Name: Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Naucz się precyzyjnej metody rozwarstwiania siatkówki poczwarki Drosophila melanogaster w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA. Technika zachowuje integralność tkanki i umożliwia szybką analizę wielu próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Zackowi Drumowi i naszym recenzentom za pomocne komentarze na temat manuskryptu. Prace te były wspierane przez R15GM114729.

1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Ustaw krzyżówki Drosophila (jak opisano wcześniej20) lub szczepy Drosophila specyficzne dla hodowli, aby uzyskać poczwarki o pożądanym genotypie. Aby upewnić się, że duża liczba poczwarek pojawi się przypadkowo, należy założyć te kultury much w dwóch egzemplarzach na bogatych w składniki odżywcze pożywkach spożywczych lub standardowych pożywkach spożywczych obficie uzupełnionych pastą drożdżową.</li>
	<li>Utrzymuj kultury Drosophila w temperaturze 25 °C. W przypadku krzyżówek wykorzystujących system UAS-GAL4, GMR-GAL4 jest idealnym sterownikiem wyrażającym się w komórkach krążka larwalnego oka za bruzdą morfogenetyczną i przez cały okres rozwoju poczwarki21,22,23,24. Krzyżówka UAS-lacZ X GMR-GAL4 służy jako idealna krzyżówka kontrolna, ponieważ napędza ekspresję nieendogennego i obojętnego białka β-galaktozydazy.</li>
	<li>Użyj końcówki 6-calowej bambusowej szyny, która została zwilżona wodą destylowaną, aby delikatnie podnieść białe poczwarki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) z boku zdrowych fiolek hodowlanych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) i umieść w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Umieść probówki w plastikowym pudełku na końcówki do pipet wraz z małym kawałkiem chusteczki nasączonej wodą destylowaną, aby utrzymać komorę w wystarczającej wilgotności, aby chronić poczwarki przed wysuszeniem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D). Inkubować poczwarki w temperaturze 25 °C aż do rozbiorów.</li>
	<li>Użyj suchej 6-calowej szyny bambusowej, aby delikatnie wypchnąć poczwarki z probówki mikrowirówki na czarną miskę sekcyjną. Połóż świeży kawałek taśmy dwustronnej na naczyniu preparacyjnym z dala od poczwarek.</li>
	<li>Używając kleszczy, ostrożnie umieść poczwarki grzbietową stroną do góry (tj. wieczkami skierowanymi do góry, <silna klasa="xfig">Rysunek 1B) na taśmie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Upewnij się, że poczwarki dobrze przylegają do taśmy. 
	UWAGA: Wilgoć na opakowaniu poczwarki utrudni bezpieczne przyleganie do taśmy, w takim przypadku pozwól poczwarkom wyschnąć na powietrzu przed umieszczeniem na taśmie dwustronnej.</li>
</ol>
2. Sekcja kompleksów oko-mózg
<ol>
	<li>Użyj kleszczy, aby usunąć wieczko z każdej poczwarki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby pokroić lub rozciąć skrzynkę poczwarki każdej poczwarki. Otwórz klapę koperty poczwarki, aby odsłonić głowę, klatkę piersiową i przedni segment brzuszny, mocując krawędzie koperty poczwarki do taśmy dwustronnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: Nie jest konieczne całkowite odsłanianie poczwarek.</li>
	<li>Przebij brzuch każdej poczwarki ostrymi kleszczami, aby chwycić zwierzę i wyjmij je z etui poczwarki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Umieścić poczwarki na czarnym naczyniu preparacyjnym, z dala od taśmy, i zalać około 400 μl lodowatego roztworu buforowanego fosforanem (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Chwyć każdą poczwarkę za brzuch kleszczami, a nożyczkami do mikrodysekcji wykonaj czyste cięcie w przekroju poprzecznym przez całą klatkę piersiową, przecinając poczwarkę na pół (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Usunąć tylną resztkę każdej tuszy z PBS i odłożyć na bok na szalce do rozwarstwiania (nie wyrzucać, patrz krok 3.2.1).</li>
	<li>Używając dwóch par cienkich kleszczy, otwórz klatkę piersiową i głowę każdej poczwarki, aby odsłonić kompleks oko-mózg (ryc. 2E). Aby to zrobić, chwyć przecięte krawędzie nabłonka klatki piersiowej i stopniowo rozrywaj, aby otworzyć klatkę piersiową, a następnie torebkę głowy, odsłaniając kompleks oko-mózg i otaczającą tkankę tłuszczową.</li>
	<li>Nie chwytając tkanki, użyj kleszczy, aby skierować kompleks oko-mózg z dala od resztek torebki głowy lub zgarnij kompleks oko-mózg z rozerwanej torebki głowy. 
	UWAGA: Kompleks oko-mózg ma kształt hantli, jest białawy i bardziej przezroczysty niż otaczający go kremowy tłuszcz (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B, E).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń większość tłuszczu związanego z kompleksami oko-mózg bez dotykania tkanki oka.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie tkanek do immunofluorescencji
<ol>
	<li>Rozetnij co najmniej 6-10 poczwarek zgodnie z opisem (kroki 2.1-2.9). 
	UWAGA: Trzy do czterech niezależnych powtórzeń każdej sekcji zwykle dostarczają wystarczających danych do przetestowania hipotezy.</li>
	<li>Mycie i utrwalanie
	<ol>
		<li>Odetnij końcówkę końcówki pipety P20 lub P100 czystą żyletką, aby zwiększyć otwór końcówki do promienia ~1 mm i nasmaruj, pipetując mieszaninę PBS i tłuszczu w górę iw dół. Tłuszcz ten można uzyskać z resztek tuszy usuniętych w kroku 2.6.</li>
		<li>Przenieś kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBS w 9-dołkowym szklanym naczyniu na lodzie. Do przenoszenia użyj nasmarowanej końcówki i mikropipety wyporowej P20 lub P100 do przenoszenia. 
		UWAGA: Kompleksy oko-mózg przylegają do niesmarowanych końcówek podczas pipetowania i ulegają uszkodzeniu lub utracie.</li>
		<li>Usuń pozostały tłuszcz związany z tkanką oka, pipetując PBS w górę iw dół, aby delikatnie zawirować kompleksy oko-mózg. W tym i wszystkich kolejnych etapach mycia nie należy bezpośrednio pipetować kompleksów oko-mózg w górę i w dół, ponieważ spowoduje to uszkodzenie delikatnej tkanki oka.</li>
		<li>Przenieść kompleksy oko-mózg w minimalnej objętości (<20 μl) PBS do co najmniej 250 μl utrwalacza. Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Inkubować przez 35 minut na lodzie. 
		UWAGA: Do tego transferu można użyć tej samej nasmarowanej końcówki przygotowanej w kroku 3.1.1.</li>
		<li> Za pomocą tej samej końcówki pipety przenieś kompleksy oko-mózg do studzienki zawierającej ~400 μL PBS. Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół, a następnie inkubować przez 5-10 minut na lodzie do umycia. Powtórz krok prania co najmniej dwa razy. 
		UWAGA: Kompleksy oko-mózg można utrzymywać przez kilka godzin w końcowym płukaniu PBS, na lodzie lub w temperaturze 4 °C, przed przejściem do kroku 3.3.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie przeciwciał
	<ol>
		<li>Aby zablokować tkankę przed ekspozycją na roztwory przeciwciał, przenieś kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBT. Do transferu należy użyć nasmarowanej końcówki i mikropipety wyporowej P20 lub P100. Inkubować przez 10 do 60 minut na lodzie.</li>
		<li>Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając odpowiednie przeciwciała w PBT. Ponieważ kompleksy oko-mózg inkubuje się w 10 μl podwielokrotności roztworu przeciwciała, przygotowana objętość będzie powtórzeniem 10.</li>
		<li>Porcję 10 μl roztworu przeciwciał do czystej studzienki z 72-dołkową tacą mikrodołkową (patrz dyskusja).</li>
		<li>Odetnij końcówkę końcówki pipety P10 czystą żyletką, aby zwiększyć otwór końcówki do promienia ~0,5 mm i nasmaruj, pipetując PBT w górę iw dół.</li>
		<li>Przenieść nie więcej niż 5 kompleksów oko-mózg w objętości <3 μl PBS do każdego 10 μl roztworu przeciwciała za pomocą mikropipety P10 wyporowej powietrza i nasmarowanej końcówki.</li>
		<li>Homogenizować roztwór przeciwciała, pipetując roztwór w górę iw dół. Nie pipetuj kompleksów oko-mózg w górę i w dół, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanki.</li>
		<li>Aby zminimalizować parowanie roztworu przeciwciała, umieść mały kawałek tkanki nasączonej wodą destylowaną w tacce mikrostudzienki i zamknij tackę (np. za pomocą dostarczonej pokrywki). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li> Przenieś kompleksy oko-mózg z tacki mikrostudzienki do ~400 μl PBT w szklanym naczyniu z 9 dołkami, w celu umycia. Użyj mikropipety P10 z wyporem powietrza i końcówki smarowanej PBT (przygotuj zgodnie z opisem w kroku 3.3.4). Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Inkubować przez 5-10 minut na lodzie.</li>
		<li>Powtórz etap prania co najmniej dwa razy. Użyj mikropipety P20 lub P100 z wyporem powietrza i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg między roztworami myjącymi.</li>
		<li>Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając odpowiednie przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem w PBT, zgodnie z wymaganiami. 100 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego jest wystarczające na partię 6-10 poczwarek. Podwielokrotność roztworu przeciwciał drugorzędowych umieścić w 9-dołkowym szklanym naczyniu preparacyjnym.</li>
		<li>Przenieś kompleksy oko-mózg do wtórnego roztworu przeciwciał. Do transferu należy użyć mikropipety wyporowej P20 lub P100 i końcówki smarowanej PBT.</li>
		<li>Kompleksy oko-mózg należy inkubować w wtórnym roztworze przeciwciał przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub 3-5 godzin w temperaturze 4 °C. Aby zapobiec bieleniu fluoroforów światłem, należy przykryć preparat folią. 
		UWAGA: Optymalny czas inkubacji w roztworze przeciwciał drugorzędowych może się różnić w zależności od zastosowanych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.</li>
		<li>Przenieś kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBT w 9-dołkowym szklanym naczyniu, aby umyć. Mieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Inkubować przez 5-10 minut na lodzie. Ten etap prania należy powtórzyć co najmniej dwa razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wtórna fiksacja
	<ol>
		<li>W celu wtórnego utrwalenia przenieść kompleksy oko-mózg do co najmniej 200 μl utrwalacza i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub 35 minut w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Wtórne mocowanie usztywnia tkankę oka, co ułatwia montaż (krok 3.5).</li>
		<li>Użyj mikropipety wyporowej P20 lub P100 i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBT w 9-dołkowym szklanym naczyniu, na lodzie, do mycia przez 5 minut.</li>
		<li>Powtórz krok prania co najmniej raz.</li>
		<li>Użyj mikropipety P20 lub P100 z wyporem powietrza i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg do ~400 μl PBS w 9-dołkowym szklanym naczyniu, na lodzie, do płukania przez 1-2 minuty. Utrzymuj tkankę w ruchu, pipetując PBS, ale nie tkankę, w górę iw dół, aby zapobiec osadzaniu się kompleksów oko-mózg i przyleganiu do szklanego naczynia podczas płukania PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montażu
	<ol>
		<li>Przenieś kompleksy oko-mózg do ~200 μL podłoża montażowego. Użyj mikropipety wyporowej P20 lub P100 i końcówki smarowanej PBT, aby przenieść kompleksy oko-mózg. Pozwól chusteczce zrównoważyć się w podłożu montażowym przez 1-2 godziny.</li>
		<li>Umieść kroplę 5-8 μl świeżego podłoża montażowego na czystym szkiełku mikroskopowym.</li>
		<li>Wytnij końcówkę P10 czystą żyletką, aby zwiększyć otwór końcówki do promienia ~0,5 mm i użyj jej oraz mikropipety P10 z wyporem powietrza, aby przenieść kompleksy oko-mózg w 5-8 μl podłoża montażowego do kropli podłoża montażowego na szkiełku.</li>
		<li>Użyj dwóch igieł wolframowych, aby oddzielić oczy od płatów wzrokowych. Przypnij kompleks oko-mózg do szkiełka za pomocą solidnej wolframowej igły i odetnij każde oko od powiązanego z nim płata wzrokowego za pomocą cienkiej wolframowej igły (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2F).</li>
		<li>Za pomocą cienkiej igły wolframowej należy przesunąć każde oko do powierzchni szkiełka mikroskopowego tak, aby podstawowa powierzchnia każdego oka przylegała do szkiełka. Delikatnie opuść czysty szkiełko nakrywkowe na chusteczkę i zabezpiecz lakierem do paznokci. 
		UWAGA: Ułożenie oczu na szkiełku tak, aby znajdowały się blisko siebie lub w linii, ułatwi późniejszą mikroskopię.</li>
		<li>Zobrazuj siatkówki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. 
		UWAGA: Slajdy należy przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną natychmiast zobrazowane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie tkanki oka do Western Blotting:
<ol>
	<li> Rozbior 10-16 poczwarek (kroki 2.1-2.9) z następującymi modyfikacjami: a) zbierz i rozdziel poczwarki w dwóch partiach w odstępie 10-15 minut oraz b) rozsiej w PBS uzupełnionym inhibitorami proteazy i fosfatazy (PBS+pi).</li>
	<li>Przenieść kompleksy oko-mózg za pomocą mikropipety P20 lub P100 z wypornością powietrza i nasmarowanej końcówki (przygotowanej jak w kroku 3.2.1) do ~400 μl PBS+pi w 9-dołkowym szklanym naczyniu, na lodzie, w celu krótkiego spłukania. 
	UWAGA: Ta nasmarowana końcówka może być używana do kolejnych kroków 4.3 i 4.4.</li>
	<li>Powtórz etap płukania dwukrotnie.</li>
	<li>Przenieś wszystkie kompleksy oko-mózg do ~400 μL lodowatego PBS+pi zdekantowanego na czyste czarne naczynie preparacyjne.</li>
	<li>Usuń każde oko z płatów wzrokowych za pomocą solidnej igły wolframowej (aby ustabilizować kompleks oko-mózg) i cienkiej żyletki lub nożyczek do mikrodysekcji, aby dokładnie odciąć każde oko od płata wzrokowego. 
	UWAGA: Na tym etapie oczy są "lepkie" i mogą lekko przylegać do naczynia preparacyjnego. Jest to korzystne, ponieważ może ułatwić usunięcie oczu z płatów wzrokowych (patrz dyskusja).</li>
	<li>"Zamiataj" wszystkie oczy w "stosie" w PBS+pi na naczyniu preparacyjnym, używając jednego ostrza cienkiej pary kleszczy.</li>
	<li>Wytnij końcówkę P10 czystą żyletką, aby poszerzyć otwór końcówki do promienia ~0,5 mm i nasmaruj wnętrze końcówki, pipetując Western Tissue Lysis Buffer (WTLB) w górę iw dół.</li>
	<li>Przenieś kompleksy oko-mózg w 5 μl PBS+pi do probówki mikrowirówkowej o pojemności 500 μl. Użyj tej nasmarowanej końcówki i mikropipety P10 z wyporem powietrza, aby zakończyć przenoszenie.</li>
	<li>Umieść probówkę do mikrowirówki na lodzie. Dodać 1 objętość (5 μl) WTLB do próbki i 10 μl 2x skoncentrowanego buforu próbki białka (lub 2,5 μl 5x zagęszczonego buforu próbki białka). Wymieszaj, stukając.</li>
	<li>Krótko przemieszać probówkę mikrowirówki i odwirować próbkę za pomocą miniwirówki biurkowej.</li>
	<li>Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C do czasu analizy. Analizuj przy użyciu standardowych protokołów.</li>
</ol>
5. Przygotowanie tkanki oka do ekstrakcji RNA:
<ol>
	<li>Noszenie rękawiczek, czystego blatu, mikroskopu, narzędzi do preparacji i czarnego naczynia preparacyjnego najpierw z 70% etanolem, a następnie odczynnikiem do odkażania RNazy. Pozostawić do wyschnięcia.</li>
	<li>Rozbioruj 30-40 poczwarek zgodnie z opisem (kroki 2.1-2.9) z następującymi modyfikacjami: a) zbierz i rozdziel od 6 do 8 poczwarek w partiach w odstępie 15-20 minut; b) przeprowadzić sekcję w PBS wolnym od nukleaz i c) wyizolować każdą partię oczu osobno, ale zgromadzić całą tkankę siatkówki w tej samej probówce do mikrowirówki (krok 5.5). 
	UWAGA: Jednoczesna sekcja zwłok przez dwie osoby przyspieszy skuteczną izolację dobrej tkanki oka.</li>
	<li>Dla każdej partii wyizoluj kompleksy oko-mózg (kroki 2.1-2.9) i przenieś do ~400 μl PBS wolnego od nukleaz w 9-dołkowym szklanym naczyniu, aby krótko spłukać na lodzie za pomocą mikropipety P20 lub P100 z wyporem powietrza i nasmarowanej końcówki (przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 3.1.2). 
	UWAGA: Ta nasmarowana końcówka może być używana do kolejnych kroków 5.4, 5.5 i 5.8.</li>
	<li>Powtórz etap płukania dwukrotnie.</li>
	<li>Przenieś kompleksy oko-mózg do świeżej kropli 400 μl lodowatego PBS wolnego od nukleaz na czystym czarnym naczyniu preparacyjnym.</li>
	<li>Usuń każde oko z płatków wzrokowych za pomocą mocnej igły wolframowej (aby ustabilizować kompleks oka i mózgu) oraz cienkiej żyletki lub nożyczek do mikrodysekcji, aby dokładnie odciąć każde oko od płata wzrokowego. 
	UWAGA: Na tym etapie oczy są "lepkie" i mogą lekko przylegać do naczynia preparacyjnego. Jest to korzystne, ponieważ może ułatwić usunięcie oczu z płatów wzrokowych (patrz Dyskusja).</li>
	<li>"Zamiataj" wszystkie oczy w "stosie" w wolnym od nukleaz PBS na naczyniu preparacyjnym, używając jednego ostrza cienkiej pary kleszczy.</li>
	<li>Przenieś oczy do sterylnej probówki mikrowirówkowej wolnej od RNaz i błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie.</li>
	<li>Powtórzyć sekcję (kroki 5.3-5.8) każdej partii poczwarek. Przenieść każdą partię oczu do tej samej probówki do mikrowirówki, która była utrzymywana w ciekłym azocie (krok 5.5), aby zgromadzić wszystkie oczy w jednej probówce.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).</li>
<li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).</li>
<li>Hayashi, T., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+mechanics+mediate+pattern+formation+in+the+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina.</a> Nature. 431, 647(2004).</li>
<li>Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Adhesion+Mediated+by+Hibris+and+Roughest+Regulates+Morphogenesis+and+Patterning+in+the+Drosophila+Eye%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye.</a> Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).</li>
<li>Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Decapentaplegic+signaling+regulates+patterning+and+adhesion+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina.</a> Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).</li>
<li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+behavior+in+the+developing+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina.</a> Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).</li>
<li>Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vav+oncogene+antagonises+EGFR+signalling+and+regulates+adherens+junction+dynamics+during+Drosophila+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development.</a> Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).</li>
<li>Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cortical+tension+mediated+by+N-cadherin+controls+cell+geometric+order+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye.</a> eLife. 6, e22796(2017).</li>
<li>Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wingless+eliminates+ommatidia+from+the+edge+of+the+developing+eye+through+activation+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis.</a> Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).</li>
<li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).</li>
<li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%E2%80%90d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).</li>
<li>Monserrate, J., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+death+zone%3A+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).</li>
<li>Bushnell, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+is+antagonized+to+ensure+the+correct+number+of+interommatidial+cells+pattern+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina.</a> Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).</li>
<li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Immunohistochemistry+of+Larval%2C+Pupal+and+Adult+Drosophila+Retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347(2012).</li>
<li>Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Mounting+of+Drosophila+Pupal+Eye+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315(2014).</li>
<li>Johnson, R. I., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+Method+to+Analyze+Drosophila+Pupal+Eye+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7008(2009).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing+%3A+the+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Drosophila+glass+protein+and+evidence+for+negative+regulation+of+its+activity+in+non-neuronal+cells+by+another+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein.</a> Development. 119 (3), 855-865 (1993).</li>
<li>Duffy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+drosophila%3A+A+fly+geneticist%27s+swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad+expression+profile+of+the+GMR-GAL4+driver+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Mol+Res%22%5BJournal%5D)">A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster.</a> Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).</li>
<li>Song, Z., McCall, K., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCP-1%2C+a+Drosophila+Cell+Death+Protease+Essential+for+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development.</a> Science. 275 (5299), 536-540 (1997).</li>
<li>Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+homologs+of+baculovirus+inhibitor+of+apoptosis+proteins+function+to+block+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death.</a> Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda rozwarstwienia oczu poczwarki Drosophila pozwala na wyizolowanie od 6 do 10 kompleksów oko-mózg w ciągu 10 do 15 minut. Jednak cierpliwość i praktyka są niezbędne, aby opanować technikę sekcji oraz poprawić jakość i szybkość sekcji. Ten krótki czas preparacji zapewnia, że każde oko znajduje się w przybliżeniu na tym samym etapie rozwoju, co zmniejsza zmienność fenotypu lub ekspresję genów siatkówki w zestawie danych. Podczas gdy alternatywne protokoły mogą wymagać mniej praktyki do opanowani...

Siatkówka Drosophila składa się z około 750 ommatidia otoczonych komórkami pigmentowymi ułożonymi w siatkę o strukturze plastra miodu1,2,3,4. Każde ommatidium zawiera osiem neuronów fotoreceptorowych, cztery czopki wydzielające soczewki i dwie pierwotne komórki pigmentowe. Wokół każdego ommatidium znajdują się komórki kratowe wytwarzające pigment i czuciowe grupy szczeciny. Ze względu na swoją postmitotyczną naturę i stereotypowy układ sześciokątny, siatkówka poczwarki Drosophila stanowi doskonały system modelowy do badania procesów morfogenetycznych, w tym adhezji komórek5,6,7,8,9,10 i apoptoza11,12,13,14,15. 
Kilka opublikowanych protokołów wykorzystuje ciśnienie powietrza do ekstrakcji kompleksów oko-mózgowych z poczwarek Drosophila16,17,18. Opisany tutaj protokół wykorzystuje narzędzia do mikrodysekcji do starannego i precyzyjnego izolowania kompleksów oko-mózg w celu uzyskania nieuszkodzonej tkanki siatkówki. Ma to kluczowe znaczenie, jeśli siatkówki mają być wykorzystywane do analiz morfologicznych, białkowych lub ekspresji genów, ponieważ uszkodzenie siatkówki może powodować stres komórkowy lub śmierć, co może modyfikować fenotyp komórkowy lub ekspresję genów. Dodatkowo, po ćwiczeniach, w ciągu 10 do 15 minut można wyizolować od 6 do 10 kompleksów oko-mózg, co ułatwia zminimalizowanie zmienności wieku i etapu rozwoju wypreparowanej tkanki oka.
Opisany poniżej protokół utrwalania, barwienia immunologicznego i całościowego montażu jest odpowiedni do przygotowania oczu Drosophila do mikroskopii fluorescencyjnej. Siatkówki mogą być inkubowane z przeciwciałami skierowanymi przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania. Na przykład, przeciwciała przeciwko składnikom połączenia adherens mogą być wykorzystane do wizualizacji obwodów wierzchołkowych komórek, dzięki czemu można ocenić cechy, w tym typ, kształt i układ komórek19. Przed fiksacją oczy mogą zostać odcięte od mózgu w celu ekstrakcji białka do analizy zachodniej lub RNA do wykorzystania w qRT-PCR lub sekwencjonowaniu RNA.

<table><tbody><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów</td></tr><tr><td>Szyny bambusowe, 6"&nbsp;</td><td>Ted Pella Inc</td><td>116</td><td></td></tr><tr><td>Beta merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan beta-glicerolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>miska</td><td></td><td></td><td>preparcyjna Szklana szalka Petriego wypełniona po brzegi SYLG170 lub SYLG184 (w kolorze czarnym z drobno zmielonym węglem drzewnym w proszku). Pozostawić w temperaturze pokojowej na 24-48 godzin do polimeryzacji.</td></tr><tr><td>Uchwyt ostrza</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmpete, wolne od EDTA tabletki koktajlowe inhibitora proteazy</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny (Zeiss LSM 501)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>lub podobny mikroskop</td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40718</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td></td><td>3M 665</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila podłoża spożywcze, bogate w składniki odżywcze&nbsp;</td><td></td><td></td><td>7,5% sacharozy, 15% glukozy, 2,5% agaru, 20% drożdży piwnych, 5% peptonu, 0,125% MgSO4,7H2O, 0,125% CaCl2,2H20</td></tr><tr><td>Drosophila pożywka, standardowy</td><td></td><td></td><td>przepis na mąkę kukurydzianą Bloomington Drosophila Stock center.&nbsp; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>utrwalający</td><td>4% formadehydu w PBS, pH 7,4.</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny (mikroskop TCS SP5 DM)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>lub podobny mikroskop</td></tr><tr><td>Kleszcze&nbsp;</td><td>Kleszcze Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>należy często ostrzyć.</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Szklane naczynia 9-dołkowe&nbsp;</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>Znany również jako naczynia 9-dołkowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe szklane (25 x 75 x 1 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>3160-100BO</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio wersja oprogramowania 5.2.5</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu do ilościowego oznaczania plam zachodnich.</td></tr><tr><td>Bufor do próbek Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>2X skoncentrowany bufor do próbek białek, suplement z beta merkaptoetanolem zgodnie z instrukcjami producenta.</td></tr><tr><td>Bufor próbki redukujący znacznik pasa ruchu&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>39000</td><td>5X skoncentrowany bufor do próbek białek.</td></tr><tr><td>Probówki mikrowirówkowe&nbsp;</td>Nożyczki do mikrodysekcji <td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Tace do mikrodołków (72 x 10 &mikro; L-studzienki</td> )<td>Nunc</td><td>438733</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td> montażowe <td>0,5% N-galalan N-propylu i 80% glicerol w PBS</td></tr><tr><td>N-galalan propylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez nukleaz (PBS w 0,1% DEPC, pH 7,4)</td><td></td><td></td> <td>Dodaj odpowiednią objętość DEPC do PBS, dobrze wymieszaj i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu. W autoklawie przez co najmniej 20 minut. Przechowywać w 4&deg; C</td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>Przygotować zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>PBS+pi (PBS plus inhibitory proteazy i fosfatazy)</td><td></td><td></td><td>10mM NaF, 1mM fosforan beta-glicerolu i 1mM Na3VO4 w PBS, pH 7,4.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>0,15% TritonX i 0,5% albumina surowicy bydlęcej w PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Uchwyt na przypinkę</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe: kozia anty-GAPDH</td><td>Imgenex</td><td>IMG-3073</td><td>Do Western blot. Używany w 1:3000</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe: królicze przeciwciało przeciw rozszczepieniu Dcp-1</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9578S Do</td><td>immunofluorescencji. Używany w 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe: szczur anty-DEcad</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>DCAD2</td><td>Do immunofluorescencji. Używane w 1:20</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe: szczur anty-DEcad</td><td>DOI: 10.1006/dbio.1994.1287</td><td>DCAD1</td><td>&nbsp; Prezent od Tadashi Uemura. Używany w 1:100.</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji RNA: Zestaw do miniprzygotowania tkanki RNA Relia Prep&nbsp;</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do odkażania rnazy (RNase Away)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050</td><td>Odłam mały kawałek ostrza i zabezpiecz w uchwycie ostrza.</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe: 488-sprzężone&nbsp; osło anty-szczurze IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-545-153</td><td>Do immunofluorescencji. Używany w 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe: cy3-sprzężone kozie anty-królicze IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td>Do immunofluorescencji. Używany w 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne: IgG (H+L) przeciw szczurom kozom sprzężonym z HRP Technologia</td> <td>sygnalizacji komórkowej</td><td>7077</td><td>Do Western blotting. Używany w 1:3000</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe: IgG (H+L) królika sprzężonego z HRP)</td> Jackson <td>ImmunoResearch</td><td>305-035-003</td><td>Do Western blotting. Używany w 1:3000</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215309</td><td></td></tr> Spektrofotometr <tr><td>wanadanu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50860</td><td></td></tr><tr><td>(NanoDrop)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2000c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop preparacyjny (M60 lub M80)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>lub podobny mikroskop</td></tr><tr><td>Sylgard ()</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (przezroczysty)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>Kolor z drobno zmielonym proszkiem charcol</td></tr><tr><td>Tkanka: Kimwipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>TritonX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek Trizma pH7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Igła wolframowa, cienka</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>Włóż do uchwytu na szpilki</td></tr><tr><td>Igła wolframowa, solidna</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>Włóż do uchwytu szpilki</td></tr><tr><td>WTLB (zachodni bufor do lizy tkanek)</td><td></td><td></td><td>150mM NaCl, 1,5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glicerol, 10mM NaF, 1mM fosforan beta-glicerolu i 1mM Na3VO4 w 50mM Tris-HCl (pH 7,5). Uzupełnij jednym stolikiem koktajlowym z proteazą cOmplete na 10 ml roztworu.</td></tr><tr><td>Pasta drożdżowa</td> <td>(lokalny supermarket)</td><td></td><td>Około 2 łyżki drożdży Fleischmann's ActiveDry (lub podobnych) rozpuszczonych w ~20 ml destylowanego H2O</td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie siatkówki poczwarki drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji rna

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Siatkówka poczwarki Drosophila stanowi doskonały system modelowy do badania procesów morfogenetycznych podczas rozwoju. W niniejszej pracy przedstawiono rzetelny protokół preparacji delikatnej siatkówki poczwarki Drosophila. Nasze podejście chirurgiczne wykorzystuje łatwo dostępne narzędzia do mikrodysekcji do otwierania poczwarek i precyzyjnej ekstrakcji kompleksów oko-mózg. Można je utrwalić, poddać immunohistochemii, a siatkówki następnie zamontować na szkiełkach mikroskopowych i zobrazować, jeśli celem jest wykrycie struktur komórkowych lub subkomórkowych. Alternatywnie, nieutrwalone siatkówki można wyizolować z tkanki mózgowej, poddać lizie w odpowiednich i wykorzystać do elektroforezy żelu białkowego lub ekstrakcji mRNA (odpowiednio w celu oceny ekspresji białka lub genu). Opanowanie opisanego protokołu mikrodysekcji może wymagać znacznej praktyki i cierpliwości, ale po opanowaniu protokół umożliwia stosunkowo szybką izolację głównie nieuszkodzonych siatkówk.

Oko poczwarki jest łatwo dostępną tkanką, która służy jako doskonały model do badania procesów rozwojowych sterujących morfogenezą. W niniejszej pracy wyizolowano siatkówki i wykorzystano immunofluorescencję do wykrycia apikalnych złączy przylegających (Rycina 3A, C) lub kaspazy Dcp-1 (Rycina 3D), która jest aktywowana podczas apoptozy (Rycina 3)25. Podejścia te pozwalają na wyraźną obserwacj...

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ jest to skuteczna metoda izolacji tkanki oka poczwarki Drosophila do wielu dalszych zastosowań. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na szybkie wypreparowanie dużej liczby oczu poczwarki bez uszkadzania tkanki. Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila będzie wyzwaniem dla nowicjuszy.Ćwiczenie tej techniki jest najlepszym sposobem na poprawę szybkości sekcji i jakości wyników. Po umieszczeniu poczwarek Drosophila na czarnym naczyniu preparacyjnym, połóż świeży kawałek taśmy dwustronnej na naczyniu preparacyjnym, z dala od poczwarek i użyj kleszczy, aby ostrożnie umieścić poczwarkę grzbietową stroną do góry na taśmie. Umieść naczynie pod mikroskopem stereoskopowym i użyj kleszczy, aby usunąć wieczko z każdej poczwarki.Użyj nożyczek do mikrodysekcji, aby przeciąć każdy przypadek poczwarki, umożliwiając jego rozwarcie, aby odsłonić głowę, klatkę piersiową i przedni segment brzucha, a także przymocuj krawędzie etui poczwarki do dwustronnej taśmy. Przebij brzuch każdej poczwarki ostrymi kleszczami i wyjmij poczwarkę z obudowy poczwarki. Umieść poczwarkę na naczyniu preparacyjnym, z dala od taśmy i przykryj poczwarkę 400 mikrolitrami lodo

dissection-drosophila-pupal-retina-for-immunohistochemistry-western

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

W niniejszym materiale przedstawiono standardowe podejście do przygotowania oczu dorosłych osobników Drosophila do wykonywania półcienkich przekrojów oraz analizy pod mikroskopem świetlnym. Protokół ten może być stosowany do ogólnej analizy morfologicznej wad oka lub, po wprowadzeniu wskazanych modyfikacji, do określania wymagań genetycznych genów w konkretnych typach komórek oka (np. analiza klonalna fotoreceptorów) bądź do analizy pod mikroskopem elektronowym.

Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować kompleks oko-mózg od poczwarek Drosophila. Przedstawiony protokół pokazuje, że procedura pozwala uzyskać wysokiej jakości tkankę, kompatybilną na przykład z barwieniem immunologicznym, a także innymi eksperymentami z ekspresją genów.

Rozwarstwienie kompleksu oko-mózg z poczwarek much: metoda izolacji tkanki siatkówki

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Celem tej techniki jest umożliwienie naukowcom przeprowadzenia sekcji, barwienia immunologicznego i montażu krążków z oczami poczwarek Drosophila melanogaster w każdym wieku.

Wypreparowanie i montaż krążków ocznych poczwarki Drosophila

Zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tkankach Drosophila jest kluczowa dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju. Oto opis prostej procedury preparowania skrzydeł poczwarki. Skrzydełka te mogą być używane jako próbki w kilku technikach (immunohistochemia, test PCR itp.).

Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół do etapowania i preparowania rozwijającej się tkanki węchowej z gatunku Drosophila. Wypreparowana tkanka może być później wykorzystana do analiz molekularnych, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa RT-Transcription-Polymerase Chain Reaction) lub sekwencjonowanie RNA (RNAseq), a także do analiz in vivo, takich jak immunohistochemia lub hybrydyzacja in situ.

Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila

Naucz się precyzyjnej metody rozwarstwiania siatkówki poczwarki Drosophila melanogaster w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA. Technika zachowuje integralność tkanki i umożliwia szybką analizę wielu próbek.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

Przeglądaj więcej filmów