Name: Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Poznaj szybką metodę oceny toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego. Protokół pozwala wykryć subtelne efekty toksyczne i działania poza docelowymi we wczesnej fazie badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez granty Fundacji Sigrid Juselius (SP, MP), Fińskiej Fundacji Kultury (AA, MH), Akademii Fińskiej (SP, MP), Fundacji Orion Farmos (MH), Fundacji Gruźlicy Tampere (SP, MH i MP) oraz Fundacji Jane i Aatos Erkko (SP i MP). Dziękujemy naszym włoskim i francuskim współpracownikom, prof. Supuranowi i prof. Winumowi, za dostarczenie inhibitorów anhydrazy węglanowej do oceny bezpieczeństwa i toksyczności w celu opracowania leków przeciwgruźliczych i przeciwnowotworowych. Dziękujemy Aulikki Lehmus i Marianne Kuuslahti za pomoc techniczną. Dziękujemy również Leenie Mäkinen i Hannaleenie Piippo za pomoc w hodowli danio pręgowanego i zbieraniu zarodków. Serdecznie dziękujemy Harlanowi Barkerowi za krytyczną ocenę manuskryptu i wnikliwe komentarze.

Główny obiekt danio pręgowanego na Uniwersytecie w Tampere posiada autoryzację założenia przyznaną przez Krajową Radę ds. Eksperymentów na Zwierzętach (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem embrionów danio pręgowanego zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem Regionalnej Jednostki Usługowej Rządu Prowincji Finlandia Wschodnia, Departamentu Spraw Społecznych i Zdrowia Regionalnej Jednostki Serwisowej Tampere # LSLH-2007-7254/Ym-23.
1. Zakładanie nocnych zbiorników godowych danio pręgowanego
<ol>
	<li>Umieść na noc 2-5 dorosłych samców danio pręgowanego i 3-5 dorosłych samic danio pręgowanego w zbiornikach godowych. (Rozmnażanie jest wywoływane rano przez automatyczny cykl ciemności i światła w nocy).</li>
	<li>Ustaw kilka krzyżówek, aby uzyskać wystarczającą liczbę zarodków do oceny toksyczności więcej niż dwóch związków chemicznych. Do oceny toksyczności każde stężenie wymaga co najmniej 20 embrionów23.</li>
	<li>Aby uniknąć radzenia sobie ze stresem u zwierząt, pozwól zwierzętom odpocząć przez 2 tygodnie przed użyciem tych samych osobników do hodowli.</li>
</ol>
2. Pobieranie zarodków i przygotowanie płytek do ekspozycji na związki chemiczne
<ol>
	<li>Następnego dnia przed południem zebrać zarodki za pomocą sitka o drobnych oczkach i przenieść je na szalkę Petriego zawierającą pożywkę zarodkową E3 [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4 i 0,1% w/v błękitu metylenowego].</li>
	<li>Usuń zanieczyszczenia za pomocą plastikowej pipety Pasteura (np. żywność i odpady stałe). Zbadaj każdą partię zarodków pod mikroskopem stereoskopowym, aby usunąć niezapłodnione/martwe zarodki (zidentyfikowane na podstawie ich nieprzezroczystego wyglądu).</li>
	<li>Przechowywać zarodki w temperaturze 28,5 °C w inkubatorze. Następnego ranka zbadaj zarodki pod mikroskopem stereoskopowym i usuń wszelkie niezdrowe lub martwe zarodki. Zastąp również starą pożywkę E3 świeżą pożywką E3. 
	UWAGA: Zarodki danio pręgowanego są zawsze utrzymywane w temperaturze 28,5 °C w warunkach laboratoryjnych. </li>
	<li>Ostrożnie przenieść 1 zarodek do każdego dołka na 24-dołkowej płytce zawierającej wystarczającą ilość podłoża E3 do pokrycia zarodków.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworu podstawowego związków chemicznych i dystrybucja rozcieńczonego związku do studni
<ol>
	<li>Wyjąć fiolki zawierające związki inhibitorowe przechowywane w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W zależności od właściwości związku, są one przechowywane w różnych temperaturach.</li>
	<li>Zważyć związek(-i) za pomocą wagi analitycznej, która może dokładnie zważyć kilka miligramów (mg) związku.</li>
	<li>Przygotować co najmniej 250 μl (100 mM) roztworu podstawowego dla każdego związku w odpowiednim rozpuszczalniku (np. wodzie E3 lub dimetylosulfotlenku (DMSO), w oparciu o właściwości rozpuszczalności związków. 
	UWAGA: Powyższe kroki można wykonać dzień przed rozpoczęciem eksperymentu w dogodnym czasie i przechowywać w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Wykonać seryjne rozcieńczenia roztworów podstawowych (np. 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM i 500 μM) przy użyciu wody E3 w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Stężenia i liczba seryjnych rozcieńczeń różnią się w zależności od związku, w zależności od ich poziomu toksyczności.</li>
	<li>Z 24-dołkowej płytki zawierającej zarodki usunąć wodę E3 z dołków za pomocą pipety Pasteura i pipety 1 ml (zawierającej 1 dpf zarodków) po jednym rzędzie na raz.</li>
	<li>Rozprowadzić 1 ml każdego rozcieńczalnika w każdym dołku (zaczynając od niższego i przechodząc do wyższego stężenia) do dołków na płytce 24-dołkowej.</li>
	<li>Ustaw grupę kontrolną z tej samej partii zarodków i dodaj odpowiednią ilość rozcieńczalnika.</li>
	<li>Oznaczyć płytki 24-dołkowe nazwą i stężeniem związku i przechowywać płytki w temperaturze 28,5 °C w inkubatorze.</li>
</ol>
4. Analiza fenotypowa i obrazowanie zarodków za pomocą mikroskopu stereoskopowego
<ol>
	<li>Zbadaj zarodki pod mikroskopem stereoskopowym pod kątem parametrów 24 godziny po ekspozycji na związki chemiczne.
	<ol>
		<li>Zwróć uwagę na takie parametry, jak śmiertelność, wylęg, bicie serca, wykorzystanie worka żółtkowego, rozwój pęcherza pławnego, ruch ryby, obrzęk osierdzia i kształt ciała23.</li>
		<li>Weź larwy wystawione na działanie każdego stężenia związku i ułóż je bokiem na małej szalce Petriego zawierającej 3% metylocelulozy o wysokiej masie cząsteczkowej za pomocą metalowej sondy. 
		UWAGA: 3% metyloceluloza (o wysokiej molekularności) jest lepką cieczą potrzebną do osadzenia ryb w wymaganej orientacji do badania mikroskopowego. Do orientacji ryb w tej cieczy potrzebna jest metalowa sonda.</li>
		<li>Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu stereoskopowego podłączonego do aparatu. Zapisuj obrazy w osobnym folderze każdego dnia do końca eksperymentu.</li>
		<li>Każdego dnia wprowadzaj wszystkie obserwacje do tabeli, w tabeli online lub na wydrukowanym arkuszu.</li>
		<li>Jeśli związki są neurotoksyczne, larwy o natężeniu od 4 do 5 dpf mogą wykazywać zmieniony wzór pływania, należy zapisać takie zmiany, rejestrując krótki (30 s do 1 minut) film przedstawiający larwy wykazujące nieprawidłowy wzorzec ruchu.</li>
		<li>Po 5 dniach ekspozycji na związki chemiczne zanotuj stężenie, przy którym umiera połowa zarodków, aby obliczyć połowę maksymalnego stężenia śmiertelnego 50 (LC50) każdej substancji chemicznej. 
		UWAGA: LC50 to stężenie, przy którym 50% zarodków umiera po 5 dniach ekspozycji na związek chemiczny. Użyj co najmniej 20 zarodków do zbadania toksyczności każdego stężenia związku23.</li>
		<li>Skonstruuj krzywą śmiertelności zarodków dla wszystkich stężeń za pomocą odpowiedniego programu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises%3A+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li>
<li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarg%2C+RC+%22Reproductive+and+Developmental+Toxicology%22">Reproductive and Developmental Toxicology</a>. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).</li>
<li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+models+in+developmental+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Systems+Biology+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li>
<li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-cancer+drug+discovery%3A+update+and+comparisons+in+yeast%2C+Drosophila%2C+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li>
<li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li>
<li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).</li>
<li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+B+Developmental+and+Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li>
<li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li>
<li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29%3A+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research.+Part+C%2C+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li>
<li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li>
<li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li>
<li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+synthesis%2C+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li>
<li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).</li>
<li>Stainier, D. Y., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li>
<li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li>
<li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides%2Fsulfamides%2Fsulfamates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li>
<li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).</li>
<li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li>
<li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li>
<li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li>
<li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li>
<li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B%3A+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li>
<li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+genes+controlling+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li>
<li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li>
<li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+pharmacological+tool%3A+the+how%2C+why+and+when%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłosili potencjalnego konfliktu interesów.

Badanie toksyczności in vitro z wykorzystaniem hodowanych komórek może wykryć przeżycie i badania morfologiczne komórek, dostarczając ograniczonych informacji na temat toksyczności wywołanej przez badany związek. Zaletą badań przesiewowych toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego jest szybkie wykrycie chemicznie wywołanych zmian fenotypowych u całego zwierzęcia podczas rozwoju embrionalnego w odpowiednim organizmie modelowym. Około 70% ludzkich genów kodujących białka ma odpo...

Opracowanie leku to kosztowny proces. Zanim pojedynczy związek chemiczny zostanie zatwierdzony przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Europejską Agencję Leków (EMA), kilka tysięcy związków jest przebadanych na podstawie kilku tysięcy związków, co kosztuje ponad miliard dolarów1. Podczas badań przedklinicznych największa część tych kosztów jest wymagana na testy na zwierzętach2. Aby ograniczyć koszty, naukowcy zajmujący się opracowywaniem leków potrzebują alternatywnych modeli do badań przesiewowych pod kątem bezpieczeństwa związków chemicznych3. W związku z tym, we wczesnej fazie opracowywania leku, bardzo korzystne byłoby zastosowanie metody, która może szybko ocenić bezpieczeństwo i toksyczność związków w odpowiednim modelu. Istnieje kilka protokołów, które zostały wykorzystane do badań przesiewowych toksyczności związków chemicznych obejmujących modele hodowli zwierzęcych i komórkowych, ale nie ma ani jednego protokołu, który byłby zatwierdzony i jest w powszechnym użyciu4,5. Istniejące protokoły z wykorzystaniem danio pręgowanego różnią się długością i były używane przez indywidualnych badaczy, którzy ocenili toksyczność zgodnie z wymaganiami dotyczącymi wygody6,7,8,9,10,11,12.
W niedawnej przeszłości danio pręgowany stał się wygodnym modelem do oceny toksyczności związków chemicznych podczas rozwoju embrionalnego6,7. Danio pręgowany ma wiele wbudowanych zalet do oceny związków chemicznych13. Nawet eksperymenty na dużą skalę są możliwe, ponieważ samica danio pręgowanego może składać partie po 200-300 jaj, które szybko rozwijają się ex vivo, nie wymagają zewnętrznego karmienia przez okres do tygodnia i są przezroczyste. Związki te mogą być dodawane bezpośrednio do wody, gdzie mogą (w zależności od charakteru związku) dyfundować przez kosmówkę, a po wykluciu przez skórę, skrzela i pysk larw. Eksperymenty nie wymagają dużej ilości związków chemicznych14 ze względu na mały rozmiar zarodka. Rozwijające się zarodki danio pręgowanego wyrażają większość białek wymaganych do osiągnięcia prawidłowego wyniku rozwojowego. W związku z tym zarodek danio pręgowanego jest czułym modelem do oceny, czy potencjalny lek może zakłócić funkcję białka lub cząsteczki sygnałowej, która jest istotna dla rozwoju. Narządy danio pręgowanego stają się funkcjonalne między 2-5 dpf15, a związki, które są toksyczne w tym wrażliwym okresie rozwoju embrionalnego, wywołują wady fenotypowe u larw danio pręgowanego. Te zmiany fenotypowe można łatwo wykryć za pomocą prostego mikroskopu bez technik inwazyjnych11. Zarodki danio pręgowanego są szeroko stosowane w badaniach toksykologicznych ze względu na ich znacznie większą złożoność biologiczną w porównaniu z badaniami przesiewowymi leków in vitro przy użyciu modeli hodowli komórkowych16,17. Jako kręgowiec, genetyczny i fizjologiczny skład danio pręgowanego jest porównywalny z człowiekiem, a zatem toksyczność związków chemicznych jest podobna między danio pręgowanym a człowiekiem8,18,19,20,21,22. Danio pręgowany jest zatem cennym narzędziem we wczesnej fazie odkrywania leków do oceny toksyczności i bezpieczeństwa związków chemicznych.
W tym artykule szczegółowo opisujemy metodę używaną do oceny bezpieczeństwa i toksyczności związków inhibitorów anhydrazy węglanowej (CA) przy użyciu 1-5 dni po zapłodnieniu (dpf) embrionów danio pręgowanego przez jednego badacza. Protokół obejmuje wystawienie zarodków danio pręgowanego na działanie różnych stężeń chemicznych związków inhibitorowych oraz badanie śmiertelności i zmian fenotypowych podczas rozwoju embrionalnego. Pod koniec ekspozycji na związki chemiczne określa się dawkę LC50 substancji chemicznej. Metoda pozwala na przeprowadzenie skutecznego badania przesiewowego 1-5 badanych związków i trwa około 8-10 godzin, w zależności od doświadczenia osoby z tą metodą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Każdy z etapów wymaganych do oceny toksyczności związków jest opisany w <silna klasa="xfig">Rysunek 2. Ocena toksyczności inhibitorów CA trwa 8 dni i obejmuje tworzenie par godowych (dzień 1); pobieranie zarodków ze zbiorników hodowlanych, czyszczenie i przenoszenie ich do inkubatora w temperaturze 28,5 °C (dzień 2); dystrybucja zarodków do studzienek na płytce 24-dołkowej i dodanie rozcieńczonych związków inhibitora CA (dzień 3); analiza fenotypowa i obrazowanie larw (dzień 4-8) oraz określenie dawki LC50 (dzień 8). Metoda ta jest szybka i skuteczna, wymaga niewielkiej ilości związku chemicznego i tylko podstawowego wyposażenia laboratorium.

<table><tbody><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Nunc</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Balance (Waga)</td><td>KERN</td><td>PLJ3000-2CM</td><td></td></tr><tr><td>Balance (Waga)</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB104-S/PH</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>JT. Sonda</td> preparcyjna Baker <td>RS421910024</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>17-467-604&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Wysokocząsteczkowa metyloceluloza</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>M0262&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator dla larw danio pręgowanego</td><td>Termaks</td><td>B8000</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Merck</td><td>1.04936.0500</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylowy</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Starlab</td><td>S1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta parafinowa Histoplast IM</td><td>Thermo Scientific</td><td>8331</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Thermo Scientific</td><td>101R20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (1 ml i 200 &mu; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4641230N, 4641210N&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-well</td><td>Thermo Scientific</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>Steriomikroskop/kamera</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C/Axiocam 105 kolorowych</td><td></td></tr><tr><td>fiolek (1,5 ml)</td><td>Fisherbrand</td><td>11569914</td><td></td></tr><tr><td>Szczepy Zebrafish AB</td><td>ZIRC&nbsp;</td><td>&nbsp; ZL1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Danio pręgowany jest szeroko stosowanym modelowym organizmem kręgowców do odkrywania leków na podstawie choroby i fenotypu. Danio pręgowany rodzi wiele potomstwa, ma przezroczyste zarodki i szybki rozwój zewnętrzny. Zarodki danio pręgowanego mogą być zatem również wykorzystywane do szybkiej oceny toksyczności leków, które są cenne i dostępne w małych ilościach. W artykule opisano metodę skutecznego badania przesiewowego toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków 1-5 dni po zapłodnieniu. Zarodki są monitorowane za pomocą mikroskopu stereoskopowego w celu zbadania wad fenotypowych spowodowanych ekspozycją na różne stężenia związków. Określa się również połowy maksymalnych stężeń śmiertelnych (LC50) związków. Obecne badanie wymagało 3-6 mg związku inhibitorowego, a cały eksperyment trwa około 8-10 godzin, aby zostać ukończonym przez osobę w laboratorium posiadającym podstawowe wyposażenie. Obecny protokół jest odpowiedni do testowania dowolnego związku w celu zidentyfikowania nietolerowalnych toksycznych lub niedocelowych skutków związku we wczesnej fazie odkrywania leku oraz w celu wykrycia subtelnych skutków toksycznych, które mogą zostać pominięte w hodowli komórkowej lub innych modelach zwierzęcych. Metoda ta zmniejsza opóźnienia proceduralne i koszty opracowywania leków.

Kluczową częścią oceny toksyczności jest testowanie różnych stężeń jednego lub wielu związków chemicznych w pojedynczym eksperymencie. Na początku należy wybrać związki do oceny toksyczności, liczbę stężeń do przetestowania dla każdego związku oraz odpowiednio sporządzić schemat (Rysunek 3). Użyliśmy innego koloru dla każdego związku, aby uporządkować próbki (Rysunek 3). Ważne jest stosowanie odpornego na rozpuszczalniki markera ...

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Procedury testowania toksyczności zostaną zademonstrowane przez dr Ashoka Aspatwara, starszego badacza z mojego laboratorium. Nasz protokół identyfikuje efekty niezamierzone i wykrywa subtelne toksyczne skutki chemikaliów we wczesnej fazie odkrywania, które mogą zostać pominięte w hodowli komórkowej lub innych modelach zwierzęcych. Główne zalety naszej techniki to: jest szybka i wydajna, wymaga bardzo małej ilości środka chemicznego oraz podstawowe zaplecze w laboratorium.Badania przesiewowe pod kątem toksyczności pomogą nam w podjęciu decyzji o stężeniu w celu zbadania jego skuteczności wobec prątków wywołujących gruźlicę oraz w dalszych obliczeniach przedklinicznych. Metoda ta wykorzystuje wgląd w niecelowe skutki chemikaliów, a zatem metoda ta może być stosowana w dowolnym obszarze badań, w którym toksyczność substancji chemicznej ma pierwszorzędne znaczenie. Ta metoda jest bardzo prosta i może być wykonana przez każdego bez wcześniejszego doświadczenia.Osoby bez doświadczenia powinny dokładnie zaplanować eksperyment i użyć tylko jednego związku. Metoda ta zapewnia toksyczne działanie substancji chemicznych w postaci zmian fenotypowych w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego, a tym samym bezpieczeństwo badanych związków. Na początek umieść na noc od dwóch do pięciu dorosłych samców danio pręgowanego i od trzech do pięciu dorosłych samic danio pręgowanego.Rano włącz światło, ponieważ rozmnażanie jest indukowane przez automatyczny cykl ciemności i późniejszy cykl światła. Aby uniknąć radzenia sobie ze stresem u zwierząt, pozwól zwierzętom odpocząć przez dwa tygodnie przed użyciem tych samych osobników do rozmnażania. Następnego dnia przed południem zebrać zarodki za pomocą sitka o drobnych oczkach i przenieść je na szalkę Petriego zawierającą pożywkę zarodkową E3.Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym, aby zbadać każdą partię zarodków. Zidentyfikuj nieprzezroczysty wygląd i usuń je jako niezapłodnione lub martwe zarodki. Trzymaj zarodki w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza w inkubatorze przez noc.Następnego ranka zbadaj zarodki pod mikroskopem stereoskopowym i usuń wszelkie niezdrowe lub martwe zarodki. Ostrożnie użyj pipety Pasteura, aby przenieść jeden zarodek do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Upewnij się, że każda studzienka zawiera wystarczającą ilość podłoża E3, aby przykryć zarodki.Wyjąć fiolki zawierające związki inhibitorowe przechowywane w lodówce w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Za pomocą wagi analitycznej zważyć odpowiednią ilość związku i przygotować 250 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu podstawowego dla każdego związku w pożywce E3 lub innym odpowiednim rozpuszczalniku. Następnie użyj pożywki E3 do seryjnych rozcieńczeń roztworów podstawowych w oparciu o poziomy toksyczności w 15-mililitrowych probówkach wirówkowych.Z dołków, z których każdy zawiera jeden zarodek DPF, użyj pipety Pasteura i pipety o pojemności 1 mililitra, aby usunąć wodę E3 po jednym rzędzie na raz. Natychmiast rozprowadzić 1 mililitr każdego rozcieńczalnika roztworów podstawowych do dołków płytki 24-dołkowej, zaczynając od niższego i przechodząc do wyższego stężenia. W przypadku grup kontrolnych dodać wodę E3 lub inny odpowiedni rozpuszczalnik.Oznaczyć 24-dołkowe płytki nazwą i stężeniem związku i przechowywać płytki w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza w inkubatorze. Należy uważać, aby rozcieńczalniki chemikaliów w studzienkach nie zostały odparowane w inkubatorze, uszczelniając boki płytki 24-dołkowej. Dwadzieścia cztery godziny po ekspozycji na związki chemiczne użyj pipety Pasteura, aby przenieść larwy wystawione na każde stężenie związku na małej szalce Petriego zawierającej 3% metylocelulozy o wysokiej masie cząsteczkowej.Za pomocą metalowej sondy połóż go bokiem. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym podłączonym do aparatu. Zrób zdjęcia i zapisuj je w osobnym folderze każdego dnia aż do końca eksperymentu.Każdego dnia wprowadzaj wszystkie obserwacje do tabeli, w tabeli online lub na wydrukowanym arkuszu. W przypadku narażenia na związki neurotoksyczne, cztery do pięciu larw DPF może wykazywać nieprawidłowy wzorzec pływania. W takim przypadku należy zapisać takie zmiany, nagrywając krótki film przedstawiający larwy trwający od 30 sekund do jednej minuty.Po pięciu dniach ekspozycji na związki chemiczne zanotuj stężenie, przy którym połowa zarodków umiera, jako połowę maksymalnego stężenia śmiertelnego 50 każdej substancji chemicznej. Skonstruuj krzywą śmiertelności zarodków dla wszystkich stężeń za pomocą odpowiedniego programu. W tym protokole krytyczną częścią oceny toksyczności jest badanie różnych stężeń jednego lub wielu związków chemicznych w jednym eksperymencie.W przypadku związków, które wywołują jakiekolwiek defekty fenotypowe u larw, wady rejestrowano co 24 godziny przez okres od jednego do pięciu dni po ekspozycji na substancję chemiczną. Zarodki leczone inhibitorami beta CA w stężeniach 250 mikromolowych i 125 mikromolowych wykazują różne wady fenotypowe w porównaniu z kontrolą. Na przykład niewyklute zarodki nawet w 3 dniu, zakrzywiona budowa ciała, niewykorzystany woreczek żółtkowy i obrzęk osierdzia oraz brak woreczków otolitowych u larw po pięciu dniach od leczenia.W innym badaniu zarodki leczone inhibitorami CA wykazały brak woreczków otolitowych i pęcherza pławnego. W eksperymentach zidentyfikowano reprezentatywny związek anhydrazy węglanowej 9, który indukował minimalne lub żadne zmiany fenotypowe podczas rozwoju embrionalnego przy 500 mikromolach. Związek ten wykazywał wysokie stężenie LC50.Jednak w porównaniu z grupą kontrolną stwierdzono, że ten sam związek o masie 300 mikromolów jest neurotoksyczny i wywołuje ataksję u larw po pięciu dniach ekspozycji. Dobra jakość zarodków jest ważna dla badań przesiewowych toksyczności substancji chemicznych. Aby uzyskać dobrej jakości zarodki, do hodowli użyj młodej pary dorosłego danio pręgowanego.Związki, które okażą się bezpieczne, można dodatkowo scharakteryzować, przeprowadzając odpowiednie eksperymenty in vitro i in vivo. W dziedzinie opracowywania leków przeciwgruźliczych technika ta pomogła w przygotowaniu dalszych eksperymentów mających na celu hamowanie in vivo Mycobacterium marinum w zarodkach danio pręgowanego. Protokół zakłada stosowanie substancji chemicznych, które mogą być toksyczne dla ludzi.Osoby biorące udział w eksperymentach powinny zachować należytą ostrożność podczas obchodzenia się z chemikaliami.

rapid-evaluation-toxicity-chemical-compounds-using-zebrafish

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym artykule, zarodki danio pręgowanego są wykorzystywane do badań przesiewowych toksyczności chemicznej. Toksyczność chemiczna jest skorelowana z odczytami fenotypu. W protokole próbki przedstawiono metodologiczne podejście do przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności chemicznej.

Badania przesiewowe toksyczności chemicznej na podstawie zarodków: ocena wpływu na rozwój zarodków danio pręgowanego

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem doświadczalnym do badania procesów rozwojowych kręgowców i modelowania chorób ludzkich. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób przeprowadzić ręczne, wysokoprzepustowe badanie chemiczne na zarodkach danio pręgowanego z odczytem hybrydyzacji in situ (WISH) w całości.

Ręczne badanie przesiewowe małych cząsteczek zbliżające się do wysokiej przepustowości przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Narażenie na teratogeny może powodować wady wrodzone. Danio pręgowany jest przydatny do określania potencjału teratogennego chemikaliów. Wykazujemy użyteczność danio pręgowanego, wystawiając zarodki na działanie różnych poziomów azotynów, a także w różnych momentach ekspozycji. Pokazujemy, że azotyny mogą być toksyczne i powodować poważne wady rozwojowe.

Danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów

Danio pręgowany został ostatnio wykorzystany jako model do walidacji potencjalnych modyfikatorów promieniowania. Niniejszy protokół opisuje szczegółowe kroki w celu wykorzystania zarodków danio pręgowanego do eksperymentów przesiewowych opartych na promieniowaniu oraz niektóre podejścia obserwacyjne do oceny wpływu różnych metod leczenia i promieniowania.

Larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Przedstawiamy nowatorskie podejście do ilościowego określania lokalizacji nanocząsteczek w naczyniach krwionośnych ludzkich guzów ksenoprzeszczepionych z wykorzystaniem dynamicznego obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym w modelu zarodka ptaka.

Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Zespół transfuzji bliźniak-bliźniak oraz sekwencja anemii i policytemii u bliźniąt to dwa potencjalnie dewastujące problemy w medycynie perinatalnej. Obie te zaburzenia występują wyłącznie u bliźniąt monochorialnych i wynikają z niezrównoważonego przepływu krwi przez naczyniowe anastomozy łożyskowe. Przedstawiamy prosty protokół służący do dokładnej oceny obecności anastomoz naczyniowych za pomocą wstrzykiwania barwnika do naczyń łożyska po urodzeniu.

Dokładna i prosta ocena anastomoz naczyniowych w łożysku jednojajuszowym z wykorzystaniem barwnika

Zebrafish stanowią cenny model do badania mechanizmów regeneracji serca u kręgowców. W niniejszym protokole przedstawiamy metodę indukcji zawału serca u dorosłych osobników tego gatunku z wykorzystaniem kriourazu. Metoda ta prowadzi do masowej śmierci komórek w obrębie 20% ściany komory, co przypomina zmiany obserwowane w zawałach u ssaków.

Indukcja zawału mięśnia sercowego u dorosłych rybek danio-osterskich z wykorzystaniem kriourazu

Opisujemy tutaj metodę obrazowania opartego na światłowodowej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (FCFM), która zapewnia innowacyjny sposób zrozumienia zjawisk fizjologicznych na poziomie komórkowym i subkomórkowym u zwierząt.

Toksyczność naczyniowa wywołana chemioterapią - obrazowanie in vivo w czasie rzeczywistym upośledzenia naczyń krwionośnych

Poznaj szybką metodę oceny toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego. Protokół pozwala wykryć subtelne efekty toksyczne i działania poza docelowymi we wczesnej fazie badań.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów