Name: Izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Poznaj skuteczną metodę izolacji komórek macierzystych miazgi zębowej z 90% wydajnością oraz ocenę ekspresji białka prionowego podczas różnicowania neuronalnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez "Fondazione Varrone" i Rieti University Hub "Sabina Universitas" dla Vincenzo Mattei.
Rysunek 5 (A, B) przedrukowany za zgodą wydawcy Taylor & Francis Ltd z: Rola wielocząsteczkowego kompleksu białka prionowego-EGFR podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych pochodzących z miazgi zębowej. Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C., Santilli F., Piccoli L., Sorice M., Mattei V. Prion. 2018 4 marca. Taylor & Francis Sp. z o.o.

Trzecie zęby trzonowe użyte w badaniu zostały wycięte od pacjentów (13-19 lat) bez wcześniejszej historii spożywania narkotyków lub alkoholu, wszyscy niepalący i z odpowiednią higieną jamy ustnej. W dniu wyjaśnienia na Wydziale Nauk Stomatologicznych i Szczękowo-Twarzowych Uniwersytetu "Sapienza" w Rzymie uzyskano świadomą zgodę pacjentów lub rodziców. Świadoma zgoda została uzyskana w oparciu o względy etyczne i zgodę komisji etycznej.
1. Ekstrakcja zęba i miazgi zębowej
<ol>
	<li>Przygotowanie odpowiedniego podłoża do konserwacji lub transportu.
	<ol>
		<li>Przygotuj średnio niskie stężenie glukozy (DMEM-L) firmy Dulbecco's Modified Eagle z L-glutaminą (494,5 ml).</li>
		<li>Dodać 5 ml penicyliny/streptomycyny (1%) i 0,5 ml amfoterycyny (0,1%).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać trzeci ząb trzonowy od pacjenta, szybko spłukać go PBS, włożyć do probówki o pojemności 15 ml z pożywką i przenieść do laboratorium w czasie krótszym niż 2 godziny.</li>
	<li>Pod kapturem zagrożenia biologicznego otwórz ząb za pomocą noża, przechodząc przez cięcie koronalne równolegle i stycznie przez dach komory miazgi.</li>
	<li>Delikatnie usuń miazgę za pomocą małej koparki i umieść ją w probówce.</li>
	<li>Przemyć trzykrotnie PBS i odwirować przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie pulpy zębowej i uwalnianie komórek macierzystych
<ol>
	<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w roztworze Hanka i umieścić go na szalce Petriego. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotowanie roztworu kolagenazy typu IV.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,8 ml DMEM-L.</li>
		<li>Rozpuść 1 mg kolagenazy typu IV w 0,8 ml DMEM-L i wiruj przez kilka minut.</li>
		<li>Dodaj DMEM-L do 1 ml, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg / mL.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć roztwór Hanka przez odwirowanie przy 2,500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i podzielić miazgę na małe plasterki około 1 mm każdy za pomocą jednorazowego skalpela.</li>
	<li>Umieścić plastry miazgi na szalce Petriego i inkubować z 1 ml kolagenazy typu IV przez 15 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Pożywka (500 ml).
	<ol>
		<li>Do 445 ml DMEM-L z L-glutaminą.</li>
		<li>Dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (10%).</li>
		<li>Dodać 5 ml penicyliny/streptomycyny (1%).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować próbkę o stężeniu 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w pożywce (etap 2.5) i wyhodować w kolbie T25 przeznaczonej dla komórek macierzystych w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Hodowla i rozmnażanie komórek macierzystych
<ol>
	<li>Codziennie sprawdzaj kulturę, a po 3 dniach wzrostu obserwuj różne klony przylegających komórek w kolbie.</li>
	<li>Co 3 dni zmieniaj pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Między 7 a 12 dniem, gdy przylegające komórki osiągną zbieżność, odłącz je, traktując komórki 1 ml trypsyny-EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C lub delikatnie używając skrobaka do komórek.</li>
	<li>Dodać 4 ml (w stosunku 1:5) pożywki hodowlanej (krok 2.5), aby zatrzymać działanie trypsyny.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek przez 6 minut przy 259 x g, usunąć supernatant i umieścić komórki w kolbie T25 do rozmnażania. 
	nuta: Co 3 dni komórki osiągają zbieg</li>.
	<li>Rozmnażaj komórki do 21 lub 28 dni (około 6-8 pasaży), aby uniknąć obecności komórek innych niż komórki macierzyste w hodowli.</li>
	<li>Odłączyć komórki za pomocą 1 ml trypsyny-EDTA na 3 minuty w temperaturze 37 °C lub delikatnie zeskrobując. Odwirować zawiesinę komórek przez 6 minut przy 259 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przebadać komórki do analizy cytofluorymetrycznej (krok 6).</li>
</ol>
4. Przejściowe wyciszanie PrPC przez siRNA
<ol>
	<li>Hoduj hDPSCss na płytkach 6-dołkowych (2 x 10<klasa sup = "xref">5 komórek/ml) z 2 ml pożywki hodowlanej (krok 2.5) przez 24 godziny.</li>
	<li>Następnego dnia przygotuj pożywkę siRNA PrP (400 μL).
	<ol>
		<li>Do sterylnej probówki dodać 384 μl DMEM-L.</li>
		<li>Dodaj 1 μl dla każdego rodzaju siRNA PrP do DMEM-L, aby uzyskać końcowe stężenie 5 nM (4 siRNA PrP zostały użyte i zweryfikowane przez dostawcę, aby zagwarantować skuteczność knockdown ≥70%).</li>
		<li>Dodać 12 μl odczynnika do transfekcji do DMEM-L.</li>
		<li>Mieszaninę należy wirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów transfekcyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 400 μl pożywki siRNA PrP do każdej próbki i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Nie odrzucając pożywki siRNA PrP, dodać 1,6 ml (stosunek 1 do 5) pożywki hodowlanej (krok 2.5).</li>
	<li>Pozostawić komórki na 72 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć 3 razy 2 ml PBS w temperaturze pokojowej uwagi.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki do hodowli neuronów przez 7 i/lub 14 dni (krok 5.1).</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę do hodowli neuronów co 3 dni. 
	nuta: Roztwór siRNA PrP należy wymieniać za każdym razem, gdy wymienia się pożywkę do hodowli neuronów.</li>
	<li>Pod koniec czasu przemyć 3 razy 2 ml PBS w RT i przetestować antygeny powierzchniowe neuronów za pomocą analizy Western Blot.</li>
</ol>
5. Proces indukcji neuronalnej hDPSC
<ol>
	<li>Preparat pożywki do hodowli neuronów (500 ml).
	<ol>
		<li>Przygotuj 444,7 ml podłoża podstawowego opracowanego dla komórek nerwowych.</li>
		<li>Do pożywki dodaj 50 ml suplementu bez surowicy, stosowanego w celu wspierania długoterminowej żywotności embrionalnych i dorosłych neuronalnych komórek macierzystych (10%).</li>
		<li>Dodać 200 μl zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) (stężenie końcowe 40 ng/ml) i 100 μl naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) do pożywki (stężenie końcowe 20 ng/ml).</li>
		<li>Dodać 5 ml penicyliny/streptomycyny (1%) do pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj hDPSC na płytkach 6-dołkowych (2 x 105 komórek/ml) do 28 dni od oddzielenia miazgi i stymuluj je 2 ml pożywki do hodowli neuronów.</li>
	<li>Co 3 dni wyrzucić supernatant, przemyć 3 razy 2 ml PBS w temperaturze pokojowej i zastąpić 2 ml pożywki do hodowli neuronalnej.</li>
	<li>Po 7 i/lub 14 dniach odłączyć komórki za pomocą 1 ml trypsyny-EDTA na 3 minuty w temperaturze 37 °C lub delikatnie za pomocą skrobaka.</li>
	<li>Dodać 4 ml (w stosunku 1:5) pożywki hodowlanej (krok 2.5), aby zatrzymać działanie trypsyny.</li>
	<li>Przeprowadzić test na obecność antygenów powierzchniowych neuronów (etap 6) lub ekspresji białka prionowego (etap 7) za pomocą analizy cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
6. Charakterystyka hDPSC za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Wybierz antygeny specyficzne dla zrębu mezenchymalnego (MSC) lub neuronalne antygeny powierzchniowe.</li>
	<li>Hodować hDPSC na płytkach 6-dołkowych (2 x 105 komórek/ml) z 2 ml pożywki hodowlanej (etap 2.5).</li>
	<li>Odłączyć hDPSC po 28 dniach od oddzielenia miazgi zębowej lub po 14 dniach pożywki do hodowli neuronów (krok 5.1) z 1 ml trypsyny-EDTA na 3 minuty w temperaturze 37 °C lub delikatnie skrobać.</li>
	<li>Dodać 4 ml (w stosunku 1:5) pożywki hodowlanej (krok 2.5), aby zatrzymać działanie trypsyny i odwirować przy 259 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć kolejne 2 razy 2 ml PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Utrwalić niepoddane działaniu lub poddane działaniu substancji hDPSC z 4% paraformaldehydem w PBS przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepuszczalność hDPSCS z 0,1% (v/v) niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w PBS przez dodatkowe 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonać blokowanie z 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w 1 ml PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyj 3 razy 1 ml PBS i inkubuj komórki z anty-CD105 (1:100/5 x 105 komórek), anty-CD44 (1:100/5 x 105 komórek), anty-STRO-1 (1:100/5 x 105 komórek), anty-CD90 (1:100/5 x 105 komórek), anty-CD73 (1:100/5 x 105 komórek), anty β3-tubuliną (1:100/5 x 105 komórek), anty-NFH (1:100/5 x 105 komórek) i anty-GAP43 (1:100/5 x 105 komórek) mAb przez 1 godzinę w RT.</li>
	<li>Przemyć komórki 3 razy 1 ml PBS i inkubować z anty-mysim PE (1:50/5 x 105 komórek) lub anty-króliczym CY5 (1:50/5 x 105 komórek) mAb przez dodatkowe 1 godzinę w RT.</li>
	<li>Użyj przeciwciał drugorzędowych do bramkowania komórek immunopozytywnych (anty-mysi PE lub anty-królik CY5 mAb) i przeanalizuj wszystkie próbki za pomocą cytometru przepływowego i uzyskaj co najmniej 20 000 zdarzeń.</li>
</ol>
7. Ocena ekspresji PrPC w hDPSC za pomocą analizy cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Hodować hDPSCss na 6-dołkowych płytkach (2 x 105 komórek/ml) z 2 ml pożywki hodowlanej (etap 2.5).</li>
	<li>Odłączyć hDPSC po 21 i 28 dniach od oddzielenia miazgi zębowej i po 7 i/lub 14 dniach za pomocą pożywki do hodowli neuronów (krok 5.1) z 1 ml trypsyny-EDTA i zatrzymać działanie trypsyny, jak opisano w kroku 6.4. Utrwalić próbki za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepuszczalność 0,1% (v/v) niejonowego surfaktantyny PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i zabarwić komórki króliczym anty-PrP mAb EP1802Y (1:50/5 x 105 komórek) mAb przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować z anty-króliczym CY5 (1:50/5 x 105 komórek) mAb przez dodatkowe 1 godzinę w RT.</li>
	<li>Przeanalizuj wszystkie próbki za pomocą cytometru przepływowego i uzyskaj co najmniej 20 000 zdarzeń.</li>
</ol>

<ol><li>Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+assays%3A+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418, 1-49 (2002).</li>
<li>Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow%2C+umbilical+cord+blood%2C+or+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).</li>
<li>Zannettino, A. C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-potential+Human+adipose-derived+stromal+stem+cells+exhibit+a+perivascular+phenotype+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo.</a> Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipid+rafts+in+neuronal+differentiation+of+dental+pulp-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells.</a> Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).</li>
<li>Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+from+the+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).</li>
<li>Young, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+in+the+neuronal+and+glial+differentiation+of+dental+pulp+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells.</a> Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).</li>
<li>Pisciotta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dental+pulp+stem+cells+%28hDPSCs%29%3A+isolation%2C+enrichment+and+comparative+differentiation+of+two+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations.</a> BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).</li>
<li>Atari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+of+the+third+molar%3A+a+new+source+of+pluripotent-like+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells.</a> Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).</li>
<li>Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+pluripotency+in+human+dental+pulp+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+oral+and+maxillofacial+surgery%3A+official+journal+of+the+American+Association+of+Oral+and+Maxillofacial+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells.</a> Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).</li>
<li>Gronthos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell properties of human dental pulp stem cells.</a> Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).</li>
<li>Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+dental+pulp+stem+cells+differentiate+toward+functionally+active+neurons+under+appropriate+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues.</a> Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).</li>
<li>Lee, Y. J., Baskakov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+form+of+the+prion+protein+is+involved+in+controlling+cell+cycle+dynamics%2C+self-renewal%2C+and+the+fate+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).</li>
<li>Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+%28PrPc%29+positively+regulates+neural+precursor+proliferation+during+developmental+and+adult+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).</li>
<li>Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+cellular+prion+protein%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The biological function of the cellular prion protein: an update.</a> BMC Biology. 15, 34(2017).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+cellular+prion+protein+to+mitochondrial+raft-like+microdomains+contributes+to+apoptosis+execution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).</li>
<li>Linden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Function+of+the+Prion+Protein%3A+A+Cell+Surface+Scaffold+of+Signaling+Modules%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).</li>
<li>Garofalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+raft-like+microdomains+in+the+regulation+of+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis.</a> Apoptosis. , 621-634 (2015).</li>
<li>Watt, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+beta-cleavage+of+the+prion+protein+in+the+cellular+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Withdrawal+Modifies+Prion+Protein+Expression+in+Rat+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus.</a> PLoS One. 12, 0169571(2017).</li>
<li>Hu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+proteins%3A+physiological+functions+and+role+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders.</a> Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).</li>
<li>Sorice, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+PrPC+to+mitochondrial+raft-like+microdomains+during+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis.</a> Prion. 6, 354-358 (2012).</li>
<li>Martellucci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Prion+protein-EGFR+multimolecular+complex+during+neuronal+differentiation+of+human+dental+pulp-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells.</a> Prion. 12 (2), 117-126 (2018).</li>
<li>Lee, Y. J., Baskokov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+form+of+the+prion+protein+guides+the+differentiation+of+human+embryonic+stem+cell+into+neuron-%2C+oligodendrocyte-+and+astrocyte-committed+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages.</a> Prion. 8, 266-275 (2014).</li>
<li>Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+human+dental+pulp+cells%3A+various+isolation+methods+and+culturing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments.</a> Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).</li>
<li>Suchanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells+and+their+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+papers+of+the+Medical+Faculty+of+the+University+Palack%C3%BD%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells and their characterization.</a> Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).</li>
<li>Bressan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age-related+biological+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells+change+in+nanostructured+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), 49146(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tej pracy skupiliśmy się na metodologii izolacji i różnicowania neuronalnego hDPSC; ponadto oceniliśmy rolę PrPC w tym procesie. Istnieje kilka metod izolowania i różnicowania hDPSC w komórkach podobnych do neuronów i krytycznych etapach tego procesu. hDPSC są zdolne do różnicowania w kilku liniach, takich jak chondroblasty, adipocyty, osteoblasty i neurony. W naszej pracy zbadaliśmy mechanizmy różnicowania neuronów i obecności PrPC. Jak omówiono powyżej, komórki te wyrażają typowe mezenchymalne a...

Mezenchymalne komórki macierzyste zostały wyizolowane z kilku tkanek, w tym szpiku kostnego, krwi pępowinowej, ludzkiej miazgi zębowej, tkanki tłuszczowej i krwi1,2,3,4,5,6. Jak donosi kilku autorów, hDPSC wykazują przyleganie do plastiku, typową morfologię podobną do fibroblastów. Reprezentują one wysoce heterogeniczną populację z odrębnymi klonami i różnicami w zdolności proliferacyjnej i różnicowej7,8. hDPSC wyrażają specyficzne markery dla mezenchymalnych komórek macierzystych (tj. CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), są ujemne dla niektórych markerów hematopoetycznych (takich jak CD14 i CD19) i są zdolne do różnicowania wieloliniowego in vitro9,10,11.
Kilku autorów wykazało, że te komórki są w stanie różnicować się w komórki podobne do neuronów za pomocą różnych protokołów, które obejmują dodawanie NGF, bFGF, EGF w połączeniu z określonymi pożywkami i suplementami7,12. Ponadto wiele białek bierze udział w procesie różnicowania neuronów, a wśród nich kilka prac wykazuje istotną rolę i znaczącą ekspresję komórkowego białka prionowego (PrPC), zarówno w embrionalnych, jak i dorosłych komórkach macierzystych13,14. PrPC reprezentuje plejotropową cząsteczkę zdolną do pełnienia różnych funkcji wewnątrz komórek, takich jak metabolizm miedzi, apoptoza i odporność na stres oksydacyjny15,16,17,18,19,20,21,22.
W naszym poprzednim artykule23, badaliśmy rolę PrPC w procesie różnicowania neuronów hDPSCs. W rzeczywistości hDPSC wyrażają przedwcześnie PrPC, a po różnicowaniu neuronalnym można było zaobserwować dodatkowy wzrost. Inni autorzy wysunęli hipotezę o możliwej roli PrPC w procesach różnicowania neuronów komórek macierzystych. Rzeczywiście, PrPC napędza różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w neurony, oligodendrocyty i astrocyty24. Celem pracy było zwrócenie uwagi na metodykę pozyskiwania komórek macierzystych z miazgi zęba, proces jej różnicowania oraz rolę PrPC podczas różnicowania neuronów.

<table><tbody><tr><td>Roztwór amfoterycyny B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>Służy do uzupełniania pożywki do hodowli komórkowych, jest to polienowy antybiotyk przeciwgrzybiczy firmy Streptomyce</td></tr><tr><td>Anti-B3tubulina</td><td>Cell Signaling Technology&nbsp;</td><td>#4466</td><td>Jedna z sześciu izoform B-tubuliny, ulega wysokiej ekspresji podczas rozwoju płodowego i pourodzeniowego, pozostając wysoko w obwodowym układzie nerwowym</td></tr><tr><td>Anty-CD105&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611314</td><td>Endoglin (CD105), główna glikoproteina ludzkiego śródbłonka naczyniowego, jest integralnym białkiem błonowym typu I z dużym obszarem zewnątrzkomórkowym, hydrofobowym regionem transbłonowym i krótkim cytoplazmatycznym ogonem</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-CD44</td><td>Millipore</td><td>CBL154-20ul</td><td>Dodatnie markery komórkowe skierowane przeciwko mezenchymalnym komórkom macierzystym</td></tr><tr><td>Anty-CD73&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej&nbsp;</td><td>13160</td><td>CD73 to glikoproteina o mocy 70 kDa zakotwiczona w glikozylofosfatydyloinozytolu, związana z błoną, która katalizuje hydrolizę zewnątrzkomórkowych monofosforanów nukleozydów do bioaktywnych nukleozydów</td></tr><tr><td>Anty-CD90</td><td>Millipore</td><td>CBL415-20ul</td><td>Dodatnie markery komórkowe przeciwciała skierowane przeciwko mezenchymalnym komórkom macierzystym</td></tr><tr><td>Anty-GAP43&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej&nbsp;</td><td>#8945</td><td>Jest specyficznym dla układu nerwowego, związanym ze wzrostem białkiem w stożkach wzrostu i obszarach o wysokiej plastyczności</td></tr><tr><td>Anty-mysie PE&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7003</td><td>Jest przeciwciałem stosowanym w cytometrii przepływowej lub analizie FACS</td></tr><tr><td>Anty-NFH&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej&nbsp;</td><td>#2836</td><td>Jest przeciwciałem, które wykrywa endogenne poziomy całkowitego białka Neurofilament-H</td></tr><tr><td>Anty-PrP mAb EP1802Y&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab52604</td><td>Monoklonalny królik [EP 1802Y] do białka prionowego PrP</td></tr><tr><td>Anty-królik CY5&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6564</td><td>Jest przeciwciałem stosowanym w cytometrii przepływowej lub analizie FACS</td></tr><tr><td>Anti-STRO 1</td><td>Millipore</td><td>MAB4315-20ul</td><td>Dodatnie markery komórkowe przeciwciała skierowane przeciwko mezenchymalnym komórkom macierzystym</td></tr><tr><td>B27 Supp XF CTS</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>A14867-01</td><td>B-27&nbsp; może być stosowany do wspomagania indukcji ludzkich nerwowych komórek macierzystych (hNSC) z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), ekspansji hNSC, różnicowanie hNSC i utrzymanie dojrzałych zróżnicowanych neuronów w hodowli</td></tr><tr><td>cytometru przepływowego BD Accuri C6&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>AC6531180187</td><td>Cytometr przepływowy wyposażony w laser niebieski (488 nm) i laser czerwony (640 nm)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie BD Accuri C6&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Kontroluje system cytometru przepływowego BD Accuri C6 w celu pozyskiwania danych, generowania statystyk i analizowania wyników</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>100-18B</td><td>podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka CL30R</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>11210908</td><td>jest to urządzenie, które służy do separacji płynów, gazów lub cieczy, na podstawie gęstości</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 3541</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>317527-185</td><td>zapewnia optymalne i powtarzalne warunki wzrostu dla kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>Kolagenaza to proteaza, która rozszczepia wiązanie między neutralnym aminokwasem (X) a glicyną w sekwencji Pro-X-Glyc-Pro, która występuje z dużą częstotliwością w kolagenie</td></tr><tr><td>Skalpel jednorazowy&nbsp;</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td>Służy do cięcia tkanek</td></tr><tr><td>DMEM-L</td><td>Euroclone</td><td>ECM0060L</td><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyroctan</td></tr><tr><td></td><td>EGF PeproThec, DBA</td><td>AF-100-15</td><td>Epidermalny czynnik wzrostu&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco firmy life technologies</td><td>10270-106</td><td>FBS jest popularnym suplementem pożywki, ponieważ zapewnia szeroki wachlarz funkcji w hodowli komórkowej. FBS dostarcza składniki odżywcze, czynniki wzrostu i przyłączania oraz chroni komórki przed uszkodzeniem oksydacyjnym i apoptozą przez mechanizmy, które są trudne do odtworzenia w systemach pożywek bezsurowicowych (SFM)</td></tr><tr><td>Filtropur BT50 0,2 500 ml Filtr butelkowy</td><td>Sarstedt</td><td>831,823,101</td><td>jest to urządzenie, które służy do filtracji roztworów</td></tr><tr><td>Flexitube GeneSolution dla PRNP</td><td>Qiagen</td><td>GS5621</td><td>4 siRNA dla genu Entrez 5621. Sekwencja docelowa nr 1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA&nbsp; N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA&nbsp; N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA&nbsp; N.4&nbsp; CAGTGACTATGAGGACCGTTA</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Hanka 1x</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>240200083</td><td>Podstawowa funkcja Hanks&prime; Zrównoważony roztwór soli ma na celu utrzymanie pH, a także równowagi osmotycznej. Dostarcza również wodę i niezbędne jony nieorganiczne do komórek</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji HiPerFect&nbsp;</td><td>Odczynnik do</td><td>transfekcji Qiagen 301705 HiPerFect to unikalna mieszanka kationowych i obojętnych lipidów, która umożliwia efektywny wychwyt siRNA i efektywne uwalnianie siRNA wewnątrz komórek, co skutkuje wysokim knockdownem genu nawet przy użyciu niskich stężeń siRNA</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A&nbsp;</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10888022</td><td>Neurobasal-A Medium to podstawowa pożywka przeznaczona do długotrwałego utrzymania i dojrzewania czystych neuronów mózgowych po urodzeniu i u dorosłych&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Paraformaldehyd jest stosowany do mocowania komórek i skrawków tkanek podczas zabiegów barwienia</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D&nbsp;</td><td>Stosuje się go do uzupełniania pożywek do hodowli komórkowych w celu kontroli zanieczyszczenia bakteryjnego</td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp; (PBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004LX10&nbsp;</td><td>PBS jest zrównoważonym roztworem soli stosowanym do obróbki i hodowli komórek ssaków. PBS służy do nawadniania, mycia i rozcieńczania komórek ssaków. Bufor fosforanowy utrzymuje pH w zakresie fizjologicznym</td></tr><tr><td>TC-Platte 6 studzienka, Komórka+,F</td><td>Sarstedt</td><td>833,920,300</td><td>Jest to powierzchnia wzrostu dla komórek adherentnych</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych T-25,Komórka +, Nasadka wentylowana</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,302</td><td>Kolba do hodowli tkankowych T-25, polistyren, Powierzchnia wzrostu Cell+ dla wrażliwych komórek przylegających, np. komórki pierwotne, szyja skośna, nasadka wentylacyjna, żółta, sterylna, Wolne od pirogenów, niecytotoksyczne, 10 szt./worek</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Szeroko stosowany niejonowy środek powierzchniowo czynny do odzysku składników membrany w łagodnych warunkach niedenaturacyjnych</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D&nbsp;</td><td>Trypsyna rozszczepia peptydy po stronie C-końcowej reszt aminokwasowych lizyny i argininy. Trypsyna służy do usuwania przylegających komórek z powierzchni hodowli</td></tr><tr><td>Probówka</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td>Probówka 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td></tr><tr><td>VBH 36 C2 Compact</td><td>Steril</td><td>ST-003009000</td><td>Zapewnia pełną ochronę środowiska i pracownika</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 &ndash; Odwrócony&nbsp; Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>3849000962</td><td>ZEISS Axio Vert.A1 zapewnia wyjątkową cenę podstawową i może zapewnić wszystkie techniki kontrastu, w tym jasne pole, kontrast fazowy, PlasDIC, VAREL, ulepszony kontrast modulacyjny Hoffmana (iHMC), DIC i fluorescencję. Wyposażone w oświetlenie LED zapewnia delikatne obrazowanie komórek znakowanych fluorescencyjnie. Axio Vert.A1 jest ergonomicznie zaprojektowany do rutynowej pracy i wystarczająco kompaktowy, aby można go było umieścić w kapturach do hodowli tkankowych.</td></tr></tbody></table>

izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Kwestie bioetyczne związane z manipulacją embrionalnymi komórkami macierzystymi hamują postęp w dziedzinie badań medycznych. Z tego powodu bardzo ważne jest pozyskiwanie dorosłych komórek macierzystych z różnych tkanek, takich jak tkanka tłuszczowa, pępowina, szpik kostny i krew. Wśród możliwych źródeł szczególnie interesująca jest miazga zęba, ponieważ jest łatwa do uzyskania ze względów bioetycznych. Rzeczywiście, ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej (hDPSC) są rodzajem dorosłych komórek macierzystych zdolnych do różnicowania się w komórkach podobnych do neuronów i można je uzyskać z trzeciego zęba trzonowego u zdrowych pacjentów (13-19 lat). W szczególności miazgę zębową usunięto za pomocą koparki, pocięto na małe plasterki, potraktowano kolagenazą IV i wyhodowano w kolbie. Aby indukować różnicowanie neuronów, hDPSC stymulowano EGF/bFGF przez 2 tygodnie. Wcześniej wykazaliśmy, że podczas procesu różnicowania zawartość komórkowego białka prionowego (PrPC) w hDPSC wzrosła. Analiza cytofluorymetryczna wykazała wczesną ekspresję PrPC, która wzrastała po procesie różnicowania neuronów. Ablacja PrPC przez siRNA PrP zapobiegała różnicowaniu neuronów indukowanemu przez EGF/bFGF. W tym artykule pokazujemy, że w miarę ulepszania metod izolacji, separacji i hodowli in vitro hDPSC za pomocą kilku prostych procedur, uzyskano bardziej wydajne klony komórek i zaobserwowano ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) na dużą skalę. Pokazujemy również, w jaki sposób hDPSC, uzyskane metodami szczegółowo opisanymi w protokole, są doskonałym modelem eksperymentalnym do badania procesu różnicowania neuronalnego MSCs oraz późniejszych procesów komórkowych i molekularnych.

Procedury izolacji i separacji hDPSCs z miazgi zębowej, pobranej z trzeciego trzonowca, są złożonymi procesami, w których niewielkie zmiany mogą doprowadzić do katastrofalnych rezultatów. W niniejszej pracy stosujemy protokół Arthur i wsp..12 z wprowadzeniem kilku ulepszeń. Reprezentatywny schemat procedur przedstawiono na Rysunku 1.
hDPSCs stanowią heterogenną popul...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i propagacji ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej w celu oceny ekspresji białka prionowego podczas procesu różnicowania neuronów.

Izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Standardowy sposób pozyskiwania komórek macierzystych z miazgi zęba jest mało wydajny, a to zależy od kilku zmiennych. Nasz protokół pozwolił na uzyskanie udanej izolacji komórek macierzystych z leczonych zębów w 90% przypadków. Główną zaletą jest uzyskanie dużej liczby komórek w ciągu kilku tygodni.To pozwala nam wykorzystać komórkę w medycynie regeneracyjnej i stworzyć biobank, który dostarczy innym naukowcom tego użytecznego narzędzia. Zabieg otwarcia zęba zostanie przeprowadzony przez dr Constantino Santacroce. Następnie protokół zostanie pokazany przez Stefano Martellucciego, doktoranta z mojego laboratorium, który jest pierwszym autorem artykułu.Na początek należy pobrać trzeci ząb trzonowy od pacjenta, szybko spłukać go PBS, włożyć do 15-mililitrowej probówki z pożywką i przenieść do laboratorium w mniej niż dwie godziny. Pod kapturem zagrożenia biologicznego użyj noża, aby otworzyć ząb za pomocą przejścia do cięcia koronalnego, równoległego i stycznego, przez dach komory miazgi. Za pomocą małej koparki delikatnie usuń miazgę i umieść ją w probówce.Następnie przemyć trzykrotnie PBS i odwirować w temperaturze pokojowej 2 500 razy przez 10 minut. Po odwirowaniu usunąć supernatant. Zawiesić osad w roztworze Hanka i przenieść próbkę na szalkę Petriego.Usuń roztwór Hanka przez odwirowanie 2 500 razy g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie za pomocą jednorazowego skalpela podziel miazgę na około milimetrowe plastry i dodaj jeden mililitr kolagenazy typu IV. Następnie odwirować próbkę o sile 2 500 g w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce. Hoduj go w kolbie T25 przeznaczonej dla komórek macierzystych w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. W okresie inkubacji należy zmieniać pożywkę co trzy dni.Gdy przylegające komórki osiągną zbieg, dodaj jeden mililitr roztworu trypsyny-EDTA do komórek, aby je odłączyć, i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej w stosunku jeden do pięciu, aby zatrzymać działanie trypsyny, i odwiruj zawiesinę komórkową w ilości 259 razy g przez sześć minut. Usunąć supernatant.Następnie umieść komórki w kolbie T25 do rozmnażania. Następnie odłącz komórki jednym mililitrem trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty. Odwirować zawiesinę komórkową 259 razy g przez sześć minut.Usunąć supernatant i przystąpić do badania komórek do analizy cytofluorymetrycznej. Aby wykonać przejściowy etap wyciszania białka prionowego, najpierw hoduj ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej na sześciodołkowych płytkach z dwoma mililitrami pożywki hodowlanej przez 24 godziny. Następnie dodaj 400 mikrolitrów małej interferującej pożywki RNA PrP do każdej próbki i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin.Nie odrzucając pożywki siRNA PrP, dodaj 1,6 mililitra pożywki hodowlanej w stosunku jeden do pięciu i pozostaw komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 72 godziny. Po okresie inkubacji usunąć supernatant i przemyć komórki dwoma mililitrami PBS trzy razy w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki do hodowli neuronów i trzymaj komórki przez siedem do 14 dni w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po okresie inkubacji umyj komórki dwoma mililitrami PBS trzykrotnie w temperaturze pokojowej i przystąp do analizy Western blot w celu zbadania antygenów powierzchniowych neuronów. Aby przeprowadzić proces indukcji neuronów, należy wyhodować 2 miliony ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej na sześciodołkowych płytkach, do 28 dni od oddzielenia miazgi. Co trzy dni wyrzucać supernatant.Przemyć trzy razy dwoma mililitrami PBS w temperaturze pokojowej i zastąpić dwa mililitry pożywki do hodowli neuronów. Po siedmiu do 14 dniach odłącz komórki jednym mililitrem trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej w stosunku jeden do pięciu, aby zatrzymać działanie trypsyny.Aby scharakteryzować ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej za pomocą cytometrii przepływowej, należy wyhodować 2 miliony na mililitr komórek na sześciodołkowych płytkach z dwoma mililitrami pożywki hodowlanej. Po 28 dniach od oddzielenia miazgi zębowej lub po dodatkowych 14 dniach z pożywką do hodowli neuronów, dodaj jeden mililitr trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby odłączyć komórki. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej w stosunku jeden do pięciu, aby zatrzymać działanie trypsyny, i odwiruj 259 razy g w temperaturze pokojowej przez sześć minut.Utrwal nieleczone lub poddane działaniu substancji komórki za pomocą 300 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie odwirować, wyrzucić supernatant i przepuścić komórki 1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w PBS w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 10 minut. Następnie ponownie odwirować, wyrzucić supernatant i wykonać blokowanie za pomocą 5% beztłuszczowego mleka w proszku w jednym mililitrze PBS w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Przemyć trzy razy jednym mililitrem PBS i inkubować komórki z przeciwciałami monoklonalnymi anty-CD105, anty-CD44, anty-STRO-1, anty-CD90, anty-CD73, anty-beta-3-tubuliną, anty-NFH i anty-GAP43 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie ponownie odwirować komórki trzy razy z rzędu z jednym mililitrem PBS w odstępach sześciominutowych, a następnie inkubować z przeciwciałami monoklonalnymi anty-mysimi PE lub anty-króliczymi CY5 w temperaturze pokojowej przez dodatkową godzinę. Użyj przeciwciał drugorzędowych do bramkowania komórek immunologicznych i przeanalizuj wszystkie próbki za pomocą cytometru przepływowego.Hodowla 2 milionów komórek na mililitr ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej na płytkach sześciodołkowych z dwoma mililitrami pożywki hodowlanej. Po 21 i 28 dniach od oddzielenia miazgi zębowej lub po dodatkowych siedmiu do 14 dniach z pożywką do hodowli neuronów, dodaj jeden mililitr trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby odłączyć komórki. Następnie odwirować, wyrzucić supernatant, a następnie utrwalić próbki 4% paraformaldehydem w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie odwirować, wyrzucić supernatant, a następnie przepuścić 1% niejonowy środek powierzchniowo czynny w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usunąć supernatant i wybarwić komórki króliczym przeciwciałem monoklonalnym anty-PrP w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Na koniec odwirować, odrzucić supernatant, a następnie inkubować z przeciwciałem monoklonalnym anty-króliczym CY5 w temperaturze pokojowej przez dodatkową godzinę.Przeanalizować wszystkie próbki za pomocą cytometru przepływowego. Po oddzieleniu miazgi skupiska komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej zostały rozszerzone na obrzeżach. Porównanie wzrostu tych komórek przed i po różnicowaniu neuronalnym wywołanym przez EGF/bFGF wykazało znaczące zmiany w morfologii komórek i wzroście neurytów.Nieleczone ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej wykazywały ekspresję multipotencjalnych mezenchymalnych antygenów powierzchniowych zrębu, takich jak CD44, CD90, CD105, CD73 i STRO-1. Po odpowiednich bodźcach indukcji neuronalnej komórki te wykazywały ekspresję specyficznych markerów neuronalnych, takich jak beta-trójtubulina, NFH i GAP43. Nieleczone lub leczone komórki nie wykazywały ekspresji markerów krwiotwórczych, takich jak CD14 i CD19.Po 28 dniach białko prionowe uległo przedwczesnej ekspresji w ludzkich komórkach macierzystych miazgi zębowej w porównaniu z odpowiednią kontrolą negatywną, a jego ekspresja uległa zwiększonej ekspresji po procesie różnicowania neuronów indukowanym przez EGF/bFGF. Analiza Western blot wykazała, że wyciszenie białka prionowego przez sRNA przed bodźcami EGF/bFGF może wpływać na proces różnicowania neuronów ludzkich komórek macierzystych miazgi zęba, zapobiegając ekspresji markerów neuronalnych beta-trójtubuliny i NFZ. Najważniejsze jest wybór enzymu, który oddzieli komórki od miazgi.W rzeczywistości, jeśli enzym jest zbyt agresywny, komórki mogą zostać uszkodzone, a ich zdolność do wzrostu i różnicowania może być zagrożona. Komórki macierzyste miazgi zęba są doskonałym modelem eksperymentalnym, który może być stosowany w badaniach in vivo i in vitro w dziedzinie medycyny regeneracyjnej. Ponieważ PrP odgrywa kluczową rolę w procesie różnicowania neuronów komórek macierzystych miazgi zęba, marker ten może być doskonałym kandydatem na skuteczny cel w chorobach neurodegeneracyjnych.Najważniejszym aspektem, na który należy zwrócić uwagę, jest stan zdrowia pacjentów, taki jak brak chorób zakaźnych.

isolation-propagation-prion-protein-expression-during-neuronal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Ten film prezentuje technikę tworzenia wspólnej kultury neuronów trójdzielnych i pierwotnych komórek miazgi zębowej za pomocą filtra transwell. W tym fizycznie oddzielonym stanie komórki mezenchymalne uzyskane z tkanki miazgi zęba wydzielają parakrynne cząsteczki sygnałowe, które przechodzą przez pory, promując różnicowanie i migrację neuronów w kierunku komórek mezenchymalnych, tworząc system kohodowli.

Ustanowienie wspólnej hodowli komórek miazgi zębowej i neuronów trójdzielnych do komunikacji krzyżowej

Ten film pokazuje proces indukowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania się w neurony poprzez transfekcję ich zmodyfikowanymi lentiwirusami przenoszącymi gen neurogennego czynnika transkrypcyjnego pod kontrolą elementu reagującego na tetracyklinę, a następnie leczenie pochodną tetracykliny i pożywką do dojrzewania.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronach przy użyciu zmodyfikowanych lentiwirusów

Ta procedura prowadzi do powstania neuronów kresomózgowiowych poprzez przejście przez punkty kontrolne, które są podobne do tych obserwowanych podczas rozwoju człowieka. Komórki mogą się spontanicznie różnicować, są wystawione na działanie czynników, które popychają je w kierunku linii neuronalnej, są izolowane i są powlekane na szkiełkach nakrywkowych, aby umożliwić końcowe różnicowanie i dojrzewanie.

Specyfikacja neuronów glutaminergicznego kresomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Opisujemy izolację, dyspersję i powlekanie komórek pierwotnych miazgi zębowej (DP) z neuronami trójdzielnymi (TG) hodowanymi na nałożonych na nich filtrach transwell. Odpowiedzi komórkowe komórek DP można analizować za pomocą immunofluorescencji lub analizy RNA/białka. Immunofluorescencja markerów neuronalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na analizę odpowiedzi na przerost neurytów.

Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku, jak założyć pierwotną hodowlę komórek macierzystych miazgi zębowej przy użyciu metody hodowli eksplantatów i charakterystykę tych komórek w oparciu o wytyczne ICSCRT. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu można uznać za mezenchymalne komórki macierzyste do dalszych zastosowań.

Pierwotna hodowla komórek macierzystych miazgi zębowej

Ten protokół kładzie nacisk na ekstrakcję, hodowlę i zachowanie multipotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zębowej poprzez trawienie enzymatyczne. Dodatkowo wykazano ich potencjał do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty, podkreślając znaczenie precyzji i spójności w tym procesie.

Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej świni (pADSC) z podskórnych tkanek tłuszczowych z badaniem multipotencji. Multipotencjalne pADSC są wykorzystywane do wyznaczania procesów różnicowania adipocytów i badania transdyferencjacji do wielu linii komórkowych mezenchymy mezodermalnej lub dalszych linii ektodermy i endodermy do badań regeneracyjnych.

Izolacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z podskórnych tkanek tłuszczowych świń

Poznaj skuteczną metodę izolacji komórek macierzystych miazgi zębowej z 90% wydajnością oraz ocenę ekspresji białka prionowego podczas różnicowania neuronalnego.

Izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej

Przeglądaj więcej filmów