Name: Nadekspresja długich niekodujących RNA przy użyciu CRISPR aktywującego geny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Poznaj metodę nadekspresji długich niekodujących RNA przy użyciu CRISPR aktywującego geny. Technika ta wykorzystuje endogenny mechanizm splicingowy do ekspresji naturalnych izoform w komórkach Jurkat.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.P. jest wspierany przez RO1 DK60729 i P30 DK 41301-26. D.P. jest wspierany przez Crohn's & Colitis Foundation (CCFA) nagrodę za rozwój kariery, CURE: Digestive Diseases Research Center (DDRC) DK41301, oraz UCLA Clinical and Translational Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. Rdzeń wirusologiczny UCLA został sfinansowany przez Center of AIDS Research (CFAR) grant 5P30 AI028697. Rdzeń Zintegrowanych Technologii Molekularnych UCLA był wspierany przez grant CURE/P30 DK041301. Prace te były również wspierane przez Instytut ds. AIDS na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles.

UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że ten protokół używa lentiwirusów z niedoborem replikacji. Postępowanie z wirusem należy przeprowadzać tylko po odpowiednim przeszkoleniu w zakresie bezpieczeństwa w laboratorium. Wybielać wszystkie przedmioty i powierzchnie, które mają kontakt z żywymi wirusami przez co najmniej 10 minut po użyciu. Przez cały czas używaj jednorazowego fartucha laboratoryjnego i ochrony twarzy/oczu, a także podwójnych rękawiczek. Wykonuj badania nad wirusami w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2+ z certyfikatem wirusowym. Poświęć kaptury do hodowli tkankowych i inkubatory do pracy z wirusami.
1. Projektowanie i generowanie wektorów
UWAGA: Najlepszym sposobem na zidentyfikowanie sekwencji gRNA jest użycie narzędzi do projektowania online (np. http://crispr-era.stanford.edu) (Rysunek uzupełniający 1: Projektowanie gRNA). Na potrzeby towarzyszącego eksperymentu reprezentatywnego firma zaprojektowała i stworzyła wektory gRNA wykorzystane w reprezentatywnym eksperymencie. Plazmid dCas9 został również zakupiony online.
<ol>
	<li>Sekwencja gRNA znajduje się przed sekwencją nukleotydową "NGG", gdzie "N" to dowolny nukleotyd, który również znajduje się w obrębie 100 par zasad od miejsca rozpoczęcia transkrypcji. Przeszukaj genetyczne bazy danych, takie jak BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) w poszukiwaniu sekwencji gRNA, aby upewnić się, że w genomie nie ma innych miejsc o podobnych sekwencjach (rysunek uzupełniający 2: BLAT). Zapewni to, że sekwencja gRNA jest unikalna dla genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI).</li>
	<li>Plazmidy gRNA i dCas9, które występują w postaci zalążków bakterii, należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Na płytce agarowej z bulionu Luria (LB) usunąć Escherichia coli z ampicyliną (tabela uzupełniająca 1) i hodować bakterie przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz kolonię i hoduj bakterie w 5 ml LB z ampicyliną (tabela uzupełniająca 1) przez noc, energicznie potrząsając płytką w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Następnego dnia dodać 2 ml bakterii do 200 ml LB z ampicyliną rosnąć w kolbie o pojemności 2 l, energicznie potrząsając kolbą przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Obracaj bakterie w temperaturze 3 724 x g przez 20 minut. Usuń pożywkę i umieść probówkę zawierającą bakterie na lodzie.</li>
	<li>Oczyść DNA bakterii za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Zestawy do oczyszczania plazmidu zawierają zastrzeżony bufor do resuspensji, bufor do lizy, bufor do płukania, bufor równowagowy i bufor elucyjny.
	<ol>
		<li>Dodać 10 ml buforu do reprodukcji z zestawu do bakterii i pipetować bakterie do roztworu. Następnie dodaj 10 ml buforu do lizy z zestawu do zawieszonych bakterii i wymieszaj je, odwracając probówkę. Odczekaj 5 minut, aby bakterie uległy lizie; Następnie dodaj 10 ml lodowatego buforu neutralizującego z zestawu do lizowanych bakterii i wymieszaj je, odwracając probówkę.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę DNA z zestawu z 10 ml buforu równowagowego przez 5 minut. Wlać próbki do filtra kolumny DNA i przepuścić roztwór przez filtr.</li>
		<li>Przemyć próbki 2x 30 ml buforu do przemywania płucz, a następnie wymyć DNA za pomocą 30 ml buforu elucyjnego w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Powoli nałóż 10,5 ml izopropanolu w temperaturze pokojowej na eluowane DNA, odwróć probówkę i natychmiast obracaj ją przy 16 200 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć supernatant i dodać 1 ml 70% etanolu do osadu DNA. Ponownie zawieś pellet, przesuwając rurkę. Wirować w temperaturze 16 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i użyć końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć większość etanolu. Suszyć granulki na powietrzu przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić je w 200 μl wody, a następnie przechowywać DNA w temperaturze -20 °C. Przewidywane stężenie wyniesie >1 μg/μL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generowanie wirusów i liczba cząsteczek
<ol>
	<li>Gdy będziesz gotowy do stworzenia lentiwirusa zawierającego dCAS9, pokryj 100-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych 5 ml 0,01% poli-L-lizyny (tabela uzupełniająca 1). Dokładnie usuń nadmiar płynu z płytek i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Płytka 5 x 106 komórek HEK 293T na szalkę w 10 ml kompletnej zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco (tabela uzupełniająca 1) i inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Następnego dnia wyjmij pożywkę z szalek HEK 293T i dodaj 10 ml kompletnego DMEM.</li>
	<li>Zmieszać 6,5 μg plazmidu pMDLg/pRRE zawierającego gag/pol (składniki wirusa), 3,5 μg plazmidu pMDG2.G zawierającego VSV-G (składnik wirusa), 2,5 μg plazmidu pRSV-Rev zawierającego Rev (składnik wirusa), 10 μg wektora gRNA zawierającego długie powtórzenia końcowe (LTR) lub wektora dCas9 zawierającego LTR i dodać wodę do całkowitej objętości 450 μL. Przefiltrować mieszaniny przez końcówkę filtra 0,2 μm przymocowaną do strzykawki.</li>
	<li>Dodać 50 μl 2,5 M CaCl2 (tabela uzupełniająca 1) do każdej próbki transfekcji DNA i delikatnie wymieszać. Przefiltruj mieszaninę wapnia i DNA przez końcówkę filtra 0,2 μm dołączoną do strzykawki. Odpipetować 500 μl 2x HBS (Tabela uzupełniająca 1) do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml. Dodaj kroplami 500 μl DNA/CaCl2 i delikatnie zwiruj. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
	<li>Powoli dodawać 1 ml zawiesiny DNA/CaCl2/HBS do każdej potrawy. Natychmiast zakręć naczyniami, aby równomiernie rozprowadzić zawartość. Każdą potrawę inkubować przez noc w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W dniu 3 powoli wyjmij i wyrzuć media z naczyń. Ostrożnie umyj komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Dodać 6 ml kompletnego DMEM uzupełnionego 20 mM HEPES i 10 mM maślanu sodu. Inkubować komórki przez 5–6 godzin w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj komórki 1x PBS i dodaj 5 ml kompletnego DMEM z 20 mM HEPES do komórek HEK 293T. Inkubować przez 12 godzin przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W 4 dniu zebrać supernatanty komórek HEK 293T i przefiltrować supernatant. Zamrozić 1 ml porcji w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Gdy wirus jest gotowy do użycia, rozmrozić na lodzie podwielokrotność cząsteczki wirusa zawierającej kondycjonowaną pożywkę (przechowywaną w sposób opisany w kroku 2.8). Doprowadź wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Użyj zestawu do testu immunoenzymatycznego p24 (ELISA), aby określić ilościowo liczbę cząstek wirusa na mililitr.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć koncentrat do płukania z zestawu, dodając 19 części destylowanej wody dejonizowanej. Rozcieńczyć kontrolę dodatnią z zestawu do 200 ng/ml, używając RMPI 1640 jako rozcieńczalnika i rozcieńczyć dla krzywej wzorcowej w probówkach o pojemności 1,5 ml zgodnie z tabelą rozcieńczeń p24 ELISA (tabela uzupełniająca 2).</li>
		<li>Dodać 20 μl 5% Triton X-100 do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby substratu. Dodać 200 μl RPMI 1640 do studzienek kontroli ujemnej. Dodaj 200 μl każdego wzorca (w dwóch egzemplarzach) do wyznaczonych studzienek.</li>
		<li>Za pomocą spektrofotometru zmierzyć stężenie wirusa w próbkach, używając krzywej wzorcowej. Rozpocząć rozcieńczanie próbki w stosunku 1:1 000 i w razie potrzeby zmodyfikować objętość, aby mieściła się w zakresie krzywej wzorcowej. Rozcieńczyć próbki preparatem Triton X-100 do końcowego stężenia 0,5% i dodać 200 μl każdej próbki w RPMI 1640 do wyznaczonych studzienek. Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przemyć płytkę 6x 300 μl 1x buforu do płukania na studzienkę. Usuń nadmiar płynu, odwracając talerz i stukając nim w ręcznik papierowy. Dodać 100 μl przeciwciała detektorowego z zestawu do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby substratu. Zamknąć płytkę i inkubować ją przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Umyć płytkę, a następnie usunąć nadmiar płynu, odwracając płytkę i stukając nią w ręcznik papierowy.</li>
		<li>W celu zmierzenia przeciwciała detektora należy przygotować peroksydazę streptawidynowo-chrzanową (SA-HRP) w ciągu 15 minut od użycia. Rozcieńczyć SA-HRP w stosunku 1:100 rozcieńczalnikiem SA-HRP. Dokładnie wymieszać rozcieńczony SA-HRP i dodać 100 μl do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby. Uszczelnić i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj płytkę 1x buforem myjącym i strzepnij nadmiar płynu, jak w kroku 2.10.4. W ciągu 15 minut od przygotowania należy użyć roztworu substratu orto-fenylenodiaminy (OPD), który dostarcza peroksydazie substratów niezbędnych do wytworzenia chemiluminescencji. Użyć jednej tabletki OPD na 11 ml rozcieńczalnika do substratu na każdą płytkę.</li>
		<li>Energicznie wymieszaj roztwór OPD, aby całkowicie go rozpuścić i chronić przed światłem. Dodać 100 μl roztworu substratu OPD do wszystkich studzienek, w tym do ślepej próby. Za pomocą spektrofotometru natychmiast odczytać absorbancję przy 450 nm, powtórzyć to 10x w odstępach 1 s i wykonać średni pomiar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Transformacja dCas9-VP 64 
<ol>
	<li>Hodowla limfocytów T Jurkat w kompletnym DMEM w kolbie T75 o gęstości 2 x 106 komórek w 15 ml pożywki. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 233 x g, a następnie ponownie zawiesić je w 10 ml zredukowanej pożywki surowicy. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Zawiesić i umieścić na płytce 1 x 106 komórek Jurkata w 5 ml zredukowanej pożywki surowicy z polibrenem (tabela uzupełniająca 1) w kolbie T75. Dodać pożywkę kondycjonowaną przez HEK 293T zawierającą 1 x 106 cząstek wirusa zawierających dCas9. Liczbę cząstek wirusa można obliczyć w przybliżeniu na podstawie testu ELISA p24, ponieważ 1 μg/ml p24 równa się 1 x 107 cząstek wirusa. Umieścić kolby w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Wybór i tworzenie klonów
<ol>
	<li>Trzy dni po zakażeniu odwirować komórki w temperaturze 233 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić je w 10 ml kompletnego DMEM z puromycyną (Tabela uzupełniająca 1). Umieścić komórki w kolbach T75 i hodować je w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Co trzeci dzień, przez okres 9 dni, wirować komórki przy 233 x g przez 5 minut i zastąpić pożywkę kompletnym DMEM z puromycyną.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Na 96-dołkowej płytce poddanej hodowli tkankowej umieścić 10 000 komórek w 100 μl kompletnego DMEM z puromycyną w pierwszym dołku i seryjnie rozcieńczyć 1:1 zawartość kolejnych dołków kompletnym DMEM z puromycyną. Wykonaj 24 rozcieńczenia i powtórz to 4 razy na płytkę, aby upewnić się, że w każdym dołku jest odpowiednia liczba komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Rozwiń komórki klonalne na dwie 24-dołkowe płytki, następnie na 6-dołkową płytkę, a na końcu na kolbę T75. Aby skupić się na trzech klonach, płytka 2 x 106 komórek na dołek 6-dołkowej płytki dla trzech klonów. Pozostałe trzy studzienki należy pokryć nietransdukowanymi komórkami Jurkat jako kontrolą. Umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na noc.</li>
	<li>Do ekstrakcji RNA należy użyć dostępnego w handlu zestawu do izolacji RNA. Wirować komórki w temperaturze 233 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć pożywkę. Użyj końcówki do pipety o pojemności 1 ml, aby ponownie zawiesić komórki w 350 μl buforu do lizy. Dodać 350 μl 70% etanolu do zlizowanych komórek, dokładnie wymieszać pipetą o pojemności 1 ml i przenieść próbkę do kolumny RNA.</li>
	<li>Wirować lizaty w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę, usunąć przepływ i dodać 700 μl niskorygorystycznego buforu płuczącego z zestawu do kolumny. Wirować lizaty w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę, usunąć przepływ i dodać 80 μl roztworu DNazy I z zestawu do kolumny; Pozostawić próbki do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować lizaty w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę, usunąć przepływ i dodać 700 μl buforu płuczącego o wysokiej rygorystyczności z zestawu do kolumny. Wirować lizaty w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę, usunąć przepływ i dodać 700 μl niskorygorystycznego buforu płuczącego do kolumny.</li>
	<li>Wyjąć kolumnę z probówki zbiorczej i przenieść ją do nowej probówki zbiorczej. Wiruj lizaty w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę, a następnie przenieś kolumnę RNA do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj 50 μl wody do kolumny i wiruj w temperaturze 10 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Użyj spektrofotometru, aby określić ilościowo stężenie RNA. Spodziewaj się, że stężenie będzie wynosić od 100 do 500 ng/μl, a absorbancja 260/280 między 1,9 a 2,1. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Do probówek o pojemności 250 μl dodać 1 μg RNA, 4 μl buforu do syntezy komplementarnego DNA (cDNA), 1 μl odwrotnej transkryptazy i wodę do końcowej objętości 20 μl. Nie należy uwzględniać kontroli odwrotnej transkryptazy. W termocyklerze syntetyzować cDNA w temperaturze 42 °C przez 30 minut i w temperaturze 95 °C przez 5 minut, aby dezaktywować odwrotną transkryptazę. Po syntezie rozcieńczyć cDNA w 60 μl wody.</li>
	<li>Przygotuj reakcje łańcuchowe polimerazy (PCR) zawierające 5 μl zieleni SYBR, 4 μl cDNA, 0,5 μl startera forward (10 μM) i 0,5 μl startera reverse (10 μM). Uruchom PCR w następujący sposób: krok 1 = 95 °C przez 3 minuty, krok 2 = 95 °C przez 10 s, krok 3 = 60 °C przez 10 s, a następnie powtórz kroki 2 i 3 przez 30x. 
	UWAGA: Sekwencja dla startera do przodu dCas9 to 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGAAGAAGA, a sekwencja dla startera wstecznego dCas9 to 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Starterem do przodu dla fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1) jest 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT, a starterem odwrotnym jest 5'-GCTTGCACCTTGACCATCT.</li>
</ol>
5. Transdukcja, selekcja, tworzenie klonów i badania przesiewowe gRNA
<ol>
	<li>Ponowna transdukcja zwalidowanych komórek Jurkat-dCas9 za pomocą wirusów zawierających gRNA, jak opisano w sekcji 3. Wybierz komórki w DMEM z higromycyną (Tabela uzupełniająca 1) przez 10 dni. Wiruj komórki i zmieniaj nośnik co 3 dni.</li>
	<li>Wykonaj seryjne rozcieńczanie komórek (jak opisano w kroku 4.2) i rozmnoż poszczególne kolonie (jak opisano w kroku 4.3). Oczyść RNA z kolonii dokładnie tak, jak opisano w kroku 4.5 i przeprowadź syntezę cDNA zgodnie z opisem w kroku 4.9. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym przeciwko rządowi Indonezji i HPRT1 lub odpowiedniemu genowi porządkowania, podobnie jak w przypadku PCR opisanego w kroku 4.10, z wyjątkiem tego przypadku, zobrazuj studzienki w każdym cyklu po kroku 3.</li>
	<li>Użyj metody progu cyklu porównawczego (Ct), aby określić zmianę krotności w klasie GOI<sup="xref">8. Krótko mówiąc, użyj następującego równania do obliczenia względnych poziomów transkryptu (RTL): 2- (średnia Ct GOI - średnia Ct genu porządkowego). Następnie oblicz średni RTL kontrolnych i podziel wszystkie wartości RTL przez średni kontrolny RTL, aby wygenerować zmianę krotności w porównaniu z próbkami kontrolnymi.</li>
</ol>

<ol><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016%3A+a+bibliometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li>
<li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs%3A+analysis+of+their+gene+structure%2C+evolution%2C+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li>
<li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs%3B+sequence%2C+structure%2C+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li>
<li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li>
<li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li>
<li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15%28INK4B%29+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li>
<li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on%2C+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li>
<li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół wykorzystania aktywacji CRISPR do nadekspresji lncRNA in vitro. Jest to szczególnie ważna technika podczas badania długich, niekodujących RNA, ponieważ produktem transkryptomicznym jest jednostka funkcjonalna. Po nadekspresji badacz może następnie wykorzystać te komórki do zwiększenia stosunku sygnału do szumu podczas badania partnerów wiążących, a nawet zmierzyć komórkowe konsekwencje zwiększonego poziomu lncRNA. Dodatkowo, ponieważ lncRNA często działają na geny cis, ta technik...

Podczas gdy większość badań biomedycznych skupia się na transkryptach kodujących białka, większość transkrybowanych genów składa się z niekodujących RNA (Ensembl release 93). Obecne badania zaczynają zgłębiać tę dziedzinę, a liczba publikacji na temat lncRNA w procesach chorobowych rosła wykładniczo w latach 2007-20171. Publikacje te pokazują, że wiele lncRNA jest związanych z chorobą. Jednak mechanizmy molekularne tych lncRNA są trudne do zbadania ze względu na ich zróżnicowane funkcje w porównaniu z mRNA. Problem ze zrozumieniem roli lncRNA w chorobie komplikuje fakt, że lncRNA są często wyrażane na niższych poziomach niż kodujące RNAs2. Dodatkowo, lncRNA są słabo zachowane, co ogranicza badania funkcjonalne w technikach opartych na ludzkiej linii komórkowej3. Jedną z metod badania mechanizmu działania tych nowych genów jest endogenna nadekspresja ich w hodowanych komórkach. Badania nad nadekspresją mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat funkcji określonych genów i umożliwić naukowcom analizę kluczowych szlaków molekularnych.
Nowa metoda aktywacji transkrypcji genów lncRNA opiera się na technologiach CRISPR opracowanych początkowo przez laboratorium Gersbach4. Protokół ten został zaadaptowany do stosowania w biologii lncRNA oraz do ekspresji tych genów w innych systemach modelowych. W technice nadekspresji CRISPR białko zwane białkiem związanym z CRISPR 9 (Cas9) może być kierowane w kierunku sekwencji DNA za pośrednictwem antysensownego gRNA, które jest rozpoznawane przez Cas9. Zwykle Cas9 indukuje rozszczepienie DNA; jednak mutacje w Cas9, wcześniej opracowane dla techniki nadekspresji, dezaktywują ten krok5. Gdy aktywator transkrypcji jest połączony z "martwym" Cas9 (dCas9) i transdukowany do linii komórkowych, można osiągnąć endogenną nadekspresję lncRNA4,6. Dodanie dodatkowych modyfikacji do gRNA, umożliwiających wiązanie się dodatkowych czynników transkrypcyjnych z gRNA, zwiększyło skuteczność systemu aktywacji genu dCas9 10-krotnie7. Co ważne, wykazano, że aktywacja transkrypcji wymaga bliskiej odległości (<200 pz) od genów miejsca rozpoczęcia transkrypcji, co umożliwia specyficzną regulację w górę w obszarach bogatych w geny7. W przeciwieństwie do technologii nokautu CRISPR, kasety dCas9 i gRNA muszą być zintegrowane z genomem, aby umożliwić komórkom zachowanie nadekspresji przez wiele pokoleń. Jedną z metod osiągnięcia tego celu jest użycie lentiwirusów do integracji kaset zawierających dCas9 i gRNA. Po integracji można określić ekspresję genu lncRNA.
W tym artykule zostanie zademonstrowany protokół nadekspresji lncRNA w modelu limfocytów T Jurkat. Pokazana jest procedura krok po kroku, którą można również dostosować do komórek przylegających.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Zestaw</td> do syntezy cDNA Aldrich <td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>(iScript)</td><td>Starter do</td><td></td> przodu BioRad 1708891 <td></td></tr><tr><td>dCas9</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>n/a</td><td>5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&nbsp;</td></tr><tr><td>Odwrócony starter dCas9</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>n/a</td><td>5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td></tr><tr><td>wektor dCas9</td><td>Addgene</td><td>50918</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10013CM</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Acros Organics</td><td>61509-0010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>plazmid gRNA</td><td>VectorBuilder</td><td>VB180119-1195qxv</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T ogniwa</td><td>ATCC&</td><td>nbsp; CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HPRT1 starter do przodu</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>n/a</td><td>GACCAGTCAACAGAGGGGACAT&nbsp;</td></tr><tr><td>Odwrócony starter HPRT1</td><td>Zintegrowane technologie DNA nie</td><td>dotyczy</td><td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Corning</td><td>MT3024CR</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-500</td><td></td></tr><tr><td>Komórki Jurkata</td><td>ATCC&</td><td>nbsp; TIB-152</td><td>klon E6-1</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Agar Corning</td><td>25005Cl</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Maxi-prep kit (zestaw do oczyszczania plazmidu)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>NIST2186II</tr><tr><td>Optimem I zmniejszył pożywkę w surowicy&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>p24 elisa</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CMR</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>pMDG2.G</td><td>Addgene &nbsp;</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#60488</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4832</td><td></td></tr><tr><td>Polibren</td><td>EMD Milipore</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-REV</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td></td></tr> Zestaw do oczyszczania <tr><td>RNA dichlorowodorku puromycyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>(Aurum RNA mini)</td><td>BioRad</td><td>7326820</td><td></td></tr><tr><td>Maślan Sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>SYBR zielony (iTaq universal)</td><td>BioRad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

nadekspresja długich niekodujących rna przy użyciu crispr aktywującego geny

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Biologia długiego niekodującego RNA (lncRNA) to nowa i ekscytująca dziedzina badań, której liczba publikacji rośnie wykładniczo od 2007 roku. Badania te potwierdziły, że lncRNA są zmienione w prawie wszystkich chorobach. Jednak badanie funkcjonalnych ról lncRNA w kontekście choroby pozostaje trudne ze względu na brak produktów białkowych, ekspresję specyficzną dla tkanki, niskie poziomy ekspresji, złożoność form splicingowych i brak ochrony między gatunkami. Biorąc pod uwagę ekspresję specyficzną dla gatunku, badania lncRNA są często ograniczone do kontekstów badawczych na ludziach podczas badania procesów chorobowych. Ponieważ lncRNA funkcjonują na poziomie molekularnym, jednym ze sposobów analizy biologii lncRNA jest usunięcie lncRNA lub nadekspresja lncRNA i zmierzenie efektów komórkowych. W artykule przedstawiono napisany i zobrazowany protokół nadekspresji lncRNA in vitro. Jako reprezentatywny eksperyment wykazano, że lncRNA związany z nieswoistym zapaleniem jelit, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), ulega nadekspresji w modelu limfocytów T Jurkat. Aby to osiągnąć, stosuje się technikę CRISPR (Activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats), aby umożliwić nadekspresję w endogennych loci genomu. Technika aktywacji CRISPR jest ukierunkowana na zestaw czynników transkrypcyjnych do miejsca rozpoczęcia transkrypcji genu, umożliwiając solidną nadekspresję wielu form splicingu lncRNA. Procedura ta zostanie podzielona na trzy etapy, a mianowicie: (i) projektowanie przewodnika RNA (gRNA) i konstrukcja wektora, (ii) generowanie i transdukcja wirusa oraz (iii) badanie przesiewowe kolonii pod kątem nadekspresji. W tym reprezentatywnym eksperymencie zaobserwowano ponad 20-krotne zwiększenie IFNG-AS1 w limfocytach T Jurkat.

Podwójny system wektorowy do nadekspresji lncRNA IFNG-AS1 
Przykładem eksperymentu opisanego w niniejszym manuskrypcie jest nadekspresja w modelu komórek T linii Jurkat wykazującym ekspresję lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 to lncRNA powiązane z nieswoistymi zapaleniami jelit, o którym wykazano, że reguluje interferon gamma10. Gen IFNG-AS1 zawiera trzy warianty splicingowe, które wszystkie wykorzystują ten sam miejsce startu tr...

Tradycyjne techniki nadekspresji oparte na cDNA mają ograniczone zastosowanie do nadekspresji długich, niekodujących RNA, ze względu na ich liczne formy splicingowe z potencjalną funkcjonalnością. W niniejszym przeglądzie opisano protokół wykorzystujący technologię CRISPR do nadekspresji wielu wariantów splicingu długiego, niekodującego RNA.

Nadekspresja długich niekodujących RNA przy użyciu CRISPR aktywującego geny

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Niekodujące RNA często mają wiele izoform. W badaniach nadekspresji in vitro często trudno jest zbadać wszystkie te wyrażone izoformy. Technika ta pozwala użytkownikom na uzyskanie ekspresji bezpośrednio z genomu i umożliwia komórkom ekspresję endogennych izoform dla określonego niekodującego RNA.Ta potężna technika pozwala użytkownikowi na precyzyjne kierowanie ekspresją dowolnego genu w genomie z wiernością i dokładnością. Projektując przewodniki RNA do określonych genów, można wykorzystać endogenną maszynerię splicingu genów do ekspresji naturalnych izoform w danej komórce. Procedurę zademonstruje Robert Rankin, post-doc z mojego laboratorium.Aby zaprojektować sekwencję przewodnika RNA, która znajduje się w obrębie 100 par zasad od miejsca rozpoczęcia transkrypcji, należy skorzystać z genetycznych baz danych, takich jak BLAT, aby upewnić się, że przewodnik RNA jest unikalny dla interesującego genu. Przechowuj przewodnik RNA i dezaktywowane plazmidy Cas9 w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na talerzu agarowym z bulionu Luria wyrzuć E.coli z ampicyliną i hoduj bakterie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia wybierz kolonię i hoduj bakterie w pięciu mililitrach LB z ampicyliną przez noc, energicznie potrząsając probówką w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj dwa mililitry bakterii do 200 mililitrów LB z ampicyliną w dwulitrowej kolbie, energicznie potrząsając kolbą przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Obracaj bakterie w tempie 3 724 razy g przez 20 minut i przystąp do oczyszczania DNA.Aby stworzyć lentiwirusa zawierającego dCas9, najpierw pokryj 100-mililitrowe naczynia do hodowli tkankowych pięcioma mililitrami 0,01% poli-L-lizyny i umieść pięć milionów HEK293T komórek na miskę w 10 mililitrach kompletnego zmodyfikowanego podłoża Eagles firmy Dulbecco, a następnie przygotuj próbki transfekcji DNA, mieszając 10 mikrogramów wektora przewodnika RNA zawierającego LTR lub dezaktywowanego wektora Cas9 zawierającego LTR z plazmidami zawierającymi składniki wirusów. Dodaj wodę do całkowitej objętości 450 mikrolitrów i przefiltruj mieszaninę przez końcówkę filtra 0,2 mikrona dołączoną do strzykawki. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 2,5-molowego dichlorku wapnia do każdej próbki transfekcyjnej DNA i delikatnie wymieszaj.Przefiltruj mieszaninę wapnia i DNA przez końcówkę filtra 0,2 mikrona dołączoną do strzykawki. Odpipetuj 500 mikrolitrów 2X HBS do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej. Dodaj kroplami 500 mikrolitrów mieszaniny wapnia-DNA i delikatnie wiruj.Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Dodaj jeden mililitr zawiesiny DNA-wapń HBS do każdej płytki do hodowli tkankowej zawierającej HEK293T i inkubuj je w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Trzeciego dnia powoli wyjmij i wyrzuć media z naczyń.Ostrożnie umyj komórki PBS raz. Dodaj sześć mililitrów kompletnego DMEM uzupełnionego 20-milimolowym HEPES i 10-milimolowym maślanem sodu. Następnie inkubuj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu godzin.Po inkubacji przemyj komórki raz PBS i dodaj do HEK293T komórek pięć mililitrów kompletnego DMEM z 20-milimolowym HEPES. Inkubuj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. W czwartym dniu należy zebrać supernatanty komórek HEK293T i przefiltrować supernatant zawierający wirusa.Aby rozpocząć liczenie cząstek wirusa, najpierw rozcieńczyć koncentrat płuczący z zestawu P24 ELISA, dodając 19 części destylowanej, dejonizowanej wody. Następnie rozcieńczyć kontrolę pozytywną z tego zestawu do 200 nanogramów na mililitr przy użyciu RPMI 1640 jako rozcieńczalnika i rozcieńczyć dla krzywej wzorcowej w 1,5-mililitrowych probówkach zgodnie z tabelą rozcieńczeń P24 ELISA. W celu zmierzenia stężenia wirusa w próbkach należy dodać rozcieńczenia próbki do wyznaczonych dołków płytki 96-dołkowej, zaczynając od rozcieńczenia 1:1000 i w razie potrzeby zmodyfikować objętość, aby mieściła się w zakresie krzywej wzorcowej.Następnie rozcieńczyć próbki Tritonem X-100 do końcowego stężenia 0,5% i dodać 200 mikrolitrów każdej próbki i RPMI 1640 do wyznaczonych studzienek. Zamknij płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Umyj płytkę sześciokrotnie 300 mikrolitrami na studzienkę buforu do płukania 1X.Usuń nadmiar płynu, odwracając talerz i stukając nim w ręcznik papierowy. Następnie dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wykrywającego z zestawu do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby substratu. Zamknij płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Umyj talerz, a następnie usuń nadmiar płynu, odwracając talerz i stukając nim w ręcznik papierowy. W celu zmierzenia przeciwciała detektora należy rozcieńczyć peroksydazę chrzanową streptawidyny w rozcieńczeniu 1:100 rozcieńczalnikiem SA-HRP. Dokładnie wymieszaj rozcieńczony SA-HRP i dodaj 100 mikrolitrów do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby.Zamknąć i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie umyj płytkę buforem myjącym 1X i strzepnij nadmiar płynu. Wrzuć jedną tabletkę orto-fenylenodiaminy do 11 mililitrów rozcieńczalnika do substratu, aby uzyskać wystarczającą ilość roztworu substratu na jedną płytkę.Energicznie wymieszaj roztwór OPD, aby całkowicie go rozpuścić i chronić przed światłem. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu OPD do wszystkich studzienek, w tym do ślepej próby. Za pomocą spektrofotometru natychmiast odczytaj absorbancję przy 450 nanometrach.Powtórz 10 razy w odstępach jednosekundowych i wykonaj średni pomiar. Zawiesić i hodować limfocyty T Jurkata w kolbie T75 o gęstości miliona komórek w pięciu mililitrach zredukowanej pożywki surowicy z polibrenem. Następnie dodaj pożywkę kondycjonowaną HEK293T zawierającą milion cząstek wirusa zawierających dCas9.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Trzy dni po zakażeniu odwiruj komórki w czasie 233 g przez pięć minut i ponownie zawieś je w 10 mililitrach kompletnego DMEM uzupełnionego puromycyną. Hodować komórki w kolbach T75 i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Co trzeci dzień przez okres dziewięciu dni wirować komórki 233 razy g przez pięć minut i zastąpić pożywkę kompletnym DMEM uzupełnionym puromycyną. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Następnie, na 96-dołkowej płytce z tkanką poddaną kulturze tkankowej, dodaj 10 000 komórek w 100 mikrolitrach kompletnego DMEM uzupełnionego puromycyną w pierwszym dołku.Wykonaj seryjne rozcieńczenia 1:1 zawartości następujących studzienek z kompletnym DMEM uzupełnionym puromycyną. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Rozwiń komórki klonalne na dwie 24-dołkowe płytki, a następnie połóż dwa miliony komórek na studzienkę sześciodołkowej płytki dla trzech klonów.Pozostałe trzy dołki należy pokryć nietransdukowanymi komórkami Jurkat jako kontrolą. Na koniec umieść komórki w kolbie T75 i umieść je na noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Aby rozpocząć ilościowy PCR w celu pomiaru ekspresji genów, najpierw zsyntetyzuj komplementarne DNA, dodając jeden mikrogram RNA, cztery mikrolitry bufora syntezy cDNA i jeden mikrolitr odwrotnej transkryptazy do probówek o pojemności 250 mikrolitrów, a następnie dodaj wodę do końcowej objętości 20 mikrolitrów.Następnie użyj termocyklera w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut i w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby dezaktywować odwrotną transkryptazę. Po syntezie rozcieńczyć cDNA 60 mikrolitrami wody. Przeprowadź reakcje łańcuchowe polimerazy dla probówek zawierających 0,5 mikrolitra każdego startera do przodu i do tyłu przy końcowym stężeniu 10 mikromolów, pięciu mikrolitrów zieleni SYBR i czterech mikrolitrów cDNA.Na koniec wybierz komórki Jurkat-dCas9 w DMEM uzupełnionym higromycyną B przez 10 dni. Odwiruj komórki i zmieniaj pożywkę co trzy dni. Oczyść RNAzę i przejdź do RT-qPCR.W tym badaniu sekwencje gRNA, które znajdowały się w odległości od 10 do 100 par zasad od miejsca rozpoczęcia transkrypcji, wykorzystano do skierowania kompleksu aktywującego Cas9 do miejsca transkrypcji IFNG-AS1, długiego niekodującego RNA związanego z nieswoistym zapaleniem jelit. Aby umożliwić wybór komórek podwójnie transdukowanych, zastosowano system dwuplazmidowy do transdukcji wzmacniaczy dCas9 lub gRNAzy do komórek. W tym przypadku białka MS2 zwiększają nadekspresję IFNG-AS1.Ekspresja Cas9 została potwierdzona dla obu klonów. Startery przeciwko HPRT1 zastosowano w celu potwierdzenia obecności RNA w komórkach nietransdukowanych. Ekspresję mRNA potwierdzono poprzez pominięcie odwrotnej transkryptazy w reakcji cDNA.Trzy warianty splicingu IFNG-AS1 można wykryć za pomocą zestawów starterów specyficznych dla transkryptu lub zestawu starterów dla wszystkich znanych transkryptów IFNG-AS1. Wszystkie krzywe fluorescencji były wykładnicze, a gen porządkowy HPRT1 osiągnął fazę wykładniczą w połowie cyklu między komórkami kontrolnymi a komórkami eksprymującymi gRNA IFNG-AS1. Startery przeciwko wszystkim znanym transkryptom IFNG-AS1 były najbardziej wykrywalne między eksperymentami, z pomiarami 20-krotnego wzrostu ekspresji IFNG-AS1.Jednak trzeci transkrypt IFNG-AS1 wykazał od pięciu do 10-krotnie znaczący wzrost poziomów IFNG-AS1. Aby aktywnie uzyskać nadekspresję pożądanego genu, kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu ma zaprojektowanie przewodnika RNA w kroku 2.1. Dodatkowo, produkcja wysokiej jakości cząsteczek wirusa zapewni solidną ekspresję składników protokołu.Gdy pożądany gen ulegnie nadekspresji, można przeprowadzić badania funkcjonalne w celu zbadania mechanizmów genu. W naszym przykładzie zdecydowaliśmy się przyjrzeć produkcji cytokin po nadekspresji naszego interesującego nas genu. Technika ta została po raz pierwszy opracowana przez Grupę Griesbach w 2013 roku i jest szeroko stosowana i rozwijana przez inne grupy.Byliśmy podekscytowani możliwością zastosowania tej techniki do długich, niekodowanych RNA w celu zbadania ich specyficznych funkcji. Lentiwirusy z wadliwymi replikacjami powinny być przetwarzane w laboratorium, które zostało zatwierdzone do pracy z wirusami. Ponadto ludzkie linie komórkowe i bakterie E. coli są uważane za niebezpieczne biologicznie.Wreszcie, rekombinowane plazmidy DNA powinny być obsługiwane przez przeszkolony personel.

overexpressing-long-noncoding-rnas-using-gene-activating-crispr

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Pętla chromatyny odgrywa znaczącą rolę w regulacji genów; jednak nie ma postępu technologicznego, który pozwalałby na selektywną i odwracalną modyfikację pętli chromatyny. W tym miejscu opisujemy potężny system reorganizacji pętli chromatyny za pomocą CRISPR-dCas9 (CLOuD9), który wykazano, że selektywnie i odwracalnie moduluje ekspresję genów w docelowych loci.

Reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem CRISPR

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Bezpośrednie dostarczanie wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/przewodnikowego RNA to szybki i skuteczny sposób na edycję genomu w komórkach krwiotwórczych. Tutaj wykorzystujemy to podejście do usunięcia tłumika intronowego RUNX1 i zbadania odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach białaczkowych OCI-AML3.

Badanie transkrypcyjnej roli tłumika intronowego RUNX1 przez rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 w komórkach ostrej białaczki szpikowej

Tutaj opisujemy narzędzie do edycji genomu oparte na czasowej i warunkowej stabilizacji zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego, krótkiego białka 9 (Cas9) związanego z powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) pod małą cząsteczką Shield-1. Metoda może być stosowana w przypadku hodowanych komórek i modeli zwierzęcych.

Nowy zestaw narzędzi do oceny funkcji genów za pomocą warunkowej stabilizacji Cas9

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Systemy CRISPR-Cas i białka anty-CRISPR zostały zintegrowane ze schematem bramek Boole'a u Saccharomyces cerevisiae. Nowe małe obwody logiczne wykazały się dobrą wydajnością i pogłębiły wiedzę zarówno na temat czynników transkrypcyjnych opartych na dCas9/dCas12a, jak i właściwości białek anty-CRISPR.

Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

To badanie przedstawia podwójny system CRISPRi ukierunkowany na długie, niekodujące RNA w komórkach czerniaka. Umożliwia kombinatoryczne knockdown genów i syntetyczne badania przesiewowe ze skutkiem śmiertelnym, identyfikując interakcje lncRNA specyficzne dla raka dla potencjalnych strategii terapeutycznych.

Strategia podwójnej interferencji CRISPR do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi RNA w komórkach nowotworowych

Skrupulatne i ustrukturyzowane podejście jest stosowane do selekcji odpornych i wrażliwych genów promieniowania poprzez zastosowanie metody przesiewowej CRISPR/Cas9 obejmującej cały genom. Protokół ten ma również potencjał, aby służyć jako wszechstronne ramy dla innych przedsięwzięć badawczych badających mechanizmy oporności na klinicznie podawane leki chemiczne.

Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie

Poznaj metodę nadekspresji długich niekodujących RNA przy użyciu CRISPR aktywującego geny. Technika ta wykorzystuje endogenny mechanizm splicingowy do ekspresji naturalnych izoform w komórkach Jurkat.

Nadekspresja długich niekodujących RNA przy użyciu CRISPR aktywującego geny

Przeglądaj więcej filmów