy infuzyjnej w stosunku do otworu MR) do strzykawki o pojemności 3 ml zgodnej z MR i zalać solą fizjologiczną.</li>
	<li>Podłącz dystalny koniec długiej linii przedłużającej do bliższego końca rurki dożylnej o pojemności 0,2 ml wypełnionej wirusem i przymocuj kaniulę odporną na refluks z końcówką o stopniku 1 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D; patrz sekcja 5, aby zapoznać się z instrukcją produkcji kaniuli) do dystalnego końca tego zespołu za pomocą łącznika cewnika w stylu zacisku (patrz tabela materiałów) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Na koniec umieścić strzykawkę w pompie zgodnej z MR (patrz Tabela materiałów). Umieść sterownik pompy w sterowni skanera, ponieważ nie jest on kompatybilny z MR.</li>
	<li>Korzystając z uzyskanych wcześniej wyjściowych anatomicznych obrazów MR, wybierz lokalizację siatki iniekcyjnej kaniuli i głębokość wprowadzenia potrzebną do dotarcia do docelowego miejsca infuzji. Zaznacz głębokość wprowadzenia na kaniuli za pomocą sterylnej taśmy.</li>
	<li>Rozpocząć infuzję z szybkością 1 μl/min i wizualnie sprawdzić przepływ płynu w przewodzie infuzyjnym, obserwując wypływ płynu z końcówki kaniuli.</li>
	<li>Wprowadzić kaniulę ręcznie przez siatkę iniekcyjną na docelową głębokość, utrzymując przepływ w linii infuzyjnej, ponieważ zapobiegnie to zatykaniu się kaniuli przez penetrowaną tkankę podczas wprowadzania.</li>
	<li>Uzyskuj szybkie (2 minuty) obrazy ważone błyskiem T1 (kąt odwrócenia = 30°, czas powtarzania/czas echa = 3,05, rozmiar matrycy = 128 x 128, grubość warstwy = 1 mm, 64 warstwy) w celu monitorowania online infuzji wektora wirusowego.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu ~10 μl wektora tak, aby wprowadzić wystarczającą ilość wirusa do wykrycia w skanerze MR, uzyskaj obrazy MR w celu zweryfikowania prawidłowego umieszczenia kaniuli, co jest widoczne na podstawie obserwowanego rozprzestrzeniania się wirusa. Jeśli głębokość wprowadzonej kaniuli jest nieprawidłowa, wyreguluj odpowiednio głębokość lub powoli wyjmij kaniulę i ponów próbę włożenia, jak w ppkt 3.12.</li>
	<li>Monitoruj infuzję za pomocą wskazówek obrazów MR online (flash T1 zależny) i zwiększaj szybkość infuzji do 5 μL/min o 1 μL/min co kilka minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Po wstrzyknięciu około 40 μl wektora wirusowego należy rozpocząć zmniejszanie szybkości infuzji o 1 μl/min i przerwać infuzję po wstrzyknięciu ~50 μl i pozostawić kaniulę na miejscu na 10 minut.</li>
	<li>Powoli wyjmij kaniulę z mózgu i przejdź do następnego miejsca. Powtórz kroki od 3.9 do 3.19 dla każdej lokalizacji.</li>
	<li>Pod koniec wstrzyknięć, przed transportem zwierzęcia, należy przykryć cylinder sterylną serwetą. Następnie przetransportuj zwierzę z powrotem na salę operacyjną.</li>
	<li>Albo eksplantować komorę kompatybilną z MR i zamknąć nacięcie chirurgiczne, wymieniając płat kostny i leżący nad nim mięsień oraz zszywając skórę przy użyciu standardowych technik aseptycznych, albo zastąp komorę tytanowym cylindrem i sztuczną oponą twardą (patrz Yazdan-Shahmorad i in. 20169) w celu rejestracji i stymulacji neuronalnej.</li>
</ol>
4. Produkcja komorowa kompatybilna z MR
<ol>
	<li>Wykonać nylonową siatkę iniekcyjną kaniuli (rysunek 1A-B), obrabiając ją zgodnie z określonymi wymiarami (rysunek uzupełniający 1).</li>
	<li>Wydrukuj w 3D cylinder kompatybilny z MR z akrylonitrylu butadienu i styrenu (tworzywo ABS0 (rysunek 1C-E) (patrz plik uzupełniający 1–3; patrz tabela materiałów dla drukarki 3D i materiałów). 
	nuta: Jedna konstrukcja utrzymuje stałą siatkę wtrysku kaniuli w cylindrze kompatybilnym z MR (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C), podczas gdy inna pozwala na obracanie siatki, rozszerzając obszar iniekcji (Rysunek 1D-E).</li>
	<li>Nawlecz siatkę do wstrzykiwań kaniuli i postukaj w odpowiednią wnękę komory kompatybilnej z MR tak, aby oba elementy wykazywały ten sam gwint. 
	nuta: Można zastosować dowolny rodzaj gwintowania, pod warunkiem, że oba elementy mają ten sam gwint.</li>
	<li>Włóż nylonową siatkę iniekcyjną kaniuli, wkręcając ją w gwintowany otwór cylindra kompatybilnego z MR.</li>
</ol>
5. Produkcja kaniuli odpornych na refluks13
<ol>
	<li>Wytnij rurkę krzemionkową o długości 30 cm z średnicą wewnętrzną 0.32 mm i średnicą zewnętrzną 0.43 mm dla wewnętrznej rurki krzemionkowej (patrz tabela materiałów) za pomocą żyletki.</li>
	<li>Wytnij rurkę krzemionkową o długości 7.5 cm i długości 5 cm z średnicą wewnętrzną 0.45 mm i średnicą zewnętrzną 0.76 mm dla zewnętrznej rurki krzemionkowej (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przyklej rurkę zewnętrzną o długości 7,5 cm do rurki wewnętrznej o średnicy 30 cm za pomocą cyjanoakrylanu tak, aby rura wewnętrzna wystawała 1 mm poza rurę zewnętrzną, tworząc stopień odporny na refluks (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 2D). Aby upewnić się, że cyjanoakrylan nie dostanie się do wnętrza rurki wewnętrznej, umieść cyjanoakrylan na zewnątrz rurki wewnętrznej, z dala od końcówki kaniuli.</li>
	<li>Wklej rurkę krzemionkową o długości 5 cm na drugi koniec rurki wewnętrznej w celu zamocowania do złącza cewnika w stylu zacisku (patrz krok 3.10).</li>
</ol>

<ol><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li>
<li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li>
<li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li>
<li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li>
<li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li>
<li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li>
<li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li>
<li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li>
<li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839(2018).</li>
<li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys%3B+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li>
<li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li>
<li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided%2C+convection+enhanced+delivery+%28CED%29+of+AAV+vector+to+the+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+BiOS%22%5BJournal%5D)">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li>
<li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li>
<li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), E7297-E7306 (2016).</li>
<li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li>
<li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li>
<li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li>
<li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li>
</ol>

PNS ma udziały finansowe w Neuralink Corp., spółce, która opracowuje terapie kliniczne wykorzystujące stymulację mózgu.

W tym miejscu przedstawiamy wykonalną i skuteczną technikę osiągania ekspresji optogenetycznej na dużą skalę w pierwotnej korze somatosensorycznej i ruchowej NHP za pomocą CED pod kontrolą MR. Zastosowanie CED pod kontrolą rezonansu magnetycznego ma znaczącą przewagę nad tradycyjnymi metodami infuzji wirusa w mózgu NHP. Jedną z takich zalet jest zdolność do osiągania ekspresji na dużych obszarach przy mniejszej liczbie wymaganych naparów. Na przykład, przy konwencjonalnych metodach, wielokrotne wstrzyknięcia 1-2 μl wekto...

Optogenetyka to potężne narzędzie, które pozwala na manipulowanie aktywnością neuronalną i badanie połączeń sieciowych w mózgu. Wdrożenie tej techniki u naczelnych (NHP) może potencjalnie poszerzyć naszą wiedzę na temat wielkoskalowych obliczeń neuronowych, funkcji poznawczych i zachowania w mózgu naczelnych. Chociaż optogenetyka została z powodzeniem wdrożona w NHP w ostatnich latach1,2,3,4,5,6,7, wyzwaniem, przed którym stoją naukowcy, jest osiągnięcie wysokiego poziomu ekspresji w dużych obszarach mózgu u tych zwierząt. W tym przypadku zapewniamy skuteczne i uproszczone podejście do osiągnięcia wysokiego poziomu ekspresji optogenetycznej na dużych obszarach kory mózgowej u makaków. Technika ta ma ogromny potencjał, aby ulepszyć obecne badania optogenetyczne na tych zwierzętach w połączeniu z najnowocześniejszymi technologiami nagrywania8,9 i stymulacji optycznej10.
Wspomagane dostarczanie konwekcyjne (CED) to sprawdzona metoda dostarczania środków farmakologicznych i innych dużych cząsteczek, w tym wektorów wirusowych, do ośrodkowego układu nerwowego11,12,13. Podczas gdy konwencjonalne metody dostarczania obejmują wiele infuzji o małej objętości rozprowadzanych w małych obszarach mózgu, CED może osiągnąć szerszą i bardziej równomierną dystrybucję środka przy mniejszej liczbie wlewów. Sterowany ciśnieniem przepływ płynu (konwekcja) podczas infuzji pozwala na szerszą i bardziej równomiernie rozłożoną transdukcję tkanki docelowej podczas dostarczania wektorów wirusowych z CED. W ostatnich badaniach wykazaliśmy transdukcję, a następnie ekspresję optogenetyczną dużych obszarów pierwotnej kory motorycznej (M1) i somatosensorycznej (S1)9 i thalamus14 przy użyciu CED sterowanego rezonansem magnetycznym (MR).
Tutaj opisujemy użycie CED do osiągnięcia ekspresji optogenetycznej w dużych obszarach korowych za pomocą zaledwie kilku wstrzyknięć korowych.

<table><tbody><tr><td>0,2 ml wysokociśnieniowe rurki dożylne</td><td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td><td>533640</td><td></td></tr><tr><td>0,32 mm ID, 0,43 mm OD Rurki krzemionkowe</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150027</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm ID, 0,76 mm OD Rurki krzemionkowe</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150625</td><td></td></tr><tr><td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td><td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABS plastik</td><td>Stratasys, MN, USA</td><td>ABSplus-P430</td><td></td></tr><tr><td>Antybakteryjna serweta do nacinania</td><td>3M</td><td>6650EZ</td><td>Ioban</td></tr><tr><td>Drape Dental Acrylic</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td>1013117</td><td>Akrylowy środek</td></tr><tr><td>wiążący Windy</td><td>VWR International, LLC.</td><td>10196-564</td><td>Langenbeck Elevator, szeroki szew</td></tr><tr><td>cienki</td><td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td><td></td><td></td>1034505</tr><tr><td>Gadoteridol</td><td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>Laser do stymulacji światłem</td><td>Omicron-Laserage, Niemcy</td><td>Kompatybilna z PhoxX 488-60</td><td></td></tr><tr><td>MR Strzykawka 3 cc</td><td>Aparat Harvard, Holliston, MA, USA</td><td>59-8377</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania MR</td><td>Kompatybilny z Pixmeo</td><td>OsiriX MD 10.0</td><td></td></tr><tr><td>MR </td><td>Pompa Aparatura Harvard, Holliston, MA, USA</td><td>Harvard PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>Rama stereotaktyczna kompatybilna z MR</td><td>KOPF</td><td>1430M MRI</td><td></td></tr><tr><td>Perifix Clamp Style Złącze cewnika</td><td>B-Braun, Betlejem, PA, USA</td> Nie <td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>plastikowe</td><td>Tworzywa sztuczne 1</td><td>0-80 x 1/8N</td><td>nylonowe</td></tr><tr><td>tytanowe</td><td>Crist Instrument Co., Inc.</td><td>6-YCX-0312</td><td>Wkręty samogwintujące do kości</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>GerMedUSA Inc,SKU</td><td>:GV70-42</td><td></td></tr><tr><td>Drukarka 3D uPrinter SE</td><td>Stratasys, MN, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Witamina E w kapsułkach</td><td>Pure Encapsulations, LLC.</td><td>DE1</td><td></td></tr><tr><td>Mokry, sterylna, wchłanialna żelatyna</td><td>Pfizer Inc.</td><td>AZL0009034201</td><td>Pianka żelowa</td></tr></tbody></table>

konwekcja wzmocniła dostarczanie optogenetycznego wektora wirusowego związanego z adenowirusem do kory mózgowej makaka rezusa pod nadzorem obrazów mri online

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

W optogenetyce naczelnych (NHP) infekowanie dużych obszarów korowych wektorami wirusowymi jest często trudnym i czasochłonnym zadaniem. Tutaj demonstrujemy zastosowanie wspomaganego rezonansem magnetycznym (MR) wspomaganego konwekcji (CED) optogenetycznych wektorów wirusowych do pierwotnej kory somatosensorycznej (S1) i motorycznej (M1) makaków w celu uzyskania wydajnej, rozległej ekspresji korowej światłoczułych kanałów jonowych. Wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV) kodujące przesuniętą ku czerwieni opsynę C1V1 połączoną z białkiem żółtej fluorescencji (EYFP) wstrzyknięto do kory mózgowej makaków rezusów pod kontrolą MR. Trzy miesiące po infuzji obrazowanie epifluorescencyjne potwierdziło duże obszary ekspresji optogenetycznej (>130 mm2) w M1 i S1 u dwóch makaków. Co więcej, byliśmy w stanie zarejestrować wiarygodne reakcje elektrofizjologiczne wywołane światłem z obszarów odciągających za pomocą matryc mikroelektrokortykograficznych. Późniejsza analiza histologiczna i barwienie immunologiczne na reporterze ujawniły rozległą i gęstą ekspresję optogenetyczną w M1 i S1 odpowiadającą rozkładowi wskazanemu przez obrazowanie epifluorescencyjne. Technika ta pozwala nam uzyskać ekspresję na dużych obszarach kory mózgowej w krótszym czasie przy minimalnych uszkodzeniach w porównaniu z tradycyjnymi technikami i może być optymalnym podejściem do optogenetycznego dostarczania wirusa u dużych zwierząt, takich jak NHP. Podejście to wykazuje ogromny potencjał w zakresie manipulacji obwodami neuronalnymi na poziomie sieci ze specyficznością typu komórki w modelach zwierzęcych ewolucyjnie zbliżonych do ludzkich.

Konwekcyjne dostarczanie leków (CED) pod kontrolą MRI
Rozprzestrzenianie się wektora wirusowego monitorowano podczas infuzji CED pod kontrolą obrazowania MR w czasie rzeczywistym (Rycina 3A). W badaniu tym celem były obszary S1 i M1 u dwóch małp (Rycina 3B). Trójwymiarowe objętości dystrybucji oszacowano w analizie post-hoc obrazów MR (<strong class="xf...

Tutaj pokazujemy wspomagane dostarczanie wektorów wirusowych do kory mózgowej za pomocą rezonansu magnetycznego (MR) jako skuteczne i uproszczone podejście do osiągnięcia ekspresji optogenetycznej w dużych obszarach korowych w mózgu makaka.

Konwekcja wzmocniła dostarczanie optogenetycznego wektora wirusowego związanego z adenowirusem do kory mózgowej makaka rezusa pod nadzorem obrazów MRI online

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Konwekcyjne wzmocnione dostarczanie (CED) optogenetycznych wektorów wirusowych u naczelnych umożliwi naukowcom manipulowanie aktywnością neuronalną na dużą skalę w celu zrozumienia złożonych obliczeń i zachowań neuronalnych. Dzięki CED możemy osiągnąć wysoką ekspresję optogenetyczną w dużych obszarach mózgu naczelnych za pomocą zaledwie kilku wstrzyknięć w krótkim czasie w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Implantacja komory rezonansu magnetycznego lub rezonansu magnetycznego jest wykonywana przy użyciu standardowej praktyki w operacjach naczelnych innych niż ludzie, procedura jest szczegółowo opisana w protokole tekstowym i krótko opisana w tym filmie.Po uspokojeniu, ułożeniu i wstępnym nacięciu zwierzęcia, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy wykonać kraniotomię okrężną, aby pokryć wcześniej zaplanowane trajektorie wstrzyknięć za pomocą trepanacji. Utwórz wgłębienie w środku planowanej kraniotomii wystarczająco głęboko w czaszce, aby zakotwiczyć trepanację za pomocą regulowanego punktu centrującego trepanacji. Po wykonaniu środka opuść trepanację na czaszkę i obracaj trepanację zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, jednocześnie wywierając nacisk w dół, aż będzie można usunąć kościaną osłonę za pomocą kleszczy.Po podniesieniu opony twardej zgodnie z opisem w protokole tekstowym, odetnij oponę twardą od środka do krawędzi kraniotomii i kontynuuj wzdłuż krawędzi cienkimi nożyczkami okulistycznymi. Zamontuj cylindryczną, wykonaną na zamówienie, konwekcyjną komorę kompatybilną z rezonansem magnetycznym do czaszki na szczycie kraniotomii, aby zapewnić wsparcie kaniuli podczas infuzji, tak aby krzywizna kołnierza komory dobrze dorównywała krzywiźnie czaszki. Przymocuj implanty do czaszki za pomocą plastikowych i akrylu dentystycznego lub kilku tytanowych.Wkrótce po wszczepieniu komory zgodnej z rezonansem magnetycznym i wprowadzeniu do niej siatki iniekcyjnej kaniuli, należy napełnić siatkę 0,9% solą fizjologiczną, aby uwidocznić miejsca wstrzyknięć za pomocą obrazów anatomicznych MR. Wypełnij również jamy komory mokrą, sterylną, wchłanialną pianką żelową, aby utrzymać wilgoć w mózgu. Przykryj skórę i cylinder sterylną obłożą do nacinania przeciwbakteryjnego, aby zachować sterylność cylindrów podczas transportu i infuzji MR.Umieścić kapsułkę z witaminą E w taki sposób, aby oznaczyć górną część siatki do wstrzykiwań w celu uzyskania pozytywnej identyfikacji. Podczas gdy zwierzę pozostaje zaintubowane, odłącz rurkę dotchawiczą od obwodu znieczulenia i ponownie podłącz ją do przenośnego urządzenia do izofluranu kompatybilnego z rezonansem magnetycznym. Przetransportuj zwierzę do skanera MRI.Uzyskaj obrazy T1, aby obliczyć odległość od górnej krawędzi siatki iniekcyjnej i powierzchni kory mózgowej. Kapsułka z witaminą E jest wyraźnie widoczna na obrazach T1 i powinna być używana jako marker w górnej części siatki iniekcyjnej. Uzyskaj obrazy T2, aby określić optymalne prowadnice kaniuli dla każdego miejsca w oparciu o docelowe miejsce infuzji.Siatka kaniuli jest wypełniona solą fizjologiczną, która jest najlepiej widoczna na obrazach T2. Korzystając z oprogramowania do obrazowania MR, przewiń płaszczyznę czołową i strzałkową, aby znaleźć docelowe miejsce infuzji. Po rozmrożeniu wektora wirusowego przez kilka godzin w temperaturze pokojowej wymieszaj wektor wirusowy ze środkiem kontrastowym MR gadoteridol za pomocą pipety lub mieszania wirowego.Załaduj zmieszanego wirusa do wysokociśnieniowej rurki dożylnej o pojemności 0,2 mililitra. Używając wysokociśnieniowego przewodu dożylnego, podłącz długi przedłużacz do trzymililitrowej strzykawki kompatybilnej z MR i zalej solą fizjologiczną. Podłącz drugi koniec długiej rurki przedłużającej do rurki dożylnej o pojemności 0,2 mililitra załadowanej wirusem.Następnie przymocuj kaniulę odporną na refluks z jednomililitrową końcówką schodkową do dystalnego końca tego zespołu za pomocą łącznika cewnika w stylu zaciskowym. Na koniec umieścić strzykawkę w pompie zgodnej z MR. Korzystając z uzyskanych wyjściowych anatomicznych obrazów MR, wybierz lokalizację siatki iniekcyjnej kaniuli i głębokość wprowadzenia potrzebną do dotarcia do docelowego miejsca infuzji.Zaznacz głębokość wprowadzenia na kaniuli za pomocą sterylnej taśmy. Rozpocznij infuzję z szybkością jednego mikrolitra na minutę i wizualnie zweryfikuj przepływ płynu w przewodzie infuzyjnym, obserwując wyrzut płynu z końcówki kaniuli. Wprowadzić kaniulę ręcznie przez siatkę iniekcyjną na docelową głębokość, utrzymując przepływ w przewodzie infuzyjnym, ponieważ zapobiegnie to zatykaniu się kaniuli przez penetrowaną tkankę podczas wprowadzania.Teraz uzyskuj szybkie obrazy flash T1 w celu monitorowania online infuzji wektora wirusowego. Po wstrzyknięciu około 10 mikrolitrów wektora w taki sposób, aby wprowadzić wystarczającą ilość wirusa do wykrycia w skanerze MR, uzyskaj obrazy MR w celu zweryfikowania prawidłowego umieszczenia kaniuli, co jest widoczne na podstawie obserwowanego rozprzestrzeniania się wirusa. Jeśli głębokość włożonej kaniuli jest nieprawidłowa, wyreguluj odpowiednio głębokość lub powoli wyjmij kaniulę i ponów próbę włożenia.Monitorowanie infuzji za pomocą wskazówek dotyczących obrazów MR online. Zwiększaj szybkość infuzji do pięciu mikrolitrów na minutę o jeden mikrolitr na minutę co kilka minut. Ważne jest, aby powoli zwiększać szybkość infuzji i nie przekraczać pięciu mikrolitrów na minutę, ponieważ wysokie szybkości infuzji mogą spowodować uszkodzenie tkanek.Po wstrzyknięciu około 40 mikrolitrów wektora wirusowego zacznij zmniejszać szybkość infuzji o jeden mikrolitr na minutę. Należy przerwać infuzję po wstrzyknięciu około 50 mikrolitrów. Pozostaw kaniulę na miejscu na dziesięć minut.Powoli wyjmij kaniulę z mózgu i przejdź do następnego miejsca. Pod koniec wstrzyknięć należy przykryć cylinder sterylną serwetą przed transportem zwierzęcia, a następnie przetransportować zwierzę z powrotem na salę operacyjną. Analizy histologiczne seryjnych odcinków koronalnych ujawniają ekspresję optogenetyczną na dużą skalę wokół miejsc infuzji.Pokazano tutaj wyjściowy obraz koronalnego rezonansu magnetycznego i rozprzestrzenianie się środka kontrastowego po infuzji dla tego samego wycinka koronalnego MR. Wycinek tkanki koronalnej jest pokazany z mniej więcej tego samego. Barwienie peroksydazą odzwierciedla ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego lub reportera EYFP.Obserwuje się dobre wyrównanie między obszarem ekspresji EYFP, mierzonym za pomocą epifluorescencji powierzchniowej i barwienia histologicznego. Obejmują one obszar rozrzutu wektorowego oszacowany na podstawie obrazów MR. Białe kropki wskazują miejsca wstrzyknięć, a cały obszar reprezentuje obszar odsłonięty przez kraniotomię.Pokazano tutaj obraz w małym powiększeniu odcinków koronalnych wybarwionych przeciwciałem anty GFP, pokazujący przyśrodkowy boczny aspekt ekspresji YFP w korze somatosensorycznej. grot strzałki wskazuje położenie ścieżki kaniuli. Sąsiednia tkanka jest pokazana w większym powiększeniu, aby pokazać laminarną dystrybucję komórek YFP dodatnich.Gęsto zaludnione regiony komórek dodatnich YFP znajdują się głównie w warstwach od drugiej do trzeciej i od piątej do szóstej. Dalsze powiększenie ujawnia typowe komórki piramidalne w warstwach od drugiej do trzeciej, warstwie piątej i warstwie szóstej. Ważne jest, aby pozostawić kaniulę na miejscu przez 10 minut po zatrzymaniu przepływu.Zapewni to, że wirus przeniknie do otaczającej docelowej tkanki nerwowej. CED jest skutecznym podejściem do osiągania jednolicie wysokich poziomów ekspresji w dużych regionach mózgu u ssaków. Ma potencjał, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat obwodów neuronowych i łączności.Po transdukcji wirusa przez CED, kolejne eksperymenty stymulacji optogenetycznej mogą być połączone z zapisem elektrycznym i esejami behawioralnymi, aby ujawnić złożoną dynamikę obwodów w mózgu. Technika ta została wcześniej zastosowana przez Yazdan-Shahmorad i współpracowników w 2018 roku, w której optogenetyczna modulacja neuronalna została wykorzystana do wywołania zmian łączności w całej sieci w korze czuciowo-ruchowej.

convection-enhanced-delivery-optogenetic-adeno-associated-viral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.

Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Ten protokół opisuje kroki i analizę danych wymaganych do pomyślnego przeprowadzenia optogenetycznego funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (ofMRI). ofMRI to nowatorska technika, która łączy odczyt fMRI w wysokim polu ze stymulacją optogenetyczną, pozwalając na specyficzne dla typu komórki mapowanie funkcjonalnych obwodów nerwowych i ich dynamiki w całym żywym mózgu.

Optogenetyczny funkcjonalny rezonans magnetyczny

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Zgodnie z obecną implementacją, optogenetyka u naczelnych wymaga wstrzyknięcia wektorów wirusowych do mózgu. Optymalna metoda iniekcji powinna być niezawodna i, w przypadku wielu zastosowań, zdolna do celowania w pojedyncze miejsca o dowolnej głębokości, które można łatwo i jednoznacznie zidentyfikować w histologii pośmiertnej. Przedstawiono metodę iniekcji o tych właściwościach.

Wstrzyknięcia wektorów AAV do optogenetyki w znieczulonym i przytomnym, zachowującym się mózgu naczelnych innych niż człowiek

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Opisano nową technikę powszechnego dostarczania wirusa związanego z adenowirusem, która wykorzystuje infuzję wirusa podpajęczynówkowego. Metoda ta nie tylko zapewnia szeroką transdukcję mysich neuronów kory nowej w warstwach powierzchownych, ale także powoduje selektywną ekspresję transgenu w neuronach piramidowych warstwy piątej, nawet przy użyciu nieselektywnego promotora.

Rozległa transdukcja mysich neuronów kory nowej przez wstrzyknięcie subbaraczynoidu AAV2

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Opisano procedurę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów piramidowych kory mózgowej przy jednoczesnym monitorowaniu elektroencefalogramu, elektromiogramu oraz stężenia mleczanu w mózgu. Rejestracje eksperymentalne są przeprowadzane u myszy z podłączonymi przewodami podczas spontanicznych cykli snu i czuwania. Sprzęt do optogenetyki został zbudowany w naszym laboratorium; sprzęt pomiarowy jest dostępny w sprzedaży.

Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Poznaj metodę konwekcji wzmocnionej z obrazowaniem MRI do dostarczania wektorów wirusowych do kory mózgowej makaka rezusa. Technika umożliwia szeroko zakresową manipulację aktywnością neuronalną w badaniach neurobiologicznych.

Konwekcja wzmocniła dostarczanie optogenetycznego wektora wirusowego związanego z adenowirusem do kory mózgowej makaka rezusa pod nadzorem obrazów MRI online (Wideo) | JoVE Journal

Konwekcja wzmocniła dostarczanie optogenetycznego wektora wirusowego związanego z adenowirusem do kory mózgowej makaka rezusa pod nadzorem obrazów MRI online

Przeglądaj więcej filmów