Name: Tworzenie materiału rekombinowanych nici pajęczych poprzez solwatację wodną przy użyciu ciepła i ciśnienia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę solwatacji wodnej rekombinowanych nici pajęczych przy użyciu ciepła i ciśnienia. Technika ta umożliwia tworzenie różnych form materiałowych zachowujących właściwości jedwabiu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną wyrazić wdzięczność za finansowanie z inicjatywy Utah Science and Technology Research (USTAR).

1. Przygotowanie mieszanki rekombinowanej pajęczej nici z liofilizowanych białek
<ol>
	<li>Określ niezbędną formułę i objętość wymaganą dla zamierzonych formacji materiałowych. Typowe formulacje wahają się od 3% (w/v) do 15% (w/v). Korzystając z tego wyboru, oblicz odpowiednie rSSp, stężenia i stosunki.
	<ol>
		<li>Do przygotowania każdego materiału opisanego w niniejszym protokole należy użyć następujących odpowiednich preparatów: hydrożele/gąbki/lyogele, 6% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2; folie/powłoki, 5% (w/v) 80:20 MaSp1:MaSp2; kleje, 12% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2; włókna, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1:MaSp2. 
		UWAGA: Mimo że większość preparatów jest lepiej dopasowana do określonych form i materiałów, istnieje szeroka gama receptur, które często mogą się pokrywać. Dodatkowo, końcowe materiały rSSp mogą być również dostosowywane podczas formowania i przetwarzania, aby uzyskać pożądane właściwości. Ogólnie rzecz biorąc, każde białko będzie wymagało zbadania odpowiednich lub użytecznych parametrów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz czystą i nową fiolkę o pojemności 8 ml z autoklawowalnym szkłem borokrzemianowym z gumową nakrętką.</li>
	<li>Zdjąć nakrętkę i umieścić pustą fiolkę na wadze analitycznej. Staruj masę pustej fiolki tak, aby waga wskazywała masę zerową.</li>
	<li>Dodaj żądany liofilizowany proszek rSSp do pustej fiolki dla każdego konkretnego materiału.
	<ol>
		<li>Przygotowując 2 ml roztworu, należy użyć tych określonych mas każdego rodzaju białka dla każdego materiału: hydrożele/gąbki/lyogele, 60 mg MaSp1 i 60 mg MaSp2; folie/powłoki, 80 mg MaSp1 i 20 mg MaSp2; kleje, 120 mg MaSp1 i 120 mg MaSp2; włókna, 200 mg MaSp1 i 50 mg MaSp2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj żądaną ilość ultraczystej wody, co najmniej 2 ml, do fiolki, która zawiera już ważone proszki rSSp. 
	UWAGA: Minimalna objętość 2 ml jest zalecana dla wszystkich procedur solwatacji.</li>
	<li>Uszczelnić nakrętkę fiolki i energicznie rozmieszać zawartość, aby utworzyć rozproszoną i jednorodną mieszaninę rSSp, która jest teraz gotowa do procedury solwatacji. Dodatkowe podejścia do homogenizacji, takie jak sonikacja lub mieszanie wirnikowe, mogą być stosowane z lub dodatkowo z mieszaniem wirowym.</li>
</ol>
2. Rekombinowana solwatacja pajęczej nici
UWAGA: Podczas procedury solwatacji generowane są wysokie temperatury i ciśnienia. Do tego procesu wymagane są odpowiednie środki ochrony osobistej, zwłaszcza okulary, długie rękawy i rękawice odporne na ciepło.
<ol>
	<li>Przeprowadzić końcową kontrolę nakrętki fiolki lub naczynia, aby upewnić się, że została mocno i bezpiecznie dokręcona. Następnie przenieś zawieszoną mieszaninę rSSp do konwencjonalnej kuchenki mikrofalowej. 
	UWAGA: Jednostki mikrofalowe w zakresie mocy od 700 do 1,500 watów, o mniejszej pojemności komory wewnętrznej i platformach obrotowych są zalecane w celu zapewnienia lepszych warunków solwatacji.</li>
	<li>Rozpocznij pracę kuchenki mikrofalowej od 5 s impulsów z pełną mocą. Po każdym pęknięciu należy na krótko otworzyć drzwiczki i ostrożnie wymieszać/zawirować fiolkę, aby zapobiec osiadaniu i utrzymać zawieszoną mieszaninę.</li>
	<li>Powtarzać ten proces mikrofalowy do momentu, gdy mieszanina i/lub roztwór osiągną temperaturę co najmniej 130 °C, mierzoną termometrem na podczerwień bezpośrednio w stosunku do roztworu zawierającego porcje fiolki. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie cząstki stałe zostaną całkowicie rozpuszczone i nie będą już widoczne. 
	UWAGA: Zaleca się, aby od czasu do czasu pozostawić fiolkę i roztwór do ostygnięcia, zwłaszcza jeśli preparat zawiera wysokie stężenie rSSp. Temperatury przekraczające 200 °C zwiększają ryzyko uszkodzenia uszczelki fiolki. Należy również zwrócić szczególną uwagę, aby przegrzana mieszanina/roztwór nie dotknęła uszczelki, co również spowoduje uszkodzenie hermetyzacji fiolki.</li>
	<li>Po pomyślnym solwatowaniu mieszaniny rSSp do roztworu, przed otwarciem należy odczekać, aby temperatura roztworu i nasadki fiolki ostygła poniżej 100 °C (temperatura wrzenia).</li>
</ol>
3. Hydrożele
<ol>
	<li>Przygotuj hydrożel z roztworu po wyjęciu go z kuchenki mikrofalowej i pozostawieniu do ostygnięcia i stężenia. Odlej hydrożel do określonej geometrii przed pozostawieniem go do całkowitego ostygnięcia. 
	UWAGA: Różne rSSps będą wymagały różnej ilości czasu, aby przejść na hydrożel. Na przykład sekwencje podobne do MaSp2 mają tendencję do szybszego tworzenia hydrożeli w porównaniu z sekwencjami podobnymi do MaSp1. Stężenie białka, zasolenie i pH również bezpośrednio wpływają na szybkość przejścia do hydrożelu.</li>
</ol>
4. Gąbki
<ol>
	<li>Przygotuj gąbki rSSp, najpierw pozwalając, aby pierwszorzędowy solwatowany roztwór utworzył hydrożel.</li>
	<li>Umieść hydrożel w łaźni wodnej, umieść tę kąpiel w zamrażarce w temperaturze -20 °C i poczekaj, aż kąpiel całkowicie zamarznie.</li>
	<li>Zakończyć proces formowania gąbki, wyjmując zamrożony hydrożel i łaźnię wodną z zamrażarki i rozmrażając w temperaturze 25 °C. Powstałą w ten sposób gąbkę można teraz wyjąć z rozmrożonej wody.</li>
</ol>
5. Lyogel
<ol>
	<li>Przygotować lyożel rSSp, bezpośrednio zamrażając utworzony hydrożel, z kąpielą wodną lub bez, i przenosząc zamrożoną próbkę hydrożelu do liofilizatora (liofilizatora).</li>
	<li>Usuń ostatni liofilizowany materiał żelowy z naczynia, w którym nastąpiła sublimacja wilgoci.</li>
</ol>
6. Folie i powłoki
<ol>
	<li>Użyj jednej z trzech następujących metod: odlewanie roztworem, natryskiwanie roztworem lub powlekanie zanurzeniowe w celu wytworzenia powłok lub powłok rSSp.
	<ol>
		<li>Odlewać rozpuszczony roztwór jedwabiu do/na formy PDMS o pożądanym kształcie.</li>
		<li>Wlać i rozprowadzić 200 μl roztworu folii i pozostawić do wyschnięcia przed oderwaniem ich od podłoża PDMS w celu przeprowadzenia testów lub obróbki.</li>
		<li>Po pozostawieniu ich do wyschnięcia, usuń uformowane folie do testów mechanicznych lub poddaj je obróbce końcowej, aby poprawić właściwości mechaniczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przygotować powłokę lub folię, której nie można usunąć z podłoża, należy użyć powłoki natryskowej lub zanurzeniowej, aby uzyskać cienką warstwę warstwy. 
	UWAGA: Aby natryskować powłokę, ten protokół okazał się skuteczny w przypadku głównego modelu aerografu do malowania natryskowego.
	<ol>
		<li>Uformuj powłokę zanurzeniową, po prostu zanurzając wybrane podłoże w rozpuszczonym rSSp i powtórz po wyschnięciu, aby uzyskać pożądaną grubość.</li>
		<li>Wykonaj wstępną warstwę natryskową przed nałożeniem warstwy zanurzeniowej, aby zwiększyć konsystencję i skuteczność końcowej powłoki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Kleje
UWAGA: Tworzenie klejów odbywa się za pomocą jednej z następujących metod.
<ol>
	<li>Bezpośrednio dodać rozpuszczony rSSp na podłoże, a następnie nałożyć drugi substrat na wierzch roztworu. Mocno zacisnąć kawałki razem, a następnie suszyć próbki w piecu o minimalnej temperaturze 25 °C przez co najmniej 16 godzin.</li>
	<li>Alternatywnie należy spryskać dwie powierzchnie podłoża powłoką natryskową, a następnie zacisnąć podłoża razem.</li>
	<li>Nakładanie rSSp metodą zanurzeniową polegającą na powlekaniu podłoży i przyklejaniu podłoży może być również stosowane do przygotowania i klejenia.</li>
</ol>
8. Włókna przędzone na mokro
<ol>
	<li>Załadować rozpuszczony roztwór domieszkowy do koncentrycznej strzykawki z końcówką Luer-Lok przez igłę ślizgową 19 G. Wyrzuć pęcherzyki powietrza i pozwól dozórce osiąść na końcu strzykawki Luer-Lok.</li>
	<li>Włóż co najmniej 25 mm rurki PEEK o średnicy wewnętrznej 0.01 cala do jednoczęściowych, szczelnych złączek palcowych rurki PEEK dla średnicy zewnętrznej 1/16 cala i stożka 10/32. Podłącz tę złączkę do rurki PEEK do żeńskiego adaptera Luer-Lok.
	<ol>
		<li>Wymienić igłę o rozmiarze 19 na ten zestaw na załadowanej strzykawce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij wysoką, przezroczystą szklaną wannę 99% czystym izopropanolem, aby użyć jej do kąpieli krzepnięcia.
	<ol>
		<li>Napełnij wanny rozciągliwe, znajdujące się poniżej rozciągliwych wanny. Będą one zawierały izopropanol w proporcji 80:20: woda destylowana w pierwszej kąpieli rozciągającej i izopropanol w proporcji 20:80: woda destylowana w drugiej kąpieli rozciągającej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw system rozciągania godeta w taki sposób, aby pierwszy godet po kąpieli krzeprzepiącej i pierwszy godet w pierwszej kąpieli rozciągającej obracały się z tą samą prędkością.
	<ol>
		<li>Rozpocznij pierwsze rozciąganie, dostosowując do tej samej prędkości prędkość ostatniego gonetu w kąpieli rozciągającej 1, środkowego górnego godetu i pierwszego godeta w kąpieli rozciągającej 2. Prędkość ta będzie 2 razy większa niż początkowa prędkość usuwania włókien.</li>
		<li>Rozpocznij drugi odcinek, dostosowując prędkości końcowego gonetu w kąpieli rozciągającej 2, ostatniego górnego godetu i nawijarki do tej samej prędkości. Prędkość ta będzie 2 razy większa niż prędkość użyta do pierwszego odcinka lub 4 razy większa niż początkowa prędkość usuwania włókien.</li>
		<li>Umieść rękawice nitrylowe na zewnątrz pośrednich godetów, aby zapobiec ślizganiu się włókna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zacznij powoli wytłaczać roztwór do kąpieli krzepiącej. W zautomatyzowanym systemie ustaw szybkość wytłaczania tak, aby odpowiadała prędkości usuwania 10 mm/s.
	<ol>
		<li>Poczekaj, aż wytłaczanie włókien stanie się jednolite przed wyciągnięciem włókien z kąpieli za pomocą cienkiego metalowego haczyka lub kleszczy. Sprawdź, czy usunięcie włókna z kąpieli utworzyło pętlę między końcówką rurki PEEK a ścieżką włókna opuszczającego wannę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź odzyskane włókno przez szereg godetów tak, aby włókno było zanurzone w kąpielach rozciągliwych, ale schło w powietrzu między kąpielami rozciągającymi i przed umieszczeniem na szpuli. Suszenie to osiąga się dzięki wyżej umieszczonym godetom pośrednim. 
	UWAGA: Szybkość usuwania włókien i/lub szybkość wytłaczania będzie musiała zostać dostosowana w oparciu o stężenie białka, dodatki i rodzaj białka, aby zapewnić wystarczający czas krzepnięcia bez gromadzenia się włókien na dnie kąpieli krzepiącej.</li>
	<li>Przymocuj całkowicie rozciągnięte włókno do szpuli na mechanizmie nawijarki za pomocą taśmy.</li>
</ol>

<ol><li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li>
<li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Than+Just+Fibers%3A+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li>
<li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sticky+Situation%3A+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955(2016).</li>
<li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li>
<li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li>
<li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li>
<li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Po oczyszczeniu rekombinowanych białek jedwabiu pajęczego należy je następnie przygotować w roztworze, który można wykorzystać do tworzenia materiału. Mieszając liofilizowane białko jedwabiu pajęczego z wodą i wystawiając tę mieszaninę na promieniowanie mikrofalowe w celu wytworzenia ciepła i ciśnienia, można przygotować roztwór rSSp. Dzięki tej prostej i wydajnej metodzie solubilizacji rSSp można uzyskać szeroką gamę form materiałowych. Każdy materiał musi być unikalnie przygotowany i przetworzony, aby osiągnąć pożądany...

Nici pajęcze wzbudziły zainteresowanie naukowców zajmujących się materiałami ze względu na ich imponującą kombinację wytrzymałości, elastyczności i biokompatybilności. Odtwarzanie włókien było tradycyjnie głównym celem badań. Wysiłki te były utrudnione przez nierozpuszczalność rekombinowanego białka jedwabiu pajęczego (rSSp) w wodzie, a także niezdolność tradycyjnych technik solwatacji (środków chaotropowych i detergentów) do uzyskania solwatacji wodnej. Co więcej, techniki, które zostały opracowane do solwatacji wersji rSSp, nie działają na wszystkich wariantach rSSp, a także wymagają znacznych manipulacji i czasu, co często prowadzi do utraty białka1,2. Doprowadziło to w dużej mierze do wykorzystania 1,1,1,3,3,3-heksafluoroizopropanolu (HFIP) jako rozpuszczalnika, z którego formuje się włókna i inne ograniczone formy materiałowe. Zaletą jest to, że wszystkie znane rSSp są rozpuszczalne w HFIP, co zapewnia jednolitość danych między każdą grupą badawczą. Wadą jest to, że HFIP jest toksycznym rozpuszczalnikiem, który jest drogi i niepraktyczny w skalowaniu ze względu na problemy zdrowotne i względy środowiskowe.
Opracowano nowatorskie podejście do solwatacji rSSp, które wypełniło lukę technologiczną między ostrym rozpuszczalnikiem organicznym HFIP a innymi technikami, które selektywnie działały dla solwatacji rSSp. Kombinację ciepła właściwego i ciśnień zastosowano do zawiesin rSSp i wody. Wyniki obejmowały bliską 100% solwatację i odzysk rSSp, a także wysokie stężenia białka; Na podstawie tych preparatów uznano, że możliwe są różne formy materiałów, które nie wszystkie były osiągalne przy użyciu HFIP lub innych rozpuszczalników organicznych3,4,5,6. Celem tego podejścia jest skuteczne i łatwe rozpuszczanie oczyszczonych i wysuszonych rekombinowanych białek pająka w roztworze wodnym, który można następnie wykorzystać do produkcji różnych form materialnych.
Włókna, folie, powłoki, kleje, hydrożele, lyogele, mikrosfery i materiały gąbkowe są łatwo osiągalne z tego samego wodnego roztworu rSSp przy użyciu tej metody. Ciągła ewolucja tej metody, nie tylko z dodatkowym rSSp, ale także z innymi białkami, może prowadzić do nowych form materiałów oraz alternatywnych sposobów oczyszczania i rozpuszczania białek.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 3 ml z końcówką Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Można używać strzykawek o innych rozmiarach, ale aby utrzymać końcówki, zaleca się użycie końcówek Luer-Lok</td></tr><tr><td>Fiolka hodowlana 4 mL, przezroczysta z gumową nasadką</td><td>Wheaton</td><td>225142</td><td>Minimalna objętość dozowania to 1 ml, maksymalna to 2 ml</td></tr><tr><td>Fiolka hodowlana 8 ml, przezroczysta z gumową nasadką</td><td>Wheaton</td><td>225144</td><td>Minimalna objętość dozownika to 2 ml, max to 4 ml</td></tr><tr><td>99% alkoholu izopropylowego, odczynnik ACS/USP Grade</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>231000099</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Plus</td><td>Labconco</td><td>7386030</td><td>Liofilizator</td></tr><tr><td>Luer Adapter żeński Luer x 10-32 żeński, Tefzel (ETFE)</td><td>IDEX</td><td>P-629</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Magic Chef</td><td>HMD1110B</td><td>120V, 60Hz AC; 1000 W; Pojemność 1,1 stopy sześciennej; ze szklanym stołem</td></tr> <tr><td>obrotowymJednoczęściowy stożek 10-32 Fingertight, do rurki 1/16" OD</td><td>IDEX</td><td>F-120X</td><td></td></tr><tr><td>PEEK 1/16" OD x 0,010" ID</td><td>IDEX</td><td>1531B</td><td></td></tr><tr><td>Opryskiwacz: Master Airbrush</td><td>Master Airbrush</td><td>TC-60</td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie materiału rekombinowanych nici pajęczych poprzez solwatację wodną przy użyciu ciepła i ciśnienia

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Wiele pająków wytwarza siedem rodzajów jedwabiu. Sześć jedwabi ma postać włókna, gdy są wytwarzane przez pająki. Włókna te nie są rozpuszczalne w wodzie. Aby odtworzyć niezwykłe właściwości mechaniczne pajęczych nici, muszą one być wytwarzane w heterologicznych żywicielach, ponieważ pająki są zarówno terytorialne, jak i kanibalistyczne. Syntetyczne analogi pajęczej nici są również nierozpuszczalne w roztworach wodnych. W związku z tym duży odsetek badań nad rekombinowanymi pajęczymi niciami opiera się na rozpuszczalnikach organicznych, które są szkodliwe dla produkcji materiałów na dużą skalę. Metoda naszej grupy wymusza solwatację tych rekombinowanych pajęczych nici w wodzie. Co ciekawe, gdy białka te są przygotowywane przy użyciu tej metody ciepła i ciśnienia, z tego samego roztworu rekombinowanych białek jedwabiu pajęczego (rSSp) można przygotować szeroką gamę form materiałowych, w tym: folie, włókna, gąbkę, hydrożel, lyożel i kleje. W artykule przedstawiono sposób wytwarzania solwatowanego rSSp i form materialnych w sposób łatwiejszy do zrozumienia niż na podstawie samych materiałów i metod pisanych.

Stosując opisaną metodę solubilizacji rSSp, można uzyskać różnorodne formy materiałowe, co przedstawiono na Rysunku 1. Metoda solubilizacji polega na poddaniu zawiesiny rSSp w wodzie działaniu ciepła i ciśnienia generowanych przez konwencjonalną kuchenkę mikrofalową. Po osiągnięciu temperatur i ciśnień krytycznych białko ulegnie solubilizacji. W oparciu o ten roztwór solubilizowanego rSSp przedstawiono wymagane warunki dla siedmiu form materiałowych: hydrożel...

Tutaj prezentujemy protokół produkcji rozpuszczalnych w wodzie rekombinowanych roztworów białek pajęczej nici oraz form materialnych, które mogą być formowane z tych roztworów.

Tworzenie materiału rekombinowanych nici pajęczych poprzez solwatację wodną przy użyciu ciepła i ciśnienia

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Ta metoda rozpuszczania rekombinowanych pajęczych nici wytwarza formy materiałowe, które nie są możliwe przy użyciu tradycyjnych ostrych rozpuszczalników organicznych. Co więcej, proces ten polega na ziarnie, w wyniku czego w wodzie powstaje prosty roztwór białka. Dzięki zastosowaniu tej metody uformowane lub wyprodukowane materiały zachowują pożądane cechy białek jedwabiu pajęczego.Ta technika rozpuszczania rekombinowanych nici pajęczych pozwala na solubilizację rekombinowanych nici pajęczych w jednoetapowym procesie. Jest to pożądane, ponieważ te notorycznie trudne do wyprodukowania białka nie są tracone w wyniku intensywnego przetwarzania. Ponadto, ponieważ roztwory są tylko białkiem w wodzie, można dodać inne biologicznie aktywne związki, jeśli jest to pożądane w danym zastosowaniu.W szczególności związek funkcji struktury białka, system ten jest memetyczny do sposobu, w jaki pająk wytwarza włókno, ponieważ wykorzystuje wodę i białka w wysokim stężeniu. Stosując tę metodę rozpuszczania i późniejszego tworzenia materiału, powinno być możliwe zrozumienie materiałów, które są formowane, oraz struktur, które są za nie odpowiedzialne. Uważa się, że może tak być, użyliśmy tej techniki do rozpuszczania syntetycznych peptydów, które w przeciwnym razie wymagałyby alkalicznego lub kwaśnego środowiska do solwatacji.Może to być korzystne w dalszych zastosowaniach tych peptydów. Co więcej, wiele znanych białek, gdy ulegają syntetycznej ekspresji, ma tendencję do kończenia we frakcji nierozpuszczalnej. Resolubilizacja, a następnie ponowne fałdowanie tych białek jest często pracochłonnym procesem, który powoduje duże straty.Wykorzystując tę technikę, możliwe będzie zwiększenie efektywności procesów odzyskiwania białek nierozpuszczalnych. Umieszczenie szczelnie zamkniętej fiolki w kuchence mikrofalowej jest nieco zniechęcające, co stwarza ryzyko przegrzania, a tym samym nadmiernego ciśnienia w fiolce. Zrozumienie etapowego podejścia do stosowania ciepła i ciśnienia ma kluczowe znaczenie.Po drugie, w szczególności w przypadku rekombinowanej nici pajęczej, obecność soli nie pozwoli technice działać lub działać tak skutecznie, w zależności od tego, ile soli jest obecne. Usuwanie soli jest kluczowe. Bądź cierpliwy i ostrożny, ściśle monitoruj czas pracy w kuchence mikrofalowej i temperaturę wewnątrz fiolki.Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ istnieje wiele ruchomych części do działania, które często są trudne do przekazania za pomocą tradycyjnych materiałów pisemnych i sekcji metody. Biorąc pod uwagę, że istnieje wiele białek, które mają problemy z rozpuszczalnością, które uniemożliwiają odpowiednie badanie, metoda ta może być potencjalnie stosowana w różnych przestrzeniach białkowych w celu ulepszenia, a nawet umożliwienia technik analitycznych i charakteryzacji. Aby rozpocząć, wybierz czystą i nową ośmiomililitrową autoklawowalną fiolkę do hodowli bakterii ze szkła borokrzemianowego z gumową zakrętką i umieść pustą fiolkę na wadze analitycznej.Rozerwać masę pustej fiolki tak, aby waga wskazywała masę zerową. Dodaj żądany liofilizowany rekombinowany proszek białka jedwabiu pajęczego do pustej fiolki dla określonego materiału. Następnie dodaj żądaną ilość ultra czystej wody, co najmniej dwa mililitry, do fiolki.Zamknij nakrętkę fiolki i energicznie rozprowadź zawartość, aby utworzyć zdyspergowaną i jednorodną mieszaninę rekombinowanych białek pajęczego jedwabiu. Przeprowadzić końcową kontrolę nasadki fiolki, aby upewnić się, że została mocno i bezpiecznie dokręcona. Następnie przenieś zawieszoną mieszaninę rekombinowanych białek jedwabiu pajęczego do konwencjonalnej kuchenki mikrofalowej o zakresie mocy od 700 do 1500 watów.Rozpocznij pracę kuchenki mikrofalowej od pięciosekundowych impulsów ustawionych na pełną moc, ręcznie włączając i wyłączając. Po każdym pęknięciu należy na krótko otworzyć drzwiczki i ostrożnie wymieszać fiolkę, aby zapobiec osiadaniu, i utrzymywać zawieszoną mieszaninę. Od czasu do czasu należy odczekać, aż fiolka i roztwór ostygną i nie dopuścić do zetknięcia się przegrzanego roztworu z uszczelką.Użyć termometru na podczerwień, aby zmierzyć temperaturę roztworu zawierającego porcję fiolki. Powtarzaj proces mikrofalowy, aż temperatura osiągnie co najmniej 130 stopni Celsjusza, a wszystkie cząstki stałe zostaną całkowicie rozpuszczone. Następnie pozwól, aby temperatura roztworu i nakrętki fiolki ostygła poniżej 100 stopni Celsjusza.Przed całkowitym schłodzeniem tego roztworu należy go odlać z fiolki w określonej geometrii, aby utworzyć hydrożel. Po uformowaniu hydrożelu umieść go w łaźni wodnej i przenieś do zamrażarki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Poczekaj, aż kąpiel całkowicie zamarznie.Zakończ proces formowania gąbki, wyjmując zamrożony hydrożel i łaźnię wodną z zamrażarki i rozmrażając w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie wyjmij powstałą gąbkę z rozmrożonej wody. Aby przygotować liożel, przenieś zamrożoną próbkę hydrożelu do liofilizatora.Po 24 godzinach usuń ostatni liofilizowany materiał żelowy z naczynia. Aby wytworzyć filmy z rekombinowanego białka jedwabiu pajęczego, odlej 200 mikrolitrów rozpuszczonego na gorąco rekombinowanego białka jedwabiu pajęczego z fiolki na formę PDMS o pożądanym kształcie. Po wysuszeniu oderwij go od podłoża PDMS w celu przetestowania lub leczenia.Aby przygotować powłokę, której nie można usunąć z podłoża, użyj rozpylacza aerografu, aby nałożyć rozpuszczone rekombinowane białko jedwabiu pajęczego, aby wykonać wstępną powłokę natryskową na wybranym podłożu. Po wysuszeniu zanurz powlekane podłoże w rozpuszczonym rekombinowanym białku jedwabiu pajęczego, aby utworzyć powłokę zanurzeniową. Powtórz powlekanie zanurzeniowe, aby uzyskać pożądaną grubość.Aby utworzyć kleje, za pomocą pipety dodaj rozpuszczone rekombinowane białko jedwabiu pajęczego na podłoże, a następnie nałóż drugi substrat na wierzch roztworu. Mocno zaciśnij kawałki razem, a następnie susz próbki w piecu o minimalnej temperaturze 25 stopni Celsjusza przez co najmniej 16 godzin. Aby wytworzyć mokre włókna przędzione, użyj igły ślizgowej o rozmiarze 19 i załaduj rozpuszczony roztwór domieszkujący do koncentrycznej strzykawki z końcówką Luer lock.Usunąć pęcherzyki powietrza i pozostawić dozróbek na końcu strzykawki Luer lock. Włóż co najmniej 25 milimetrów rurki PEEK do jednoczęściowych szczelnych złączek palcowych rurki PEEK dla jednej średnicy zewnętrznej ponad 16 cali i 10 ponad 32 grzebienia. Wymień igłę o rozmiarze 19 na tę konfigurację na żeńskim adapterze Luer lock strzykawki.Następnie umieść rękawice nitrylowe na zewnątrz pośrednich godetów, aby zapobiec ślizganiu się włókna, które ma być generowane, i aby uniknąć uszkodzenia silników. Zaopatrz się w wysoką, przezroczystą szklaną wannę z 99% czystym izopropanolem do użycia jako kąpiel koagulacyjną. Napełnij pierwszą kąpiel rozciągającą izopropanolem i wodą destylowaną w proporcji 80 do 20.W drugiej kąpieli rozciągającej napełnij izopropanol i wodę destylowaną w proporcji od 20 do 80. Skonfiguruj system Godet stretch na komputerze. Aby dostosować główną prędkość usuwania włókna, wyreguluj drążek przesuwny dla prędkości trypletu Godet A do wartości od 10 do 14 milimetrów na sekundę, w zależności od tego, jak dobrze i szybko tworzy się światłowód.Zainicjuj pierwsze rozciąganie, przesuwając drążek rozciągliwy godeta potrójnego B do dwóch Dla ostatniego gonetu w kąpieli rozciągającej jeden, środkowego górnego godetu i pierwszego godeta w kąpieli rozciągającej dwa. Zainicjuj drugie rozciąganie, przesuwając drążek rozciągliwy godeta potrójnego C na dwa dla końcowego gonetu w kąpieli rozciągającej dwa, ostatniego górnego godetu i nawijarki. Taka konfiguracja zapewnia, że pierwszy godet po kąpieli krzeprzepiącej i pierwszy godet w pierwszej kąpieli rozciągającej obracają się z tą samą prędkością.Następnie załaduj roztwór jedwabiu do strzykawki niestandardowego przyrządu do wirowania. W zautomatyzowanym systemie ustaw szybkość wytłaczania na 10 milimetrów na sekundę, aby wytłaczać roztwór jedwabiu do szklanej kąpieli koagulacyjnej wypełnionej izopropanolem. Pozwól, aby wytłaczanie włókien stało się jednolite, zanim wyciągniesz włókna z kąpieli za pomocą cienkiego metalowego haczyka.Sprawdź, czy usunięcie włókna z kąpieli tworzy pętlę między końcówką rurki PEEK a ścieżką włókna opuszczającego kąpiel. Przeprowadź odzyskane włókno przez szereg godetów, tak aby włókno było zanurzone w kąpielach rozciągliwych, ale suszyło się w powietrzu między kąpielami rozciągającymi i przed umieszczeniem na szpuli. W tym protokole poprzez rozpuszczalność rekombinowanego białka jedwabiu pajęczego można uzyskać różnorodne formy materiałowe.Prezentowanych jest tu siedem form materialnych. Hydrożele, lyogele, gąbki, kleje, powłoki, folie i włókna. Włókna wymagają najdalej idącej obróbki poprzez wytłaczanie do kąpieli koagulacyjnej, a następnie seryjne rozciąganie surowego włókna w kąpielach po wydrążeniu.Biorąc pod uwagę, że roztwory białka i wody są podgrzewane do stosunkowo wysokiej temperatury i ciśnienia, z naszego doświadczenia wynika, że roztwory są sterylne w momencie solwatacji białka. Dzięki temu każda z przedstawionych tutaj form materiału może zostać przeniesiona do hodowli komórkowej, o ile jest odpowiednio traktowana, w celu zbadania odpowiedzi komórkowej na materiały. Z pewnością technika ta doprowadziła do odkrycia nowych form materiałów, w tym klejów i materiału gąbczastego.Formy materiałowe, które niekoniecznie są zorientowane na tworzenie włókien, chociaż tworzenie włókien jest jednym z obszarów, w których również nastąpiła poprawa dzięki rozwojowi tej techniki. Wytwarzanie ciepła i ciśnienia wewnątrz szczelnie zamkniętej fiolki wiąże się z nieodłącznym niebezpieczeństwem. Podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze nosić środki ochrony osobistej.

material-formation-recombinant-spider-silks-through-aqueous-solvation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym materiale opisujemy wydajną strategię usuwania gruczołów jedwabniczych z odwłoka samic czarnej wdowy. Procedura ta umożliwia szybką izolację siedmiu odrębnych gruczołów jedwabniczych w sposób wysoce oczyszczony, co stanowi istotny proces dla badaczy zajmujących się produkcją jedwabiu pająków oraz montażem włókien.

Mikrodysekcja gruczołów produkujących jedwab u pająka wdowie czarne

Pomimo wyjątkowych właściwości mechanicznych i biochemicznych jedwabiu pająków, materiał ten nie może być pozyskiwany w dużych ilościach metodami konwencjonalnymi. W niniejszej pracy opisujemy efektywną strategię przędzenia sztucznych włókien jedwabiu pająka, co stanowi istotny proces dla badaczy analizujących produkcję jedwabiu pająków oraz jego zastosowanie jako biomateriałów nowej generacji.

Produkcja syntetycznego jedwabiu pajęczego w skali laboratoryjnej

Włókna pajęczego jedwabiu wykazują niezwykłe właściwości mechaniczne. Zmodyfikowany Araneus diadematus Fibroin 4 (eADF4) może być przetwarzany na siatki włókninowe za pomocą elektroprzędzenia. W tym przypadku siatki włókninowe eADF4 są stosowane w celu poprawy wydajności urządzeń filtrujących powietrze.

Urządzenia filtrujące powietrze, w tym siatki włókninowe z elektroprzędzonych rekombinowanych białek jedwabiu pajęczego

Mieszanie to efektywne podejście do generowania biomateriałów o szerokim zakresie właściwości i połączonych cechach. Przewidując interakcje molekularne między różnymi naturalnymi białkami jedwabiu, można zaprojektować nowe platformy ze stopów białek jedwabiu i jedwabiu o regulowanej odporności mechanicznej, reakcji elektrycznej, przezroczystości optycznej, przetwarzalności chemicznej, biodegradowalności lub stabilności termicznej.

Projektowanie materiałów ze stopów białek jedwabiu i jedwabiu do zastosowań biomedycznych

Przedstawiono protokół mikroprzepływowego przędzenia i charakterystyki mikrostruktury regenerowanego jedwabnego włókna fibroinowego.

Mikroprzepływowe przędzenie na sucho i charakterystyka regenerowanych włókien fibroiny jedwabiu

Ten protokół demonstruje zdolność do wykorzystania reaktywnego druku atramentowego do drukowania samoruchomych, biokompatybilnych i przyjaznych dla środowiska mikromieszadeł do użytku w zastosowaniach biomedycznych i środowiskowych.

Reaktywny druk atramentowy i analiza napędu samobieżnych mikromieszadeł na bazie jedwabiu

Opisano metodę obrazowania za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) w trybie stukowym (tapping mode) w celu wizualizacji plazmidowego DNA, białek cytoplazmatycznych oraz kompleksów DNA-białko. Metoda obejmuje alternatywne podejścia do przygotowania próbek do obrazowania AFM po przeprowadzeniu manipulacji biochemicznych. DNA zawierające specyficzne regiony oddziałujące z białkami są obserwowane w warunkach buforu zbliżonego do fizjologicznego.

Wizualizacja rekombinowanego DNA i kompleksów białkowych przy użyciu mikroskopii sił atomowych

Wodne systemy dwufazowe były używane do jednoczesnego modelowania wielu populacji komórek. Ta szybka i łatwa metoda modelowania komórek wykorzystuje separację faz wodnych roztworów dekstranu i glikolu polietylenowego oraz napięcie międzyfazowe, które istnieje między tymi dwoma roztworami polimerów.

Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Opisujemy techniki mikrotworzenia cienkich warstw nanoporowatego złota za pomocą druku szablonowego i fotolitografii, a także metody hodowli komórek na mikrofabrykowanych wzorach. Ponadto opisano metody analizy obrazu w celu scharakteryzowania morfologii materiału i hodowanych komórek przy użyciu technik skaningowej mikroskopii elektronowej i fluorescencyjnej.

Mikrofabrykacja nanoporowatych wzorów złota do badań interakcji komórka-materiał

Omawiane są protokoły badania tworzenia się biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym, które naśladuje porowate media. Urządzenie mikroprzepływowe składa się z szeregu mikrofilarów i badane jest tworzenie biofilmu przez Pseudomonas fluorescens w tym urządzeniu.

Protokół tworzenia strumienia biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrofilarami

Poznaj metodę solwatacji wodnej rekombinowanych nici pajęczych przy użyciu ciepła i ciśnienia. Technika ta umożliwia tworzenie różnych form materiałowych zachowujących właściwości jedwabiu.

Tworzenie materiału rekombinowanych nici pajęczych poprzez solwatację wodną przy użyciu ciepła i ciśnienia

Przeglądaj więcej filmów