Name: Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę hodowli napromieniowanych organoidów gruczołów sutkowych myszy do badania rekrutacji komórek nowotworowych. Technika ta pozwala analizować interakcje z komórkami odpornościowymi i mechanizmy nawrotu raka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Laurze L. Bronsart za dostarczenie makrofagów RAW 264.7 znakowanych GFP i dTomato. Badania te były wspierane finansowo przez #R00CA201304 grantu NIH.

Badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi oraz protokołami zatwierdzonymi przez Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Przygotowanie myszy i pozyskanie komórek (na podstawie Nguyen-Ngoc i wsp.11)
<ol>
	<li>Uśmierć myszy atymiczne Nu/Nu (w wieku 8-10 tygodni) poprzez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie kręgów szyjnych. Oczyść skórę za pomocą 70% etanolu.</li>
	<li>Wycinaj gruczoły mlekowe brzuszne i pachwinowe z myszy, używając wysterylizowanych wcześniej nożyczek i pęsety. Usuń węzły chłonne przed resekcją. Przepłucz w sterylnym 1x roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (Rycina 1A).</li>
	<li>Umieść tkankę w probówkach 15 mL z 10 mL pożywki DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Media/Nutrient Mixture F12) do transportu. Próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C lub przetworzyć natychmiast. Przechowuj w lodzie.</li>
	<li>Naświetl próbki dawką 20 Gy przy użyciu źródła cezu (Rycina 1B).</li>
	<li>45 min po naświetlaniu umieść gruczoły mlekowe w sterylnej płytce hodowlanej 35 mm i rozdrobnij skalpelami (Rycina 1C,D). Rozdrabniaj, wykonując około 40 cięć, aż tkanka zmięknie, a uzyskane fragmenty nie będą większe niż około 1 mm2 powierzchni.</li>
	<li>Przenieś materiał do roztworu kolagenazy w probówce wirówkowej 50 mL. Roztwór kolagenazy składa się z 2 mg/mL kolagenazy (patrz Tabela materiałów), 2 mg/mL trypsyny, 5% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 μg/mL insuliny oraz 50 μg/mL gentamycyny w pożywce DMEM/F12. Użyj 10 mL roztworu kolagenazy na jedną mysz.</li>
	<li>Umieść w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C, mieszając na wirówce typu vortex co 10 min przez 30-60 min. Trawienie jest zakończone, gdy roztwór kolagenazy stanie się mętny (Rycina 1E,F).</li>
	<li>Odwiruj strawiony roztwór z prędkością 450 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT). Zaobserwowane zostaną trzy warstwy. Nadosad jest złożony z tłuszczu, warstwa środkowa to roztwór wodny, a na spodzie znajduje się osad. Osad będzie miał czerwony kolor, ponieważ jest mieszaniną komórek nabłonkowych, pojedynczych komórek zrębu i erytrocytów (Rycina 1G).</li>
	<li>Przed kontaktem z próbkami pokryj wszystkie pipety, końcówki do pipet i probówki wirówkowe roztworem albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Roztwór BSA składa się z 2,5 w/v % BSA w buforowanym roztworze soli fosforanowej Dulbecco (DPBS). Aby pokryć powierzchnię, po prostu dodaj, a następnie usuń roztwór BSA z wnętrza końcówki pipety i probówek. Roztwór BSA można wykorzystać ponownie, choć przed każdym eksperymentem powinien zostać przefiltrowany sterylnie.</li>
	<li>W celu dodatkowego odzyskania komórek przenieś nadosad do nowej probówki 15 mL pokrytej BSA. Energicznie pipetuj w górę i w dół, aby rozproszyć warstwę tłuszczu. Wiruj z prędkością 450 x g przez 10 min w RT. Odessaj nadosad, pozostawiając w probówce niewielką ilość pożywki, aby uniknąć odessania osadu komórkowego.</li>
	<li>Odessaj warstwę wodną z probówki zawierającej oryginalny osad.</li>
	<li>Dodaj 10 mL DMEM/F12 do probówki z oryginalnym osadem i przenieś zawartość do drugiej probówki. Energicznie pipetuj, aby połączyć i resuspender oba osady.</li>
	<li>Wiruj z prędkością 450 x g przez 10 min w RT. Odessaj nadosad i dodaj do probówki 4 mL DMEM/F12.</li>
	<li>Dodaj 40 μL doksyrybonukleazy (DNase) do zawiesiny i delikatnie wstrząsaj ręcznie przez 2-5 min w RT. Roztwór DNase składa się z 4 U/mL DNase w DMEM/F12.</li>
	<li>Dodaj 6 mL DMEM/F12 i dokładnie wymieszaj pipetą. Wiruj probówkę z prędkością 450 x g przez 10 min w RT.</li>
	<li>Odessaj nadosad do poziomu 0,5 mL. Resuspender w 10 mL DMEM/F12 i dokładnie wymieszaj pipetą.</li>
	<li>Przyspiesz wirowanie do 450 x g i zatrzymaj 4 s po osiągnięciu tej prędkości.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.16-1.17 jeszcze trzy razy, aby oczyścić organoidy poprzez różnicowanie odwirowywanie. Osad powinien mieć teraz kolor złamanej bieli i składać się wyłącznie z organoidów nabłonkowych (Rycina 1H). 
	UWAGA: Organoidy można również filtrować za pomocą sterylnych filtrów siatkowych 40 μm. Po kroku 1.16 przepuść pipetą pożywkę zawierającą organoidy przez filtr do probówki wirówkowej, a następnie przepłucz 5 do 10 mL pożywki DMEM/F12. Odwróć filtr nad nową probówką wirówkową 50 mL. Przepuść 10 mL pożywki DMEM/F12 w przeciwnym kierunku, aby wypłukać retentat. Retentat powinien składać się z organoidów, a filtrat głównie z komórek zrębu, które można odrzucić lub zachować, jeśli jest to pożądane.</li>
</ol>
2. Oznaczanie gęstości i wysiewanie organoidów
<ol>
	<li>Resuspend pellet w 10 mL DMEM/F12. Pipetuj dokładnie, aby uzyskać jednorodny roztwór.</li>
	<li>Przenieś 50 µL do szalki Petriego o średnicy 30 mm i obejrzyj pod mikroskopem fazokontrastowym przy powiększeniu 20x. Policz liczbę organoidów za pomocą licznika mechanicznego. 
	UWAGA: W tym etapie konsekwentnie używano końcówek do pipet o minimalnej średnicy 457 μm, co stanowi 5-10 razy średnicę wysiewanych organoidów. Do przenoszenia objętości 2 mL lub większych (np. kroki 1.16 i 2.1) należy używać pipet serologicznych o średnicy końcówki powyżej 1 500 μm.</li>
	<li>Oblicz gęstość organoidów, korzystając z następującego równania: 
	<img alt="Równanie służące do obliczenia stężenia organoidów w probówce, przedstawione w formie diagramu stosunku formuł." src="/files/ftp_upload/59293/59293eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie"> 
	Pożądana gęstość to 1 000 organoidów/mL, aby uprościć dalsze rozcieńczanie. Jeśli gęstość jest zbyt niska, wiruj przy 450 x g przez 5 min i odessaj medium. Dodaj ilość medium niezbędną do osiągnięcia 1 000 organoidów/mL i pipetuj dokładnie, aby uzyskać jednorodną mieszaninę.
	<ol>
		<li>Aby hodować organoidy w macierzy białkowej, wysiej organoidy w stężeniu 1 organoid/μL w kolagenie typu 1 rozcieńczonym do 87% lub w błonie podstawnej wyekstrahowanej z mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm. Podczas pracy z próbkami utrzymuj je w lodzie.</li>
		<li>Aby zamrozić organoidy, przenieś pożądaną objętość do oddzielnej probówki wirówkowej. Wirować przy 450 x g przez 5 min. Odessać medium, a następnie dodać taką samą objętość 90% FBS/10% DMSO. Resuspenduj organoidy, a następnie rozdziel je do krioprobówek. Przenieś do -80 ˚C, a w ciągu tygodnia do ciekłego azotu.</li>
		<li>Aby rozmrozić, ogrzewaj w łaźni wodnej w temperaturze 37 ˚C przez jedną minutę. Wiruj przy 450 x g przez 5 min, a następnie odessać medium do mrożenia. Przepłucz sterylnym DPBS, a następnie ponownie wiruj. Odessać DPBS i dodać medium do organoidów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pipetuj 50 µL (50 organoidów) do każdego dołka płytki niskoprzylepnej (Rysunek 1I).</li>
	<li>Dodaj 150 µL medium do organoidów, aby całkowita objętość robocza wyniosła 200 µL. Medium do organoidów składa się z 1% penicyliny-streptomycyny i 1% insuliny-transferyny-selenu (ITS) w medium DMEM/F12.</li>
	<li>Co 2 dni ostrożnie wymieniaj medium. 
	UWAGA: Płytki niskoprzylepne nie są modyfikowane do hodowli tkanek; w związku z tym komórki mogą zostać łatwo oderwane. Odsysaj medium powoli, przechylając płytkę i wkładając końcówkę pipety przy krawędzi każdego dołka. Pozostaw niewielką ilość medium na dnie dołka. Dodawaj nowe medium powoli, aby uniknąć wywierania niepotrzebnych sił ścinających na organoidy.</li>
</ol>
3. Kokultywacja z makrofagami
<ol>
	<li>Hodować makrofagi RAW 264.7 znakowane GFP lub dTomato w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Wysiać 1 x 104, 5 x 104 lub 1 x 105 komórek/mL do pożywki dla organoidów.</li>
	<li>Wykorzystać obrazowanie fluorescencyjne oraz mikroskopię fazowo-kontrastową żywych komórek do monitorowania infiltracji makrofagów w czasie.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne organoidów
UWAGA: Organoidy można barwić w dołkach o niskiej adhezji lub przenieść na szkiełka z komorą. Aby przenieść organoidy, należy delikatnie pipetować ciecz w górę i w dół, aż organoidy odłączą się od płytek. Następnie przenieść je na szkiełka z komorą i inkubować przez 4-8 h, aby umożliwić adhezję organoidów do powierzchni płytki.
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę do organoidów z dołków poprzez ostrożne odessanie. Utrwalić próbki w 10% neutralnie buforowanej formalinie przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przemyć 3x przez 5 min w 1x PBS. W razie potrzeby utrwalone próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez jeden tydzień do dalszego barwienia.</li>
	<li>Przeprowadzić permeabilizację za pomocą 0,1% 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene glycol przez 5 min. 
	UWAGA: Aby zabarwić F-aktynę, inkubować próbki z faloidyną w rozcieńczeniu 1:1 000 oraz barwnikiem jądrowym bisbenzimidem w stężeniu 1,67 nM w 1% PBS/BSA przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Następnie przejść do kroku 4.8.</li>
	<li>Przemyć 0,5PBS. Próbki można przechowywać w temperaturze 4°C obrazami kopii i obrazami immunofluorescencyjnymi. mechanizmy przyczyniające się do blokady CTC z 5% normalną surowicą kozią w 0,1% PBS/Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (PBST) przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Przemyć 3x przez 5 min w PBS.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem Anti-Cytokeratin 14 w rozcieńczeniu 1:1 000, E-Cadherin w rozcieńczeniu 1:200 lub Tight Junction Protein One w rozcieńczeniu 1:100 w 1% NGS w PBST przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Przemyć 3x przez 5 min w PBST.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem wtórnym Goat Anti-Rabbit w rozcieńczeniu 1:200 w 1% NGS/PBST przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Przykryć folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło.</li>
	<li>Przemyć 3x przez 5 min w PBS. Użyć barwnika jądrowego (patrz Tabela materiałów) do zabarwienia jąder.</li>
	<li>Przemyć 3x przez 5 min w PBS. W przypadku użycia szkiełka z komorą, zamontować z szkiełkiem nakrywnym. Przechowywać owinięte w folię w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
</ol>

<ol><li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association+Surgery%22%5BJournal%5D)">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li>
<li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li>
<li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li>
<li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li>
<li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+of+matrix+metalloproteinases%2C+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).</li>
<li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li>
<li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Morphogenesis%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li>
<li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li>
<li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li>
<li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li>
<li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li>
<li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5%2Bcells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li>
<li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li>
<li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li>
<li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li>
<li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28United+Kingdom%29%22%5BJournal%5D)">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li>
<li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li>
<li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).</li>
<li>Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from:
 <a target="_blank" href="http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract">http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract</a> (1989).</li>
<li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+Adipocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology%2C+Biology%2C+Physics%22%5BJournal%5D)">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li>
<li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+M1%2FM2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li>
<li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Cancer%22%5BJournal%5D)">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole opracowaliśmy metodę powtarzalnego wzrostu i charakterystyki napromieniowanych organoidów sutka (ryc. 1). Dawkę napromieniowania 20 Gy zastosowano w celu odzwierciedlenia wcześniejszych modeli rekrutacji komórek nowotworowych in vivo5. Napromienianie gruczołów sutkowych ex vivo przed powstaniem organoidów pozwoliło na wyizolowanie skutków uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem bez odpowiedniej infiltracji komórek odpornościowych. Opracowanie napromien...

Około 60% pacjentek z potrójnie ujemnym rakiem piersi (TNBC) wybiera terapię oszczędzającą pierś (BCT) jako formę leczenia1. W tej metodzie leczenia guz zawierający część tkanki piersi jest usuwany, a otaczająca normalna tkanka jest wystawiana na działanie promieniowania jonizującego w celu zabicia wszelkich pozostałych komórek nowotworowych. Leczenie zmniejsza nawroty u większości populacji chorych na raka piersi; jednak około 13,5% leczonych pacjentów z TNBC doświadcza nawrotów lokoregionalnych2. Dlatego badanie, w jaki sposób promieniowanie może rekrutować krążące komórki nowotworowe (CTC), doprowadzi do ważnych informacji na temat nawrotu miejscowego3,4.
Poprzednie prace wykazały, że promieniowanie normalnej tkanki zwiększa rekrutację różnych typów komórek5. W przedklinicznych modelach TNBC napromienianie prawidłowych tkanek zwiększyło makrofagi, a następnie rekrutację komórek nowotworowych do normalnych tkanek5. Status immunologiczny wpłynął na rekrutację komórek nowotworowych do miejsc napromieniowanych, przy czym migrację komórek nowotworowych obserwowano u osób z obniżoną odpornością. Rekapitulacja tych interakcji przy użyciu organoidów pochodzących z gruczołów sutkowych pozwoli na obserwację migracji komórek i interakcji komórka-zręb w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii i obrazowania żywych komórek w celu określenia roli uszkodzeń popromiennych w zmianie zachowania komórek nowotworowych.
Organoidy sutkowe myszy pomogły wyjaśnić kluczowe etapy rozwoju gruczołu sutkowego. Organoid sutkowy to wielokomórkowy, trójwymiarowy konstrukt izolowanego nabłonka sutka o wielkości większej niż 50 μm6,7,8,9,10. Korzystając z pierwotnych organoidów nabłonkowych, Simian i wsp. ocenili czynniki niezbędne do rozgałęzienia gruczołu sutkowego7. Shamir i in. odkryli, że rozprzestrzenianie się może odbywać się bez przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego, co zapewnia wgląd w kaskadę przerzutów8. Metody generowania i charakteryzowania organoidów z tkanki gruczołu sutkowego są dobrze znane6,11,12,13. Jednakże, zgodnie z naszą wiedzą, metody hodowli napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych nie zostały zgłoszone. Protokół hodowli i charakterystyki napromieniowanych organoidów byłby kluczowym krokiem w rekapitulacji indukowanej promieniowaniem rekrutacji komórek immunologicznych i nowotworowych.
W tym artykule opisujemy metodę hodowli i charakteryzowania napromieniowanych organoidów nabłonka sutka w mikropłytkach o niskiej adhezji pokrytych hydrofilowym polimerem, który wspomaga tworzenie sferoid. Organoidy te hodowano wspólnie z makrofagami w celu zbadania kinetyki infiltracji komórek odpornościowych. Prace te można rozszerzyć o współhodowlę organoidów z komórkami tłuszczowymi w celu podsumowania cech sutka, komórek raka piersi w celu wizualizacji rekrutacji komórek nowotworowych oraz limfocytów T CD8 + w celu zbadania interakcji komórek nowotworowych z układem odpornościowym. Do oceny napromieniowanych organoidów można wykorzystać wcześniej ustalone protokoły. Wcześniejsze modele kohodowli organoidów sutka i komórek odpornościowych rzuciły światło na mechanizmy przerzutów i rozprzestrzeniania się. DeNardo i wsp. odkryli, że regulacja limfocytów T CD4 + makrofagów związanych z nowotworem wzmacniała fenotyp przerzutowy gruczolakoraka sutka14. Modele kokultur wykorzystano również do wyjaśnienia mechanizmów rozwoju biologicznego. Plaks i wsp. wyjaśnili rolę limfocytów T CD4 + jako regulatorów w dół organogenezy sutka15. Jednak nasza grupa jest pierwszą, która opracowała procedurę wizualizacji, w jaki sposób normalne napromienianie tkanek wpływa na zachowanie komórek odpornościowych. Ponieważ wykazano, że normalne napromienianie tkanek zwiększa rekrutację komórek nowotworowych5, protokół ten może być dalej rozwijany w celu analizy, w jaki sposób zachowanie komórek nowotworowych jest zmieniane przez napromienianie normalnych tkanek i komórek, co prowadzi do lepszego zrozumienia nawrotu raka.

<table><tbody><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>Anty-cytokeratyna 14</td><td>abcam</td><td>ab181595</td><td>Partia: GR3200524-3</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium Histolyticum, typ VIII</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAzy</td><td></td> Roche <td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td> Fisher <td>14190250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>E-kadheryny</td><td>24E10</td><td>Partia: 13</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik wtórny</td><td>abcam</td><td>ab150077</td><td>zielony Partia: GR3203000-1</td></tr><tr><td>Kozia anty-królik wtórny</td><td>abcam</td><td>ab150080</td><td>czerwony Partia: GR3192711-1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher</td><td>62249</td><td>Partia: TG2611041</td></tr><tr><td>Insulina (10 mg / mL)</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen, 100x</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Membrana podstawna Matrigel (błona podstawna ekstrahowana z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nuclon Sphera 96-dołkowe płytki</td><td>Thermo</td><td>174927</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>10128-856</td><td></td></tr><tr><td>Długopis/paciorkowiec</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Phalloidin</td><td>abcam</td><td>ab176757</td><td>Partia: GR3214582-16</td></tr><tr><td>Białko ścisłego połączenia 1</td><td>Novus</td><td>NBP1-85047</td><td>Partia: C115428</td></tr><tr><td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)glikol fenylopolietylenowy)</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (monolaurynian glikolu polietylenowego)</td><td>Sigma</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoidy pochodzące z trawionej tkanki to wielokomórkowe trójwymiarowe (3D) konstrukty, które lepiej odwzorowują warunki in vivo niż monowarstwy komórek. Chociaż nie są one w stanie w pełni odwzorować złożoności in vivo, zachowują pewną funkcjonalność oryginalnego narządu. W modelach nowotworowych organoidy są powszechnie stosowane do badania inwazji komórek nowotworowych. Protokół ten ma na celu opracowanie i scharakteryzowanie organoidów z prawidłowej i napromieniowanej tkanki gruczołu sutkowego myszy w celu oceny odpowiedzi na promieniowanie w normalnych tkankach. Organoidy te mogą być stosowane w przyszłych badaniach nad rakiem in vitro w celu oceny interakcji komórek nowotworowych z napromieniowanymi organoidami. Gruczoły sutkowe wycięto, napromieniowano do 20 Gy i strawiono w roztworze kolagenazy VIII. Organoidy nabłonkowe oddzielono poprzez różnicowanie odśrodkowe, a organoidy 3D opracowano w 96-dołkowych mikropłytkach o niskiej adhezji. Organoidy wyrażały charakterystyczny marker nabłonkowy cytokeratynę 14. Interakcję makrofagów z organoidami zaobserwowano w eksperymentach z udziałem współkultur. Model ten może być przydatny do badania interakcji guz-zręb, infiltracji komórek odpornościowych i polaryzacji makrofagów w napromieniowanym mikrośrodowisku.

Napromieniowane organoidy nabłonka gruczołów mlekowych zostały pomyślnie uzyskane z gruczołów mlekowych myszy, przetworzone i hodowane na płytkach o niskim stopniu adhezji (Rysunek 1). Wydajność organoidów przetestowano poprzez wysiew w różnych środowiskach wzrostu (Rysunek 2A-G). Bezpośredni wysiew komórek na 10 cm płytki hodowlane traktowane do hodowli tkanek doprowadził do przerostu komórek fibroblastów. Fibroblasty zidentyfikowano pod mikroskopem fazokontrastowym w tej s...

Organoidy powstałe z mysich gruczołów sutkowych zostały napromieniowane i scharakteryzowane w celu oceny cech nabłonka i interakcji z komórkami odpornościowymi. Napromieniowane organoidy można wykorzystać do lepszej oceny interakcji komórka-komórka, które mogą prowadzić do rekrutacji komórek nowotworowych w napromieniowanej normalnej tkance.

Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Protokół ten może być wykorzystywany i dalej rozwijany do analizy, w jaki sposób promieniowanie jonizujące wpływa na rekrutację komórek nowotworowych, prowadząc do lepszego zrozumienia nawrotu raka. Organoidy sutkowe to potężne modele. Naśladują one podstawowe cechy in vivo, ale pozwalają na łatwą izolację zmiennych biologicznych.Zastosowanie płyt o niskiej przyczepności eliminuje wyzwania związane z przepływem pracy związane z matrycami białkowymi. Pacjentki z potrójnie ujemnym rakiem piersi doświadczają miejscowego nawrotu regionalnego częściej po terapii. Badanie, w jaki sposób promieniowanie wpływa na zachowanie guza i komórek odpornościowych, doprowadzi do ważnych informacji na temat mechanizmów nawrotów.Mikroskopię konfokalną organoidów demonstruje Javier Gomez, doktorant w laboratorium Silvera Batista. Rozpocznij tę procedurę od usunięcia gruczołów sutkowych brzusznych i pachwinowych od ofiarowanych myszy, jak opisano w protokole tekstowym. 45 minut po napromienieniu próbek zgodnie z opisem w protokole tekstowym umieścić gruczoły sutkowe w 35-milimetrowej sterylnej płytce komórkowej i zmielić skalpelami.Miel około 40 pociągnięciami, aż tkanka się rozluźni i uzyskasz kawałki o powierzchni nie większej niż około jednego milimetra kwadratowego. Teraz przenieś tkankę do roztworu kolagenazy w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Użyj 10 mililitrów roztworu kolagenazy na mysz.Umieść probówki z próbkami w łaźni wodnej na 30 do 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wirując przez pięć sekund co 10 minut. Trawienie jest zakończone, gdy roztwór kolagenazy jest mętny. Odwiruj strawiony roztwór w temperaturze 450 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Teraz obserwuje się trzy warstwy. Supernatant składa się z tłuszczu, środkowa warstwa to roztwór wodny, a dno to osad. Osadek wydaje się czerwony, ponieważ jest mieszaniną komórek nabłonkowych, pojedynczych komórek zrębu i czerwonych krwinek.Przed kontaktem należy wstępnie pokryć wszystkie pipety, końcówki pipet i probówki wirówkowe roztworem BSA poprzez dodanie i usunięcie roztworu BSA. Roztwór BSA może być ponownie użyty, chociaż powinien być sterylnie przefiltrowany przed każdym eksperymentem. W celu dodatkowego odzysku należy przenieść supernatant do świeżej 15-mililitrowej probówki pokrytej BSA.Energicznie pipetować w górę i w dół, aby rozproszyć warstwę tłuszczu. Odwirować próbkę w temperaturze 450 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, pozostawiając niewielką ilość pożywki w probówce, aby uniknąć zasysania osadu komórkowego.Teraz odessać warstwę wodną z rurki za pomocą oryginalnego granulatu. Dodaj 10 mililitrów DMEM / F12 do probówki z oryginalnym granulem i przenieś do drugiej probówki. Energicznie odpipetować, aby połączyć i ponownie zawiesić dwie granulki.Po odwirowaniu w temperaturze 450 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i dodać cztery mililitry DMEM/F12 do probówki. Dodać 40 mikrolitrów dezoksyrybonukleazy do zawiesiny i delikatnie wstrząsać ręcznie przez dwie do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Dodaj sześć mililitrów DMEM/F12 i dokładnie odpipetować.Po odwirowaniu probówki w temperaturze 450 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant do oznaczenia 0,5 mililitra. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach DMEM/F12 i dokładnie odpipetować. Teraz odwiruj probówkę, pulsując do 450 razy G i zatrzymując się cztery sekundy po osiągnięciu tej prędkości.Powtórz etapy mycia jeszcze trzy razy, aby oczyścić organoidy poprzez różnicowanie odśrodkowe. Osad powinien mieć teraz białawy kolor, składający się tylko z organoidów nabłonkowych. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach DMEM/F12.Dokładnie odpipetować, aby uzyskać jednorodny roztwór. Przenieś 50 mikrolitrów na 30-milimetrową szalkę Petriego i obejrzyj pod mikroskopem z kontrastem fazowym pod kątem 20x. Policz liczbę organoidów za pomocą licznika zliczającego.Odpipetować 50 mikrolitrów organoidów do każdego dołka płytki o niskiej przyczepności. Dodaj 150 mikrolitrów pożywki organoidowej, aby uzyskać całkowitą objętość roboczą do 200 mikrolitrów. Ostrożnie wymieniaj pożywkę co dwa dni.Utrzymuj surowe makrofagi 264,7 znakowane GFP lub pomidorami D w pożywkach DMEM uzupełnionych 10% FPS i 1% penicyliną-streptomycyną. Wysiew komórki w pożywce organoidowej o pożądanej gęstości. Użyj kontrastu fazy żywej komórki i obrazowania fluorescencyjnego, aby monitorować infiltrację makrofagów w czasie.Usuń podłoże organoidowe ze studzienek, ostrożnie zasysając. Utrwal próbki za pomocą 10% neutralnej formaliny przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj utrwalone organoidy trzy razy przez pięć minut w 1X PBS.W razie potrzeby utrwalone próbki można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez tydzień w celu dalszego barwienia. Po umyciu należy przepuszczać utrwalone organoidy przez pięć minut. Zablokuj utrwalone organoidy 5% normalną surowicą kozią w 0,1% PBST przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj trzy razy przez pięć minut PBS.Inkubować utrwalone organoidy z anty-cytokeratyną-14, E-kadheryną lub białkiem o ścisłym połączeniu, w 1% NGS w PBST przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj trzy razy przez pięć minut w PBST. Teraz inkubuj organoidy z kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikom z 1% NGS PBST przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Przykryj folią, aby uniknąć ekspozycji na światło. Po umyciu jak poprzednio, użyj barwnika jądrowego do barwienia jąder przez około pół godziny. Myj poplamione organoidy przez pięć minut w PBS trzy razy.W przypadku korzystania ze szkiełka komorowego należy zamontować za pomocą szkiełka nakrywkowego. Organoidy należy przechowywać zawinięte w folię w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni. Napromieniowane organoidy można było hodować na płytkach o niskiej przyczepności lub w błonie podstawnej, ale najszybszy wzrost nastąpił w płytkach o niskiej przyczepności.Organoidy podsumowały charakterystykę gruczołu sutkowego. Zaobserwowano konstrukty, które są morfologicznie podobne do przewodów i płatów. Tendencje wzrostu wskazują, że gdy organoidy zostały wysiane natychmiast po trawieniu i sortowaniu, nienapromieniowane organoidy rosły szybciej niż napromieniowane organoidy, najprawdopodobniej z powodu zahamowania wzrostu komórek wynikającego z mechanizmów naprawy uszkodzeń DNA.Organoidy wyrażały cechy nabłonka, które oceniano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Napromieniowane organoidy wykazywały ekspresję markerów nabłonkowych. Cytokeratyna-14, marker mioepitelium, ulegała silnej ekspresji na powierzchni napromieniowanych organoidów.Dodatkowo E-kadheryna i białko o ścisłym złączu uległy ekspresji w połączeniach komórkowych organoidów. Białka te są niezbędne do prawidłowej adhezji komórek. Po napromieniowaniu organoidy nadal zachowywały swoje cechy nabłonkowe.Barwienie fluorescencyjne organoidów można uwidocznić na płytkach o niskiej przyczepności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak najwyraźniejszą wizualizację uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Skorygowaną całkowitą intensywność fluorescencji obliczono poprzez odjęcie tła i znormalizowanie przez obszar organoidów.Hodowla organoidów na 96-dołkowych płytkach o niskiej przyczepności również uprościła eksperymenty z kokulturą. Po wysiewie w stężeniach typowych dla gruczołu sutkowego, kolokalizacja makrofagów wzrastała wraz z napromieniowanymi organoidami. Podczas wykonywania tej procedury najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to to, aby nie trawić nadmiernie organoidów i odpowiednio oczyścić różnicowanie odśrodkowe.Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty z kokulturą. Organoidy mogą być hodowane wspólnie z komórkami nowotworowymi, innymi komórkami odpornościowymi i komórkami zrębu w celu odtworzenia napromieniowanego mikrośrodowiska związanego z nawrotem. Metoda ta będzie ważna dla oceny, w jaki sposób normalne uszkodzenie tkanek specyficznie wpływa na dynamikę komórek odpornościowych i ostatecznie zostanie wykorzystana do zrozumienia mechanizmów rekrutacji komórek nowotworowych.Organoidy sutka wyjaśniły mechanizmy rozwoju gruczołu sutkowego i solidnie podsumowały raka piersi in vitro. Mamy nadzieję, że nasz model dostarczy informacji na temat indukowanej promieniowaniem rekrutacji komórek nowotworowych.

growth-characterization-irradiated-organoids-from-mammary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Przedstawiono protokół generowania ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych, które składają się z komórek nabłonkowych i zrębowych oraz zachowują cechy natywnej tkanki endometrium. Protokół ten opisuje metody od pozyskania tkanki macicy do histologicznego przetwarzania organoidów endometrialnych.

Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

Szczegółowy protokół jest tutaj podany do ustalania ludzkich organoidów piersi na podstawie resekcji guza piersi pochodzących od pacjenta lub normalnej tkanki piersi. Protokół zawiera kompleksowe instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli, zamrażania i rozmrażania organoidów piersi pochodzących od ludzkich pacjentów.

Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Tutaj prezentujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem poprzez hodowlę oddzielonych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek czerniaka. Organoidy te wiernie odwzorowują specyficzne dla pacjenta nowotwory in vitro, oferując innowacyjne podejście do badania mechanizmów immunosupresyjnych nowotworów, badań przesiewowych leków, mechanizmów oporności na leki i podejść do nadzoru nad rakiem.

Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Heterogeniczność raka prostaty i oporność na leczenie pozostają wyzwaniami. Opisujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów (PDO), które zachowują kluczowe cechy guza rodzicielskiego. Ten standaryzowany model wspiera badania przesiewowe leków i postępy w medycynie precyzyjnej.

Ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów: szczegółowy protokół eksperymentalny

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Opracowano unikalną metodę inżynierii tkankowej w celu wydłużenia licznych włókien nerwowych w hodowli poprzez odtworzenie wzrostu aksonów indukowanego rozciąganiem; jest to forma wzrostu układu nerwowego, w której nerwy wydłużają się równocześnie ze wzrostem powiększającego się organizmu.

Wzrost aksonów indukowany rozciąganiem: mechanotransdukcja wzrostu neuronalnego

Poznaj metodę hodowli napromieniowanych organoidów gruczołów sutkowych myszy do badania rekrutacji komórek nowotworowych. Technika ta pozwala analizować interakcje z komórkami odpornościowymi i mechanizmy nawrotu raka.

Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych

Przeglądaj więcej filmów