Name: Codzienna fototerapia czerwonym światłem regulująca wzrost biofilmu Candida albicans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj metodę fototerapii czerwonym światłem o długości fali 635 nm w celu regulacji wzrostu biofilmu Candida albicans. Protokół ocenia wpływ światła na rozwój biofilmu przez 48 godzin, oferując potencjalną alternatywę dla tradycyjnych terapii przeciwgrzybiczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Pauli da Silveira, dr Cecílii Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawnowi M. Maule, Shane'owi M. Maule, dr Malvinowi N. Janalowi i dr Irianie Zanin za rozwój tego badania. Dziękujemy również dr Alexandrowi D. Johnsonowi (UCSF) za oddanie szczepu analizowanego w tym badaniu.

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotuj agar z dekstrozą sabourauda (SDA). Zawiesić 65 g SDA uzupełnionego chloramfenikolem (50 mg/l) w 1 000 ml wody destylowanej. Gotować, aby całkowicie rozpuścić pożywkę. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 15 PSI (121°C) przez 30 min. Schłodzić do temperatury 45-50 °C. Dobrze wymieszać i wlać 20 ml SDA do sterylnych płytek Petriego (rozmiar: 100 mm x 15 mm).</li>
	<li>Przygotować pożywkę na bazie azotu drożdżowego (YNB) uzupełnioną 100 mM glukozy, mieszając 6,7 g YNB i 18 g dekstrozy z 1,000 ml ultraczystej wody. Wymieszać za pomocą mieszadła i wysterylizować pożywkę za pomocą systemu filtrów próżniowych 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotuj RPMI, mieszając 10,4 g RPMI 1640 i 34,32 g kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS) z 1,000 ml ultraczystej wody. Wymieszać w mieszadle bez podgrzewania i dostosować pH do 7, dodając 1 N NaOH (Dodaj 2 g NaOH do 50 ml ultraczystej wody). Wysterylizuj pożywkę za pomocą systemu filtrów próżniowych 0,22 μm.</li>
</ol>
2. Pre-inokulum i inokulum
<ol>
	<li>Usuń mikroorganizm C. albicans SN425 z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozwól mu się rozmrozić w temperaturze otoczenia. Wysiew 10 μl kultury wyjściowej na szalkach Petriego zawierających SDA uzupełniony chloramfenikolem (50 mg/l). Inkubować szalki Petriego w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Po 48 godzinach inkubacji dodać 10 kolonii C. albicans do 10 ml pożywki na bazie azotu drożdżowego (YNB) uzupełnionej 100 mM glukozy i inkubować beztlenowo w temperaturze 37 °C przez 16 godzin dla pre-inokulum.</li>
	<li>Po inkubacji przez 16 godzin przygotować inokuluma, rozcieńczając kultury starterowe na świeżej pożywce YNB uzupełnionej 100 mM glukozy w proporcji 1:10 (1 ml kultury starterowej rozcieńczony w 9 ml YNB). Zmierzyć początkową gęstość optyczną (OD) przy 540 nm.</li>
	<li>Inkubować inokulum w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez 8 godzin, aż szczepy osiągną fazę wzrostu w środkowej części stanu i zmierzyć końcowy OD przy długości fali 540 nm. Odejmij końcowy OD od początkowego OD, aby sprawdzić, czy OD inokulum znajdują się w środkowej fazie wzrostu (8 godzin, w oparciu o krzywe wzrostu w <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Aby osiągnąć inokulum z 107 komórkami mL-1, odwirować inokulum przez 5 minut przy 5,500 x g, odrzucić supernatant i zagęścić inokulum do połowy objętości probówek.</li>
</ol>
3. Tworzenie biofilmu i fototerapia
<ol>
	<li>Dodać 1 ml inokulum do dołków 24-dołkowej płytki polistyrenowej. Inkubować tlenowo w temperaturze 37 °C przez 90 minut, aby umożliwić przyleganie komórek do dna studzienek.</li>
	<li>Jako źródło światła należy użyć niespójnego światła czerwonego (patrz tabela materiałów) o długości fali 635 ± 10 nm i stałej mocy wyjściowej 1 460 mW cm−2. </li>
	<li>Użyj miernika mocy, aby zmierzyć gęstość mocy światła. Zastosowana ekspozycja promieniowania wynosi 87,6 J cm-2, co odpowiada około 1 minutzie ekspozycji. Użyj wzoru Gęstość energii (J/cm2) = gęstość mocy (W/cm2) x czas naświetlania (s). Między źródłem światła a biofilmem należy zachować odległość 5 mm, aby uniknąć podgrzania próbki.</li>
	<li>Biofilmy kontroli dodatniej należy traktować 0,12% chlorheksydyną przez 1 minutę, a biofilmy kontroli ujemnej 0,89% NaCl przez 1 minutę. </li>
	<li>Po zabiegach przemyj wszystkie biofilmy dwukrotnie 0,89% roztworem NaCl.</li>
	<li>Dodać 1 ml RPMI 1640 buforowanego kwasem 3-(N-morfolino)propanosulfonowym (MOPS) o pH 7 do biofilmów i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Rano zastosować te same zabiegi, co w krokach 3.2-3.6, przemyć biofilmy dwukrotnie 0,89% NaCl, dodać do studzienek nowy RPMI buforowany MOPS (1 ml, pH 7) i inkubować tlenowo w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Tego samego dnia, po 6 godzinach, należy naświetlić biofilmy światłem czerwonym. Biofilmy kontroli dodatniej należy traktować 0,12% chlorheksydyną przez 1 minutę, a biofilmy kontroli ujemnej 0,89% NaCl przez 1 minutę. Po zabiegach należy dwukrotnie przemyć biofilmy 0,89% roztworem NaCl.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.2-3.8 aż do osiągnięcia 48 godzin rozwoju biofilmu. 
	UWAGA: Zasadniczo jeden zabieg odbędzie się rano, a drugi po południu tego samego dnia (w odstępie 6 godzin).</li>
</ol>
4. Przetwarzanie
<ol>
	<li>Dodaj 1 ml sterylnego 0,89% NaCl do studzienki, aby usunąć biofilm, zdrapując go ze studzienki za pomocą końcówki pipety. Dodaj usunięty biofilm do sterylnej probówki.</li>
	<li>Dodaj kolejny 1 ml sterylnego 0,89% NaCl do studzienki. Zdrap go ponownie i dodaj zawiesinę do tej samej probówki, aby uzyskać całkowitą objętość 2 ml.</li>
	<li>Jednostki tworzące kolonie (CFU)
	<ol>
		<li>Energicznie wirować zawiesinę biofilmu przez 1 minutę. Z zawiesiny biofilmu użyć podwielokrotności 0,1 ml do seryjnego rozcieńczenia.</li>
		<li>Rozcieńczyć zawiesinę biofilmu od 10-1 do 10-4 w 0,89% roztworze NaCl.</li>
		<li>Wysiewać 50 μl z każdego rozcieńczenia na płytki SDA i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
		<li>Policz kolonie i zastosuj wzór CFU/ml = liczba kolonii x 10n / q (n = rozcieńczenie; q = objętość wysiewu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sucha masa
	<ol>
		<li>Zważ i oznacz probówki do mikrowirówek.</li>
		<li>Z zawiesiny biofilmu użyć 0,1 ml do oznaczania suchej masy (biomasy).</li>
		<li>Dodać 1 ml bezwzględnego etanolu do podwielokrotności 0,1 ml biofilmów i przechowywać w temperaturze -20 °C przez 18 godzin. Po 18 godzinach odwirować przy 10 000 x g przez 10 min.</li>
		<li>Odrzucić supernatant, umieścić probówki na eksykatorze w celu wysuszenia próbek przez tydzień i ponownie zważyć probówki do mikrowirówek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polisacharydy rozpuszczalne w wodzie (WSP) i polisacharydy rozpuszczalne w alkaliach (ASP)
	<ol>
		<li>Pozostałą część objętości (1,8 ml) należy energicznie wirować z zawiesiny biofilmu przez 1 minutę i odwirowywać przy 5 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przechowywać supernatant w nowej probówce i dwukrotnie przemywać osad komórkami, które zawierają nierozpuszczalne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, sterylną wodą ultraczystą (5 500 × g, 10 min w 4 °C).</li>
		<li>Zawiesić nierozpuszczalną zawartość w 1,8 ml sterylnej ultraczystej wody.</li>
		<li>Polisacharydy rozpuszczalne w wodzie (WSPs) 
		UWAGA: Wykonaj ten eksperyment pod wyciągiem.
		<ol>
			<li>Z przechowywanego supernatantu odrezerwować 1 ml do oznaczania ilościowego rozpuszczalnych w wodzie polisacharydów (WSP).</li>
			<li>Przechowywać w roztworze supernatant homogenizować przez 1 minutę. Następnie przenieś do sterylnych probówek i dodaj 2,5 objętości 95% etanolu. Przechowywać probówki przez 18 godzin w temperaturze -20 °C do wytrącania się WSP.</li>
			<li>Po 18 godzinach odwirować probówki o stężeniu 9 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu wyrzucić supernatanty.</li>
			<li>Umyj próbki trzykrotnie 75% etanolem i wysusz granulki na powietrzu. Ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnej ultraczystej wody i oznaczyć ilościowo WSP metodą kwasu fenolowo-siarkowego.</li>
			<li>Użyj 0,1% glukozy (0,01 g glukozy na 10 ml ultraczystej wody) dla krzywej wzorcowej (0, 2,5, 5, 10, 15, 20 i 25 μl glukozy na probówkę).</li>
			<li>Dodać 200 μl 5% fenolu (2,7 ml 90% fenolu na 47,3 ml wody ultraczystej) do szklanej probówki zawierającej 200 μl próbki lub wzorcowego punktu krzywej (w trzech egzemplarzach na próbkę) i ostrożnie wymieszać.</li>
			<li>Dodaj 1 ml kwasu siarkowego do probówki i wymieszaj. Odczekać 20 minut na reakcję i zmierzyć próbki za pomocą spektrofotometru (490 nm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Polisacharydy rozpuszczalne w alkaliach (ASP) 
		UWAGA: Wykonaj ten eksperyment w dygestorium.
		<ol>
			<li>Z nierozpuszczalnej, ponownie zawieszonej ilości oddzielić 1 ml w celu oznaczenia ASP. Odwirować podwielokrotności każdej zawiesiny biofilmu (13 000 x g, przez 10 minut w temperaturze 4 °C).</li>
			<li>Ostrożnie usunąć supernatant z każdej probówki. Następnie umieść próbki na koncentratorze próżniowym, aby wysuszyć granulki.</li>
			<li>Zważyć granulki i dodać 300 μl 1 N NaOH (2 g NaOH do 50 ml ultraczystej wody) na 1 mg suchej masy. Inkubować je przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie odwirowywać w temperaturze 13 000 × g przez 10 minut.</li>
			<li>Ostrożnie zebrać supernatanty za pomocą pipety i przenieść do probówek do mikrowirówek, utrzymując osad.</li>
			<li>Ponownie dodać równą objętość 1 N NaOH do probówek zawierających osady i powtórzyć te same kroki, co powyżej, dla ekstrakcji ASP.</li>
			<li>Po inkubacji przez 2 godziny odwirować próbki (13 000 x g przez 10 min), ostrożnie zebrać supernatanty i dodać do wcześniej pobranych supernatantów.</li>
			<li>W przypadku trzeciej ekstrakcji powtórzyć te same kroki, co powyżej, ale tym razem nie inkubować próbek przez 2 godziny przed odwirowaniem.</li>
			<li>Następnie do każdej próbki dodać trzy objętości 95% etanolu. Następnie należy przechowywać próbki w temperaturze -20 °C przez 18 godzin w celu wytrącenia ASP.</li>
			<li>Odwirować probówki (9 500 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C) i odrzucić supernatanty.</li>
			<li>Umyj każdą granulkę trzykrotnie 75% etanolem i wysusz na powietrzu (te same procedury miały miejsce w przypadku WSP). Ponownie zawiesić granulki w równej całkowitej objętości pierwszej ekstrakcji za pomocą 1 N NaOH.</li>
			<li>Odczytać próbki w celu oznaczania ilościowego ASP przy użyciu fenolu siarkowego (tak samo jak w przypadku analizy WSP).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+species%3A+current+epidemiology%2C+pathogenicity%2C+biofilm+formation%2C+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).</li>
<li>Harriott, M. M., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+form+polymicrobial+biofilms%3A+effects+on+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).</li>
<li>Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+antifungal+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today+Technologies%22%5BJournal%5D)">Overcoming antifungal resistance.</a> Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).</li>
<li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).</li>
<li>Zarnowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+entries+in+a+fungal+biofilm+matrix+encyclopedia%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia.</a> MBio. 5, e013333 (2014).</li>
<li>Mitchell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+participation+in+biofilm+matrix+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Community participation in biofilm matrix assembly and function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).</li>
<li>Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+super+glue%3A+the+biofilm+matrix+and+its+composition%2C+assembly%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions.</a> PLoS Pathogens. 12, e1005828(2016).</li>
<li>Dai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light+rescues+mice+from+potentially+fatal+Pseudomonas+aeruginosa+burn+infection%3A+efficacy%2C+safety%2C+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).</li>
<li>de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+twice-daily+blue+light+treatment+on+matrix-rich+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development.</a> PLoS One. 10 (7), e0131941(2015).</li>
<li>Fontana, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+effect+of+photodynamic+therapy+in+dental+plaque-derived+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).</li>
<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li>
<li>Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+genes+TEC1+and+EFG1+in+Candida+albicans+influences+extracellular+matrix+composition+and+biofilm+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology.</a> Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372(2017).</li>
<li>Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culturing+and+screening+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms.</a> Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60(2018).</li>
<li>Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).</li>
<li>Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+comparison+of+Candida+albicans+and+Candida+glabrata+biofilms+under+different+conditions+and+their+susceptibility+to+caspofungin+and+anidulafungin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin.</a> Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).</li>
<li>Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+media+profoundly+affect+Candida+albicans+and+Candida+tropicalis+growth%2C+adhesion+and+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias++Do++Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development.</a> Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).</li>
<li>Kadosh, D., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+Candida+albicans+filamentous+growth+program+by+relief+of+transcriptional+repression%3A+a+genome-wide+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis.</a> Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).</li>
<li>Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+on+Streptococcus+mutans+using+curcumin+and+toluidine+blue+activated+by+a+novel+LED+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device.</a> Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszymi etapami udanej hodowli biofilmu C. albicans są: 1) wykonanie pre-inokulum i inokulum w pożywce YNB uzupełnionej 100 mM glukozy; 2) odczekać 90 minut na fazę adhezji i ostrożnie umyć studzienki dwukrotnie 0,89% NaCl w celu usunięcia nieprzylegających komórek; oraz 3) dodanie pożywki RPMI do przylegających komórek, aby rozpocząć tworzenie biofilmu, ponieważ RPMI będzie stymulować wzrost strzępek. Podczas hodowli C. albicans mogą wystąpić aneuploidie. W związku z tym ważne jest, aby nie uży...

Zwiększona częstość występowania cukrzycy, stosowanie terapii immunosupresyjnej, zakażenie wirusem HIV, epidemia AIDS, inwazyjne procedury kliniczne i konsumpcja antybiotyków o szerokim spektrum działania w ostatnich latach zwiększyły częstość występowania chorób związanych z Candida albicans1,2. Zakażenia C. albicans są często związane z rozwojem biofilmu i mogą powodować objawy kliniczne, takie jak kandydoza, lub objawy ogólnoustrojowe, takie jak kandydemia1,2. Jednym z najbardziej godnych uwagi czynników wirulencji wzrostu biofilmu jest tworzenie zewnątrzkomórkowej macierzy polisacharydowej. Tworzenie biofilmu współpracuje w celu zwiększenia odporności na istniejące leki przeciwgrzybicze, stres środowiskowy i mechanizmy immunologiczne gospodarza3.
Wzrost biofilmu C. albicans rozpoczyna się od wczesnego przylegania komórek planktonu do podłoża, po którym następuje rozmnażanie komórek drożdży przez powierzchnię substratu i wzrost strzępek. Ostatnią fazą wzrostu biofilmu jest faza dojrzewania, w której rozwój drożdży jest hamowany, rozwój strzępek rozszerza się, a macierz zewnątrzkomórkowa otacza biofilm4. Egzopolisacharydy C. albicans (EPS) w matrycy oddziałują ze sobą, tworząc kompleks mannan-glukan5,6. Interakcja egzopolisacharydów ma kluczowe znaczenie dla obrony biofilmów przed lekami7. W związku z tym redukcja EPS z macierzy zewnątrzkomórkowej C. albicans może pomóc w opracowaniu nowych protokołów antybiofilmu do kontroli kandydozy jamy ustnej.
Światło reguluje wzrost, rozwój i zachowanie kilku organizmów8 i zostało zastosowane jako środek przeciwbakteryjny w fotodynamicznej chemioterapii przeciwbakteryjnej (PACT). PACT stosuje światło widzialne o określonej długości fali i fotosensybilizator pochłaniający światło9. Jednak fotouczulacze mają trudności z przenikaniem przez biofilm, co powoduje niższą skuteczność10. Niepowodzenie środków terapeutycznych w pełnej infiltracji biofilmów jest powodem, dla którego biofilmy czasami opierają się tradycyjnej terapii przeciwdrobnoustrojowej3,5. Aby dezaktywować zamknięte komórki drobnoustrojów, środki przeciwdrobnoustrojowe muszą przenikać przez macierz zewnątrzkomórkową; niemniej jednak EPS charakteryzuje przeszkodę dyfuzyjną dla takich cząsteczek, podpowiadając ich poziom przenoszenia do biofilmu lub wpływając na odpowiedź środka przeciwdrobnoustrojowego na samą matrycę<klasa SUP = "xref">11.
Biorąc pod uwagę wady PACT, samo użycie światła jawi się jako wartościowe ulepszenie. Wstępne dane wykazały, że leczenie światłem niebieskim dwa razy dziennie znacznie hamowało wytwarzanie nierozpuszczalnego EPS w biofilmie Streptococcus mutans. Poprzez zmniejszenie ilości nierozpuszczalnego w EPS, niebieskie światło zmniejszyło wzrost biofilmu. Niemniej jednak wyniki fototerapii z wykorzystaniem światła czerwonego w biofilmach C. albicans są skąpe. W związku z tym celem niniejszego badania była ocena, w jaki sposób fototerapia światłem czerwonym wpływa na wzrost i rozmieszczenie biofilmu C. albicans. W przypadku leczenia dwa razy dziennie dostosowaliśmy poprzednie protokoły naszego laboratorium9,12, aby zapewnić łatwy i powtarzalny model biofilmu, który dostarcza odpowiedzi dotyczące żywotności, suchej masy i ilości polisacharydów zewnątrzkomórkowych po leczeniu światłem czerwonym. Ten sam protokół może być stosowany do testowania innych terapii.

<table><tbody><tr><td>Klorhexidine 20%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza (D-glukoza) Bezwodny</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>DSP-MD.43</td><td></td></tr><tr><td>LumaCare LC-122 A&nbsp;</td><td>LumaCare Medical Group, Newport Beach, Kalifornia, Stany Zjednoczone&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S641-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Bioodczynniki Fisher&nbsp;</td><td>BP 359-500</td><td></td></tr><tr><td>Phenol 5%</td><td>Milipore Sigma</td><td>843984</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 buforowany 3-(N-morfolino)</td><td>Agar</td> dekstrozowy <td>Sigma R7755</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud uzupełniony chloramfenikolem</td><td>Acumedia</td><td>7306A</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Baza azotowa drożdży&nbsp;</td><td>Difco</td><td>DF0392-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 24-dołkowa płyta styropianowa&nbsp;</td><td>Sokół</td><td>353935</td><td></td></tr></tbody></table>

codzienna fototerapia czerwonym światłem regulująca wzrost biofilmu candida albicans

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Tutaj prezentujemy protokół oceny wyników dziennego leczenia światłem czerwonym na wzrost biofilmu Candida albicans. Aby zwiększyć planktonowy wzrost C. albicans SN425, inokulum rosło na pożywkach drożdżowych na bazie azotu. Do tworzenia biofilmu zastosowano pożywki RPMI 1640, które mają wysokie stężenie aminokwasów, aby wspomóc wzrost biofilmu. Biofilmy trwające 48 godzin traktowano dwa razy dziennie przez okres 1 minuty za pomocą niekoherentnego urządzenia świetlnego (światło czerwone; długość fali = 635 nm; gęstość energii = 87,6 J·cm-2). Jako kontrolę pozytywną (PC) zastosowano 0,12% chlorheksydyny (CHX), a jako kontrolę ujemną (NC) do biofilmów zastosowano 0,89% NaCl. Jednostki tworzące kolonie (CFU), suchą masę, rozpuszczalne i nierozpuszczalne egzopolisacharydy oznaczono ilościowo po zabiegach. Krótko mówiąc, przedstawiony tutaj protokół jest prosty, powtarzalny i dostarcza odpowiedzi dotyczących żywotności, suchej masy i ilości zewnątrzkomórkowych polisacharydów po leczeniu światłem czerwonym.

Rysunek 2 przedstawia wyniki Log10 CFU/mL C. albicans po codziennych zabiegach światłem czerwonym przez 1 min. Światło czerwone znacząco zredukowało wartość Log10 CFU/mL w porównaniu z grupą NC (p = 0,004). Rysunek 3 prezentuje wyniki masy biomasy (mg) biofilmu C. albicans po codziennych zabiegach. Wszystkie grupy leczone wykazały redukcję biomasy w porównaniu z grupą NC (p = 0,000), a grup...

Tutaj prezentujemy protokół do oceny wpływu zastosowania czerwonego światła na wzrost biofilmu Candida albicans. Niekoherentne urządzenie do pomiaru światła czerwonego o długości fali 635 nm i gęstości energii 87,6 J·cm-2 stosowano przez cały okres wzrostu biofilmów Candida albicans przez 48 godzin.

Codzienna fototerapia czerwonym światłem regulująca wzrost biofilmu Candida albicans

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Candida jest najczęstszą przyczyną rozsianego zakażenia grzybiczego u gospodarzy z obniżoną odpornością. Niezdolność środków terapeutycznych do pełnej infiltracji biofilmu z powodu matrycy jest jednym z powodów, dla których biofilmy są odporne na tradycyjne terapie. Nasz protokół ocenia, w jaki sposób fototerapia wykorzystująca światło czerwone zakłóca wzrost i rozmieszczenie biofilmów Candida albicans.Zastosowane metody są dobrze znane, ponieważ szczep użyty w tym badaniu miał scharakteryzowaną macierz zewnątrzkomórkową, a urządzenie świetlne zostało z powodzeniem zastosowane do innych zawiesin i biofilmów mikroorganizmów planktonowych. Największą zaletą tego urządzenia jest skrócenie czasu zabiegu, co sprawia, że jest ono bardziej widoczne do zastosowań klinicznych. Podczas hodowli Candida albicans należy pamiętać, że można nabyć przeciwciała.Dlatego ważne jest, aby nie używać kolonii, które mają więcej niż siedem dni, nie rozpoczynać tworzenia płytek w temperaturze czterech stopni Celsjusza i nie usuwać ponownie smug komórek z istniejących płytek. Podobnie, szczep powinien być stosowany przed 18 godzinami nocnego wzrostu. Przy pierwszym użyciu spektrofotometru ważne jest, aby najpierw uzyskać farmę kolonii w jednostkach liczby, aby skorelować z wartościami gęstości optycznej.Dlatego eksperymenty rozpoczną się od stosowania środka fazy wzrostu w początkowym stężeniu komórek od 10 do siedmiu komórek na mililitr. Wykazano, że takie stężenie komórek zapewnia najbardziej zależne i stabilne biofilmy materii. Na początek zawiesić 65 gramów SDA, uzupełnionych 50 miligramami na litr chloramfenikolu, w 1 000 mililitrach wody destylowanej w zlewce.Umieścić zlewkę na grzałce, aby się zagotowała, aby całkowicie rozpuścić podłoże. Następnie przenieś pożywkę do szklanej butelki. Umieść nakrętkę na butelce, ale nie przykręcaj jej całkowicie, aby upewnić się, że butelka jest w stanie odpowietrzyć.Umieść butelkę w autoklawie, aby wysterylizować roztwór w temperaturze 15 PSI i 121 stopni Celsjusza przez 30 minut. Schłodzić roztwór do około 45 stopni Celsjusza. Użyj jednorazowej, sterylnej pipety, aby dobrze wymieszać i odpipetuj 20 mililitrów SDA do sterylnych płytek Petriego.Aby przygotować pożywkę YNB, uzupełnioną 100 milimolową glukozą, wymieszaj 6,7 grama YNB i 18 gramów dekstrozy z 1 000 mililitrów ultra czystej wody w zlewce. Umieść mieszadło w zlewce i umieść je na talerzu do mieszania. Przefiltruj pożywkę przez system filtrów próżniowych o wielkości 0,22 mikrometra w celu sterylizacji.Przygotuj podłoże RPMI, mieszając 10,4 grama RPMI-1640 i 34 gramy MOPS z 1 000 mililitrów ultra czystej wody. Wymieszaj w mieszadle bez ognia i dostosuj pH do siedmiu, dodając jeden normalny wodorotlenek sodu. Wysterylizuj pożywkę za pomocą systemu filtrów próżniowych o wielkości 0,22 mikrometra.Najpierw rozmrozić mikroorganizm Candida albicans SN 425 w temperaturze otoczenia. Wysiewaj 10 mikrolitrów kultury stop na wcześniej przygotowanych szalkach Petriego zawierających SDA, uzupełnionych chloramfenikolem. Inkubować szalki Petriego w warunkach tlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.Do pre-inokulum użyj wysterylizowanego lubrykantu, aby wybrać 10 kolonii Candida albicans z szalek Petriego i umieścić je w probówce wirówkowej zawierającej 10 mililitrów pożywki YNB, uzupełnionej glukozą. Inkubować probówkę tlenowo w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Następnie przygotuj inokulum, dodając tę kulturę starterową do świeżej pożywki YNB, uzupełnionej glukozą, w proporcji 1 do 10 do rozcieńczenia.Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć początkową średnicę zewnętrzną przy 540 nanometrach. Inkubować inokulum tlenowo w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem godzin i zmierzyć końcowy OD przy 540 nanometrach. Odejmij końcowy OD od początkowego OD, aby sprawdzić, czy OD inokulum znajdują się w środkowej fazie wzrostu.Aby uzyskać inokulum z 10 do siedmiu komórek na mililitr, odwirować inokulum przez pięć minut w temperaturze 5 500 razy G. Wlać supernatant do zlewki zawierającej podchloryn sodu i dodać świeży YNB w celu zagęszczenia inokulum do połowy poprzedniej objętości. Dodaj jeden mililitr inokulum do każdej studzienki 24-dołkowej płytki polistyrenowej. Inkubować tlenowo w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut, aby umożliwić przyleganie komórek do dna studzienek.Traktuj biofilmy przez jedną minutę jednym mililitrem 0,12% chlorheksydyny dla biofilmów kontroli pozytywnej. W celu kontroli ujemnej należy traktować biofilmy przez jedną minutę jednym mililitrem sterylnego 0,89% chlorku sodu. Następnie umyj studzienki dwa razy, po jednej minucie każda, jednym mililitrem sterylnego 0,89% chlorku sodu, aby usunąć nieprzylegające komórki.Następnie włącz niekoherentne czerwone światło i użyj miernika mocy, aby zmierzyć gęstość mocy światła. Określ czas ekspozycji na podstawie wymaganej gęstości energii 87,6 dżuli na centymetr kwadratowy. Umieść talerz pod czerwonym światłem.Utrzymuj odległość między źródłem światła a biofilmem na poziomie pięciu mililitrów, aby uniknąć podgrzewania próbki. Po ekspozycji przez jedną minutę dodaj jeden mililitr wysterylizowanej pożywki RPMI do każdej studzienki i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Rano powtórz to samo mycie, obróbkę światłem, zabiegi kontroli pozytywnej i negatywnej oraz inkubację przez sześć godzin z pożywką RPMI.Ponownie umyj biofilmy dwukrotnie, wystaw je na działanie czerwonego światła i wykonaj zabiegi kontroli pozytywnej i negatywnej. Zassać roztwór w studzienkach i dodać pożywkę RPMI. Powtórz inkubację, mycie, obróbkę światłem oraz zabiegi kontroli pozytywnej i ujemnej, aż do osiągnięcia 48 godzin rozwoju biofilmu.Aby rozpocząć przetwarzanie, wyrzuć pożywkę i dodaj jeden mililitr sterylnego 0,89% chlorku sodu do studzienki i użyj końcówki pipety, aby zeskrobać biofilm z dołka. Przenieś usunięty biofilm do sterylnej probówki. Dodaj kolejny mililitr sterylnego 0,89% chlorku sodu do studzienki.Zdrap go ponownie i dodaj zawiesinę do tej samej tuby, aby uzyskać łączną objętość 2 mililitrów. Energicznie wirować zawiesinę biofilmu przez jedną minutę. Do analizy CFU przenieść podwielokrotność 0,1 mililitra z zawiesiny biofilmu do probówki mikrowirówki zawierającej 900 mikrolitrów 0,89% roztworu chlorku sodu na każde rozcieńczenie.Rozcieńczyć roztwór biofilmu od 10 do ujemnego, od 10 do ujemnego czterech, w roztworze soli. Wysiewaj 50 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytki SDA i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Policz kolonie i zastosuj formułę.W celu analizy suchej masy należy najpierw zważyć i oznaczyć mikroprobówki wirówkowe. Dodaj 0,1 mililitra zawiesiny biofilmu i jeden mililitr absolutnego etanolu do probówek i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Następnie odwiruj go 10 000 razy G przez 10 minut.Odrzucić supernatant i umieścić probówki w eksykatorze w celu wysuszenia próbek przez jeden tydzień. Ponownie zważ mikroprobówki wirówkowe i wykonaj odejmowanie, aby uzyskać masę biomasy. W tym eksperymencie, po dziennym leczeniu czerwonym światłem przez jedną minutę biofilmów Candida albicans, CFU został zmniejszony w porównaniu z kontrolą negatywną traktowaną chlorkiem sodu.Wyniki dotyczące biomasy biofilmów Candida albicans po codziennych zabiegach pokazują, że grupa leczona czerwonym światłem wykazywała podobną redukcję biomasy do obserwowanej w grupie kontroli pozytywnej, leczonej chlorheksydyną. Obie grupy wykazały również statystyczne podobieństwo do siebie. Podczas gdy oba wykazały zmniejszenie biomasy w porównaniu z kontrolą ujemną traktowaną chlorkiem sodu.W kontroli pozytywnej obserwowano mniejsze ilości rozpuszczalnego i nierozpuszczalnego EPS Candida albicans w porównaniu z kontrolą ujemną. Chociaż nie jest to statystycznie istotne, dzienne stosowanie czerwonego światła liczbowo zmniejszyło ilość EPS rozpuszczalnego i nierozpuszczalnego EPS. Grupa kontrolna negatywna i grupa leczona światłem czerwonym wykazały statystyczne podobieństwo.Pomiar gęstości mocy światła za pomocą miernika mocy przed rozpoczęciem zabiegu w celu określenia dokładnych okresów stosowania. Kroki zapewniają, że gęstość energii zawsze będzie wynosić 87,6 dżuli na centymetr kwadratowy. Użyj wcześniej cytowanej formuły.Pomiar odbywa się przy użyciu tego samego od światła do butelki z talerzami, pięć milimetrów. Związek między fototerapią a lekami przeciwgrzybiczymi można zbadać, aby sprawdzić, czy wstępne leczenie czerwonym światłem, a następnie podanie leku, poprawia przenikanie leku do biofilmu. W przypadku leczenia dwa razy dziennie dostosowaliśmy protokoły naszego laboratorium, zapewniając łatwy i powtarzalny model biofilmu, który dostarcza odpowiedzi na pytania dotyczące żywotności, suchej masy i zewnątrzkomórkowych ilości polisacharydów po leczeniu światłem czerwonym.Protokół jest ogólny i może być stosowany do testowania innych terapii, oprócz światła czerwonego, w tym leków, innych świateł lub kombinacji światła i leków. Praca z mikroorganizmami wymaga specjalnego sprzętu, takiego jak okulary ochronne, fartuch laboratoryjny z guzikami i rękawice nitro.

daily-phototherapy-with-red-light-to-regulate-candida-albicans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowaliśmy platformę wysokiej gęstości do mikromacierzy, składającą się z 3D nano-biofilmów C. albicans, nazwaną CaBChip. Profil wrażliwości leków testowanych na CaBChip jest porównywalny z konwencjonalnym modelem płytki 96-dołkowej, co sugeruje, że chip grzybiczy jest idealnie dostosowany do prawdziwie wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych.

Chip do hodowli biofilmu Candida albicans (CaBChip) do wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych

Źródło: Zhao, K. i in. Model in vitro do badania wpływu terapii fotodynamicznej pośredniczonej kwasem 5-aminolewulinowym na biofilm gronkowca aureus . J. Vis. Exp. (2018)Film prezentuje protokół terapii fotodynamicznej mający na celu ocenę działania antybakteryjnego na biofilmy bakterii Gram-dodatnie. Biofilmy dzielą się na cztery grupy: dwie otrzymują prekursor fotosensyzatora, a dwie otrzymują bufor. Wszystkie są inkubowane w ciemności, po czym następuje ekspozycja na czerwone światło dla...

Aktywacja światłem biofilmów bakteryjnych z użyciem prekursora fotosensywnego

Aby zobaczyć i określić ilościowo wewnętrzne cechy biofilmów Candida albicans, przygotowujemy nienaruszone próbki stałe, które są klarowane przez dopasowanie współczynnika załamania. Następnie można wykorzystać optyczną mikroskopię przekrojową do uzyskania trójwymiarowych danych obrazowych na całej grubości biofilmu.

Oczyszczanie i obrazowanie biofilmów Candida albicans

Rosnąca częstość występowania lekoopornych Candida albicans jest poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie. Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT) może stanowić strategię walki z lekoopornymi infekcjami grzybiczymi. Niniejszy protokół opisuje skuteczność aPDT za pośrednictwem Rose bengal na wielolekoopornym szczepie C. albicans in vitro.

Terapia fotodynamiczna za pośrednictwem róży bengalskiej w celu zahamowania Candida albicans

Protokół oparty na 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej przy użyciu testu redukcji 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-5-karboksyanilid-2H-tetrazolium (XTT) jest opisany tutaj, w celu zbadania wpływu przeciwciał na biofilmy utworzone przez C. tropicalis. Ten protokół in vitro może być wykorzystany do sprawdzenia wpływu potencjalnych nowych związków przeciwgrzybiczych na aktywność metaboliczną komórek gatunku Candida w biofilmach.

Rozpuszczalny test redukcyjny na bazie tetrazoliu do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis

Ten protokół opisuje zastosowanie przeciwbakteryjnej terapii fotodynamicznej (aPDT) w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. aPDT wykonano przy użyciu rozpuszczalnej w wodzie mieszaniny kurkuminoidów i niebieskiego światła LED.

Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kurkuminoidów na mysim modelu kandydozy jamy ustnej

Znaczenie małych kolonii w lekooporności Candida spp. nie zostało w pełni zbadane. Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT) stanowi obiecującą strategię walki z lekoopornymi infekcjami grzybiczymi. Badanie to pokazuje, że aPDT za pośrednictwem róży bengalskiej skutecznie dezaktywuje Candida glabrata i indukuje drobne kolonie, prezentując unikalną procedurę.

Indukcja drobnych kolonii w Candida glabrate za pomocą terapii fotodynamicznej za pośrednictwem Rose Bengal

Urządzenie LED z niebieskim światłem o średnicy 405 nm wykazuje skuteczność antybakteryjną przeciwko szerokiemu zakresowi patogenów ran podczas oceny na syntetycznym modelu skóry opartym na kolagenie. To uproszczone podejście in vitro oferuje powtarzalną i etycznie wykonalną alternatywę dla wczesnej fazy oceny terapii przeciwdrobnoustrojowych opartych na świetle.

Badanie urządzenia LED z niebieskim światłem w celu tłumienia patogenów ran z wykorzystaniem syntetycznego modelu skóry na bazie kolagenu

Opisujemy prostą, szybką i niezawodną metodę tworzenia biofilmów Candida albicans z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotytacyjnych oraz jej przydatność w badaniu wrażliwości komórek wewnątrz biofilmów na środki przeciwgrzybicze.

Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans

Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.

Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych

Poznaj metodę fototerapii czerwonym światłem o długości fali 635 nm w celu regulacji wzrostu biofilmu Candida albicans. Protokół ocenia wpływ światła na rozwój biofilmu przez 48 godzin, oferując potencjalną alternatywę dla tradycyjnych terapii przeciwgrzybiczych.

Codzienna fototerapia czerwonym światłem regulująca wzrost biofilmu Candida albicans

Przeglądaj więcej filmów