Nadekspresja długich niekodujących RNA przy użyciu CRISPR aktywującego geny

Niekodujące RNA często mają wiele izoform. W badaniach nadekspresji in vitro często trudno jest zbadać wszystkie te wyrażone izoformy. Technika ta pozwala użytkownikom na uzyskanie ekspresji bezpośrednio z genomu i umożliwia komórkom ekspresję endogennych izoform dla określonego niekodującego RNA.

Ta potężna technika pozwala użytkownikowi na precyzyjne kierowanie ekspresją dowolnego genu w genomie z wiernością i dokładnością. Projektując przewodniki RNA do określonych genów, można wykorzystać endogenną maszynerię splicingu genów do ekspresji naturalnych izoform w danej komórce. Procedurę zademonstruje Robert Rankin, post-doc z mojego laboratorium.

Aby zaprojektować sekwencję przewodnika RNA, która znajduje się w obrębie 100 par zasad od miejsca rozpoczęcia transkrypcji, należy skorzystać z genetycznych baz danych, takich jak BLAT, aby upewnić się, że przewodnik RNA jest unikalny dla interesującego genu. Przechowuj przewodnik RNA i dezaktywowane plazmidy Cas9 w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na talerzu agarowym z bulionu Luria wyrzuć E.coli z ampicyliną i hoduj bakterie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia wybierz kolonię i hoduj bakterie w pięciu mililitrach LB z ampicyliną przez noc, energicznie potrząsając probówką w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj dwa mililitry bakterii do 200 mililitrów LB z ampicyliną w dwulitrowej kolbie, energicznie potrząsając kolbą przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Obracaj bakterie w tempie 3 724 razy g przez 20 minut i przystąp do oczyszczania DNA.

Aby stworzyć lentiwirusa zawierającego dCas9, najpierw pokryj 100-mililitrowe naczynia do hodowli tkankowych pięcioma mililitrami 0,01% poli-L-lizyny i umieść pięć milionów HEK293T komórek na miskę w 10 mililitrach kompletnego zmodyfikowanego podłoża Eagles firmy Dulbecco, a następnie przygotuj próbki transfekcji DNA, mieszając 10 mikrogramów wektora przewodnika RNA zawierającego LTR lub dezaktywowanego wektora Cas9 zawierającego LTR z plazmidami zawierającymi składniki wirusów. Dodaj wodę do całkowitej objętości 450 mikrolitrów i przefiltruj mieszaninę przez końcówkę filtra 0,2 mikrona dołączoną do strzykawki. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 2,5-molowego dichlorku wapnia do każdej próbki transfekcyjnej DNA i delikatnie wymieszaj.

Przefiltruj mieszaninę wapnia i DNA przez końcówkę filtra 0,2 mikrona dołączoną do strzykawki. Odpipetuj 500 mikrolitrów 2X HBS do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej. Dodaj kroplami 500 mikrolitrów mieszaniny wapnia-DNA i delikatnie wiruj.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodaj jeden mililitr zawiesiny DNA-wapń HBS do każdej płytki do hodowli tkankowej zawierającej HEK293T i inkubuj je w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Trzeciego dnia powoli wyjmij i wyrzuć media z naczyń.

Ostrożnie umyj komórki PBS raz. Dodaj sześć mililitrów kompletnego DMEM uzupełnionego 20-milimolowym HEPES i 10-milimolowym maślanem sodu. Następnie inkubuj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu godzin.

Po inkubacji przemyj komórki raz PBS i dodaj do HEK293T komórek pięć mililitrów kompletnego DMEM z 20-milimolowym HEPES. Inkubuj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. W czwartym dniu należy zebrać supernatanty komórek HEK293T i przefiltrować supernatant zawierający wirusa.

Aby rozpocząć liczenie cząstek wirusa, najpierw rozcieńczyć koncentrat płuczący z zestawu P24 ELISA, dodając 19 części destylowanej, dejonizowanej wody. Następnie rozcieńczyć kontrolę pozytywną z tego zestawu do 200 nanogramów na mililitr przy użyciu RPMI 1640 jako rozcieńczalnika i rozcieńczyć dla krzywej wzorcowej w 1,5-mililitrowych probówkach zgodnie z tabelą rozcieńczeń P24 ELISA. W celu zmierzenia stężenia wirusa w próbkach należy dodać rozcieńczenia próbki do wyznaczonych dołków płytki 96-dołkowej, zaczynając od rozcieńczenia 1:1000 i w razie potrzeby zmodyfikować objętość, aby mieściła się w zakresie krzywej wzorcowej.

Następnie rozcieńczyć próbki Tritonem X-100 do końcowego stężenia 0,5% i dodać 200 mikrolitrów każdej próbki i RPMI 1640 do wyznaczonych studzienek. Zamknij płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Umyj płytkę sześciokrotnie 300 mikrolitrami na studzienkę buforu do płukania 1X.

Usuń nadmiar płynu, odwracając talerz i stukając nim w ręcznik papierowy. Następnie dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wykrywającego z zestawu do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby substratu. Zamknij płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Umyj talerz, a następnie usuń nadmiar płynu, odwracając talerz i stukając nim w ręcznik papierowy. W celu zmierzenia przeciwciała detektora należy rozcieńczyć peroksydazę chrzanową streptawidyny w rozcieńczeniu 1:100 rozcieńczalnikiem SA-HRP. Dokładnie wymieszaj rozcieńczony SA-HRP i dodaj 100 mikrolitrów do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby.

Zamknąć i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie umyj płytkę buforem myjącym 1X i strzepnij nadmiar płynu. Wrzuć jedną tabletkę orto-fenylenodiaminy do 11 mililitrów rozcieńczalnika do substratu, aby uzyskać wystarczającą ilość roztworu substratu na jedną płytkę.

Energicznie wymieszaj roztwór OPD, aby całkowicie go rozpuścić i chronić przed światłem. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu OPD do wszystkich studzienek, w tym do ślepej próby. Za pomocą spektrofotometru natychmiast odczytaj absorbancję przy 450 nanometrach.

Powtórz 10 razy w odstępach jednosekundowych i wykonaj średni pomiar. Zawiesić i hodować limfocyty T Jurkata w kolbie T75 o gęstości miliona komórek w pięciu mililitrach zredukowanej pożywki surowicy z polibrenem. Następnie dodaj pożywkę kondycjonowaną HEK293T zawierającą milion cząstek wirusa zawierających dCas9.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Trzy dni po zakażeniu odwiruj komórki w czasie 233 g przez pięć minut i ponownie zawieś je w 10 mililitrach kompletnego DMEM uzupełnionego puromycyną. Hodować komórki w kolbach T75 i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Co trzeci dzień przez okres dziewięciu dni wirować komórki 233 razy g przez pięć minut i zastąpić pożywkę kompletnym DMEM uzupełnionym puromycyną. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Następnie, na 96-dołkowej płytce z tkanką poddaną kulturze tkankowej, dodaj 10 000 komórek w 100 mikrolitrach kompletnego DMEM uzupełnionego puromycyną w pierwszym dołku.

Wykonaj seryjne rozcieńczenia 1:1 zawartości następujących studzienek z kompletnym DMEM uzupełnionym puromycyną. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Rozwiń komórki klonalne na dwie 24-dołkowe płytki, a następnie połóż dwa miliony komórek na studzienkę sześciodołkowej płytki dla trzech klonów.

Pozostałe trzy dołki należy pokryć nietransdukowanymi komórkami Jurkat jako kontrolą. Na koniec umieść komórki w kolbie T75 i umieść je na noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Aby rozpocząć ilościowy PCR w celu pomiaru ekspresji genów, najpierw zsyntetyzuj komplementarne DNA, dodając jeden mikrogram RNA, cztery mikrolitry bufora syntezy cDNA i jeden mikrolitr odwrotnej transkryptazy do probówek o pojemności 250 mikrolitrów, a następnie dodaj wodę do końcowej objętości 20 mikrolitrów.

Następnie użyj termocyklera w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut i w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby dezaktywować odwrotną transkryptazę. Po syntezie rozcieńczyć cDNA 60 mikrolitrami wody. Przeprowadź reakcje łańcuchowe polimerazy dla probówek zawierających 0,5 mikrolitra każdego startera do przodu i do tyłu przy końcowym stężeniu 10 mikromolów, pięciu mikrolitrów zieleni SYBR i czterech mikrolitrów cDNA.

Na koniec wybierz komórki Jurkat-dCas9 w DMEM uzupełnionym higromycyną B przez 10 dni. Odwiruj komórki i zmieniaj pożywkę co trzy dni. Oczyść RNAzę i przejdź do RT-qPCR.

W tym badaniu sekwencje gRNA, które znajdowały się w odległości od 10 do 100 par zasad od miejsca rozpoczęcia transkrypcji, wykorzystano do skierowania kompleksu aktywującego Cas9 do miejsca transkrypcji IFNG-AS1, długiego niekodującego RNA związanego z nieswoistym zapaleniem jelit. Aby umożliwić wybór komórek podwójnie transdukowanych, zastosowano system dwuplazmidowy do transdukcji wzmacniaczy dCas9 lub gRNAzy do komórek. W tym przypadku białka MS2 zwiększają nadekspresję IFNG-AS1.

Ekspresja Cas9 została potwierdzona dla obu klonów. Startery przeciwko HPRT1 zastosowano w celu potwierdzenia obecności RNA w komórkach nietransdukowanych. Ekspresję mRNA potwierdzono poprzez pominięcie odwrotnej transkryptazy w reakcji cDNA.

Trzy warianty splicingu IFNG-AS1 można wykryć za pomocą zestawów starterów specyficznych dla transkryptu lub zestawu starterów dla wszystkich znanych transkryptów IFNG-AS1. Wszystkie krzywe fluorescencji były wykładnicze, a gen porządkowy HPRT1 osiągnął fazę wykładniczą w połowie cyklu między komórkami kontrolnymi a komórkami eksprymującymi gRNA IFNG-AS1. Startery przeciwko wszystkim znanym transkryptom IFNG-AS1 były najbardziej wykrywalne między eksperymentami, z pomiarami 20-krotnego wzrostu ekspresji IFNG-AS1.

Jednak trzeci transkrypt IFNG-AS1 wykazał od pięciu do 10-krotnie znaczący wzrost poziomów IFNG-AS1. Aby aktywnie uzyskać nadekspresję pożądanego genu, kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu ma zaprojektowanie przewodnika RNA w kroku 2.1. Dodatkowo, produkcja wysokiej jakości cząsteczek wirusa zapewni solidną ekspresję składników protokołu.

Gdy pożądany gen ulegnie nadekspresji, można przeprowadzić badania funkcjonalne w celu zbadania mechanizmów genu. W naszym przykładzie zdecydowaliśmy się przyjrzeć produkcji cytokin po nadekspresji naszego interesującego nas genu. Technika ta została po raz pierwszy opracowana przez Grupę Griesbach w 2013 roku i jest szeroko stosowana i rozwijana przez inne grupy.

Byliśmy podekscytowani możliwością zastosowania tej techniki do długich, niekodowanych RNA w celu zbadania ich specyficznych funkcji. Lentiwirusy z wadliwymi replikacjami powinny być przetwarzane w laboratorium, które zostało zatwierdzone do pracy z wirusami. Ponadto ludzkie linie komórkowe i bakterie E. coli są uważane za niebezpieczne biologicznie.

Wreszcie, rekombinowane plazmidy DNA powinny być obsługiwane przez przeszkolony personel.