Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego
25 sierpnia 2019
Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.
Procedury testowania toksyczności zostaną zademonstrowane przez dr Ashoka Aspatwara, starszego badacza z mojego laboratorium. Nasz protokół identyfikuje efekty niezamierzone i wykrywa subtelne toksyczne skutki chemikaliów we wczesnej fazie odkrywania, które mogą zostać pominięte w hodowli komórkowej lub innych modelach zwierzęcych. Główne zalety naszej techniki to: jest szybka i wydajna, wymaga bardzo małej ilości środka chemicznego oraz podstawowe zaplecze w laboratorium.
Badania przesiewowe pod kątem toksyczności pomogą nam w podjęciu decyzji o stężeniu w celu zbadania jego skuteczności wobec prątków wywołujących gruźlicę oraz w dalszych obliczeniach przedklinicznych. Metoda ta wykorzystuje wgląd w niecelowe skutki chemikaliów, a zatem metoda ta może być stosowana w dowolnym obszarze badań, w którym toksyczność substancji chemicznej ma pierwszorzędne znaczenie. Ta metoda jest bardzo prosta i może być wykonana przez każdego bez wcześniejszego doświadczenia.
Osoby bez doświadczenia powinny dokładnie zaplanować eksperyment i użyć tylko jednego związku. Metoda ta zapewnia toksyczne działanie substancji chemicznych w postaci zmian fenotypowych w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego, a tym samym bezpieczeństwo badanych związków. Na początek umieść na noc od dwóch do pięciu dorosłych samców danio pręgowanego i od trzech do pięciu dorosłych samic danio pręgowanego.
Rano włącz światło, ponieważ rozmnażanie jest indukowane przez automatyczny cykl ciemności i późniejszy cykl światła. Aby uniknąć radzenia sobie ze stresem u zwierząt, pozwól zwierzętom odpocząć przez dwa tygodnie przed użyciem tych samych osobników do rozmnażania. Następnego dnia przed południem zebrać zarodki za pomocą sitka o drobnych oczkach i przenieść je na szalkę Petriego zawierającą pożywkę zarodkową E3.
Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym, aby zbadać każdą partię zarodków. Zidentyfikuj nieprzezroczysty wygląd i usuń je jako niezapłodnione lub martwe zarodki. Trzymaj zarodki w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza w inkubatorze przez noc.
Następnego ranka zbadaj zarodki pod mikroskopem stereoskopowym i usuń wszelkie niezdrowe lub martwe zarodki. Ostrożnie użyj pipety Pasteura, aby przenieść jeden zarodek do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Upewnij się, że każda studzienka zawiera wystarczającą ilość podłoża E3, aby przykryć zarodki.
Wyjąć fiolki zawierające związki inhibitorowe przechowywane w lodówce w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Za pomocą wagi analitycznej zważyć odpowiednią ilość związku i przygotować 250 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu podstawowego dla każdego związku w pożywce E3 lub innym odpowiednim rozpuszczalniku. Następnie użyj pożywki E3 do seryjnych rozcieńczeń roztworów podstawowych w oparciu o poziomy toksyczności w 15-mililitrowych probówkach wirówkowych.
Z dołków, z których każdy zawiera jeden zarodek DPF, użyj pipety Pasteura i pipety o pojemności 1 mililitra, aby usunąć wodę E3 po jednym rzędzie na raz. Natychmiast rozprowadzić 1 mililitr każdego rozcieńczalnika roztworów podstawowych do dołków płytki 24-dołkowej, zaczynając od niższego i przechodząc do wyższego stężenia. W przypadku grup kontrolnych dodać wodę E3 lub inny odpowiedni rozpuszczalnik.
Oznaczyć 24-dołkowe płytki nazwą i stężeniem związku i przechowywać płytki w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza w inkubatorze. Należy uważać, aby rozcieńczalniki chemikaliów w studzienkach nie zostały odparowane w inkubatorze, uszczelniając boki płytki 24-dołkowej. Dwadzieścia cztery godziny po ekspozycji na związki chemiczne użyj pipety Pasteura, aby przenieść larwy wystawione na każde stężenie związku na małej szalce Petriego zawierającej 3% metylocelulozy o wysokiej masie cząsteczkowej.
Za pomocą metalowej sondy połóż go bokiem. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym podłączonym do aparatu. Zrób zdjęcia i zapisuj je w osobnym folderze każdego dnia aż do końca eksperymentu.
Każdego dnia wprowadzaj wszystkie obserwacje do tabeli, w tabeli online lub na wydrukowanym arkuszu. W przypadku narażenia na związki neurotoksyczne, cztery do pięciu larw DPF może wykazywać nieprawidłowy wzorzec pływania. W takim przypadku należy zapisać takie zmiany, nagrywając krótki film przedstawiający larwy trwający od 30 sekund do jednej minuty.
Po pięciu dniach ekspozycji na związki chemiczne zanotuj stężenie, przy którym połowa zarodków umiera, jako połowę maksymalnego stężenia śmiertelnego 50 każdej substancji chemicznej. Skonstruuj krzywą śmiertelności zarodków dla wszystkich stężeń za pomocą odpowiedniego programu. W tym protokole krytyczną częścią oceny toksyczności jest badanie różnych stężeń jednego lub wielu związków chemicznych w jednym eksperymencie.
W przypadku związków, które wywołują jakiekolwiek defekty fenotypowe u larw, wady rejestrowano co 24 godziny przez okres od jednego do pięciu dni po ekspozycji na substancję chemiczną. Zarodki leczone inhibitorami beta CA w stężeniach 250 mikromolowych i 125 mikromolowych wykazują różne wady fenotypowe w porównaniu z kontrolą. Na przykład niewyklute zarodki nawet w 3 dniu, zakrzywiona budowa ciała, niewykorzystany woreczek żółtkowy i obrzęk osierdzia oraz brak woreczków otolitowych u larw po pięciu dniach od leczenia.
W innym badaniu zarodki leczone inhibitorami CA wykazały brak woreczków otolitowych i pęcherza pławnego. W eksperymentach zidentyfikowano reprezentatywny związek anhydrazy węglanowej 9, który indukował minimalne lub żadne zmiany fenotypowe podczas rozwoju embrionalnego przy 500 mikromolach. Związek ten wykazywał wysokie stężenie LC50.
Jednak w porównaniu z grupą kontrolną stwierdzono, że ten sam związek o masie 300 mikromolów jest neurotoksyczny i wywołuje ataksję u larw po pięciu dniach ekspozycji. Dobra jakość zarodków jest ważna dla badań przesiewowych toksyczności substancji chemicznych. Aby uzyskać dobrej jakości zarodki, do hodowli użyj młodej pary dorosłego danio pręgowanego.
Związki, które okażą się bezpieczne, można dodatkowo scharakteryzować, przeprowadzając odpowiednie eksperymenty in vitro i in vivo. W dziedzinie opracowywania leków przeciwgruźliczych technika ta pomogła w przygotowaniu dalszych eksperymentów mających na celu hamowanie in vivo Mycobacterium marinum w zarodkach danio pręgowanego. Protokół zakłada stosowanie substancji chemicznych, które mogą być toksyczne dla ludzi.
Osoby biorące udział w eksperymentach powinny zachować należytą ostrożność podczas obchodzenia się z chemikaliami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Zarodki rybek danio są wykorzystywane do testów toksyczności związków chemicznych ze względu na ich rozwój zewnętrzny oraz wrażliwość na substancje chemiczne. Metoda ta pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych przy minimalnym zużyciu związku, co czyni ją wydajnym i kosztowo efektywnym systemem testowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Toksykologia
- Neuronauka
- Farmakologia
Wstęp
- Zarodki danio przeziernego są idealne do oceny toksyczności chemicznej.
- Rozwijają się one zewnętrznie, co zapewnia przejrzysty wgląd w zmiany fenotypowe.
- Niewielkie ilości substancji chemicznych można testować bezpośrednio na zarodkach.
- Podejście to pozwala zidentyfikować efekty pozacelowe, które są często pomijane w innych modelach.
Cel badania
- Zaprezentowanie szybkiego i wydajnego protokołu badań toksyczności.
- Identyfikacja subtelnych efektów toksycznych substancji chemicznych we wczesnych fazach odkrywania leków.
- Wsparcie w określaniu stężeń do dalszych badań przeciwko patogenom.
Zastosowane metody
- Bezpośrednia aplikacja związków chemicznych do embrionów danio przebrzanego.
- Obserwacja zmian fenotypowych w celu oceny toksyczności.
- Wykorzystanie podstawowej aparatury laboratoryjnej do przeprowadzania testów.
- Przesiewowe badanie efektów pozatarcowych związków chemicznych.
Główne wyniki
- Metoda jest prosta i może być wykonywana bez wcześniejszego doświadczenia.
- Skutecznie identyfikuje ona efekty pozacelowe substancji chemicznych.
- Szybkie wyniki ułatwiają sprawne podejmowanie decyzji dotyczących dalszych badań.
- Metoda jest stosowalna w różnych obszarach badawczych, w których kluczowe jest znaczenie toksyczności chemicznej.
Wnioski
- Zarodki danio pręgowanego stanowią cenny model do badań toksyczności.
- Metoda ta zwiększa efektywność wczesnej oceny związków chemicznych.
- Można ją dostosować do różnorodnych zastosowań badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przesiewowe badanie toksyczności zarodków rybki zebrafish umożliwia wczesne wykrywanie efektów poza docelowych oraz subtelnych działań toksycznych w procesie odkrywania leków, co zmniejsza odsetek niepowodzeń na późnych etapach badań. Metoda ta pozwala na szybką ocenę związków w małych objętościach, zwiększając efektywność kapitałową oraz pewność prognostyczną w wyborze wiodących kandydatów na leki. Jest ona szczególnie cenna przy priorytetyzacji związków w programach poszukiwania leków przeciwprątkowych oraz celowanych w inne patogeny.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ujawnianie defektów fenotypowych powiązanych z ekspozycją na dany związek.
- Wartość operacyjna: Wymaga jedynie 3-6 mg związku, co umożliwia przesiewanie cennych cząsteczek lub takich, których zapas jest ograniczony.
- Wartość prognostyczna: Wykrywanie neurotoksyczności i toksyczności rozwojowej, których nie zauważono w hodowlach komórkowych, co usprawnia ograniczanie ryzyka w procesie wyboru celu terapeutycznego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane LC50 oraz obrazowanie fenotypowe w zależności od czasu do modelowania zależności dawka-odpowiedź.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje standardową infrastrukturę stereomikroskopową i inkubatory, nie wymagając specjalistycznego sprzętu.
- Skalowalność: Pozwala na testowanie wielu stężeń na jednej płytce 24-dołkowej, co wspiera kampanie przesiewowe o średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wczesne wyniki badań toksyczności z późniejszą walidacją in vivo, taką jak badania hamowania mycobacterium marinum.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Identyfikuje związki powodujące minimalne zaburzenia fenotypowe (np. anhydraza węglanowa 9 przy 500 µM) w celu ich dalszego rozwoju.
- Zgodność z biomarkerami: Punkty końcowe fenotypowe, takie jak obrzęk osiercia i nadmuchiwanie pęcherza pławnego, służą jako translacyjne wskaźniki toksyczności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesną fazę odkrywania leków, służąc jako wsparcie dla optymalizacji wiodących struktur oraz wyboru kandydatów do badań przedklinicznych, szczególnie w sytuacjach ograniczonej dostępności związków.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących fenotypów rozwojowych i neurotoksycznych indukowanych przez związki chemiczne.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalną ocenę śmiertelności i wad podprogowych w okresie od 1 do 5 dni po zapłodnieniu.
- Analityka: Dostarcza obliczenia LC50 oraz czasowe profile wad w celu porównkowego rankingowania związków.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość przejścia od toksyczności zarodkowej do modeli hamowania patogenów w całym organizmie.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany, niskonakładowy punkt kontrolny toksyczności, możliwy do zastosowania w różnych obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rejestrację profili toksyczności całego organizmu.
- Wartość operacyjna: Jeden cykl trwa od 8 do 10 godzin, co umożliwia szybką iterację w fazach przejścia od hitu do leadu (hit-to-lead).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wczesne wykrywanie niedopuszczalnej toksyczności, co obniża ryzyko biologiczne w portfelach projektów.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, kierując zasoby w stronę związków o korzystniejszym profilu bezpieczeństwa.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest podstawowa wiedza w zakresie hodowli rybek danio ostrobłonkich oraz obchodzenia się z embrionami.
- Niezbędny jest stereomikroskop, inkubator ustawiony na 28,5°C oraz standardowe naczynia laboratoryjne (płytki 24-dołkowe, pipety Pasteura).
- Wymagane jest spójne określanie stadium rozwoju embrionów oraz ślepa próba podczas oceny w celu zapewnienia wiarygodności danych u różnych użytkowników.
- Należy uwzględnić rozpuszczalność związków oraz kontrole rozpuszczalnika w seriach rozcieńczeń.
- Metoda ogranicza się do oceny toksyczności ostrej; efekty przewlekłe lub narządowe wymagają zastosowania modeli uzupełniających.
