Name: Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę pomiaru zużycia tlenu w żywych nicieniach Caenorhabditis elegans bez izolacji mitochondriów. Protokół umożliwia analizę funkcji mitochondrialnej i zdrowia komórkowego w modelu genetycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Kevinowi Bittmanowi za jego wskazówki w ustanowieniu Seahorse XFp w laboratorium. Prace te zostały GM088213 wsparte przez National Institutes of Health.

UWAGA: Rysunek 2 przedstawia schematyczny przegląd pełnego protokołu.
1. Wzrost i synchronizacja populacji nicieni9,10
<ol>
	<li>Przenieś larwy L4 o pożądanym tle genetycznym (np. N2 [typ dziki] i zwierzęta sel-12) na płytki pożywki hodowlanej nicieni (NGM) (patrz Tabela 1 dla przepisu) świeżo wysiane trawnikiem Escherichia coli (OP50)11. Użyć co najmniej dwóch płytek 100 mm lub trzech płytek 60 mm dla każdego odkształcenia. Inkubować robaki w odpowiedniej temperaturze wzrostu (między 15–25 °C) przez 3–4 dni lub do momentu, gdy płytki zostaną zagęszczone dużą liczbą jaj i grawitacyjnych robaków.</li>
	<li>Zmyć jaja i robaki z płytek za pomocą około 6 ml buforu M9 (przepis znajduje się w tabeli 1) na 100 mm płytkę nicieni i przenieść je za pomocą szklanych pipet Pasteura do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml dla każdego szczepu. Obracaj te probówki przez 3 minuty przy 6,180 x g i odessaj bufor M9, zatrzymując tylko osady zwierząt i jaj.</li>
	<li>Dodać 3-4 ml roztworu wybielacza (przepis znajduje się w Tabeli 1) do każdej probówki i z przerwami wirować przez 6 minut. Dodać bufor M9, aby napełnić każdą probówkę i wirować przy 6,180 x g przez 1 minutę i odsysać supernatant. Powtórzyć to płukanie M9 trzy razy i przenieść granulki jaj do świeżej probówki o pojemności 15 ml zawierającej około 9 ml buforu M9.</li>
	<li>Zsynchronizuj świeżo wyklute robaki, nutując w temperaturze 20 °C przez 16–48 godzin. Obracaj te rurki w temperaturze 6 180 x g przez 1,5 minuty i połóż zsynchronizowane zwierzęta L1 na indywidualnych płytkach NGM, świeżo obsianych trawnikiem OP50 (około 6 000–10 000 zwierząt na płytkę 100 mm) i utrzymuj w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Zwierzęta te osiągną stadium larwalne L4 po ~42 godzinach. W tym czasie przenieś larwy L4 za pomocą platynowego kilofa na płytki NGM z nasionami OP50 zawierające 0,5 mg/ml 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUdR), aby zapobiec wytwarzaniu przez nie potomstwa. 
	UWAGA: Upewnij się, że w ramach eksperymentu wszystkie szczepy są synchronizowane przez podobny czas. Zabieg FUdR sterylizuje zwierzęta i zapobiega składaniu jaj i produkcji potomstwa, co może mieć wpływ na OCR. Te wysterylizowane zwierzęta zostaną przeanalizowane następnego dnia (dzień 1 dorosłe zwierzęta po ~66 godzinach) do testu. Doniesiono, że FUdR wpływa na fizjologię i długość życia niektórych zmutowanych robaków. Dlatego należy to wziąć pod uwagę, gdy lek jest używany do sterylizacji12,13,14. Robaki można również sterylizować za pomocą mutacji feminizujących, takich jak fem-1 (hc17) lub fem-3 (e2006). Jednak mutacje te mogą wpływać na funkcję mitochondriów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie związków do wstrzykiwania i hydratacja sond
UWAGA: Podczas testu mierzone są zarówno podstawowe, jak i maksymalne tempo oddychania nicieni. Maksymalne oddychanie jest wyzwalane u zwierząt po dodaniu cyjanku karbonylu-4 (trifluormetoksy)fenylohydrazonu (FCCP), jonoforu rozprzęgającego, który zaburza potencjał błony mitochondrialnej, a tym samym syntezę ATP poprzez transport protonów przez błonę mitochondrialną, umożliwiając jednocześnie pompowanie protonów, transport elektronów i zużycie tlenu4,15 odłączony od syntezy ATP (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ostatnim etapem testu jest dodanie azydku sodu (NaN3), leku, który hamuje kompleksy IV i V w ETC, co pozwala określić oddychanie niemitochondrialne16 (Rysunek 1). Poniższe kroki można wykonać dzień przed właściwym testem.
<ol>
	<li>Przygotować 1 ml roztworów podstawowych FCCP (10 mM w dimetylosulfotlenku [DMSO]: 1000x końcowe stężenie testowe) i NaN3 (400 mM w dH2O: 10x końcowe stężenie testowe) i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Przeprowadź krzywą stężenia, aby zoptymalizować stężenie FCCP wymagane do uzyskania maksymalnej odpowiedzi OCR dla każdego instrumentu i ustawienia laboratoryjnego.</li>
	<li>Uwodnić wkład czujnika, dodając 200 μl dH2O do każdej studzienki (i otaczającego zbiornika) w płytce, upewniając się, że sondy czujnika są zanurzone w dH2O i przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Sondy nabojowe można pozostawić zanurzone do 72 godzin, ale w przypadku długotrwałego uwodnienia płytki należy owinąć folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C. Jeśli nawodnienie przez noc nie jest możliwe, wkład z czujnikiem należy nawodnić przez co najmniej 4 godziny przed badaniem.</li>
	<li>Wyłącz element grzejny w interfejsie respirometru i przechowuj instrument w inkubatorze o temperaturze 15 °C na noc, aby obniżyć temperaturę rdzenia w instrumencie, aby zapobiec przegrzaniu zwierząt podczas testu. 
	UWAGA: Respirometr jest wyposażony w element grzejny, ale nie może być chłodzony. W inkubatorze o temperaturze 15 °C respirometr będzie miał stabilną temperaturę w zakresie 18–22 °C, która jest zdrową temperaturą dla utrzymania C. elegans.</li>
</ol>
3. Ładowanie narkotyków i równoważenie nabojów
<ol>
	<li>Odpipetować i wyrzucić dH2O używane do uwodnienia sond czujników i zastąpić je 200 μl roztworu kalibru (pH 7,4) w każdym dołku. Rozcieńczyć roztwór podstawowy FCCP do 100 μM FCCP w dH2O i dodać 20 μl rozcieńczonego roztworu do portu wtryskowego A we wkładzie czujnika. Dodać 22 μl 400 mM azydku sodu do portu B wkładu czujnika.</li>
	<li>Włącz respirometr i na ekranie głównym wybierz Start; pojawi się strona szablonów. Na stronie szablonów wybierz opcję Pusty lub wcześniej zaprojektowany szablon; pojawi się strona Grupy. Na stronie Grupy wybierz studzienki A i H jako studzienki tła i przypisz pozostałe 6 dołków do odpowiednich grup zgodnie z planem eksperymentalnym.</li>
	<li>Naciśnij strzałkę w prawym dolnym rogu, aby przejść do strony Protokół. Na stronie Protocol (Protokół) upewnij się, że wybrano przyciski Equilibrate, Basal (Podstawowy) i Injections 1 (Wstrzyknięcia) 1 i 2. Na tej stronie dostosuj liczbę odczytów podstawowego OCR, a także maksymalnego OCR (po wstrzyknięciu 1 z FCCP) i niemitochondrialnego OCR (po wstrzyknięciu 2 z azydkiem sodu). 
	UWAGA: Każdy pomiar jest poprzedzony etapem mieszania i oczekiwania, a ramy czasowe dla tych parametrów przedstawiono w Tabeli 2.</li>
	<li>Wybierz strzałkę w prawym dolnym rogu, a pojawi się monit o załadowanie płytki wkładu czujnika. Upewnij się, że płytka wkładu czujnika jest załadowana we właściwej orientacji, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie przypomnienia. Respirymetr będzie teraz równoważył nabój. 
	UWAGA: Ta równowaga zapewnia wystarczająco dużo czasu na umieszczenie zwierząt do badania w odpowiednich dołkach płytki komórkowej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie płytki ślimakowej i przebiegu testu
<ol>
	<li>Dodać 200 μl buforu M9 do każdego z 8 dołków płytki komórkowej oraz do zbiorników otaczających studzienki.</li>
	<li>Zbierz ~100 robaków z każdego szczepu na nieobsiane płytki NGM i odstaw na 2-3 minuty. Zwilż koniec platynowego kilofa buforem M9 i wybierz 20 zwierząt zsynchronizowanych pod względem wieku do studzienek B-G, pozostawiając puste studzienki A i H w tle. 
	UWAGA: Po załadowaniu każdej studni odczekaj około 2 minut, aby zwierzęta mogły osiedlić się na dnie studni. Zaleca się również przeprowadzenie krzywej liczby ślimaków w celu optymalizacji liczby ślimaków na studzienkę dla każdego instrumentu i ustawień laboratoryjnych.</li>
	<li>Do tej pory respirometr powinien być skalibrowany i klikając OK na ekranie, płytka zawierająca bufor kalibracyjny zostaje wysunięta i można ją wyjąć z respirometru, podczas gdy wkład czujnika pozostaje wewnątrz przyrządu. Zastąp tabliczkę kalibru tabliczką zawierającą zwierzęta. Załaduj tabliczkę i zamknij drzwi, naciskając Kontynuuj i pozwól testowi działać.</li>
</ol>
5. Analiza danych po eksperymencie
<ol>
	<li>Po zakończeniu testu postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie i wyjmij płytkę ogniwa oraz wkład czujnika, a następnie włóż dysk flash do portu USB, aby zapisać dane przebiegu w formacie .war. Wyjmij wkład czujnika i pozwól zwierzętom osiąść na dnie studzienek przez około 2 minuty. Umieść płytki komórkowe pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym i policz liczbę zwierząt w studzience.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie analityczne na komputerze i otwórz kartę normalizacja, aby znormalizować OCR do liczby zwierząt. Zastosuj odpowiednie etykiety dla różnych grup na karcie modyfikacji i wyeksportuj plik jako plik Prism do dalszej analizy. 
	UWAGA: Średnia z pierwszych pięciu pomiarów przed dodaniem FCCP to podstawowy OCR, podczas gdy średnia z pięciu pomiarów po dodaniu FCCP to maksymalny OCR, a średnia z ostatnich pięciu pomiarów (należy wykonać co najmniej dwa pomiary) po dodaniu azydku sodu to częstość oddychania niemitochondrialnego. Test należy powtórzyć trzy razy, aby zapewnić odtwarzalność.</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger Principles of Biochemistry</a>. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).</li>
<li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li>
<li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca%282%2B%29+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940(2015).</li>
<li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li>
<li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li>
<li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li>
<li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li>
<li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li>
<li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12%2C+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer%27s+disease+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li>
<li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+Ca2%2B+in+the+regulation+of+cellular+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oddychanie mitochondrialne jest wnikliwym wskaźnikiem funkcji mitochondriów; Dlatego możliwość pomiaru wskaźników zużycia tlenu w systemie biologicznym, zarówno in vitro, jak i in vivo, jest bardzo cenna. Respirometry wykrywają poziom tlenu za pomocą luminoforów na bazie porfiryny, które są gaszone przez tlen lub za pomocą amperometrycznych czujników tlenu, które polegają na wytwarzaniu prądu elektrycznego proporcjonalnego do ciśnienia tlenu. Elektroda Clarka należy do tej drugiej kategorii i była szeroko stosowana w lit...

Adenozynotrójfosforan (ATP), główne źródło energii komórkowej, jest wytwarzany w mitochondriach przez enzymy w łańcuchu transportu elektronów (ETC) znajdującym się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Pirogronian, kluczowy metabolit wykorzystywany do produkcji mitochondrialnego ATP, jest importowany do macierzy mitochondrialnej, gdzie ulega dekarboksylacji w celu wytworzenia acetylokoenzymu A (CoA). Następnie acetylo-CoA wchodzi w cykl kwasu cytrynowego, w wyniku czego powstaje dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH), kluczowa cząsteczka nośnika elektronów. Gdy elektrony z NADH są przekazywane do tlenu przez ETC, protony gromadzą się w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, co powoduje generowanie gradientu elektrochemicznego w poprzek błony. Protony te będą następnie przepływać z przestrzeni międzybłonowej przez ten gradient elektrochemiczny z powrotem do macierzy mitochondrialnej przez pory protonowe syntazy ATP, napędzając jej rotację i syntezę ATP1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Funkcja mitochondriów nie ogranicza się do produkcji energii, ale jest również kluczowa dla homeostazy wapnia, wychwytywania reaktywnych form tlenu (ROS) i apoptozy, krytycznie pozycjonując ich funkcję w zdrowiu organizmu2. Funkcję mitochondriów można ocenić za pomocą różnych testów, w tym między innymi analiz mierzących potencjał błony mitochondrialnej, poziomy ATP i ROS oraz stężenia wapnia w mitochondriach. Jednak testy te zapewniają pojedynczy obraz funkcji mitochondriów i dlatego mogą nie zapewniać kompleksowego obrazu zdrowia mitochondriów. Ponieważ zużycie tlenu podczas wytwarzania ATP zależy od niezliczonych sekwencyjnych reakcji, służy on jako doskonały wskaźnik funkcji mitochondriów. Co ciekawe, zaobserwowano różnice w tempie zużycia tlenu w wyniku dysfunkcji mitochondriów3,4,5.
Wskaźniki zużycia tlenu (OCR) żywych próbek mogą być mierzone za pomocą technik, które można ogólnie podzielić na dwie grupy: amperometryczne czujniki tlenu i luminofory na bazie porfiryny, które mogą być gaszone przez tlen6. Amperometryczne czujniki tlenu są szeroko stosowane do pomiaru OCR w hodowanych komórkach, tkankach oraz w systemach modelowych, takich jak C. elegans. Jednak luminofory zawierające respirometry na bazie porfiryny mają następujące zalety: (1) pozwalają na porównanie obok siebie dwóch próbek w trzech egzemplarzach, (2) wymagają mniejszej wielkości próbki (np. 20 robaków na studzienkę w porównaniu z ~2000−5000 robaków w komorze)<klasa sup = "xref">7, oraz (3) respirometr można zaprogramować tak, aby wykonywał cztery różne wstrzyknięcia związków w żądanych momentach podczas całego przebiegu doświadczalnego, eliminując potrzebę ręcznej aplikacji.
W tym protokole opisane są kroki związane z użyciem respirometru z czujnikiem tlenu na bazie porfiryny do pomiaru OCR u żywych, nienaruszonych C. elegans. Chociaż istnieje pisemny protokół do korzystania z respirometru o dużej przepustowości o dużej przepustowości8, protokół ten został dostosowany do użytku z bardziej przyjaznym dla budżetu, dostępnym i mniejszym instrumentem. Protokół ten jest szczególnie przydatny do oceny różnicy w OCR między dwoma szczepami, w przypadku których wysokoprzepustowe badania przesiewowe nie są wymagane, a ich stosowanie byłoby nadmierne.

<table><tbody><tr><td>Szalki Petriego 100 mm, 60 mm</td><td>Kord-Valmark Labware Products</td><td>2900, 2901</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 1,5 ml</td><td>Globe Scientific</td><td>6285</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 & razy; 22 mm Szkiełko nakrywkowe</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-10</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Bacto pepton</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto trypton</td><td>BD, Bacto</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Bacto</td><td>BD, Bacto</td><td>212705</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu (FCCP)</td><td>Abcam</td><td>ab120081</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>C314-500</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana (dH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek dimetylu (DMSO)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C987Y85</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>Krackeler Scientific</td><td>6-72050-900</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4&middot; 7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Analizator Seahorse XFp</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optymalna funkcja mitochondriów jest kluczowa dla zdrowej aktywności komórkowej, szczególnie w komórkach o wysokim zapotrzebowaniu na energię, takich jak te w układzie nerwowym i mięśniach. W związku z tym dysfunkcja mitochondriów jest związana z niezliczonymi chorobami neurodegeneracyjnymi i ogólnie starzeniem się. Caenorhabditis elegans są potężnym systemem modelowym do wyjaśniania wielu zawiłości funkcji mitochondriów. Oddychanie mitochondrialne jest silnym wskaźnikiem funkcji mitochondriów, a niedawno opracowane respirometry oferują najnowocześniejszą platformę do pomiaru oddychania w komórkach. W tym protokole udostępniamy technikę analizy żywych, nienaruszonych C. elegans. Protokół ten obejmuje okres ~ 7 dni i obejmuje etapy (1) hodowli i synchronizacji C. elegans, (2) przygotowania związków do wstrzyknięcia i uwodnienia sond, (3) ładowania leku i równoważenia wkładu, (4) przygotowania płytki testowej robaków i przebiegu testu oraz (5) analizy danych po eksperymencie.

Zastosowanie opisanego w niniejszym dokumencie protokołu pozwoliło na oznaczenie OCR zwierząt typu dzikiego oraz trzech różnych szczepów mutantów sel-12. Gen sel-12 koduje ortolog preseniliny u C. elegans17. Mutacje w ludzkiej presenilinie są najczęstszym zaburzeniem genetycznym związanym z rozwojem rodzinnej postaci choroby Alzheimera18. Nasze badania wykazały podwyższone poziomy wapnia mitochondrialnego u zwierzą...

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Funkcja mitochondriów ma kluczowe znaczenie dla homeostazy komórkowej, a tempo zużycia tlenu jest decydującym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące analizy wskaźnika zużycia tlenu u C.elegans. Protokół ten wykorzystuje żywe, mobilne C.elegans, zapewniając legalny pomiar funkcji mitochondriów.Zwiększenie potrzeby izolacji mitochondriów, krok, który może potencjalnie wpłynąć na ich integralność. Na początek przenieś larwy L4 o pożądanym tle genetycznym na świeżo zasiany trawnik Escherichia coli na pożywce wzrostowej nicieni lub płytkach NGM. Użyć co najmniej dwóch płytek 100 mm lub trzech płytek 60 mm dla każdego odkształcenia.Wysiaduj robaki w odpowiedniej temperaturze wzrostu przez trzy do czterech dni lub do momentu, gdy płytki zostaną zagęszczone dużą liczbą jaj i robaków grawitacyjnych. Zmyj jaja i robaki z płytek za pomocą około 6 mililitrów buforu M9 na 100 milimetrową płytkę nicieni. Za pomocą szklanych pipet pastwiskowych przenieś jaja i robaki do indywidualnych 15-mililitrowych probówek wirówkowych dla każdego szczepu.Wiruj te probówki przez trzy minuty w temperaturze 6, 180 g. Po odwirowaniu odessać bufor M9, pozostawiając tylko zwierzę i osad jajowy. Dodaj trzy do czterech mililitrów roztworu wybielacza do każdej probówki i z przerwami wiruj przez sześć minut.Następnie dodaj bufor M9, aby napełnić każdą probówkę i wirować z prędkością 6,180 g przez jedną minutę. Odessać supernatant i powtórzyć to płukanie za pomocą M9 trzy razy. Po umyciu przenieś granulki jaj do świeżej 15-mililitrowej probówki zawierającej około dziewięciu mililitrów buforu M9.Zsynchronizuj świeżo wyklute robaki, nutując w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 16 do 48 godzin. Po odkręceniu tych rurek na 6, 180 g przez 1,5 minuty, połóż zsynchronizowane zwierzęta L-1 na świeżo obsianym trawniku OP50 na indywidualnych płytkach NGM. Utrzymuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż zwierzęta osiągną stadium larwalne L-4 po około 42 godzinach.W tym momencie użyj platynowego kilofa, aby przenieść larwy L4 na płytki NGM z nasionami OP50 zawierające 0,5 miligrama na mililitr FUdR, aby zapobiec wytwarzaniu potomstwa. Uwodnić wkład czujnika, dodając 200 mikrolitrów wody destylowanej do każdej studzienki na płytce, upewniając się, że sondy czujnika są zanurzone. Przechowuj talerze przez noc w temperaturze pokojowej.Wyłącz element grzejny w interfejsie respirometru. Przechowywanie maszyny w inkubatorze o temperaturze 15 stopni Celsjusza obniża temperaturę rdzenia wewnątrz maszyny i zapobiega przegrzaniu zwierząt podczas testu. Po całonocnej inkubacji odpipetować i wyrzucić wodę destylowaną używaną do uwodnienia sond czujnika i zastąpić ją 200 mikrolitrami roztworu kalibru w każdym dołku.Rozcieńczyć roztwór podstawowy FCCP do 100 mikromolowych FCCP w wodzie destylowanej. Następnie dodać 20 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu do portu A iniekcyjnego we wkładzie czujnika. Dodać 22 mikrolitry 400-milimolowych azydków sodu do portu B iniekcyjnego wkładu czujnika.Teraz włącz respirometr. Na ekranie głównym wybierz start, a pojawią się strony szablonów. Na stronie szablonów wybierz pusty" lub wcześniej zaprojektowany szablon.Pojawi się strona grup. Na stronie grup wybierz studzienki A i H jako studzienki tła, a pozostałe sześć studzienek przypisz do odpowiednich grup zgodnie z planem eksperymentalnym. Wejdź na stronę protokołu, klikając strzałkę w prawym dolnym rogu i upewnij się, że wybrano przycisk równowagi, podstawowy i wstrzyknięcia jeden i dwa.Dostosuj liczbę odczytów podstawowego OCR, a także maksymalnego OCR i OCR niemitochondrialnego. Wybierz strzałkę w prawym dolnym rogu. Pojawi się monit o załadowanie płytki wkładu czujnika.Upewnij się, że płytka wkładu czujnika jest załadowana we właściwej orientacji, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie przypomnienia. Respirametr zrównoważy teraz wkład. Dodaj 200 mikrolitrów buforu M9 do każdej z ośmiu studzienek i otaczających zbiorników płytki komórkowej.Zbierz około 100 robaków z każdego szczepu na niewysiewane płytki NGM i odstaw na dwie do trzech minut. Następnie zwilż koniec platynowego kilofa buforem M9 i wybierz 20 zsynchronizowanych zwierząt w wieku do studzienek od B do G, pozostawiając puste studzienki tła A i H. Teraz kliknij OK w oprogramowaniu respirometru, aby wysunąć płytkę zawierającą bufor kalibracyjny.Zdejmij płytkę z respirometru, pozostawiając wkładkę czujnika wewnątrz instrumentu. Zastąp tabliczkę kalibru tabliczką zawierającą zwierzęta. Załaduj płytki i zamknij drzwi, naciskając przycisk Kontynuuj i pozwól testowi działać.Po zakończeniu testu postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby wyjąć płytkę ogniwa i wkład czujnika. Włóż dysk flash do portu USB, aby zapisać format run data war. Wyjmij wkład czujnika i pozwól zwierzętom osiąść na dnie studzienek przez około dwie minuty.Umieść płytki komórkowe pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym i policz liczbę zwierząt w studzience. Otwórz oprogramowanie analityczne, a następnie zakładkę normalizacja, aby znormalizować wskaźniki zużycia tlenu do liczby zwierząt. Zastosuj odpowiednie poziomy dla różnych grup w zakładce modyfikuj i wyeksportuj plik jako plik pryzmatyczny do dalszej analizy.Średnia z pierwszych pięciu pomiarów to podstawowy OCR. Średnia z pięciu pomiarów po dodaniu FCCP to maksymalny OCR. Wreszcie, średnia z ostatnich pięciu pomiarów po dodaniu azydku sodu to częstość oddychania niemitochondrialnego.Ponieważ rozregulowanie wapnia może powodować zmianę funkcji mitochondriów, zmierzono OCR zarówno u mutantów sel-12, jak i u zwierząt typu dzikiego, aby zbadać wpływ mutacji sel-12 na funkcję mitochondriów i zdrowie. Zwierzęta typu dzikiego konsekwentnie wykazywały podstawowe wskaźniki OCR poniżej pięciu pikomoli na minutę na robaka. Podczas gdy wszystkie trzy szczepy mutantów sel-12 wykazywały znacznie podwyższony OCR, wynoszący około siedmiu pikomoli na minutę na robaka.Po dodaniu FCCP nastąpił wzrost OCR typu dzikiego, a także mutantów sel-12, zgodnie z oczekiwaniami. Zwierzęta typu dzikiego wykazywały maksymalny OCR wynoszący około siedmiu pikomoli na minutę na robaka. Podczas gdy mutanty sel-12 miały OCR na poziomie około 10 pikomoli na minutę na robaka.W tym teście należy używać żywych, dobrze odżywionych i asynchronicznych zwierząt i unikać przenoszenia jaj lub tusz do studzienek testowych. Ponadto temperatura wewnętrzna przyrządu nie powinna przekraczać 25 stopni Celsjusza. Wybielacz, FCCP, FUdR i azydek sodu są toksyczne.Dlatego należy zachować ostrożność noszenia rękawic ochronnych podczas przygotowywania roztworów podstawowych i ładowania leków.

measurement-oxygen-consumption-rates-intact-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejsza praca szczegółowo opisuje sposób wykorzystania komór hipoksji z przepływem ciągłym do generowania atmosfer o określonych stężeniach O2 w celu zrozumienia reakcji biologicznych na obniżone stężenie O2. System ten jest łatwy w konfiguracji i konserwacji oraz wystarczająco elastyczny, aby dostosować go do szerokiego zakresu stężeń O2 oraz różnych systemów...

Tworzenie określonych środowisk gazowych w celu badania wpływu hipoksji na C. elegans

W tym filmie pokazujemy metodę wytwarzania rozwojowo zsynchronizowanej populacji bezpłodnych dorosłych C. elegans. Przykładowy protokół synchronizuje robaki w celu zbadania wskaźników zużycia tlenu u żywych zwierząt.

Synchronizacja nicieni: metoda uzyskiwania populacji robaków w identycznych stadiach rozwoju

C. elegans jest przydatnym modelem do badania wpływu alkoholu etylowego na zachowanie. Prezentujemy test behawioralny, który ilościowo określa wpływ alkoholu etylowego na szybkość poruszania się pełzających dżdżownic; zarówno początkową wrażliwość, jak i rozwój ostrej tolerancji funkcjonalnej na alkohol etylowy można zmierzyć za pomocą tego testu.

Badanie wpływu alkoholu etylowego na prędkość poruszania się Caenorhabditis elegans

C. elegans jest atrakcyjnym organizmem modelowym do badania szlaków transdukcji sygnałów zaangażowanych w odporność na stres oksydacyjny. Tutaj przedstawiamy protokół pomiaru odporności zwierząt C. elegans na stres oksydacyjny w fazie ciekłej, przy użyciu kilku środków utleniających w 96-dołkowych płytkach.

Pomiar odporności Caenorhabditis elegans na stres oksydacyjny w 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Pomiar zmian w tempie przemiany materii jest kluczowy dla zrozumienia postępu różnych chorób i starzenia się. W tym miejscu przedstawiamy nową technikę pomiaru zużycia tlenu w całej głowie, która bardziej przypomina stan fizjologiczny i może pomóc w ujawnieniu nowych leków modyfikujących aktywność mitochondriów.

Pomiar i interpretacja wskaźników zużycia tlenu w całych segmentach głowy muchy

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Kulometryczna respirometria jest idealna do pomiaru tempa metabolizmu małych organizmów. Po dostosowaniu do Drosophila melanogaster w niniejszym badaniu, zmierzone spożycieO2 mieściło się w zakresie zgłoszonym dla dzikiego typu D. melanogaster w poprzednich badaniach. Konsumpcja O2 na muchę przez mutanty CASK, które są mniejsze i mniej aktywne, była znacznie niższa niż w przypadku typu dzikiego.

Pomiar zużyciaO2 u Drosophila melanogaster za pomocą mikrorespirometrii kulometrycznej

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Poznaj metodę pomiaru zużycia tlenu w żywych nicieniach Caenorhabditis elegans bez izolacji mitochondriów. Protokół umożliwia analizę funkcji mitochondrialnej i zdrowia komórkowego w modelu genetycznym.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów