Name: Oczyszczanie frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia z hodowanych neuronów hipokampalnych. Technika wykorzystuje wiązanie TLCN z vitronektyną do izolacji struktur kluczowych dla rozwoju synaptycznego i plastyczności neuronowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Shigeo Okabe i Hitomi Matsuno za hodowlę neuronów hipokampa o niskiej gęstości, Masayoshi Mishina za myszy z niedoborem TLCN, Sachiko Mitsui i Momoko Shiozaki za pomoc techniczną, a także członkom laboratorium Yoshihara za pomocne dyskusje. Prace te były wspierane przez granty JSPS KAKENHI nr JP20700307, JP22700354 i JP24500392 oraz MEXT KAKENHI Granty nr JP23123525 dla YF i JP20022046, JP18H04683 oraz JP18H05146 dla YY.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania RIKEN Wako.
1. Kultura neuronów hipokampa
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki hodowlanej
	<ol>
		<li>Przygotowanie 200x mieszanki witaminowej. Rozpuść 100 mg soli półwapniowej kwasu D-pantotenowego, 100 mg chlorku choliny, 100 mg kwasu foliowego, 180 mg i-inozytolu, 100 mg niacynamidu, 100 mg chlorowodorku pirydoksalu i 100 mg chlorowodorku tiaminy w 500 ml ultraczystej wody za pomocą mieszadła magnetycznego. Roztwór nie jest całkowicie rozpuszczony. Ostrożnie wymieszać, podać porcję w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotowanie roztworu ryboflawiny. Rozpuść 100 mg ryboflawiny w 500 ml ultraczystej wody za pomocą mieszadła magnetycznego. Roztwór nie jest całkowicie rozpuszczony. Ostrożnie wymieszać, podać porcję w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotowanie 1 M CaCl2. Rozpuścić 7,35 g CaCl2·2H2O w 50 ml ultraczystej wody za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
		<li>Przygotowanie minimalnej ilości niezbędnej pożywki (MEM). Rozpuścić 400 mg KCl, 6800 mg NaCl, 2 200 mg NaHCO3, 158 mg NaH2PO4·2H2O, 7000 mg D-glukozy i 200 mg MgSO 4-7H2O w 950 ml ultraczystej wody za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
		<li>Miareczkować 1,8 ml 1 M CaCl2 do MEM kropla po kropli za pomocą pipety o pojemności 1 ml i stałym mieszadłem na mieszadle magnetycznym. Dostosuj pH MEM do pH 7,25 za pomocą 1 mol/l HCl.</li>
		<li>Dodaj 5 ml mieszanki witamin 200x i 200 μl roztworu ryboflawiny do MEM. Dostosuj objętość roztworu do 1 000 ml z ultraczystą wodą. Przefiltrować roztwór za pomocą systemu filtrów 0,22 μm i przechowywać go w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotowanie 10 roztworów podstawowych DNazy-I. Rozpuścić 100 mg DNazy-I w 12,5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS), przefiltrować przez filtr 0,22 μm, podwielokrotność w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać probówki w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotowanie roztworu podstawowego cytozyny β-D-arabinofuraranozydu (Ara-C). Rozpuścić 25 mg Ara-C w 8,93 ml ultraczystej wody (końcowe stężenie 10 mM), przefiltrować przez filtr 0,22 μm, podwielokrotność w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C</li>
		<li>Przygotowanie podłoża galwanicznego. Wymieszaj 1 ml roztworu aminokwasów MEM, 750 μl 1 M HEPES, 1 ml B27, 125 μl 200 mM glutaminy, 250 μl penicyliny/streptomycyny, 2,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 44,375 ml MEM w probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Przygotowanie pożywki stopowej. Wymieszaj 1 ml roztworu aminokwasów MEM, 750 μl 1 M HEPES, 5 ml FBS (ostatnie 10%) i 43,25 ml MEM w probówce o pojemności 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie potraw pokrytych poli-L-lizyną
	<ol>
		<li>Pokryj 35 mm plastikowe szalki do hodowli komórkowych 0,2 mg/ml bromowodorku poli-L-lizyny przez 1 dzień w temperaturze 25 °C. 
		nuta: Nie należy stosować poli-L-lizyny zamiast bromowodorku poli-L-lizyny.</li>
		<li>Umyj naczynia 2 ml ultraczystej wody 3 razy. Inkubować naczynia z 1,5 ml pożywki Stop w temperaturze 25 °C aż do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparowanie neuronów hipokampa z zarodka myszy
	<ol>
		<li>Tkankowe źródło neuronów hipokampa. Wypreparuj hipokamp od myszy C57BL6 / J typu dzikiego i z niedoborem TLCN w dniach embrionalnych 16-17 zgodnie z metodą Lu et al.19.</li>
		<li>Wypreparowane hipokampy inkubować w 0,25% trypsyny i 1x DNaseI w HBSS zawierającym 15 mM HEPES, pH 7,2 przez 15 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem co 3 minuty. Usunąć roztwór. Inkubować hipokampy w 10 ml pożywki STOP w celu dezaktywacji trypsyny w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Przenieść hipokampy do 10 ml świeżej pożywki STOP i inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Przenieść hipokampy do 10 ml świeżej pożywki STOP i inkubować w temperaturze 4 °C przez kolejne 5 minut. Przenieść hipokampy do 900 μl pożywki STOP i 100 μl 10x DNaseI w probówce o pojemności 15 ml. Podziel hipokampy na izolowane neurony, pipetując 20 razy za pomocą 1 ml pipet. 
		nuta: Końcówka pipety o pojemności 1 ml lekko dotyka dna probówki o pojemności 15 ml podczas dysocjacji hipokampa.</li>
		<li>Dodać 9 ml pożywki galwanicznej i przefiltrować przez sitko o wielkości 70 μm do probówki o pojemności 50 ml. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i dostosuj do 3,5 x 104 komórek/ml w pożywce galwanicznej.</li>
		<li>Odessać pożywkę STOP z naczyń pokrytych poli-L-lizyną. Umieść komórki na szalkach pokrytych poli-L-lizyną w proporcji 7 x 104 komórki / naczynie (2 ml / naczynie).</li>
		<li>Po 60-64 godzinach inkubacji w 5% CO2 w temperaturze 37 °C dodać 2 μl roztworu podstawowego Ara-C (ostatnie 10 μM) do neuronów i powoli wstrząsać naczyniem. Przechowywać szalki hodowlane w wilgotnym pudełku bez zmiany pożywki w temperaturze poniżej 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia
<ol>
	<li>Po 13 dniach in vitro (DIV) dodaj magnetyczne mikrogranulki polistyrenowe (3 x 106 cząstek na talerz) do 20 szalek zawierających wyhodowane neurony. Po 1 dniu przemyj neurony w 1 ml PBS z mieszaniem 3 razy, aby usunąć pożywkę i niezwiązane mikrogranulki. Po usunięciu PBS należy poddać neurony lizie za pomocą 500 μl / naczynie buforu do lizy (PBS zawierający 0,01% Triton X-100, koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA i koktajl inhibitorów fosfatazy).</li>
	<li>Zebrać lizat za pomocą skrobaka do komórek i przenieść lizat do mikroprobówek o niskim poziomie wiązania białka (10 probówek). Ustaw rurki na separatorze magnetycznym i odczekaj 1 min. Zebrać supernatant i użyć go jako frakcji niezwiązanej do barwienia srebrem i analizy Western blot.</li>
	<li>Przenieś kulki do nowej mikroprobówki o niskiej wiązalności białek, umieść na separatorze magnetycznym i całkowicie usuń supernatant. Dodać 500 μl buforu do lizy i myć kulki za pomocą mieszalnika wirowego przez 15 sekund. Umieść probówkę na separatorze magnetycznym, odczekaj 1 minutę, usuń supernatant i dodaj 500 μl buforu do lizy. Powtórz mycie koralików 10 razy i usuń supernatant.</li>
	<li>Elutować białka związane z kulkami (frakcja związana) przez dodanie 50 μl 1x buforu próbki SDS (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS i 10% glicerolu) i gotować probówkę w temperaturze 98 °C przez 5 minut. Odwirować probówkę o stężeniu 860 x g przez 10 s i umieścić probówkę na separatorze magnetycznym na 1 minutę. Zebrać supernatant i użyć go jako frakcji związanej. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Zmierzyć stężenia białek we frakcjach niezwiązanych i związanych za pomocą testu białka BCA. Wizualizacja roztworów białkowych z błękitem bromofenolowym i dostosowanie stężenia do 5 ng/μL dla SDS-PAGE.</li>
</ol>
3. Barwienie srebrem i analiza Western Blot
<ol>
	<li>Oddzielić frakcje związane i niezwiązane (50 ng) za pomocą SDS-PAGE za pomocą żelu gradientowego 5-20%. Żel poplamić srebrem.</li>
	<li>Western blot z użyciem anty-TLCN-C (1/3 000), anty-bydlęcej witronektyny (1/5 000), anty-aktyny (1/1 000) i anty-α-tubuliny (1/1 000) jako przeciwciał pierwszorzędowych oraz koziej anty-króliczej IgG sprzężonej z HRP jako przeciwciała drugorzędowego. Wizualizacja antygenów za pomocą chemiluminescencyjnego odczynnika do wykrywania Western Blotting i obrazowania chemiluminescencyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions%3A+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li>
<li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li>
<li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li>
<li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+formation+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683(2012).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+proteome%2C+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li>
<li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li>
<li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin+slows+spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li>
<li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li>
<li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li>
<li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin%3A+a+neuronal+area+code+molecule%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Telencephalin: a neuronal area code molecule?</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li>
<li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li>
<li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li>
<li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li>
<li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27(2018).</li>
<li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density%2C+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li>
<li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li>
<li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowaliśmy metodę oczyszczania frakcji bogatej w filopodia dendrytyczne z wykorzystaniem powinowactwa między cząsteczką adhezyjną TLCN a białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej witronektyną. W porównaniu z frakcją PSD możliwe jest zidentyfikowanie białek synaptycznych działających na niedojrzałą synapsę z frakcji bogatej w filopodia dendrytyczne. Tym samym składniki frakcji bogatej w filopodia dendrytyczne różnią się od składników frakcji PSD o 74%. W odróżnieniu od frakcji PSD, użyliśmy hodowanych neuronów hipokampa do ...

Filopodia dendrytyczne są uważane za prekursory kolców. Filamenty aktynowe w filopodiach dendrytycznych regulują ich wydłużanie i retrakcję1,2,3. Po zetknięciu się z aksonem, wybrane filopodia dendrytyczne rozpoczynają dojrzewanie do kolców i tworzy się synapsa4,5. Składniki kolców zostały określone na podstawie kompleksowej analizy postsynaptycznych frakcji gęstości6,7, podczas gdy składniki filopodiów dendrytycznych pozostają w dużej mierze nieznane. Wykazano, że telencefalina (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, kinaza PI3, Akt, mTOR, kinaza polo-podobna 2, CaMKII, syndecan-2, paralemina-1, ARF6 i EphB regulują powstawanie filopodiów dendrytycznych 5,8,9,10,11, podczas gdy nie opracowano metody kompleksowej analizy cząsteczek obecnych w filopodiach dendrytycznych.
TLCN (ICAM-5) jest specyficznie wyrażany przez neurony kolczaste w najbardziej rostralnym segmencie mózgu, telencephalon12. TLCN ma 9 domen podobnych do Ig w regionie zewnątrzkomórkowym, region transbłonowy i ogon cytoplazmatyczny13. TLCN wiąże się z witronektyną (VN) i integryną LFA-1 w regionie zewnątrzkomórkowym, z preseniliną w regionie transbłonowym oraz z fosfo-ERM i α-aktyniną w regionie cytoplazmatycznym5,8,14,15,16. TLCN wiąże się z cytoszkieletem aktynowym poprzez fosfo-ERM na końcach filopodiów dendrytycznych i α-aktyniny w kolcach i trzonach dendrytycznych8,16.
Wykazaliśmy, że nadekspresja TLCN zwiększa tworzenie dendrytycznych filopodiów i indukuje powrót kolców do filopodia10. Konstytutywna aktywna forma ezryny związana z regionem cytoplazmatycznym TLCN i wzmocniona powstawanie filopodiów dendrytycznych 8. W ten sposób TLCN reguluje tworzenie filopodiów dendrytycznych poprzez białka wiążące aktynę. Esselens i wsp. wykazali, że mikrogranulki indukują akumulację TLCN na hodowanych neuronach17. Wykazaliśmy, że struktury miseczek fagocytarnych powstawały na dendrytach neuronalnych wokół mikrokulek pokrytych VN w sposób zależny od TLCN15. Składniki filopodiów dendrytycznych są podobne do tych z miseczki fagocytarnej. Trudno jest zebrać filopodia dendrytyczne, ale stosunkowo łatwiej jest zebrać kubek fagocytarny za pomocą mikrokulek magnetycznych. W związku z tym opracowaliśmy metodę oczyszczania miseczki fagocytarnej zamiast filopodiów dendrytycznych18. W tym miejscu opisujemy metodę oczyszczania frakcji bogatej w filopodia dendrytyczne.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mLl Low Binding MCT</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39640T</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>2530149</td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastikowe naczynia do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Anty-aktyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5060</td><td></td></tr><tr><td>Anty-alfa-aktynina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5044</td><td></td></tr><tr><td>Anty-alfa-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ezrin</td><td>Klon Sigma-Aldrich3C12</td><td>, SAB4200806</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Galphaq</td><td>Santacruz</td><td>sc-393</td><td></td></tr><tr><td>Anty-MAP2</td><td>Chemicon</td><td>klon AP20, MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Moesin</td><td>Klon Sigma-Aldrich</td><td>38/87, M7060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLCbeta1</td><td>Santacuz</td><td>sc-5291</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSD95</td><td>MA2</td><td>ABR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Spectrin beta</td><td>Chemicon</td><td>MAB1622</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Merck</td><td>1.08122.0005</td><td></td></tr><tr><td>Chrolek wapnia, wodny</td><td>Wako</td><td>038-19735</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek choliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Cytozyna beta-D-arabinofuranozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-6645</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Kwas D-pantotenowy sól hemiwapniowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel</td><td>ATTO</td><td>E-T520L</td><td></td></tr><tr><td>Kwas foliowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td> Jackson <td>ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Inozytol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td></td></tr><tr><td>LAS-1000 mini</td><td>Folia Fuji</td><td>LAS-1000 mini</td><td>Do wykrywania luminescencji z membrany WB</td></tr><tr><td>Magnetyczne mikrokulki polistyrenowe</td><td>Sperotech</td><td>PM-20-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM roztwór aminokwasów</td><td>Gibco</td><td>11130-051</td><td>30 mM chlorowodorek L-argininy, 5 mM L-cystyna, 10 mM chlorowodorek L-histydyny-H2O, 20 mM L-izoleucyna, 20 mM L-leucyna, 19,8 mM chlorowodorek L-lizyny, 5,1 mM L-metionina, 10 mM L-fenyloalanina, 20 mM L-treonina, 2,5 mM L-tryptofan, 10 mM L-tyrozyna i 20 mM L-walina</td></tr><tr><td>System elektroforezy wielkości mini-płyty</td><td>ATTO</td><td>AE-6530</td><td></td></tr><tr><td>Niacynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny</td><td>Nacali</td><td>28360-14</td><td></td></tr><tr><td>Pirydoksal HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6155</td><td></td></tr><tr><td>Ryboflawina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9504</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain 2 Kit</td><td>wako Wako</td><td>291-5031</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Półsucha komórka transferowa</td><td>Bio-rad</td><td>1703940JA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra czysta woda</td><td>MilliQ</td><td></td><td>Do produkcji ultra czystej wody</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Filopodia dendrytyczne to cienkie i długie wypukłości oparte na włóknie aktyny, które rozciągają się i chowają, jakby szukały docelowego aksonu. Kiedy filopodia dendrytyczne nawiązują kontakt z docelowym aksonem, zaczynają dojrzewać do kolców, co prowadzi do powstania synapsy. Kresomózgowienie (TLCN) jest obficie zlokalizowane w filopodiach dendrytycznych i jest stopniowo wykluczane z kolców. Nadekspresja TLCN w hodowanych neuronach hipokampa indukuje tworzenie filopodiów dendrytycznych. Wykazaliśmy, że kresomózgowienie silnie wiąże się z cząsteczką macierzy zewnątrzkomórkowej, witronektyną. Mikrogranulki pokryte witronektyną indukowały tworzenie miseczek fagocytarnych na dendrytach neuronalnych. W miseczce fagocytarnej gromadzą się białka wiążące TLCN, takie jak fosforylowane Ezrin/Radixin/Moesin (fosfo-ERM) i F-aktyna, co sugeruje, że składniki miseczki fagocytarnej są podobne do tych z filopodiów dendrytycznych. W ten sposób opracowaliśmy metodę oczyszczania kielicha fagocytarnego zamiast filopodiów dendrytycznych. Magnetyczne kulki polistyrenowe pokryto witronektyną, która jest obficie obecna w pożywce hodowlanej neuronów hipokampa i która indukuje tworzenie miseczek fagocytarnych na dendrytach neuronalnych. Po 24 godzinach inkubacji kubki fagocytarne zostały delikatnie rozpuszczone z detergentem i zebrane za pomocą separatora magnetycznego. Po umyciu kulek białka wiążące zostały wymyte i przeanalizowane przez barwienie srebrem i Western blot. We frakcji wiążącej TLCN i aktyna były obficie obecne. Ponadto wiele białek zidentyfikowanych na podstawie frakcji było zlokalizowanych w filopodiach dendrytycznych; Dlatego nazwaliśmy frakcję wiążącą frakcją bogatą w filopodia dendrytyczne. W artykule opisano szczegóły dotyczące metody oczyszczania frakcji bogatej w filopodia dendrytyczne.

W hodowlach neuronów hipokampa TLCN występował obficie w filopodiach dendrytycznych, trzonie oraz somie i kolokalizował się z F-aktyną (Rysunek 1A, B). Po dodaniu polistyrenowych mikrokulek do hodowlanych neuronów hipokampa, kulki zostały automatycznie pokryte witronektyną (VN) pochodzącą z płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zawartej w medium hodowlanym; wiązały się one głównie z dendrytami i indukowały tworzenie się pucharów fagocytarnych (<st...

W tym protokole wprowadzamy metodę oczyszczania bogatej w filopodia frakcji dendrytycznej z fagocytarnej struktury wypukłości przypominającej miseczkę na hodowanych neuronach hipokampa, wykorzystując specyficzne i silne powinowactwo między cząsteczką adhezyjną filopodialną, TLCN, a cząsteczką macierzy zewnątrzkomórkowej, witronektyną.

Oczyszczanie frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

W porównaniu z frakcją PSD możliwe jest zidentyfikowanie białka synaptycznego działającego na niedojrzałą synapsę wokół frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia. Użyliśmy żywego neuronu do indukowania tworzenia czapeczki fagocytarnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że aktywne białko w sztucznej genezie można zidentyfikować na podstawie frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia.Na początek przygotuj 200x Vitamin Mix, rozpuszczając 100 mg witaminy B5, 100 mg chlorku choliny, 100 mg kwasu foliowego, 180 mg I-inozytolu, 100 mg witaminy B3, 100 mg chlorowodorku witaminy B6 i 100 mg chlorowodorku tiaminy w 500 ml ultraczystej wody za pomocą mieszadła magnetycznego. Ostrożnie wymieszać porcję w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować roztwór ryboflawiny, rozpuść 100 mg ryboflawiny w 500 mg ultraczystej wody za pomocą mieszadła magnetycznego.Ostrożnie wymieszać porcję w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować jeden molowy dichlorek wapnia, rozpuść 7,35 grama dwuwodnego chlorku wapnia w 50 ml ultraczystej wody za pomocą mieszadła magnetycznego. Do przygotowania minimalnej po

purification-of-the-dendritic-filopodia-rich-fraction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji i oczyszczania neuronów obwodowych Drosophila z wykorzystaniem strategii szybkiego sortowania komórek wspomaganego magnetycznymi kulkami. RNA uzyskane z wyizolowanych komórek może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach, w tym w badaniach mikromacierzy.

Izolacja i oczyszczanie neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania magnetycznego z użyciem kulek

Opisano generowanie, oczyszczanie oraz inwazję komórkową wewnątrzkomórkowych, cytoplazmatycznych aggresomów pełnowymiarowego białka DISC1 z kultur komórkowych, a także znakowanego, multimerycznego rekombinowanego fragmentu białka DISC1 w E. coli. Inwazyjność komórkową wykazano dla komórek biorców w kulturze komórkowej oraz dla neuronów in vivo po stereotaktycznej inokulacji mózgu.

Generowanie, oczyszczanie i charakterystyka inwazyjnych komórkowo form białka DISC1

Heterologiczna ekspresja i oczyszczanie transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) są znaczącymi wyzwaniami i czynnikami ograniczającymi rozwój terapii lekowych mukowiscydozy. Protokół ten opisuje dwie metody izolacji miligramowych ilości CFTR odpowiednie do badań funkcjonalnych i strukturalnych.

Oczyszczanie białka transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy ulegającego ekspresji w Saccharomyces cerevisiae

Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Tutaj prezentujemy protokół dysocjacji komórek do efektywnego izolowania komórek obecnych w niskiej obfitości w systemie wzrokowym Drosophila poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS).

Oczyszczanie komórek o niskiej liczebności w układzie wzrokowym Drosophila

Ten protokół frakcjonowania pozwoli badaczom wyizolować białka cytoplazmatyczne, jądrowe, mitochondrialne i błonowe z komórek ssaków. Dwie ostatnie frakcje subkomórkowe są dalej oczyszczane za pomocą gradientu gęstości izopikenowej.

Frakcjonowanie komórek U937 przez izopiknowe oczyszczanie w gradimencie gęstości

Na podstawie mechanizmu składania kompleksu białkowego INAD, w tym protokole, zmodyfikowano strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji w celu oczyszczenia endogennego kanału TRP Drosophila.

Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila

Rekonstrukcja in vitro białek cytoszkieletu jest kluczowym narzędziem do zrozumienia podstawowych właściwości funkcjonalnych tych białek. W niniejszej pracy opisano protokół oczyszczania i oceny jakości rekombinowanych kompleksów septynowych, które odgrywają kluczową rolę w podziale i migracji komórek.

Oczyszczanie i kontrola jakości rekombinowanych kompleksów septynowych do rekonstytucji bezkomórkowej

Poznaj metodę oczyszczania frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia z hodowanych neuronów hipokampalnych. Technika wykorzystuje wiązanie TLCN z vitronektyną do izolacji struktur kluczowych dla rozwoju synaptycznego i plastyczności neuronowej.

Oczyszczanie frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia

Przeglądaj więcej filmów