Tworzenie materiału rekombinowanych nici pajęczych poprzez solwatację wodną przy użyciu ciepła i ciśnienia

Ta metoda rozpuszczania rekombinowanych pajęczych nici wytwarza formy materiałowe, które nie są możliwe przy użyciu tradycyjnych ostrych rozpuszczalników organicznych. Co więcej, proces ten polega na ziarnie, w wyniku czego w wodzie powstaje prosty roztwór białka. Dzięki zastosowaniu tej metody uformowane lub wyprodukowane materiały zachowują pożądane cechy białek jedwabiu pajęczego.

Ta technika rozpuszczania rekombinowanych nici pajęczych pozwala na solubilizację rekombinowanych nici pajęczych w jednoetapowym procesie. Jest to pożądane, ponieważ te notorycznie trudne do wyprodukowania białka nie są tracone w wyniku intensywnego przetwarzania. Ponadto, ponieważ roztwory są tylko białkiem w wodzie, można dodać inne biologicznie aktywne związki, jeśli jest to pożądane w danym zastosowaniu.

W szczególności związek funkcji struktury białka, system ten jest memetyczny do sposobu, w jaki pająk wytwarza włókno, ponieważ wykorzystuje wodę i białka w wysokim stężeniu. Stosując tę metodę rozpuszczania i późniejszego tworzenia materiału, powinno być możliwe zrozumienie materiałów, które są formowane, oraz struktur, które są za nie odpowiedzialne. Uważa się, że może tak być, użyliśmy tej techniki do rozpuszczania syntetycznych peptydów, które w przeciwnym razie wymagałyby alkalicznego lub kwaśnego środowiska do solwatacji.

Może to być korzystne w dalszych zastosowaniach tych peptydów. Co więcej, wiele znanych białek, gdy ulegają syntetycznej ekspresji, ma tendencję do kończenia we frakcji nierozpuszczalnej. Resolubilizacja, a następnie ponowne fałdowanie tych białek jest często pracochłonnym procesem, który powoduje duże straty.

Wykorzystując tę technikę, możliwe będzie zwiększenie efektywności procesów odzyskiwania białek nierozpuszczalnych. Umieszczenie szczelnie zamkniętej fiolki w kuchence mikrofalowej jest nieco zniechęcające, co stwarza ryzyko przegrzania, a tym samym nadmiernego ciśnienia w fiolce. Zrozumienie etapowego podejścia do stosowania ciepła i ciśnienia ma kluczowe znaczenie.

Po drugie, w szczególności w przypadku rekombinowanej nici pajęczej, obecność soli nie pozwoli technice działać lub działać tak skutecznie, w zależności od tego, ile soli jest obecne. Usuwanie soli jest kluczowe. Bądź cierpliwy i ostrożny, ściśle monitoruj czas pracy w kuchence mikrofalowej i temperaturę wewnątrz fiolki.

Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ istnieje wiele ruchomych części do działania, które często są trudne do przekazania za pomocą tradycyjnych materiałów pisemnych i sekcji metody. Biorąc pod uwagę, że istnieje wiele białek, które mają problemy z rozpuszczalnością, które uniemożliwiają odpowiednie badanie, metoda ta może być potencjalnie stosowana w różnych przestrzeniach białkowych w celu ulepszenia, a nawet umożliwienia technik analitycznych i charakteryzacji. Aby rozpocząć, wybierz czystą i nową ośmiomililitrową autoklawowalną fiolkę do hodowli bakterii ze szkła borokrzemianowego z gumową zakrętką i umieść pustą fiolkę na wadze analitycznej.

Rozerwać masę pustej fiolki tak, aby waga wskazywała masę zerową. Dodaj żądany liofilizowany rekombinowany proszek białka jedwabiu pajęczego do pustej fiolki dla określonego materiału. Następnie dodaj żądaną ilość ultra czystej wody, co najmniej dwa mililitry, do fiolki.

Zamknij nakrętkę fiolki i energicznie rozprowadź zawartość, aby utworzyć zdyspergowaną i jednorodną mieszaninę rekombinowanych białek pajęczego jedwabiu. Przeprowadzić końcową kontrolę nasadki fiolki, aby upewnić się, że została mocno i bezpiecznie dokręcona. Następnie przenieś zawieszoną mieszaninę rekombinowanych białek jedwabiu pajęczego do konwencjonalnej kuchenki mikrofalowej o zakresie mocy od 700 do 1500 watów.

Rozpocznij pracę kuchenki mikrofalowej od pięciosekundowych impulsów ustawionych na pełną moc, ręcznie włączając i wyłączając. Po każdym pęknięciu należy na krótko otworzyć drzwiczki i ostrożnie wymieszać fiolkę, aby zapobiec osiadaniu, i utrzymywać zawieszoną mieszaninę. Od czasu do czasu należy odczekać, aż fiolka i roztwór ostygną i nie dopuścić do zetknięcia się przegrzanego roztworu z uszczelką.

Użyć termometru na podczerwień, aby zmierzyć temperaturę roztworu zawierającego porcję fiolki. Powtarzaj proces mikrofalowy, aż temperatura osiągnie co najmniej 130 stopni Celsjusza, a wszystkie cząstki stałe zostaną całkowicie rozpuszczone. Następnie pozwól, aby temperatura roztworu i nakrętki fiolki ostygła poniżej 100 stopni Celsjusza.

Przed całkowitym schłodzeniem tego roztworu należy go odlać z fiolki w określonej geometrii, aby utworzyć hydrożel. Po uformowaniu hydrożelu umieść go w łaźni wodnej i przenieś do zamrażarki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Poczekaj, aż kąpiel całkowicie zamarznie.

Zakończ proces formowania gąbki, wyjmując zamrożony hydrożel i łaźnię wodną z zamrażarki i rozmrażając w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie wyjmij powstałą gąbkę z rozmrożonej wody. Aby przygotować liożel, przenieś zamrożoną próbkę hydrożelu do liofilizatora.

Po 24 godzinach usuń ostatni liofilizowany materiał żelowy z naczynia. Aby wytworzyć filmy z rekombinowanego białka jedwabiu pajęczego, odlej 200 mikrolitrów rozpuszczonego na gorąco rekombinowanego białka jedwabiu pajęczego z fiolki na formę PDMS o pożądanym kształcie. Po wysuszeniu oderwij go od podłoża PDMS w celu przetestowania lub leczenia.

Aby przygotować powłokę, której nie można usunąć z podłoża, użyj rozpylacza aerografu, aby nałożyć rozpuszczone rekombinowane białko jedwabiu pajęczego, aby wykonać wstępną powłokę natryskową na wybranym podłożu. Po wysuszeniu zanurz powlekane podłoże w rozpuszczonym rekombinowanym białku jedwabiu pajęczego, aby utworzyć powłokę zanurzeniową. Powtórz powlekanie zanurzeniowe, aby uzyskać pożądaną grubość.

Aby utworzyć kleje, za pomocą pipety dodaj rozpuszczone rekombinowane białko jedwabiu pajęczego na podłoże, a następnie nałóż drugi substrat na wierzch roztworu. Mocno zaciśnij kawałki razem, a następnie susz próbki w piecu o minimalnej temperaturze 25 stopni Celsjusza przez co najmniej 16 godzin. Aby wytworzyć mokre włókna przędzione, użyj igły ślizgowej o rozmiarze 19 i załaduj rozpuszczony roztwór domieszkujący do koncentrycznej strzykawki z końcówką Luer lock.

Usunąć pęcherzyki powietrza i pozostawić dozróbek na końcu strzykawki Luer lock. Włóż co najmniej 25 milimetrów rurki PEEK do jednoczęściowych szczelnych złączek palcowych rurki PEEK dla jednej średnicy zewnętrznej ponad 16 cali i 10 ponad 32 grzebienia. Wymień igłę o rozmiarze 19 na tę konfigurację na żeńskim adapterze Luer lock strzykawki.

Następnie umieść rękawice nitrylowe na zewnątrz pośrednich godetów, aby zapobiec ślizganiu się włókna, które ma być generowane, i aby uniknąć uszkodzenia silników. Zaopatrz się w wysoką, przezroczystą szklaną wannę z 99% czystym izopropanolem do użycia jako kąpiel koagulacyjną. Napełnij pierwszą kąpiel rozciągającą izopropanolem i wodą destylowaną w proporcji 80 do 20.

W drugiej kąpieli rozciągającej napełnij izopropanol i wodę destylowaną w proporcji od 20 do 80. Skonfiguruj system Godet stretch na komputerze. Aby dostosować główną prędkość usuwania włókna, wyreguluj drążek przesuwny dla prędkości trypletu Godet A do wartości od 10 do 14 milimetrów na sekundę, w zależności od tego, jak dobrze i szybko tworzy się światłowód.

Zainicjuj pierwsze rozciąganie, przesuwając drążek rozciągliwy godeta potrójnego B do dwóch Dla ostatniego gonetu w kąpieli rozciągającej jeden, środkowego górnego godetu i pierwszego godeta w kąpieli rozciągającej dwa. Zainicjuj drugie rozciąganie, przesuwając drążek rozciągliwy godeta potrójnego C na dwa dla końcowego gonetu w kąpieli rozciągającej dwa, ostatniego górnego godetu i nawijarki. Taka konfiguracja zapewnia, że pierwszy godet po kąpieli krzeprzepiącej i pierwszy godet w pierwszej kąpieli rozciągającej obracają się z tą samą prędkością.

Następnie załaduj roztwór jedwabiu do strzykawki niestandardowego przyrządu do wirowania. W zautomatyzowanym systemie ustaw szybkość wytłaczania na 10 milimetrów na sekundę, aby wytłaczać roztwór jedwabiu do szklanej kąpieli koagulacyjnej wypełnionej izopropanolem. Pozwól, aby wytłaczanie włókien stało się jednolite, zanim wyciągniesz włókna z kąpieli za pomocą cienkiego metalowego haczyka.

Sprawdź, czy usunięcie włókna z kąpieli tworzy pętlę między końcówką rurki PEEK a ścieżką włókna opuszczającego kąpiel. Przeprowadź odzyskane włókno przez szereg godetów, tak aby włókno było zanurzone w kąpielach rozciągliwych, ale suszyło się w powietrzu między kąpielami rozciągającymi i przed umieszczeniem na szpuli. W tym protokole poprzez rozpuszczalność rekombinowanego białka jedwabiu pajęczego można uzyskać różnorodne formy materiałowe.

Prezentowanych jest tu siedem form materialnych. Hydrożele, lyogele, gąbki, kleje, powłoki, folie i włókna. Włókna wymagają najdalej idącej obróbki poprzez wytłaczanie do kąpieli koagulacyjnej, a następnie seryjne rozciąganie surowego włókna w kąpielach po wydrążeniu.

Biorąc pod uwagę, że roztwory białka i wody są podgrzewane do stosunkowo wysokiej temperatury i ciśnienia, z naszego doświadczenia wynika, że roztwory są sterylne w momencie solwatacji białka. Dzięki temu każda z przedstawionych tutaj form materiału może zostać przeniesiona do hodowli komórkowej, o ile jest odpowiednio traktowana, w celu zbadania odpowiedzi komórkowej na materiały. Z pewnością technika ta doprowadziła do odkrycia nowych form materiałów, w tym klejów i materiału gąbczastego.

Formy materiałowe, które niekoniecznie są zorientowane na tworzenie włókien, chociaż tworzenie włókien jest jednym z obszarów, w których również nastąpiła poprawa dzięki rozwojowi tej techniki. Wytwarzanie ciepła i ciśnienia wewnątrz szczelnie zamkniętej fiolki wiąże się z nieodłącznym niebezpieczeństwem. Podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze nosić środki ochrony osobistej.