Identyfikacja nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony

Metoda ta stanowi skuteczną alternatywę dla konwencjonalnego podejścia opartego na analogach w pozyskiwaniu nadproducentów aminokwasów. Technika ta przewyższa tradycyjną metodę analogową, zapewniając jednocześnie dokładność, czułość i wysoką przepustowość. Metoda ta rzuca nowe światło na zrozumienie siły nadprodukcji aminokwasów i translacji rzadkich kodonów i teoretycznie może być zastosowana do wszystkich mikroorganizmów.

Protokół ten opiera się głównie na podstawowych molekularnych operacjach eksperymentalnych, które są łatwe do wykonania, ale mogą wymagać wielu prób w celu osiągnięcia odpowiedniego doboru rygorystycznych warunków naprężania. Wizualna demonstracja tej techniki pozwala na bezpośrednie docenienie wydajności selekcji i systemu badań przesiewowych w identyfikacji producentów aminokwasów. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj wektor we fragmentach markera, na lodzie, w stosunku molowym od jednego do jednego do siedmiu punktów pięć mikrolitrów mieszanki montażowej do całkowitej objętości dziesięciu mikrolitrów.

Inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę. Przekształć pięć mikrolitrów produktu montażowego w 50 mikrolitrów ogniw składowych w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Odzyskaj komórki w bulionie Super Optimal z pożywką kataboliczną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie połóż je na pożywce LB Agar i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia użyj preferowanego zestawu komercyjnego, aby wyizolować plazmid. Najpierw przekształć 50 mikrolitrów kompetentnych komórek w jeden mikrolitr plazmidu, który przenosi KanR typu dzikiego.

Przekształć drugi zestaw kompetentnych komórek z plazmidem zawierającym KanR RC 29 ze wszystkimi kodonami leucyny zastąpionymi rzadkim kodonem CTA. Płytkę i inkubować kulturę komórkową zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieś kolonie, które zawierają gen markera selekcyjnego typu dzikiego w pochodnej bogatej w rzadkie kodony, indywidualnie do pięciu mililitrów pięciokrotnie rozcieńczonej pożywki LB zawierającej kanamycynę w stężeniu 50 mikrogramów na mililitr.

Próbki należy inkubować w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 250 obr./min. Następnie przenieś 200 mikrolitrów każdej z kultur komórkowych na 96-dołkową płytkę w trzech powtórzeniach w określonych punktach czasowych. Użyj czytnika płytek, aby zmierzyć OD600.

Zaszczepić barwniki zawierające gen markera KanR RC 29 w dwóch zestawach po pięć mililitrów pożywki 0,2 x LB, która zawiera kanamycynę, z lub bez dostarczania L-leucyny. Dodaj L-leucynę do jednego z pożywek do końcowego stężenia jednego grama na litr. Próbki należy inkubować w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 250 obr./min i mierzyć zawartość OD600 dla każdej kultury w określonych punktach czasowych.

Na początek przekształć 50 mikrolitrów szczepu rodzicielskiego użytego do mutagenezy w jeden mikrolitr plazmidu, który przenosi GFP typu dzikiego lub PPG typu dzikiego. Płytkie i inkubować kultury komórkowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieś kolonie pojedynczo do pięciu mililitrów odpowiednio rozcieńczonej pożywki LB.

Próbki należy inkubować w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 250 obr./min. W przypadku markerów fluorescencyjnych przenieś 200 mikrolitrów kultur komórkowych na 96-dołkową przezroczystą dolną tylną płytkę w trzech egzemplarzach w określonych punktach czasowych. Zmierz OD600 we fluorescencji i oblicz intensywność fluorescencji.

W przypadku markerów chromogennych zmierz rozwój koloru kultur komórkowych. Wykonaj test karmienia zgodnie z wcześniejszym opisem i zmierz intensywność fluorescencji lub rozwój koloru w określonych punktach czasowych. Najpierw przekształć 50 mikrolitrów zmutowanych komórek za pomocą jednego mikrolitra plazmidu przenoszącego marker selekcyjny KanR RC 29 lub markery przesiewowe GFP RC lub PPG RC. Następnie odwiruj kultury komórkowe w temperaturze 4000 razy G przez pięć minut.

W celu selekcji odrzucić supernatant i dodać pięć mililitrów pożywki 0,2 x LB zawierającej kanamycynę do komórek zawierających marker selekcyjny. Próbkę inkubować przez noc w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia umieść nocną kulturę na pożywce agarowej o grubości 0,2 x LB zawierającej kanamycynę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin.

Do badań przesiewowych należy umieścić odpowiednią liczbę komórek, w których znajduje się marker przesiewowy, na pożywce agarowej LB zawierającej odpowiedni antybiotyk. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem godzin. Następnie zaszczepij pożywkę LB zawierającą odpowiedni antybiotyk każdą pojedynczą kolonią z płytki.

Próbki należy inkubować w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 250 obr./min. Zmierz OD600 i fluorescencję i oblicz intensywność fluorescencji, jeśli używany jest GFP RC. Zmierz rozwój barwy kultur komórkowych, jeśli używany jest PPG RC.

Aby zweryfikować produktywność aminokwasów kandydujących szczepów, przygotuj kulturę nasion, zaszczepiając pięć mililitrów pożywki LB każdym z kandydujących szczepów i pozwól komórkom rosnąć przez noc w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min i w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zbierz komórki z jednego mililitra kultury komórkowej, wirując w temperaturze 4000 razy G przez dwie minuty. Wyrzuć supernatant i ponownie zamieszaj paletę jednym mililitrem sterylnej wody.

Zaszczepić 20 mililitrów pożywki M9 zawierającej cztery procent glukozy za pomocą 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i inkubować w 250-mililitrowym wytrząsarce przy 250 obr./min i w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia odwirować jeden mililitr pożywki hodowlanej w temperaturze 4000 razy G przez pięć minut. Przenieś 200 mikrolitrów supernatantu do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Przygotować roztwory wzorcowe L-leucyny w podanych tutaj stężeniach. W dygestorium dodać 100 mikrolitrów jednego milimolowego trietyloaminy i 100 mikrolitrów jednego molowego izotiocyjanianu fenylu zarówno do supernatantu, jak i do wzorców. Delikatnie wymieszaj roztwory i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Następnie dodaj 400 mikrolitrów n-heksanu do tej samej probówki i wiruj przez dziesięć sekund. Dolna faza zawiera pochodne aminokwasów i jest używana do analizy HPLC. Przefiltruj dolną fazę przez membrany politetrafluoroetylenowe o pojemności 0,2 mikrolitra.

Następnie uruchom jeden mikrolitr próbki na ultra HPLC wyposażonej w kolumnę C18 o natężeniu przepływu 0,42 mililitra na minutę i przy temperaturze kolumny 40 stopni Celsjusza. Użyj detektora diodowego, aby wykryć docelowe aminokwasy w odległości 254 nanometrów i obliczyć ich stężenia, mapując obszary pików pod krzywą standardową. W tym badaniu nadprodukcja aminokwasów jest identyfikowana przy użyciu rzadkich markerów bogatych w kodony, aby jednocześnie osiągnąć dokładność, czułość i wysoką przepustowość.

W przypadku systemu selekcji należy zaobserwować gwałtowny spadek OD600 dla szczepów zawierających rzadki gen oporności na antybiotyki bogaty w kodony w porównaniu ze szczepem zawierającym typ dziki. Hamowanie rzadkiego kodonu na ekspresję białek odbywa się głównie w warunkach głodu. Po dodatkowym podaniu odpowiedniego aminokwasu, OD600 dla szczepu zawierającego rzadki gen oporności na antybiotyki bogaty w kodony znacznie wzrasta.

W przypadku systemu badań przesiewowych intensywność fluorescencji w liczbie komórek fluorescencyjnych jest znacznie niższa w przypadku szczepu, który wyraża białko fluorescencyjne z rzadkiego genu bogatego w kodony niż w przypadku genu typu dzikiego. Podawanie odpowiedniego aminokwasu przywróci ekspresję białek z rzadkich genów bogatych w kodony. W przypadku stosowania fioletowego białka, kolor rozwinięty z rzadkiego PPG bogatego w kodony jest jaśniejszy niż z genu typu dzikiego.

Nierozcieńczona pożywka LB umożliwia powolną ekspresję rzadkiego PPG bogatego w kodony bez podawania L-leucyny w eksprymowanym fioletowym białku, które staje się widoczne po granulowaniu komórek. Nie ukrywa to jednak faktu, że ekspresja genu z rzadkiego, bogatego w kodony PPG jest wzmacniana przez podawanie L-leucyny. Strategia oparta na rzadkich kodonach może zidentyfikować nadproducentów docelowych aminokwasów z biblioteki mutacji, a mutanty te powinny wytwarzać większe ilości docelowych aminokwasów niż szczepy rodzicielskie.

Próbując tej procedury, ważne jest, aby dostosować częstotliwość rzadkich kodonów, aby uzyskać wyraźne rozróżnienie w OD lub kolorze między komórkami zawierającymi markery typu dzikiego a rzadkimi pochodnymi bogatymi w kodony. Analiza transkryptomu i sekwencjonowanie genomu mogą być zastosowane do wybranych szczepów w celu zbadania mechanizmu związanego z produkcją aminokwasów. Korzystając z tej techniki, można by skutecznie zidentyfikować nadprodukcję aminokwasów, a analiza ich informacji genetycznej dostarczyłaby nowych informacji na temat mechanizmów stojących za nadprodukcją aminokwasów.

Derywatyzacja aminokwasów może być szkodliwa. Upewnij się, że nosisz rękawice i odzież ochronną i wykonaj te czynności w dygestorium.