Izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej

Standardowy sposób pozyskiwania komórek macierzystych z miazgi zęba jest mało wydajny, a to zależy od kilku zmiennych. Nasz protokół pozwolił na uzyskanie udanej izolacji komórek macierzystych z leczonych zębów w 90% przypadków. Główną zaletą jest uzyskanie dużej liczby komórek w ciągu kilku tygodni.

To pozwala nam wykorzystać komórkę w medycynie regeneracyjnej i stworzyć biobank, który dostarczy innym naukowcom tego użytecznego narzędzia. Zabieg otwarcia zęba zostanie przeprowadzony przez dr Constantino Santacroce. Następnie protokół zostanie pokazany przez Stefano Martellucciego, doktoranta z mojego laboratorium, który jest pierwszym autorem artykułu.

Na początek należy pobrać trzeci ząb trzonowy od pacjenta, szybko spłukać go PBS, włożyć do 15-mililitrowej probówki z pożywką i przenieść do laboratorium w mniej niż dwie godziny. Pod kapturem zagrożenia biologicznego użyj noża, aby otworzyć ząb za pomocą przejścia do cięcia koronalnego, równoległego i stycznego, przez dach komory miazgi. Za pomocą małej koparki delikatnie usuń miazgę i umieść ją w probówce.

Następnie przemyć trzykrotnie PBS i odwirować w temperaturze pokojowej 2 500 razy przez 10 minut. Po odwirowaniu usunąć supernatant. Zawiesić osad w roztworze Hanka i przenieść próbkę na szalkę Petriego.

Usuń roztwór Hanka przez odwirowanie 2 500 razy g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie za pomocą jednorazowego skalpela podziel miazgę na około milimetrowe plastry i dodaj jeden mililitr kolagenazy typu IV. Następnie odwirować próbkę o sile 2 500 g w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce. Hoduj go w kolbie T25 przeznaczonej dla komórek macierzystych w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. W okresie inkubacji należy zmieniać pożywkę co trzy dni.

Gdy przylegające komórki osiągną zbieg, dodaj jeden mililitr roztworu trypsyny-EDTA do komórek, aby je odłączyć, i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej w stosunku jeden do pięciu, aby zatrzymać działanie trypsyny, i odwiruj zawiesinę komórkową w ilości 259 razy g przez sześć minut. Usunąć supernatant.

Następnie umieść komórki w kolbie T25 do rozmnażania. Następnie odłącz komórki jednym mililitrem trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty. Odwirować zawiesinę komórkową 259 razy g przez sześć minut.

Usunąć supernatant i przystąpić do badania komórek do analizy cytofluorymetrycznej. Aby wykonać przejściowy etap wyciszania białka prionowego, najpierw hoduj ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej na sześciodołkowych płytkach z dwoma mililitrami pożywki hodowlanej przez 24 godziny. Następnie dodaj 400 mikrolitrów małej interferującej pożywki RNA PrP do każdej próbki i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin.

Nie odrzucając pożywki siRNA PrP, dodaj 1,6 mililitra pożywki hodowlanej w stosunku jeden do pięciu i pozostaw komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 72 godziny. Po okresie inkubacji usunąć supernatant i przemyć komórki dwoma mililitrami PBS trzy razy w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki do hodowli neuronów i trzymaj komórki przez siedem do 14 dni w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po okresie inkubacji umyj komórki dwoma mililitrami PBS trzykrotnie w temperaturze pokojowej i przystąp do analizy Western blot w celu zbadania antygenów powierzchniowych neuronów. Aby przeprowadzić proces indukcji neuronów, należy wyhodować 2 miliony ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej na sześciodołkowych płytkach, do 28 dni od oddzielenia miazgi. Co trzy dni wyrzucać supernatant.

Przemyć trzy razy dwoma mililitrami PBS w temperaturze pokojowej i zastąpić dwa mililitry pożywki do hodowli neuronów. Po siedmiu do 14 dniach odłącz komórki jednym mililitrem trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej w stosunku jeden do pięciu, aby zatrzymać działanie trypsyny.

Aby scharakteryzować ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej za pomocą cytometrii przepływowej, należy wyhodować 2 miliony na mililitr komórek na sześciodołkowych płytkach z dwoma mililitrami pożywki hodowlanej. Po 28 dniach od oddzielenia miazgi zębowej lub po dodatkowych 14 dniach z pożywką do hodowli neuronów, dodaj jeden mililitr trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby odłączyć komórki. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej w stosunku jeden do pięciu, aby zatrzymać działanie trypsyny, i odwiruj 259 razy g w temperaturze pokojowej przez sześć minut.

Utrwal nieleczone lub poddane działaniu substancji komórki za pomocą 300 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie odwirować, wyrzucić supernatant i przepuścić komórki 1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w PBS w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 10 minut. Następnie ponownie odwirować, wyrzucić supernatant i wykonać blokowanie za pomocą 5% beztłuszczowego mleka w proszku w jednym mililitrze PBS w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Przemyć trzy razy jednym mililitrem PBS i inkubować komórki z przeciwciałami monoklonalnymi anty-CD105, anty-CD44, anty-STRO-1, anty-CD90, anty-CD73, anty-beta-3-tubuliną, anty-NFH i anty-GAP43 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie ponownie odwirować komórki trzy razy z rzędu z jednym mililitrem PBS w odstępach sześciominutowych, a następnie inkubować z przeciwciałami monoklonalnymi anty-mysimi PE lub anty-króliczymi CY5 w temperaturze pokojowej przez dodatkową godzinę. Użyj przeciwciał drugorzędowych do bramkowania komórek immunologicznych i przeanalizuj wszystkie próbki za pomocą cytometru przepływowego.

Hodowla 2 milionów komórek na mililitr ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej na płytkach sześciodołkowych z dwoma mililitrami pożywki hodowlanej. Po 21 i 28 dniach od oddzielenia miazgi zębowej lub po dodatkowych siedmiu do 14 dniach z pożywką do hodowli neuronów, dodaj jeden mililitr trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby odłączyć komórki. Następnie odwirować, wyrzucić supernatant, a następnie utrwalić próbki 4% paraformaldehydem w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie odwirować, wyrzucić supernatant, a następnie przepuścić 1% niejonowy środek powierzchniowo czynny w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usunąć supernatant i wybarwić komórki króliczym przeciwciałem monoklonalnym anty-PrP w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Na koniec odwirować, odrzucić supernatant, a następnie inkubować z przeciwciałem monoklonalnym anty-króliczym CY5 w temperaturze pokojowej przez dodatkową godzinę.

Przeanalizować wszystkie próbki za pomocą cytometru przepływowego. Po oddzieleniu miazgi skupiska komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej zostały rozszerzone na obrzeżach. Porównanie wzrostu tych komórek przed i po różnicowaniu neuronalnym wywołanym przez EGF/bFGF wykazało znaczące zmiany w morfologii komórek i wzroście neurytów.

Nieleczone ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej wykazywały ekspresję multipotencjalnych mezenchymalnych antygenów powierzchniowych zrębu, takich jak CD44, CD90, CD105, CD73 i STRO-1. Po odpowiednich bodźcach indukcji neuronalnej komórki te wykazywały ekspresję specyficznych markerów neuronalnych, takich jak beta-trójtubulina, NFH i GAP43. Nieleczone lub leczone komórki nie wykazywały ekspresji markerów krwiotwórczych, takich jak CD14 i CD19.

Po 28 dniach białko prionowe uległo przedwczesnej ekspresji w ludzkich komórkach macierzystych miazgi zębowej w porównaniu z odpowiednią kontrolą negatywną, a jego ekspresja uległa zwiększonej ekspresji po procesie różnicowania neuronów indukowanym przez EGF/bFGF. Analiza Western blot wykazała, że wyciszenie białka prionowego przez sRNA przed bodźcami EGF/bFGF może wpływać na proces różnicowania neuronów ludzkich komórek macierzystych miazgi zęba, zapobiegając ekspresji markerów neuronalnych beta-trójtubuliny i NFZ. Najważniejsze jest wybór enzymu, który oddzieli komórki od miazgi.

W rzeczywistości, jeśli enzym jest zbyt agresywny, komórki mogą zostać uszkodzone, a ich zdolność do wzrostu i różnicowania może być zagrożona. Komórki macierzyste miazgi zęba są doskonałym modelem eksperymentalnym, który może być stosowany w badaniach in vivo i in vitro w dziedzinie medycyny regeneracyjnej. Ponieważ PrP odgrywa kluczową rolę w procesie różnicowania neuronów komórek macierzystych miazgi zęba, marker ten może być doskonałym kandydatem na skuteczny cel w chorobach neurodegeneracyjnych.

Najważniejszym aspektem, na który należy zwrócić uwagę, jest stan zdrowia pacjentów, taki jak brak chorób zakaźnych.