Name: Błona naczyniówkowo-omocznaniowa piskląt w modelu in vivo do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi przy użyciu modelu błony naczyniówkowo-omocznaniowej piskląt. Technika umożliwia badanie interakcji komórek nowotworowych z nerwami in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty NIH/NIDCR DE027551 i DE022567 (NJD).

Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty z użyciem szczurów w tym protokole są przeprowadzane zgodnie z zasadami IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) z naszej instytucji. Eksperymenty z jajami w tym badaniu są zwolnione z regulacji IACUC.
1. Inkubacja jaj (szacowany czas: 5 min, dzień zerowy)
<ol>
	<li>Zdobądź wolne od patogenów zapłodnione komercyjne jaja Lohmann White Leghorn, najlepiej pierwszego dnia po zapłodnieniu. Wysiadywać sześć jaj na grupę doświadczalną w inkubatorze do nawilżania jaj w temperaturze 38 °C i wilgotności 54% przez 8 dni z rotacją godzinną. Stosuj regularną rotację jaj, aby zapobiec przywieraniu zarodka do błon jajowych. 
	UWAGA: Przed inkubacją jaja należy przechowywać w lodówce o temperaturze 18 °C, aby zatrzymać rozwój zarodków na maksymalnie 1 tydzień. </li>
</ol>
2. Zbiór i przygotowanie DRG (szacowany czas: 2 godziny, dzień 8)
UWAGA: Eksperymenty na myszach i szczurach wymagają zgody (IACUC). W niektórych krajach stosowanie jaj kurzych wymaga również zezwolenia.
<ol>
	<li>Zdobądź od sześciu do siedmiu tygodni szczurów Sprague Dawley (~ 200 g wagi), aby wydobyć DRG. 
	UWAGA: Jeden szczur powinien dać ~ 40 DRG szyjki macicy i klatki piersiowej. Mysz DRG również integruje się z CAM, jednak warunki dla tego gatunku muszą być zoptymalizowane niezależnie. </li>
	<li>W komorze z przepływem laminarnym zbierz DRG z okolic szyjki macicy i klatki piersiowej zgodnie z protokołem ekstrakcji DRG myszy opublikowanym w innym miejscu22. Postępuj zgodnie z Rysunek 2, aby dowiedzieć się, jak zbierać DRG.
	<ol>
		<li>Poddaj szczura eutanazji przez nakłucie serca po podaniu ketaminy/ksylazyny wstrzykniętej dootrzewnowo. Oczyść skórę szczura 70% etanolem i usuń kręgosłup szczura za pomocą nożyczek. Nie należy wykonywać zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ mogłoby to spowodować uszkodzenie DRG szyjki macicy. </li>
		<li>Oddziel odcinek szyjny, piersiowy i lędźwiowy tym samym nożycem, postępując zgodnie ze schematyczną reprezentacją anatomiczną i ogólnymi obrazami dostarczonymi w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A-D. Umieść sekcje kręgosłupa w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym z 1x PBS, aby utrzymać mokre tkanki.</li>
		<li>Delikatnymi nożyczkami do kości otwórz kości kręgów w części grzbietowej i brzusznej, oddzielając kręgosłup na dwie boczne połówki (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2E-F). Umieść skrawki tkanek w czystym naczyniu o średnicy 10 cm ze świeżym 1x PBS.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy delikatnie odłącz rdzeń kręgowy od kości kręgów, aby uwidocznić DRG (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G). </li>
		<li>Cienkimi kleszczami trzymanymi pod każdym DRG chwyć go i wyciągnij z jamy kostnej, w której jest osadzony. Nie trzymaj DRG bezpośrednio, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanek. Nie przycinaj wiązek aksonów z DRG (<silna klasa="xfig">Rysunek 2H). 
		UWAGA: Unikaj używania DRG odcinka lędźwiowego, ponieważ mają one ograniczoną integrację z CAM. Aby uzyskać lokalizację regionu DRG, postępuj zgodnie ze schematyczną ilustracją i ogólnymi obrazami anatomicznymi na <silna klasa="xfig">Rysunek 2A-D.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast po zbiorze umieść każdy DRG w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 2% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) i 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu DRG. Zgrupuj wszystkie DRG w tym samym naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm z 4 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Po zebraniu wszystkich DRG przenieś je do nowego naczynia hodowlanego z pożywką hodowlaną DMEM uzupełnioną 2% Pen/Strep plus 10% FBS i zawierającą 1,25 μg/ml czerwonego barwnika fluorescencyjnego. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych. W tym czasie przygotuj jaja do przyjęcia DRG zgodnie z opisem poniżej (krok 3). 
	UWAGA: Odstęp czasu między zbiorem DRG a zakończeniem znakowania fluorescencyjnego powinien być wystarczający do przygotowania jaj; DRG można przechowywać w inkubatorze przez kilka godzin.</li>
</ol>
3. Przygotowanie jaj do szczepienia DRG (szacowany czas: 1 h dla tuzina jaj, dzień 8)
<ol>
	<li>W komorze z przepływem laminarnym przyciemnij światło i prześwietl jaja, aby sprawdzić żywotność i fazę embrionalną. Wyklucz jaja o słabym unaczynieniu, jaja niezapłodnione lub jaja niezgodne z 8 dniem po zapłodnieniu. Delikatnie trzymaj jajko naturalnie występującym workiem powietrznym w kierunku źródła światła (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). </li>
	<li>Ołówkiem zaznacz skorupkę jajka, w której znajdują się otwory (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A-B).
	<ol>
		<li>Po pierwsze, zidentyfikuj przyczepienie rozwijającego się zarodka do CAM jako ciemne ruchome naczynie przyczepione do błony jajowej i zaznacz ten obszar, aby uniknąć interwencji w tym regionie.</li>
		<li>Po drugie, wybierz obszar okna operacyjnego jako dobrze unaczyniony obszar w odległości co najmniej 2 cm od przyczepu zarodka i narysuj okrąg o średnicy 1,5 cm. Około 1 cm od okna operacyjnego narysuj kwadrat o boku 0,5 cm w mniej unaczynionym obszarze.</li>
		<li>Po trzecie, narysuj obszar worka powietrznego, aby wykluczyć go z obszaru operacyjnego. Zaznacz środek worka powietrznego krzyżem. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą narzędzia obrotowego i wiertła do grawerowania o średnicy 3 mm wywierć skorupkę jajka w zaznaczonym kwadracie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Użyj kleszczyków, aby usunąć skorupkę jajka bez usuwania zewnętrznej błony skorupki jajka (biała błona tuż pod skorupką) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). Pracuj ostrożnie, aby uniknąć przypadkowej perforacji tej membrany. </li>
	<li>Używając tego samego wiertła, co w kroku 3.3, wykonaj punktową perforację w zaznaczonym krzyżu w obszarze worka powietrznego, aby umożliwić przepływ powietrza do jajka (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3E). Uważaj, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku na jajko, aby uniknąć jego rozbicia lub uszkodzenia.</li>
	<li>Umieść 30 μl HBSS w kwadratowym otworze, nad nienaruszoną zewnętrzną błoną skorupki jaja (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E). Za pomocą igły strzykawkowej 30 G wykonaj punktową perforację w błonie zewnętrznej w tym kwadratowym obszarze (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3F). </li>
	<li>Umieść jajko w źródle światła, aby uwidocznić worek powietrzny. Dociśnij gumową bańkę zakraplacza i umieść ją w małej perforacji wykonanej w obszarze worka powietrznego (krok 3.4). Zwolnij ciśnienie w bańce, aż zobaczysz separację dwóch membran w obszarze okna operacyjnego (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3G); Powtórz ten krok tyle razy, ile potrzebujesz, aby uzyskać całkowite oddzielenie membran w obszarze okna operacyjnego.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1-3.6 dla wszystkich jaj.</li>
	<li>Używając tego samego wiertła, co w kroku 3.3, wywierć okrągłe okienko operacyjne, uważając, aby nie rozerwać zewnętrznej membrany skorupy jajka (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3H). Oczyść powierzchnię jajka, delikatnie przyklejając taśmę klejącą, aby usunąć wszystkie luźne cząstki. </li>
	<li>kleszczami wyjmij skorupkę jajka z wywierconego obszaru (<silna klasa="xfig">Rysunek 3I-J). Następnie, tymi samymi kleszkami, usuń zewnętrzną membranę skorupki jaja (<silna klasa="xfig">Rysunek 3K), uważając, aby nie wprowadzić małych cząstek skorupki do wnętrza jaja, aby zminimalizować zanieczyszczenie. </li>
	<li>Zidentyfikować CAM w odległości około 1 cm od powierzchni jaja. Przykryj tymczasowo każde otwarte jajko membraną z wosku parafinowego, aby uniknąć zanieczyszczenia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3L).</li>
	<li>Powtórz kroki 3.8-3.10 dla wszystkich jaj. Umieść jaja z powrotem w inkubatorze bez rotacji, aż DRG będą gotowe do szczepienia.</li>
</ol>
4. Szczepienie DRG na CAM (szacowany czas: 40 min, dzień 8)
<ol>
	<li>Przygotuj naczynie hodowlane o średnicy 6 cm z pożywką HBSS, aby umyć DRG przed implantacją. Przynieś przygotowane jaja do komory laminarnej do hodowli komórkowych. Usuń błonę parafinową z jajka (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4A).</li>
	<li>Za pomocą cienkich sterylnych kleszczyków delikatnie chwyć jeden DRG z wnętrza pożywki hodowlanej. Zanurz go w pożywce HBSS, aby usunąć nadmiar podłoża zawierającego barwnik fluorescencyjny. Trzymaj DRG bardzo delikatnie; W przeciwnym razie przyklei się do kleszczy. </li>
	<li>Umieść DRG na CAM, uważając, aby nie przebić membrany (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4B-C). W razie potrzeby użyj innej pary kleszczy, aby pomóc odłączyć DRG od końcówki kleszczy podczas umieszczania go na CAM. 
	UWAGA: Utrzymywanie DRG w stanie mokrym z podłożem HBSS ułatwi również odłączenie się od kleszczy.</li>
	<li>Przykryj jajko sterylnym przezroczystym dressingiem foliowym. Zakryj wszystkie szyby i nakłucia wykonane w skorupce jajka, aby uniknąć skażenia bakteryjnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D).</li>
	<li>Po zaszczepieniu DRG we wszystkich jajach, jaja należy inkubować w inkubatorze nawilżającym w temperaturze 38 °C i wilgotności 54% przez 2 dni, bez rotacji.</li>
</ol>
5. Szczepienie komórek nowotworowych na CAM (szacowany czas: 1 h 30 min, dzień 10)
<ol>
	<li>Po 48 godzinach przed szczepieniem komórek należy umieścić potrzebne komórki na płytkach hodowlanych. Oblicz 0,5 do 1 x 106 komórek na jajo dla komórek UM-SCC-1 w celu wygenerowania trójwymiarowych guzów w CAM. Należy pamiętać, że liczba komórek może się różnić w zależności od linii komórkowej.</li>
	<li>Odessać pożywkę i dodać pożywkę hodowlaną DMEM uzupełnioną 1% Pen/Strep plus 10% FBS i 2,5 μg/ml zielonego barwnika fluorescencyjnego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie sprawdź intensywność fluorescencji pod mikroskopem, odessaj pożywkę, przemyj raz 1x PBS i dodaj 0,25% trypsyny na maksymalnie 10 minut. Zneutralizuj trypsynę za pomocą pożywki uzupełnionej DMEM. </li>
	<li>Wirować przy 250 x g przez 4 minuty, aby uzyskać osad komórkowy. Zassać pożywkę DMEM i ponownie zawiesić w HBSS, aby zmyć nadmiar barwnika fluorescencyjnego. Policz komórki za pomocą hemocytometru. </li>
	<li>Przynieś jaja do komory laminarnej do hodowli komórkowych. Za pomocą nożyczek i kleszczy otwórz przezroczysty opatrunek foliowy, który przykrywa jajko (<silna klasa="xfig">Rysunek 4E-F).</li>
	<li>Ponownie odwirować obliczoną liczbę komórek, odessać pożywkę HBSS i ponownie zawiesić w końcowym stężeniu od 0,5 do 1x106 komórek na 5 μl tej samej pożywki (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 4G). Przygotować ilość potrzebną do całkowitej liczby jaj (5 μl zawiesiny komórek na jajo).</li>
	<li>Umieść 5 μl roztworu komórkowego na CAM, około 2 mm od DRG (<silna klasa="xfig">Rysunek 4H). Zachowaj jednakowe odległości między DRG a komórkami. Bądź bardzo ostrożny, aby nie naruszyć jaja, aby zminimalizować rozprzestrzenianie się komórek. 
	UWAGA: Aby rozpocząć implantację komórek, należy wybrać komórki jajowe, na których powierzchnia CAM jest wizualnie sucha. Jeśli powierzchnia jest zbyt mokra, komórki mogą się rozprzestrzeniać i nie tworzyć regularnych guzów.</li>
	<li>Przykryj jajko nowym dressingiem filmowym, jak w kroku 4.4. Przeszczep komórki we wszystkich jajach. Jaja należy inkubować w inkubatorze nawilżającym w temperaturze 38 °C i wilgotności 54% przez 7 dni, bez rotacji.</li>
</ol>
6. Zbiór CAM (szacowany czas: 1 h dla tuzina jaj, dzień 17)
<ol>
	<li>Przygotuj 6-dołkowe płytki o 4% PFA (paraformaldehyd) pH 7,0, jedno dołek na jajko, 2 ml na dołek.</li>
	<li>Przynieś jaja na stół laboratoryjny. Za pomocą igły dołączonej do strzykawki w celu perforacji opatrunku foliowego, upuść około 300 μl PFA na CAM, aby lekko usztywnić CAM, ułatwiając w ten sposób proces zbioru. Powtórz to dla wszystkich jaj.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek usuń górną połowę skorupki jajka (w miejscu, w którym znajduje się okno operacyjne) z przymocowanym do niej modułem CAM (<silna klasa="xfig">Rysunek 4I). Zmniejsz rozmiar tej połowy do około 3 cm średnicy, pozostawiając część CAM, w której DRG i komórki nowotworowe zostały przeszczepione w środku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4J). Chwyć CAM cienkimi kleszczami i odłącz go od skorupki jajka, umieszczając go w PFA. Ustaw DRG i komórki rakowe skierowane do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 4K-L). 
	UWAGA: Obszar 3 cm powinien obejmować zarówno DRG, jak i komórki. DRG jest łatwo widoczny jako mały guzek przyczepiony do CAM, jednak komórki nowotworowe są czasami trudne do zidentyfikowania podczas ogólnego badania. </li>
	<li>Alternatywnie, za pomocą nożyczek, poszerz okienko operacyjne, usuwając skorupkę jajka z górnej części jajka, jednocześnie utrzymując CAM na miejscu; usuń około 1 cm poza okno operacyjne (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4M) i zidentyfikuj DRG i komórki na CAM (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 4N-O). Za pomocą delikatnych, cienkich kleszczyków przytrzymaj CAM za jedną z krawędzi i delikatnie go podnieś. Ostrymi, delikatnymi nożyczkami delikatnie przetnij CAM, aby usunąć okrągły obszar o średnicy około 3 cm (<silna klasa="xfig">Rysunek 4P) i umieść CAM w PFA z DRG i komórkami rakowymi skierowanymi do góry. 
	UWAGA: Unikaj rozciągania lub trzymania CAM kleszczami w wielu miejscach, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek, które mogą generować artefakty mikroskopowe. </li>
	<li>Umieść każdą membranę CAM w jednym dołku (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4L). Delikatnie chwyć krawędzie CAM, aby rozprowadzić tkankę w PFA lub delikatnie potrząśnij płytką, aż CAM zostanie rozłożony, aby uniknąć artefaktów fałdowania.</li>
	<li>Eutanazja zarodka (dzień 17) poprzez szybkie ścięcie głowy. Zebrane tkanki utrwalić w PFA przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu zastąpić PFA 1x PBS i przechowywać tkanki w PBS w temperaturze 4 °C do momentu zatopienia w parafinie w celu podziału. Unikaj nadmiernej fiksacji, która uszkodzi delikatne naczynia krwionośne CAM. </li>
	<li>Za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego sfotografuj membrany w ciągu 2 dni po zbiorze, aby uniknąć utraty sygnałów fluorescencyjnych.</li>
</ol>

<ol><li>Schmitd, L. B., Scanlon, C. S., D'Silva, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perineural+Invasion+in+Head+and+Neck+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Perineural Invasion in Head and Neck Cancer.</a> Journal of dental research. 97 (7), 742-750 (2018).</li>
<li>Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perineural+invasion+in+cancer%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Perineural invasion in cancer: a review of the literature.</a> Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).</li>
<li>Schmitd, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+Perineural+Invasion%3A+Integration+of+Biology+With+Clinical+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Redefining Perineural Invasion: Integration of Biology With Clinical Outcome.</a> Neoplasia (New York, N.Y). 20 (7), 657-667 (2018).</li>
<li>Chinn, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+perineural+invasion+in+the+pathologically+N0+neck+in+oral+cavity+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology--head+and+neck+surgery+%3A+official+journal+of+American+Academy+of+Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Impact of perineural invasion in the pathologically N0 neck in oral cavity squamous cell carcinoma.</a> Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 149 (6), 893-899 (2013).</li>
<li>Tai, S. K., Li, W. Y., Yang, M. H., Chu, P. Y., Wang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perineural+invasion+in+T1+oral+squamous+cell+carcinoma+indicates+the+need+for+aggressive+elective+neck+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+surgical+pathology%22%5BJournal%5D)">Perineural invasion in T1 oral squamous cell carcinoma indicates the need for aggressive elective neck dissection.</a> The American journal of surgical pathology. 37 (8), 1164-1172 (2013).</li>
<li>Scanlon, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galanin+modulates+the+neural+niche+to+favour+perineural+invasion+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Galanin modulates the neural niche to favour perineural invasion in head and neck cancer.</a> Nature communications. 6, 6885(2015).</li>
<li>Amit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+RET+induces+perineurial+invasion+of+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Upregulation of RET induces perineurial invasion of pancreatic adenocarcinoma.</a> Oncogene. 36 (23), 3232-3239 (2017).</li>
<li>Huyett, P., Gilbert, M., Liu, L., Ferris, R. L., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+for+Perineural+Invasion+in+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (119), (2017).</li>
<li>Ayala, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+dorsal+root+ganglia+and+human+prostate+cell+line+interaction%3A+redefining+perineural+invasion+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer.</a> The Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Histone+Methyltransferase+EZH2+Mediates+Tumor+Progression+on+the+Chick+Chorioallantoic+Membrane+Assay%2C+a+Novel+Model+of+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+oncology%22%5BJournal%5D)">The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma.</a> Translational oncology. 6 (3), 273-281 (2013).</li>
<li>Busch, C., Krochmann, J., Drews, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+as+an+experimental+system+for+melanoma+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The chick embryo as an experimental system for melanoma cell invasion.</a> PloS one. 8 (1), e53970(2013).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+In+Ovo+Chick+Chorioallantoic+Membrane+%28CAM%29+Assay+as+an+Efficient+Xenograft+Model+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (104), (2015).</li>
<li>Ota, I., Li, X. Y., Hu, Y., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+MT1-MMP+and+MT2-MMP-dependent+basement+membrane+transmigration+program+in+cancer+cells+by+Snail1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of a MT1-MMP and MT2-MMP-dependent basement membrane transmigration program in cancer cells by Snail1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20318-20323 (2009).</li>
<li>Murphy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRANSPLANTABILITY+OF+TISSUES+TO+THE+EMBRYO+OF+FOREIGN+SPECIES+%3A+ITS+BEARING+ON+QUESTIONS+OF+TISSUE+SPECIFICITY+AND+TUMOR+IMMUNITY%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">TRANSPLANTABILITY OF TISSUES TO THE EMBRYO OF FOREIGN SPECIES : ITS BEARING ON QUESTIONS OF TISSUE SPECIFICITY AND TUMOR IMMUNITY.</a> The Journal of experimental medicine. 17 (4), 482-493 (1913).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gelatin+sponge-chorioallantoic+membrane+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay.</a> Nature. 1 (1), 85-91 (2006).</li>
<li>Auerbach, R., Arensman, R., Kubai, L., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+angiogenesis%3A+lack+of+inhibition+by+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced angiogenesis: lack of inhibition by irradiation.</a> International journal of cancer. 15 (2), 241-245 (1975).</li>
<li>Banerjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-coupled+receptor+GALR2+promotes+angiogenesis+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">The G protein-coupled receptor GALR2 promotes angiogenesis in head and neck cancer.</a> Molecular cancer therapeutics. 13 (5), 1323-1333 (2014).</li>
<li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+for+quantitative+study+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Experimental model for quantitative study of metastasis.</a> Cancer research. 40 (7), 2300-2309 (1980).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology%2C+medicine+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li>
<li>Moreno-Jimenez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+assay+for+the+study+of+human+bone+regeneration%3A+a+refinement+animal+model+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">The chorioallantoic membrane (CAM) assay for the study of human bone regeneration: a refinement animal model for tissue engineering.</a> Scientific reports. 6, 32168(2016).</li>
<li>Vu, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+chorioallantoic+membrane+assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+nanoparticle-based+anticancer+drugs+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Chick chorioallantoic membrane assay as an in vivo model to study the effect of nanoparticle-based anticancer drugs in ovarian cancer.</a> Scientific reports. 8 (1), 8524(2018).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+research+notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC research notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Cavel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoneurial+macrophages+induce+perineural+invasion+of+pancreatic+cancer+cells+by+secretion+of+GDNF+and+activation+of+RET+tyrosine+kinase+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Endoneurial macrophages induce perineural invasion of pancreatic cancer cells by secretion of GDNF and activation of RET tyrosine kinase receptor.</a> Cancer research. 72 (22), 5733-5743 (2012).</li>
<li>Guo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+sympathetic+nerve+with+pancreatic+cancer+cells+promotes+perineural+invasion+through+the+activation+of+STAT3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Interaction of the sympathetic nerve with pancreatic cancer cells promotes perineural invasion through the activation of STAT3 signaling.</a> Molecular cancer therapeutics. 12 (3), 264-273 (2013).</li>
<li>Deborde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vivo+Murine+Sciatic+Nerve+Model+of+Perineural+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (134), (2018).</li>
<li>Magnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagnon%2C+C+%22Autonomic+nerve+development+contributes+to+prostate+cancer+progression%22">Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression</a>. 341 (6142), Science. New York, N.Y. 1236361(2013).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Zaprezentowany tutaj model in vivo CAM-DRG rozwiązuje problemy poprzednich modeli, demonstrując interakcję nerw-guz przed fizyczną inwazją komórek nowotworowych na nerw. Większość badań in vivo PNI koncentruje się na rozprzestrzenianiu się guza i hamowaniu funkcji motorycznych i zależy od bezpośredniego wstrzyknięcia komórek nowotworowych do nerwów kulszowych 23,24,25. Wstrzyknięcie nerwu kulszowego jest modelem PNI in vivo, w którym komórki rakowe są wstrzykiwane do nerwu kulszowego myszy lub szczura, gdzie guz następnie rośnie. Modele iniekcyjne są przydatne do pokazania destrukcyjnej progresji guza i bólu wynikającego z komórek nowotworowych w nerwach. Model nerwu kulszowego nadaje się również do badania czynników, które umożliwiają komórkom rakowym rozwój w nerwie, ale brakuje mu możliwości oceny wczesnej fazy PNI, ponieważ wprowadza komórki bezpośrednio do nerwu, omijając osłonki nerwowe. W innym podejściu, chirurgicznie wszczepione ortotopowe przeszczepy guza zastosowano w celu scharakteryzowania znaczenia adrenergicznych i cholinergicznych włókien nerwowych w promowaniu progresji raka prostaty, sugerując w ten sposób znaczącą rolę nerwów w progresji guza26. Model ten polegał na chemicznej ablacji mysich nerwów współczulnych i przywspółczulnych. Włókna przywspółczulne infiltrowały tkanki nowotworowe, proces związany z PNI, ale model nie był specjalnie używany do oceny fizycznych interakcji między nerwem a guzem. Model CAM-DRG pozwala na badanie interakcji między nerwem a nowotworem podczas PNI. Co więcej, modele mysie są drogie i czasochłonne w porównaniu z modelem CAM. Sugerujemy wykorzystanie modelu CAM-DRG do badań mechanistycznych PNI.

Niektóre zalety podejścia CAM-DRG obejmują ocenę PNI i innych fenotypów, takich jak wzrost guza, przerzuty i angiogeneza. Identyfikacja ludzkiego DNA na dolnej części CAM i/lub w wątrobie może być wykorzystana do wykrywania przerzutów ludzkich linii komórek nowotworowych10, co jest bardziej czułym podejściem eksperymentalnym w porównaniu z cięciem i barwieniem tkanek, które może nie ujawniać małych przerzutów.

Metoda CAM-DRG ma pewne ograniczenia, w tym krótki czas obserwacji. Układ odpornościowy zarodka jest fizjologicznie aktywny do 1827 dnia, kiedy może dojść do odrzucenia i procesu zapalnego, co ogranicza czas eksperymentu. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę odległość podczas przeszczepiania komórek nowotworowych w pobliżu DRG; większe odległości DRG od raka mogą upośledzać interakcje molekularne między komórkami nowotworowymi a nerwami lub mogą opóźniać fizyczny kontakt między oboma składnikami modelu. Ponadto, jeśli zarodki są starsze niż określono w tym protokole, ruchy zarodków mogą spowodować przemieszczenie komórek nowotworowych. Dlatego ważne jest, aby do szczepienia komórek używać jaj zgodnie z 10 dniem po zapłodnieniu.

Ponieważ układ odpornościowy nie jest w pełni rozwinięty przed 18 dniem,27 dzień, mikrośrodowisko guza w CAM jest podobne do tego, jakie występują w mysich modelach z immunosupresją, często stosowanych w badaniach nad rakiem. Dlatego model ten nie jest przydatny do oceny roli komórek odpornościowych w progresji guza. Kolejnym ograniczeniem jest ograniczona dostępność odczynników dla gatunków kurczaków, takich jak przeciwciała, cytokiny i startery.

Dokładne wykonanie tego protokołu wymaga praktyki; Może to być jednak wykonane przez członka laboratorium bez konieczności korzystania ze specjalistycznego obiektu podstawowego. Wiercenie skorupki jajka wymaga przeszkolenia. Przed pierwszym wypróbowaniem tego modelu zaleca się ćwiczenie na jajach spożywczych (niezapłodnionych). Wysoką przeżywalność zarodkową i sukces modelu można osiągnąć, jeśli przestrzegane są pewne kluczowe kroki w celu uniknięcia infekcji: odpowiednia profilaktyka antybiotykowa DRG w 2% Pen/Strep, praca w komorze z przepływem laminarnym i unikanie dyspersji cząstek skorupki jaja na CAM. Bardzo ważne jest również utrzymanie stabilnej wilgotności podczas całkowitego czasu inkubacji jaj. Zalecamy zwiększanie liczby jaj w grupie, aż do opanowania techniki. Najczęstszymi problemami niedoświadczonego personelu laboratoryjnego są zanieczyszczenie jaj i niedokładna technika szczepienia komórek.

Zbiór DRG wymaga również szkolenia; Zaleca się praktykę w zbieraniu DRG do eksperymentów in vitro8 przed przystąpieniem do modelu in vivo. Hodowla DRG in vitro jest okazją do optymalizacji warunków i poprawy techniki w celu skrócenia czasu trwania ekstrakcji DRG. Szczególną uwagę należy zwrócić na technikę zbioru podczas chwytania DRG za pomocą kleszczy. DRG nie powinno odbywać się bezpośrednio; Pod nim należy zastosować ciśnienie. Zalecamy użycie soczewki powiększającej, aby lepiej uwidocznić DRG podczas ekstrakcji.

Co ważne, wykonując ten model po raz pierwszy, wszystkie warunki powinny być zoptymalizowane pod kątem pożądanej linii komórkowej. Model ten został zoptymalizowany pod kątem DRG szczurów i linii komórkowej HNC UM-SCC-1. Zastosowanie mysiego DRG i innych typów komórek nowotworowych może wymagać optymalizacji. Przy wyższym stężeniu przeszczepionych komórek guzy mają tendencję do gęstszego i sztywniejszego wzrostu, co ułatwia pomiary guza. Biorąc pod uwagę wiele jaj dla każdej grupy i odpowiednią koncentrację komórek dla każdej komórki jajowej, do każdego doświadczenia może być potrzebnych kilka milionów komórek. Aby ułatwić planowanie, należy wziąć pod uwagę wiedzę na temat czasu podwajania ogniw. W przypadku niektórych krytycznych kroków w tym protokole znajduje się tabela rozwiązywania problemów (Tabela 1).

Inwazja okołonerwowa (PNI) jest niedostatecznie zbadanym fenotypem raka, który wiąże się z częstym nawrotem choroby i słabym przeżyciem u pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym głowy i szyi (HNC)1. PNI definiuje się mikroskopowo jako komórki nowotworowe w obrębie nerwów lub wokół nich2,3. Po wykryciu PNI pacjenci prawdopodobnie otrzymają terapie uzupełniające, takie jak planowe rozwarstwienie szyi i/lub radioterapia4,5. Terapie te są jednak agresywne i nie są specyficzne dla PNI. W rzeczywistości nie ma terapii blokującej PNI, przede wszystkim dlatego, że mechanizmy leżące u podstaw interakcji między nerwem a guzem są nadal słabo poznane.
Różne mechanizmy molekularne są związane z przyciąganiem guzów nerwowych; nowotwory i komórki zrębu uwalniają neuropeptydy i czynniki wzrostu, które sprzyjają neuritogenezie6,7. W przypadku hodowli in vitro, komórki HNC i zwoje korzenia grzbietowego (DRG) mają silną odpowiedź; Wpływ na inwazję komórek nowotworowych i neurytogenezę można zaobserwować po kilku dniach w hodowli6,8,9. Brakuje jednak odpowiednich modeli in vivo, które mogłyby podsumować interakcje guz-nerw przed inwazją. Tutaj prezentujemy model PNI in vivo do badania wczesnych interakcji między komórkami HNC a nerwami6. Dostosowaliśmy model błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) pisklęcia, aby uwzględnić komponent nerwowy, szczepiąc DRG w CAM, a następnie przeszczep komórek rakowych, aby naśladować unerwione mikrośrodowisko guza.
Model CAM został z powodzeniem wykorzystany do oceny inwazji komórek przez błonę podstawną, naśladując wczesne inwazyjne stadia raka i czerniaka10,11,12. CAM składa się z górnego nabłonka kosmówkowego, mezenchymy pośredniczącej i dolnego nabłonka omoczniowego. Nabłonek kosmówkowy jest strukturalnie podobny do ludzkiego epithelium10,13 w tym, że błona podstawna bogata w kolagen IV symuluje błonę podstawną, która oddziela nabłonek jamy ustnej od leżącej poniżej tkanki łącznej. Odkąd pierwsze przeszczepy nowotworowe zostały wykonane w CAM w 1913 roku14, opracowano wiele adaptacji metody, aby umożliwić ocenę angiogenezy15,16,17, progresja guza i przerzuty18. Co ważne, technika przeszczepiania guzów do CAM zmieniła się bardzo niewiele, ale zastosowania stale ewoluują. Opublikowano testy o coraz większej złożoności, w tym badania przesiewowe leków19, inżynieria tkanki kostnej20 oraz leki przeciwnowotworowe na bazie nanocząstek21.
Nasze laboratorium korzysta z modelu CAM-DRG, w którym DRG ssaków jest izolowany i szczepiony na powierzchni górnego CAM. Po włączeniu DRG do CAM, komórki HNC są szczepione w pobliżu DRG i mogą wchodzić w interakcje z DRG przed pobraniem i analizą całego systemu in vivo. Co ważne, system umożliwia wizualną obserwację ex-vivo zarówno DRG, jak i guza poprzez znakowanie fluorescencyjne DRG i komórek nowotworowych. Protokół ten składa się z wielu etapów o różnym stopniu złożoności, wykonywanych w ciągu 17 dni, od inkubacji jaj do zbioru CAM (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Komórki wyrażające różne białka będące przedmiotem zainteresowania mogą być testowane w tym modelu w celu wyjaśnienia szlaków molekularnych odpowiedzialnych za inwazję nerwów w raku, a także w celu badania przesiewowego leków bezpośrednio ukierunkowanych na inwazję neuronalną. Komórki wstępnie potraktowane lekiem kandydującym mogą być przeszczepiane na CAM, a występowanie PNI badane w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. W rzeczywistości model CAM został wykorzystany do badań przesiewowych leków jako etap pośredni między badaniami in vitro a przedklinicznymi badaniami in vivo na gryzoniach19. 
Projekt eksperymentalny będzie się różnił w zależności od hipotezy. Na przykład, jeśli testuje się rolę określonego białka na PNI, grupa eksperymentalna obejmowałaby DRG przeszczepiony komórkami nowotworowymi z nadekspresją białka, podczas gdy grupa kontrolna powinna zawierać DRG z komórkami stabilnie transfekowanymi pustym wektorem. W celu odpowiedzi na konkretne pytania można zastosować kilka różnych projektów eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td># 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła ACE</td><td>SCHOTT Ameryka Północna, Inc.</td><td></td><td>Służy do transilluminacji jaj</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA barwnik fluorescencyjny</td><td>Life Technologies</td><td># C7025</td><td>Recreate 50&micro; g w 20 i mikro; L DMSO i zapasy na -20oC. Użyj 1&micro; L roztworu podstawowego/ml pożywki hodowlanej.</td></tr><tr><td>CellTracker Czerwony barwnik fluorescencyjny CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td># C34552</td><td>Rekonstytucja 50&mikro; g w 40 i mikro; L DMSO i zapasy na -20oC. Użyj 1&micro; L roztworu podstawowego/ml pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Akumulatorowe narzędzie rotacyjne</td><td>DREMEL</td><td># 866</td><td>Służy do wiercenia skorupki jaja</td></tr><tr><td>DMEM (1x)</td><td>Gibco</td><td># 11965-092</td><td>Dulbeecco's Modified Eagle Medium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Bioreagenty Fisher</td># <td>BP231-100</td><td>Dimethyl Sulfoxide</td></tr><tr><td>Dumont # 5 drobne kleszcze</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td># 11254-20</td><td>Służy do zbioru DRG</td></tr><tr><td>Inkubator do jaj</td><td>GQF&nbsp; Digital Sportsman</td><td># 1502</td><td>Inkubator jaj wyposażony w automatyczny rotator, cyfrowy termostat, kontrolę temperatury i wilgotności</td></tr><tr><td>Frez do grawerowania</td><td>DREMEL#</td> <td>108</td><td>Służy do wiercenia skorupki jajka</td></tr><tr><td>Bardzo cienkie kleszcze Graefe, zakrzywione</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td># 11151-10</td><td>Służy do szczepienia DRG na CAM w 8 dniu i do pobierania tkanki CAM w 17 dniu</td></tr><tr><td>Bardzo cienkie kleszcze Graefe, straight</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td># 11150-10</td><td>Służy do szczepienia DRG na CAM w 8 dniu i do zbierania tkanki CAM w 17 dniu</td></tr><tr><td>Zapłodnione jaja</td><td></td><td></td> Lohmann White Leghorn <td>Zapłodnione jaja we wczesnych dniach zapłodnienia, najlepiej w pierwszym dniu po zapłodnieniu. Jaja użyte w tym protokole pochodzą z fermy drobiu Uniwersytetu Stanowego Michigan.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kleszczyki filtracyjne</td><td>EMD Millipore</td><td># XX6200006P</td><td>kleszcze używane do usuwania skorupki jajka</td></tr><tr><td>Cienkie chirurgiczne proste, ostre nożyczki</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>#14060-09</td><td>Używane do zbierania tkanki CAM w dniu 17</td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td># 14025-092</td><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka</td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Gibco</td><td># 10082-147</td><td>Inaktywowana termicznie surowica</td></tr> <tr><td>bydlęcaMembrana parafinowa</td><td>Folia laboratoryjna Parafilm</td> <td># PM-996</td><td>Służy do&nbsp; tymczasowego zakrywania otworów jajowych do szczepienia DRG w dniu 8</td></tr><tr><td>PBS (1x) pH 7,4</td><td>Gibco</td> <td># 10010-023</td><td>Buforowany fosforanem długopis soli</td></tr><tr><td>fizjologicznej / paciorkowiec</td><td>Gibco</td> <td># 15140-122</td><td>10 000 jednostek/ml Penicilin, 10 000 &mikro; g / ml Streptomycyna</td></tr><tr><td>PFA (roztwór paraformaldehydu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># P6148-1KG</td><td>Rozcieńczyć w wodzie, aby uzyskać 4% roztwór PFA</td></tr><tr><td>Szczury Sprague Dawley (samice)</td><td>Laboratoria Charles River</td><td>Kod szczepu: 001</td><td>6-7 tygodni (waga 190-210g)</td></tr><tr><td>Opatrunek z przezroczystej folii Tegaderm</td><td>3M</td><td># 9505W</td><td>Sterylny, 6x7cm, używany do zakrywania otworów jaj podczas inkubacji</td></tr></tbody></table>

błona naczyniówkowo-omocznaniowa piskląt w modelu in vivo do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Inwazja okołonerwowa to fenotyp, w którym rak otacza lub atakuje nerwy. Wiąże się to ze złymi wynikami klinicznymi w przypadku raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz innych nowotworów. Badania mechanistyczne wykazały, że przesłuch molekularny między nerwami a komórkami nowotworowymi występuje przed interakcją fizyczną. Istnieje tylko kilka modeli in vivo do badania inwazji okołonerwowej, zwłaszcza w celu zbadania wczesnej progresji, zanim dojdzie do fizycznych interakcji nerw-guz. Model błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia został wykorzystany do badania inwazji raka, ponieważ błona podstawna nabłonka kosmówkowego naśladuje błonę ludzkiej tkanki nabłonkowej. Tutaj zmieniliśmy przeznaczenie modelu błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia, aby zbadać inwazję okołonerwową, przeszczepianie zwojów korzenia grzbietowego szczura oraz komórek raka płaskonabłonkowego głowy i szyi człowieka na nabłonek kosmówki. Wykazaliśmy, w jaki sposób ten model może być przydatny do oceny zdolności komórek rakowych do inwazji tkanki nerwowej in vivo.

Po optymalizacji metoda ta pozwala na niemal 100% integrację DRG z CAM. Reprezentatywne wyniki integracji DRG przedstawiono na Ryc. 5A-B. Integracja DRG z CAM jest istotna, ponieważ zapewnia żywotność tkanki DRG podczas eksperymentu. Mikroskopowo DRG widoczne jest w tkance łącznej CAM (barwienie H&amp;E). Wewnątrz tkanki DRG często obserwuje się naczynia krwionośne, co sugeruje, że unaczynienie CAM odżywia przeszczepioną tkankę. Za pomocą barwienia H&amp;E na CAM identyfikuje się również wszczepione guzy; w zależności od stopnia inwazji, guzy mogą przejawiać od braku do licznych wysp nowotworowych naciekających tkankę łączną (Ryc. 5C-D). Reprezentatywna Ryc. 5E-F przedstawia pobrany CAM w obrazowaniu w polu jasnym oraz w obrazowaniu fluorescencyjnym z nałożonymi kanałami. Komórki UM-SCC-1 z nadekspresją receptora Galaniny 2 wykazywały zwiększoną inwazję DRG w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Ryc. 5G-H). Interakcję między rakiem a DRG obserwuje się jako kierunkową inwazję komórek raka w stronę DRG (Ryc. 5H).
Analizę danych przeprowadza się na różne sposoby. Kierunkową inwazję komórek rakowych w stronę zwoju korzeniowego tylnego (DRG) traktuje się jako zmienną dychotomiczną i zlicza liczbę embrionów wykazujących ten wzorzec inwazji w każdej grupie. Różnice statystyczne między grupami oblicza się za pomocą testu binomialnego dla proporcji. Odległość między komórkami rakowymi a DRG oraz powierzchnię guza mierzy się programem ImageJ6, a różnice między grupami ocenia się za pomocą testu t Studenta. Aby zapewnić dokładność analizy w programie ImageJ, wszystkie zdjęcia z jednego eksperymentu powinny być wykonane przy tych samych ustawieniach światła i ekspozycji. Po dostosowaniu progu obrazu (threshold) i jasności wszystkich zdjęć według tych samych kryteriów, narzędzie „analyze particles” służy do pomiaru powierzchni guza, a narzędzie pomiaru liniowego do wyznaczenia odległości guz-DRG. Ważne jest stosowanie stałych ustawień rozmiaru analizowanych cząsteczek dla wszystkich zdjęć we wszystkich grupach. W niektórych przypadkach guzy rosną w grubość i mogą być mierzone ręcznie za pomocą cyfrowego suwmiarki, co umożliwia pomiar objętości.
Z wykorzystaniem przekrojów tkanki CAM zatopionej w parafinie można przeprowadzić barwienie H&amp;E lub immunohistochemię komórek nabłonkowych (przeciwciało antycytokeratynowe reaktywne dla gatunku ludzkiego), co pozwala na ocenę nacieku do tkanki łącznej. Inwazję ilościowo określa się jako liczbę wysp nowotworowych w tkance łącznej na jedno jajo. Do uwidocznienia błony podstawnej można zastosować immunofluorescencję dla kolagenu IV. Ponadto, w przypadku użycia komórek nowotworowych znakowanych GFP, identyfikacja tych komórek w przekrojach tkankowych jest możliwa bez konieczności wykonywania immunohistochemii na cytokeratynę. Analiza przerzutów i angiogenezy w eksperymentach z wykorzystaniem CAM jest omówiona w innych opracowaniach10,17.
<img alt="Harmonogram badania CAM; inkubacja jaj, przeszczepianie zwojów korzeniowych nerwów rdzeniowych (DRG), przeszczep komórek rakowych, pobieranie tkanek; eksperyment." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59296/59296fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Harmonogram eksperymentu obejmujący główne etapy w dniach 0, 8, 10 i 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59296/59296fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie kręgów myszy wraz z diagramami i obrazami z sekcji przedstawiającymi odcinki szyjny, piersiowy i lędźwiowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59296/59296fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Ekstrakcja zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w 8. dniuASchemat szczura ilustrujący anatomiczne położenie kręgosłupa. BSchemat konfiguracji kręgów szczura przedstawiający różne regiony ciała; zielony dla kręgów szyjnych, ciemnoniebieski dla kręgów piersiowych, pomarańczowy dla kręgów lędźwiowych i jasnoniebieski dla kręgów krzyżowych. C-DWidok brzuszny kręgosłupa szczura po wycięciu chirurgicznym; podział obszarów przedstawiony na B. EDisekcja kręgów w celu otwarcia kanału kręgowego, polegająca na rozdzieleniu trzonów kręgów na dwie sekcje boczne zawierające zwoje korzeni grzbietowych (DRG). Cięcie powinno przechodzić przez grzbietową i brzuszną część każdego kręgu w linii środkowej. FWygląd makroskopowy odsłoniętego odcinka piersiowego kręgosłupa. GPo odsunięciu rdzenia kręgowego zwoje korzeni grzbietowych (DRG) są łatwo widoczne w kanałach kręgowych (groty strzałek wskazują 3 DRG). HObraz stereomikroskopowy jednego zwoju korzenia tylnego (strzałka) z odpowiadającymi mu pęczkami aksonów (grot strzałki). Paski skali: C, D, Fi G, 1 cm; H, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59296/59296fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ocena żywotności zarodków; proces manipulacji komórkami jajowymi; sekwencja edukacyjnych technik laboratoryjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59296/59296fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przygotowanie jaj w 8. dniu. A-B. Identyfikacja naczyń krwionośnych i oznaczeń jaja przed procedurą. Strzałki na A wskaż naturalnie występujący woreczek powietrzny. C-DWiercenie i otwarcie skorupy jaja w miejscu zaznaczonym kwadratowym otworem. Strzałka na D wskazuje na nienaruszoną zewnętrzną błonę skorupową jaja po usunięciu skorupy za pomocą kleszczyków tępych. EZaznaczony krzyżyk na worku powietrznym zostaje przebity wiertłem, aby umożliwić dopływ powietrza do jaja (grot strzałki). 30 µL pożywki HBSS nanosi się na zewnętrzną błonę skorupki jaja w obrębie kwadratowego otworu. FPrzy użyciu cienkiej igły strzykawki należy przebić zewnętrzną błonę skorupki jaja w miejscu, w którym wcześniej umieszczono HBSS. GNaciska się gumową gruszkę pipety podczas mocowania jej do otworu wykonanego w worku powietrznym. Po zwolnieniu nacisku palca powietrze zostaje wyssane, co powoduje wytworzenie sztucznego worka powietrznego (białe strzałki), który powinien rozciągać się do okna operacyjnego. HKrawędzie okna operacyjnego wierci się w pozycji niemal równoległej do skorupy jaja, aby uniknąć przypadkowej perforacji. I-JUsunięcie skorupki jaja za pomocą pęsety tępiej. KUsuń zewnętrzną błonę skorupki jaja za pomocą kleszczyków tępych, uważając, aby nie wprowadzić cząsteczek na błonę pozarębową (CAM) (obserwowaną na głębokości ok. 1 cm pod powierzchnią). LJaja są tymczasowo pokrywane błoną z wosku parafinowego i umieszczane z powrotem w inkubatorze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59296/59296fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat przeszczepu nowotworowego w embrionie kurczaka z etapami pobierania tkanek DRG i CAM w 8., 10. i 17. dniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59296/59296fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Przeszczepianie zwojów korzeniowych nerwów rdzeniowych (DRG), komórek oraz pobieranie błony colonistsycznej (CAM): Dzień 8: ABłonę pozarędkową (CAM) można łatwo zaobserwować po usunięciu membrany z wosku parafinowego. B-CZa pomocą precyzyjnej pęsety zwoje korzeni grzbietowych (DRG) umieszcza się na CAM. DJajo zostaje przykryte opatrunkiem foliowym i umieszczone w inkubatorze; strzałki wskazują przykryte otwory. W dniu 10: E-FOpatrunek foliowy zostaje usunięty, a zlokalizowany zostaje zwoj z korzenia grzbietowego (DRG) (grot strzałki na F). G-H. 5 µL roztwór komórek nanosi się na błonę bielmową (CAM) w odległości ok. 2 mm od zwoju korzeniowego grzbietowego (DRG). W dniu 17.: I-L i M-P zaprezentowano dwa różne podejścia stosowane do pobierania błony alantoiczno-chordalnej (CAM). ISkorupkę jaja otwiera się za pomocą precyzyjnych nożyczek, zaczynając od otworu wykonanego w obrębie komory powietrznej, aż do usunięcia górnej połowy jaja. JSkorupka jaja zawierająca błonę hordeum (CAM) zostaje zmniejszona do rozmiaru około 3 cm. K-LZa pomocą precyzyjnej pęsety błonę Calleriusa (CAM) oddziela się od skorupy jaja i umieszcza w PFA. M-OPowiększenie okna operacyjnego wykonuje się w celu wizualizacji zwojów korzeni grzbietowych (DRG) oraz komórek nowotworowych na błonie pochewkowej alantois (CAM). Grot strzałki wskazuje nowotwór, a strzałka wskazuje DRG. PBłonę jarzamową (CAM) chwyta się precyzyjną pęsetą, wycina ostrymi nożyczkami i umieszcza w PFA, zgodnie z przedstawionym w L. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59296/59296fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Analiza histologiczna, barwione preparaty tkanek, widoki powiększone; porównanie wzrostu guza, wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59296/59296fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki. A. H&amp;Przekrój poprzeczny wykazujący integrację DRG w CAM. BPrzy większym powiększeniu A; strzałki wskazują naczynia krwionośne błony CAM w zwojach korzeni grzbietowych (DRG). CKomórki UM-SCC-1 przeszczepione na błonę chalazalną (CAM) i pobrane cztery dni po przeszczepieniu (H&amp;barwienie E). DPrzy większym powiększeniu C widoczne są naciekające wyspy nowotworowe w tkance łącznej błony chłoniowej (CAM) (strzałki). EMakroskopowy obraz stereomikroskopowy błony błonowo-ciałowej (CAM) z przeszczepionymi komórkami UM-SCC-1-GALR2 oraz zwojem rdzeniowym (DRG) szczura, pobrany w 17. dniu. FPołączone obrazy fluorescencyjne i jasnopolowe z zaznaczonymi na czerwono zwojami korzeni grzbietowych (DRG) oraz na zielono komórkami nowotworowymi. G-HStereomikroskopia fluorescencyjna błony naskórkowo-łożyskowej (CAM) przeszczepionej z zwojem korzeniowym tylnym (DRG) i komórkami UM-SCC-1-GALR2 w porównaniu z komórkami kontrolnymi, ilustrująca kierunkową inwazję komórek UM-SCC-1-GALR2 do DRG (H). Paski skali: A-D, 500 µm; E-H, 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59296/59296fig5v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td colspan="3">Problem</td>
			<td colspan="3">Uzasadnienie</td>
			<td colspan="3">Roztwór</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2.1</td>
			<td colspan="3">Nie można zidentyfikować przytwierdzenia zarodka.</td>
			<td colspan="3">Pozycja przyczepienia jest trudna do zaobserwowania, gdy jajo pozostaje w spoczynku.</td>
			<td colspan="3">Szybko obróć jajo bokiem, aby móc dostrzec długie naczynie przylegające do błony jajowej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.3 &amp; 3.8</td>
			<td colspan="3">Perforacja zewnętrznej błony skorupki jaja podczas wiercenia.</td>
			<td colspan="3">Błędne ustawienie wiertła.</td>
			<td colspan="3">Podczas wiercenia należy ustawić wiertło niemal równolegle do skorupy jaja. Jeśli błona została przebita w kroku 3.3, nie ma potrzeby wykonywania dalszej perforacji igłą, zgodnie z opisem w kroku 3.5. W przypadku wystąpienia krwawienia należy odrzucić jajo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.3</td>
			<td colspan="3">Zwoje DRG przywierają do pęsety.</td>
			<td colspan="3">Zwoje korzeniowe tylne (DRG) są suche.</td>
			<td colspan="3">Ponownie zwilż zwoje korzeniowe tylne (DRG) w roztworze HBSS i/lub użyj cienkiej igły, aby pomóc w odłączeniu DRG od pęsety.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.2</td>
			<td colspan="3">Komórki nie są idealnie znakowane barwnikiem fluorescencyjnym.</td>
			<td colspan="3">Czas inkubacji. Niektóre komórki wymagają dłuższego czasu znakowania.</td>
			<td colspan="3">Pozostawić komórki na dodatkową godzinę w pożywce z barwnikiem fluorescencyjnym.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.6</td>
			<td colspan="3">Pęcherzyk powietrza w kropli z komórkami.</td>
			<td colspan="3">Wykorzystanie całego płynu znajdującego się w końcówce pipety.</td>
			<td colspan="3">Załaduj 1µL więcej niż pożądana objętość i nie należy używać końcowego µL pipety podczas implantacji komórek. Zapobiegnie to powstaniu pęcherzyków powietrza w mieszaninie komórek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.3</td>
			<td colspan="3">Brak możliwości zidentyfikowania zwojów korzeniowych grzbietowych (DRG) lub komórek podczas pobierania błony chalazowej (CAM).</td>
			<td colspan="3">Mały zwoj z korzeni tylnych (DRG), przemieszczenie DRG, rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych.</td>
			<td colspan="3">Jeśli zwoje korzeni grzbietowych (DRG) nie są widoczne, należy pobrać większy obszar błony chalazowej (CAM) i umieścić go w większym naczyniu do utrwalania. Należy sprawdzić położenie DRG oraz komórek w świetle fluorescencyjnym przy użyciu stereomikroskopu, a następnie przyciąć CAM do mniejszego rozmiaru w celu zatopienia w parafinie.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Tabela rozwiązywania problemów

Inwazja okołonerwowa jest agresywnym fenotypem dla raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz innych nowotworów. Model błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia został wykorzystany do badania angiogenezy, inwazji raka i przerzutów. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ten model można wykorzystać do oceny inwazji okołonerwowej in vivo.

Błona naczyniówkowo-omocznaniowa piskląt w modelu in vivo do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous ...

Niniejszy protokół umożliwia badanie in vivo wczesnych interakcji między komórkami nowotworowymi a nerwami oraz badanie szlaków molekularnych inwazji nerwowej w nowotworach. Głównymi zaletami tej techniki są krótki czas eksperymentu oraz możliwość badania inwazji okołonerwowej i innych fenotypów nowotworowych w ramach tego samego doświadczenia. Przed pierwszym zastosowaniem tej techniki zaleca się przećwiczenie wiercenia w komercyjnych jajach niezapłodnionych oraz izolacji zwojów korzeni grzbietowych w celu zoptymalizowania techniki obu procedur.Procedurę zademonstruje Min Liu, naukowiec z mojego laboratorium. Rozpocznij od inkubacji sześciu komercyjnych, wolnych od patogenów zapłodnionych jaj na grupę eksperymentalną w inkubatorze nawilżającym w temperaturze 38 °C i wilgotności 54% w pierwszym dniu po zapłodnieniu przez osiem dni, przy obracańciu jaj co godzinę. Ósmego dnia oczyść skórę grzbietową uśpionego szczura 70% etanolem i za pomocą nożyczek usuń kręgosłup.Oddziel regiony szyjny, piersiowy i lędźwiowy, a następnie umieść sekcje kręgosłupa w 10 cm szalce hodowlanej z PBS, aby zapobiec wysychaniu próbek tkankowych. Za pomocą delikatnych nożyczek do kości otwórz kręgi piersiowe i szyjne od strony grzbietowej i brzusznej, aby podzielić kręgosłup na dwie połowy boczne, a następnie przełóż sekcje tkanki do czystej 10 cm szalki ze świeżym PBS. Używając pincety, delikatnie oddziel rdzeń kręgowy od kręgów, aby uwidocznić zwoje rdzeniowe tylnych korzeni.Umieszczając końcówki precyzyjnej pincety pod każdym zwojem, chwyć tkankę i wyciągnij ją z jam kostnych, w których się znajdują. Natychmiast po pobraniu umieść każdy zwoj w pożywce DMEM uzupełnionej o 2% penicyliny i streptomycyny (Pen-Strep) oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby zapobiec bakteryjnemu zanieczyszczeniu tkanek nerwowych. Po pobraniu wszystkich zwojów przenieś tkanki do nowej naczynia hodowlanego zawierającego świeżą pożywkę DMEM uzupełnioną o 2% Pen-Strep, 10% FBS oraz 1,2 µg/mL czerwonego barwnika fluorescencyjnego w celu jednogodzinnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych.Aby przygotować jaja do przeszczepu zwoju korzeniowego tylnego, przyciemnić światło w komorze z laminarnym przepływem powietrza i, trzymając jajo naturalnie występującym pęcherzykiem powietrznym w stronę źródła światła, poddać każde jajo prześwietleniu w celu sprawdzenia żywotności kurczaka i fazy embrionalnej. Zidentyfikować miejsce przyczepienia rozwijającego się zarodka do błony chorionallantoicznej jako ciemne, ruchome naczynie przytwierdzone do błony jaja i zaznaczyć to miejsce ołówkiem, aby uniknąć interwencji w tym obszarze. Wyznaczyć obszar o szerokości 1,5 centymetra w dobrze unaczynionym miejscu, co najmniej dwa centymetry od miejsca przyczepienia zarodka, który posłuży jako okno operacyjne, oraz narysować kwadrat o boku 0,5 centymetra w obszarze słabiej unaczynionym, około jeden centymetr od okna operacyjnego.Następnie zaznacz środek obszaru komory powietrznej. Dalej, używając narzędzia rotacyjnego i wiertła grawerskiego o średnicy 3 mm, ostrożnie wywierć otwór w skorupie jaja wewnątrz zaznaczonego kwadratu. Za pomocą pęsety tępej usuń fragmenty skorupy, uważając, aby nie usunąć białej zewnętrznej błony skorupowej znajdującej się bezpośrednio pod skorupą.Użyj wiertarki, aby ostrożnie wykonać punktowe nawiercenie w zaznaczonym krzyżyku w obszarze komory powietrznej, umożliwiając przepływ powietrza do wnętrza jaja bez rozbicia lub uszkodzenia skorupy, a następnie dodaj 30 µL HBSS do kwadratowego otworu nad nienaruszoną zewnętrzną błoną skorupową. Używając igły o rozmiarze 30 G, wykonaj punktowe nakłucie zewnętrznej błony w obrębie obszaru kwadratu. Następnie przyłóż jajo do źródła światła, aby zwizualizować komorę powietrzną, i naciśnij gumową gruszkę pipety kroplowej.Umieść gruszkę zakraplacza nad małym otworem w worku powietrznym i zwolnij nacisk na gruszkę, aż do momentu zaobserwowania rozdzielenia błony zewnętrznej i błon chorioallantoicznych w obszarze okna operacyjnego, powtarzając ten krok do czasu uzyskania całkowitego rozdzielenia błon. Po zmodyfikowaniu wszystkich jaj w ten sam sposób, wywierć okrągłe okno operacyjne w jednym z jaj, uważając, aby nie przerwać zewnętrznej błony skorupki, a następnie użyj klejącej strony kawałka taśmy klejącej, aby usunąć wszelkie luźne fragmenty ze skorupy. Za pomocą pęsety tępiej usuń skorupkę z wywierconego obszaru, a następnie zewnętrzną błonę skorupki, dbając o to, aby do wnętrza jaja nie dostały się małe cząstki skorupy w celu zminimalizowania kontaminacji.Po usunięciu skorupki i zewnętrznej błony, zgodnie z pokazaną procedurą, należy przykryć jaja membraną z wosku parafinowego i umieścić je z powrotem w inkubatorze do jaj bez obracania, aż zwoje korzeni grzbietowych będą gotowe do przeszczepienia. W celu przeszczepienia zwoju korzenia grzbietowego na błonę chorioalantoidną, należy użyć cienkich sterylnych pęset, aby ostrożnie uchwycić jeden zwój w naczyniu hodowlanym i delikatnie wypłukać tkankę w pojemniku ze świeżym HBSS. Następnie należy umieścić zwój na błonie chorioalantoidnej jednego jaja, uważając, aby nie przebić błony, a wszystkie otwory w jajach zakryć sterylnymi, przezroczystymi opatrunkami foliowymi.Po przeszczepieniu wszystkich jaj, należy przenieść je z powrotem do inkubatora do jaj z nawilżaczem na dwa dni, nie stosując obracania. Po zakończeniu inkubacji przenieść jaja do komory z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą nożyczek oraz pęsety otworzyć przezroczysty opatrunek z folii. Następnie nanieść od 0,5 do jednego miliona znakowanych fluorescencyjnie komórek nowotworowych w 5 µL HBSS na błonę chorioallantoiczną każdego jaja, około 2 mm od każdego zwoju korzeni grzbietowych, zachowując jednolity odstęp między zwojami a komórkami.Następnie przykryj jaja nową folią opatrunkową i umieść je ponownie w inkubatorze do jaj na siedem dni, bez obracania. Po zakończeniu inkubacji wyjmij jaja na blat laboratoryjny. Za pomocą strzykawki wykonaj perforację folii opatrunkowej każdego jaja i nanieś około 300 µL 4% paraformaldehydu na każdą błonę splotowatą, aby lekko utwardzić tkankę i ułatwić proces pobierania.Za pomocą nożyczek usunąć górną połowę skorupki jaja wraz z przytwierdzoną błoną chorioallantoiczną. Zmniejszyć rozmiar skorupki do średnicy około trzech centymetrów, zachowując fragment błony chorioallantoicznej, w który przeszczepiono zwoje korzeni grzbietowych oraz komórki nowotworowe, w centrum fragmentu skorupki. Następnie uchwycić błonę chorioallantoiczną precyzyjną pęsetą i oddzielić tkankę od skorupki jaja, aby przenieść ją stroną z zwojami korzeni grzbietowych i komórkami nowotworowymi do góry do jednego z dołków płytki 6-dołkowej, zawierającej 2 mL 4% paraformaldehydu w każdym dołku.Integracja zwojów korzeni grzbietowych z błoną chorioallantoiczną jest istotna, ponieważ błona chorioallantoiczna zapewnia odżywienie tkanki zwoju korzeni grzbietowego podczas eksperymentu. Mikroskopowo zwój korzeni grzbietowy obserwuje się w obrębie tkanki łącznej błony chorioallantoicznej, a wewnątrz tkanki zwoju często widoczne są naczynia krwionośne, co sugeruje, że unaczynienie błony chorioallantoicznej odżywia przeszczepioną tkankę. Za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną na błonie chorioallantoicznej identyfikuje się również implantowane guzy.W zależności od stopnia naciekania, guzy mogą nie wykazywać żadnych lub przejawiać liczne wyspy nowotworowe naciekające tkankę łączną. W tym reprezentatywnym eksperymencie obrazowanie z analizą fluorescencji nałożonej wykazało zwiększone naciekanie zwoju korzeniowego tylnego w błonach chorioallantoicznych przeszczepionych komórkami nowotworowymi z nadekspresją receptora galaniny 2 w porównaniu z guzami kontrolnymi. Ten użyteczny i tani model in vivo naciekania okołonerwowego może być powielony nawet przez laboratoria o ograniczonych zasobach.

the-chick-chorioallantoic-membrane-vivo-model-to-assess-perineural

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Błona chorioallantoiczna (CAM) zarodka kurczaka stanowi unikalne, naturalnie immunodeficyjne środowisko hodowlane do badania angiogenezy i tumorigenzy. Niniejszy artykuł wideo prezentuje poszczególne etapy hodowli kurczaka ex ovo, aplikację substancji potencjalnie angiogennych oraz skuteczną inokulację komórek i tkanek nowotworowych na powierzchni CAM.

Hodowla kurcząt ex ovo oraz test CAM ex ovo: jak to naprawdę działa

W tym filmie opisujemy wszczepianie komórek rakowych na błonę kosmówkowo-omoczniową kurczaka w celu wygenerowania modelu in ovo. Model z powodzeniem wszczepia komórki raka jajnika w celu zbadania progresji raka ginekologicznego.

Modelowanie raka błony moczowo-omoczniowej kurczaka: model in ovo do badania nowotworzenia i przerzutów komórek rakowych

Ten film demonstruje procedurę dożylnego wstrzykiwania komórek rakowych do naczyń krwionośnych błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu wygenerowania modelu przerzutów raka CAM. Wstrzyknięte komórki ostatecznie tworzą rozproszone kolonie pojedynczych komórek nowotworowych, co pozwala na badanie inwazji raka i przerzutów.

Dożylne wstrzyknięcie komórek rakowych do naczyń błony moczowo-omoczniowej kurczaka: procedura mająca na celu ustalenie modelu raka błony moczowo-omoczniowej w celu zbadania inwazji raka i przerzutów

W tym filmie opisujemy metodę wspólnego hodowania zwojów korzenia grzbietowego i komórek rakowych na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurcząt lub CAM w celu zbadania inwazji okołonerwowej.

Błona kosmówkowo-omocznaniowa piskląt lub model guza CAM: metoda in ovo do symulacji okołonerwowej inwazji komórek nowotworowych

Ten film pokazuje izolację błony kosmówkowo-omoczniowej zawierającej guz od zarodka kurczaka. Pozyskany CAM może być wykorzystany do dalszych zastosowań.

Zbiór błony chorioallantoicznej piskląt: metoda izolowania błony chorioomocznowej zawierającej przeszczep guza z jaja kurzego

W tym filmie demonstrujemy procedurę tworzenia modelu inwazji komórek raka okołonerwowego in vitro poprzez wspólną hodowlę zwoju korzenia grzbietowego myszy i komórek raka neurotropowego. Model może być wykorzystany do przeprowadzania testów na raka, uzyskując szybkie i powtarzalne wyniki.

Ustanowienie trójwymiarowego modelu kohodowli mysich zwojów korzenia grzbietowego i komórek rakowych: model in vitro do badania inwazji okołonerwowych komórek rakowych

W tym filmie rozwijamy mysi model in vivo do inwazji okołonerwowej poprzez wstrzykiwanie komórek raka trzustki do nerwu kulszowego. Model ten pomaga określić ilościowo zakres inwazji i zbadać interakcje między komórkami rakowymi a nerwami.

Mysi model inwazji okołonerwowej: generowanie modelu in vivo do symulacji inwazji okołonerwowej w nerwie kulszowym myszy

W tym filmie opisujemy procedurę tworzenia mysiego modelu inwazji okołonerwowej poprzez wstrzykiwanie komórek rakowych do nerwu kulszowego. Model może pomóc w zrozumieniu skali inwazji nerwów w celu późniejszej oceny leków przeciwnowotworowych.

Mysi model inwazji nerwu kulszowego lub PNI: ekstrakcja i przetwarzanie nerwu kulszowego w celu zrozumienia inwazji komórek rakowych

Inwazja okołonerwowa (PNI) jest powszechną cechą raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC), powodując niższe wskaźniki przeżycia. Jego mechanizmy są słabo poznane. Wykorzystując neuryty generowane z mysich zwojów korzenia grzbietowego ograniczonych do półstałej matrycy, można badać szlaki zaangażowane w PNI linii komórkowych HNSCC.

Model inwazji okołonerwowej w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

Opisujemy in vivo mysi model inwazji okołonerwowej poprzez wstrzykiwanie syngenicznych komórek raka trzustki do nerwu kulszowego. Model pozwala na ilościowe określenie zakresu inwazji nerwów i wspiera badanie komórkowych i molekularnych mechanizmów inwazji okołonerwowej.

Mysi model nerwu kulszowego in vivo inwazji okołonerwowej

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

Poznaj metodę oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi przy użyciu modelu błony naczyniówkowo-omocznaniowej piskląt. Technika umożliwia badanie interakcji komórek nowotworowych z nerwami in vivo.

Błona naczyniówkowo-omocznaniowa piskląt w modelu in vivo do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi

Przeglądaj więcej filmów