Name: Identyfikacja nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji nadproducentów aminokwasów przy użyciu markerów bogatych w rzadkie kodony. Technika zapewnia dokładność, czułość i wysoką przepustowość jednocześnie, przewyższając tradycyjne podejścia oparte na analogach toksycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspólnie wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 21676026), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (grant nr 2017YFD0201400) oraz Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich (grant nr 2017M620643). Prace w UCLA Institute of Advancement (Suzhou) były wspierane przez wewnętrzne granty z prowincji Jiangsu i Parku Przemysłowego Suzhou.

1. Budowa plazmidów wyrażających geny markerowe bogate w rzadkie kodony
<ol>
	<li>Należy wybrać gen markerowy, który zawiera odpowiednią liczbę wspólnych kodonów dla docelowego aminokwasu. 
	UWAGA: Dla L-leucyny, gen oporności na kanamycynę kanR, który zawiera 29 kodonów leucyny, z których 27 to kodony powszechne, jest używany do budowy systemu selekcji13. Gen gfp, który zawiera 17 wspólnych kodonów z 19 kodonów leucyny, lub fioletowy gen kodujący białko prancerpurple (ppg), który zawiera 14 wspólnych kodonów leucyny, jest używany w systemie przesiewowym (tabela uzupełniająca 1).</li>
	<li>Zastąp wspólne kodony w genach markerowych synonimicznym rzadkim kodonem. W przypadku L-leucyny zastąp jej kodony w kanR, gfp lub ppg rzadkim kodonem CTA, generując odpowiednio kanR-RCs, gfp-RC lub ppg-RC13 (Tabela uzupełniająca 1). 
	UWAGA: Częstość występowania rzadkiego kodonu w genach markerowych będzie miała wpływ na rygorystyczność systemu selekcji lub badań przesiewowych. Ogólnie rzecz biorąc, zwiększenie liczby rzadkich kodonów zwiększy rygorystyczność systemu selekcji lub badań przesiewowych. Aby osiągnąć odpowiednią siłę selekcji lub badań przesiewowych, zaprojektuj serię genów markerowych, które zawierają różną liczbę rzadkich kodonów i porównaj ich działanie.</li>
	<li>Generuj bloki budulcowe genów markerowych bogatych w rzadkie kodony za pomocą narzędzi takich jak GeneDesign14 (http://54.235.254.95/gd/) do syntezy genów. Alternatywnie, zamów geny markerowe z komercyjnych usług syntezy genów.
	<ol>
		<li>Na stronie GeneDesign wybierz pozycję Projekt bloku konstrukcyjnego (nakładanie się o stałej długości).</li>
		<li>Wklej sekwencje genów markerowych bogatych w rzadkie kodony w polu Sekwencja.</li>
		<li>Umożliwia zdefiniowanie długości nakładania się oligonukleotydów zespołu; należy pamiętać, że domyślna wartość 40 pz działa poprawnie dla większości sekwencji. 
		UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją online, aby uzyskać więcej instrukcji dotyczących ustawień innych parametrów.</li>
		<li>Kliknij przycisk Projektuj bloki konstrukcyjne i uporządkuj oligonukleotydy wymienione na stronie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsyntetyzuj geny zmodyfikowane rzadkimi kodonami za pomocą dokładnej syntezy opartej na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)15.</li>
	<li>Ligacja bogatego w rzadkie kodony kanR-RC do wektora pET-28a, gfp-RC do pSB1C3 i ppg-RC do CPB-37-44116. 
	UWAGA: Mapy plazmidów pET-28a i pSB1C3 są dostępne w internetowej bazie danych plazmidów SnapGene (tabela uzupełniająca 1); mapa plazmidu CPB-37-441 jest dostępna na stronie internetowej białka chromogennego ATUM.
	<ol>
		<li>Na lodzie dodać wektor i fragmenty znacznika w stosunku molowym 1:1 do 7,5 μl mieszanki montażowej (patrz tabela materiałów) do całkowitej objętości 10 μl. Inkubować próbkę w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przekształć 5 μl produktu montażowego w 50 μl właściwych komórek (patrz tabela materiałów) w temperaturze 42 °C przez 30 s.</li>
		<li>Odzyskaj komórki w pożywce SOC (Super optymalny bulion z represją katabolitu) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, pokryj je na pożywce agarowej LB (bulion lizogeniczny) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Zaszczepić kolonię na pożywce LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 godzin.</li>
		<li>Wyizoluj plazmid za pomocą preferowanego zestawu komercyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Optymalizacja warunków wyboru
<ol>
	<li>Spraw, aby szczep macierzysty używany do mutagenezy został przekształcony w kompetentne komórki17.</li>
	<li>Przekształć 50 μl kompetentnych komórek za pomocą 1 μl plazmidu, który przenosi kanR typu dzikiego, i przekształć inny zestaw kompetentnych komórek z plazmidem zawierającym kan R-RC29 z całym kodonem leucyny zastąpionym rzadkim kodonem CTA.</li>
	<li>Dodać 950 μl pożywki SOC i inkubować próbkę w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umieścić 100 μl kultury komórkowej na pożywce agarowej LB zawierającej 50 μg·mL-1 kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez około 8 godzin, aż pojawią się kolonie.</li>
	<li>Wybierz kolonie, które zawierają kanR typu dzikiego i bogaty w rzadkie kodony leucyny kan R-RC29 i użyj każdej z nich do zaszczepienia 5 ml pięciokrotnie rozcieńczonej pożywki LB (0,2 x LB) zawierającej 50 μg·mL-1 kanamycyny. Próbki inkubować w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Medium ma kluczowe znaczenie dla systemu selekcji. Powinien zawierać tylko tyle węgla i azotu, aby umożliwić ekspresję białka oporności na antybiotyki z genu typu dzikiego, a nie z pochodnych zmodyfikowanych kodonami rzadkimi. W tym przypadku stężenie L-leucyny w pożywce 1x LB jest zbyt wysokie, aby całkowicie zahamować ekspresję białka z bogatego w rzadkie kodony kanR. W ten sposób rozcieńczoną pożywkę LB ze współczynnikiem rozcieńczenia, takim jak 5, stosuje się do wytworzenia wyraźnej różnicy w ekspresji białek z genów typu dzikiego i genów bogatych w rzadkie kodony.</li>
	<li>Przenieść 200 μl każdej z kultur komórkowych na 96-dołkową płytkę w trzech powtórzeniach w określonych punktach czasowych (np. 8 godzin, 16 godzin i 24 godzin). Zmierz średnicę zewnętrzną600 (gęstość optyczną przy 600 nm) za pomocą czytnika płytek. 
	UWAGA: Jeśli nie można wykryć spadku OD600 w komórce dla szczepów zawierających geny markerowe bogate w kodony rzadkie w porównaniu z OD600 szczepu zawierającego geny markerowe typu dzikiego, spróbuj zwiększyć ilość rzadkiego kodonu w genach markerowych lub użyć bardziej rozcieńczonej pożywki.</li>
	<li>Wykonać test podawania aminokwasów, aby sprawdzić, czy ekspresja genów markerowych bogatych w rzadkie kodony (np. kan R-RC29) może zostać przywrócona przez zwiększenie stężenia docelowych aminokwasów. 
	UWAGA: W celu selekcji nadproducentów L-leucyny, L-leucyna jest używana do karmienia.
	<ol>
		<li>Zaszczepić szczepy zawierające gen markera kan R-RC29 w 5 ml 0,2x LB (zawierającego 50 μg·mL-1 kanamycyny) z lub bez dostarczania 1 g·L-1 L-leucyny. Zaszczep kolejne 5 ml 0,2x LB szczepami, które zawierają kanR typu dzikiego jako kontrolę. Inkubować próbki w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zmierz OD600 dla każdej kultury w określonych punktach czasowych (np. 15 godzin, 17 godzin, 19 godzin i 22 godzin).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Optymalizacja warunków przesiewowych
<ol>
	<li>Przekształć 50 μl szczepu rodzicielskiego używanego do mutagenezy za pomocą 1 μl plazmidu (~50 ng·μL-1), który przenosi gfp typu dzikiego lub ppg typu dzikiego. Przekształć również szczep rodzicielski za pomocą bogatych w rzadkie kodony pochodnych genów markerowych.</li>
	<li>Dodać 950 μl pożywki SOC i inkubować próbkę w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umieścić 100 μl kultury komórkowej na pożywce agarowej LB zawierającej odpowiednie antybiotyki (25 μg·mL-1 chloramfenikolu dla plazmidu gfp zawierającego marker cmR lub 50 μg·mL-1 kanamycyny dla plazmidu ppg zawierającego marker kanR) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz jedną kolonię, która zawiera gfp lub ppg typu dzikiego i jedną kolonię, która zawiera odpowiednią pochodną bogatą w rzadkie kodony, i przenieś je indywidualnie do 5 ml odpowiednio rozcieńczonej pożywki LB. Próbki inkubować w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: W przypadku szczepów E. coli zawierających rzadkie kodony oleucyny gfp-RC lub ppg-RC, nierozcieńczona pożywka LB (1x LB) może być użyta do wytworzenia znaczących różnic w ekspresji genów markerowych typu dzikiego i bogatych w rzadkie kodony. Indukowalne promotory są również wykorzystywane do kierowania ekspresją genów markerów przesiewowych. Rozpocznij indukcję, gdy komórki wejdą w fazę wykładniczą, aby osiągnąć lepszą dyskryminację.</li>
	<li>W przypadku markerów fluorescencyjnych przenieść 200 μl każdej z kultur komórkowych na 96-dołkową czarną płytkę z przezroczystym dnem w trzech egzemplarzach w określonych punktach czasowych (np. 2 godziny, 4 godziny i 6 godzin). Zmierz OD600 i fluorescencję i oblicz intensywność fluorescencji (stosunek fluorescencji do OD600). W przypadku markerów chromogennych zmierz rozwój barwy kultur komórkowych. 
	UWAGA: Jeśli nie można wykryć niższej intensywności fluorescencji dla szczepów zawierających gfp-RC w porównaniu ze szczepami zawierającymi gfp typu dzikiego, lub jeśli nie można wykryć jaśniejszego koloru dla komórek wyrażających fioletowe białko z ppg-RC niż z genu typu dzikiego, spróbuj zwiększyć liczbę rzadkich kodonów w genach markerowych lub użyć bardziej rozcieńczonej pożywki.</li>
	<li>Wykonać test karmienia (patrz kroki 2.7.1 i 2.7.2). Zmierz intensywność fluorescencji lub rozwój koloru w określonych punktach czasowych (np. 12 godzin, 18 godzin i 24 godzin).</li>
</ol>
4. Identyfikacja nadproducentów aminokwasów
<ol>
	<li>Zaszczepić 100 μl kultury mutantów w 5 ml pożywki LB (2% v/v) i inkubować ją w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C, aż wartości OD600 osiągną 0,4.</li>
	<li>Zamień mutanty w kompetentne komórki17.</li>
	<li>Przekształć 50 μl zmutowanych komórek z 1 μl plazmidu (~50 ng·μL-1) przenoszącego marker selekcyjny kan R-RC29 lub markery przesiewowe gfp-RC lub ppg-RC. Dodać 950 μl pożywki SOC i obracać próbkę w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wybierz nadproducentów aminokwasów.
	<ol>
		<li>Odwirować kulturę komórkową przy 4 000 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i dodać 5 ml pożywki 0,2x LB zawierającej 50 μg·mL-1 kanamycyny. Próbkę inkubować przez noc w wytrząsarce o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rozmnażać przez noc (np. 100 μl, w zależności od gęstości komórek hodowli) na pożywce agarowej o wielkości 0,2 LB zawierającej 50 μg·mL-1 kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 h. 
		UWAGA: Rozwinięte kolonie są kandydatami docelowych nadproducentów aminokwasów i, w tym przypadku, nadproducentów L-leucyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesiewać nadproducentów aminokwasów.
	<ol>
		<li>Umieścić odpowiednią liczbę komórek (np. 100 μl), w których znajduje się marker przesiewowy (jak opisano w kroku 4.3) na pożywce agarowej LB zawierającej odpowiedni antybiotyk (25 μg·mL-1 chloramfenikolu do badań przesiewowych z gfp-RC i 50 μg·mL-1 kanamycyny do badania przesiewowego z ppg-RC) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 godzin.</li>
		<li>Zaszczepić pożywkę LB zawierającą odpowiedni antybiotyk (patrz krok 4.5.1) każdą pojedynczą kolonię z płytki. Inkubować próbki w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zmierz OD600 i fluorescencję i oblicz intensywność fluorescencji, jeśli używany jest gfp-RC. Zmierz rozwój koloru kultur komórkowych, jeśli używany jest ppg-RC. Należy zauważyć, że szczepy wykazujące wyższą intensywność fluorescencji lub głębszy kolor niż szczep rodzicielski są kandydatami na nadproducentów aminokwasów i, w tym przypadku, nadproducentów L-leucyny. 
		UWAGA: Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją nadaje się również do identyfikacji pojedynczych komórek o wysokim wskaźniku, gdy do badań przesiewowych wykorzystuje się geny białek fluorescencyjnych bogate w rzadkie kodony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź produktywność aminokwasów kandydujących szczepów.
	<ol>
		<li>Zaszczepić 5 ml pożywki LB każdym z kandydujących szczepów i pozwolić komórkom rosnąć przez noc w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Pobrać komórki z 1 ml kultury komórkowej przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 2 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnej wody.</li>
		<li>Zaszczepić 20 ml pożywki M9 zawierającej 4% glukozy 200 μl zawiesiny komórkowej i inkubować w wytrząsarce o pojemności 250 ml przy 250 obr./min w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Odwirować 1 ml pożywki przy 4 000 x g przez 5 minut. Przenieść 200 μl supernatantu do czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Przygotować roztwory L-leucyny (klasa HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa)) 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 i 1 g·L-1 jako wzorce.</li>
		<li>Dodać 100 μl 1 mM trietyloaminy i 100 μl 1 M izotiocyjanianu fenylu do supernatantu i wzorców, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h18. 
		UWAGA: Trietyloamina i izotiocyjanian fenylu mogą powodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu oraz są szkodliwe w przypadku wdychania. Nosić rękawice i maskę i, jeśli to możliwe, wykonać tę czynność w dygestorium.</li>
		<li>Dodaj 400 μl n-heksanu do tej samej probówki i wiruj przez 10 s. Przefiltruj dolną fazę zawierającą pochodne aminokwasów przez membranę politetrafluoroetylenową o grubości 0,2 μm. 
		UWAGA: n-heksan może powodować podrażnienie skóry. Nosić rękawice i odzież ochronną. W przypadku kontaktu ze skórą spłucz skórę dużą ilością wody.</li>
		<li>Przygotować ruchomą fazę A, mieszając 0,1 M octan sodu (pH 6,5) i acetonitryl w stosunku objętościowym 99,3:0,7. Przygotować acetonitryl (80% v/v) jako fazę ruchomą B. Przefiltrować wszystkie fazy ruchome przez membrany z politetrafluoroetylenu 0,2 μm. 
		UWAGA: Acetonitryl jest szkodliwy w przypadku wdychania i może powodować podrażnienia skóry i oczu. Nosić rękawice i odzież ochronną i wykonać tę czynność w dygestorium.</li>
		<li>Uruchomić 1 μl próbki na ultra-HPLC wyposażonej w kolumnę C18 zgodnie z programem elucji w tabeli 1 przy natężeniu przepływu 0,42 ml·min-1 i temperaturze kolumny 40 °C. Wykryć docelowe aminokwasy przy długości fali 254 nm za pomocą detektora diodowego i obliczyć ich stężenia, odwzorowując obszary pików na krzywej wzorcowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas (min)</td>
			<td>Faza mobilna A (%)</td>
			<td>Faza ruchoma B (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>Rozdział 98</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,5</td>
			<td>70</td> Rozdział
			<td>Rozdział 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Rozdział 43</td>
			<td>57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7,1</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Rozdział 98</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Program elucji do ilościowego oznaczania aminokwasów.

<ol><li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTatsumi%2C+N+%22Corynebacterium+glutamicum%3A+biology+and+biotechnology%22">Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology</a>. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).</li>
<li>Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTonouchi%2C+N+%22Amino+Acid+Fermentation%22">Amino Acid Fermentation</a>. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).</li>
<li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).</li>
<li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li>
<li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Progress%22%5BJournal%5D)">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li>
<li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids%3A+a+focus+on+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li>
<li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+metabolisms%2C+and+applications+of+L-proline+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li>
<li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li>
<li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synonymous+but+not+the+same%3A+the+causes+and+consequences+of+codon+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li>
<li>Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino%E2%80%90acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li>
<li>Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel%2B+and+Rel%E2%88%92+strains+during+amino+acid+starvation%3A+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616(2018).</li>
<li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign%3A+rapid%2C+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li>
<li>Xiong, A. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li>
<li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li>
<li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li>
<li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li>
<li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discharging+tRNAs%3A+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li>
<li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li>
<li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli%3A+an+analysis+of+three+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li>
<li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li>
<li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G%E2%80%A2+U+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507(2014).</li>
<li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li>
<li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+on+codon+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li>
<li>Huo, Y. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Liczba rzadkich kodonów w genach markerowych oraz pożywka selekcyjna lub przesiewowa mają kluczowe znaczenie dla zahamowania ekspresji białek z genów markerowych zmodyfikowanych rzadkimi kodonami. Jeśli nie można wykryć znaczącej różnicy między ekspresjami białek z genów markerowych typu dzikiego a ich pochodnych, zwiększenie liczby rzadkich kodonów lub użycie pożywki o ograniczonej zawartości składników odżywczych może wzmocnić różnice. Jeśli jednak efekt hamowania jest zbyt silny, ekspresja białka może nie zostać odzys...

Obecna produkcja aminokwasów opiera się głównie na fermentacji. Jednak miana i plony dla większości szczepów produkujących aminokwasy są poniżej rosnących wymagań globalnego rynku aminokwasów, który jest wart miliardy dolarów1,2. Uzyskanie wysokowydajnych nadproducentów aminokwasów ma kluczowe znaczenie dla ulepszenia przemysłu aminokwasowego.
Tradycyjna strategia identyfikacji nadproducentów aminokwasów wykorzystuje konkurencję między aminokwasami i ich analogami w syntezie białek3,4. Analogi te są w stanie ładować tRNA, które rozpoznają odpowiednie aminokwasy, a tym samym hamować wydłużenia łańcuchów peptydowych, prowadząc do zatrzymania wzrostu lub śmierci komórki5. Jednym ze sposobów na przeciwstawienie się naprężeniom analogowym jest zwiększenie stężenia aminokwasów wewnątrzkomórkowych. Wzbogacone aminokwasy będą konkurować z analogami o skończone tRNA i zapewnią prawidłową syntezę funkcjonalnych białek. W związku z tym szczepy, które przetrwają analogi, mogą być wybrane i prawdopodobnie są nadproducentami odpowiednich aminokwasów.
Chociaż okazała się skuteczna w doborze nadproducentów aminokwasów, takich jak L-leucyna6, strategia oparta na analogach ma poważne wady. Jednym z głównych problemów jest oporność analogowa wynikająca z procesu mutagenezy lub spontanicznych mutacji. Szczepy z opornością mogą uniknąć selekcji poprzez blokowanie, eksportowanie lub degradację analogów5. Innym problemem są toksyczne skutki uboczne analogów dla innych procesów komórkowych7. W konsekwencji szczepy, które przetrwają selekcję analogową, mogą nie być nadproducentami aminokwasów, podczas gdy pożądani nadproducenci mogą zostać fałszywie wytępieni z powodu negatywnych skutków ubocznych.
Tutaj prezentowana jest nowatorska strategia oparta na prawie odchylenia kodonów w celu osiągnięcia dokładnej i szybkiej identyfikacji nadproducentów aminokwasów. Większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niż jeden tryplet nukleotydowy, który jest w różny sposób faworyzowany przez organizmy gospodarza8,9. Niektóre kodony są rzadko używane w sekwencjach kodujących i są określane jako rzadkie kodony. Ich translacje na aminokwasy opierają się na pokrewnych tRNA, które przenoszą odpowiednie aminokwasy. Jednak tRNA, które rozpoznają rzadkie kodony, zwykle mają znacznie niższą obfitość niż tRNA popularnych kodonów10,11. W związku z tym te rzadkie tRNA są mniej skłonne do wychwytywania wolnych aminokwasów w konkurencjach z innymi izoakceptorami, a translacje sekwencji bogatych w rzadkie kodony zaczynają zwalniać lub nawet są przerywane, gdy ilości aminokwasów są ograniczone10. Teoretycznie translacje mogłyby zostać przywrócone, gdyby po naładowaniu synonimicznych wspólnych tRNA wystąpiła nadwyżka aminokwasów z powodu nadprodukcji lub dodatkowego podawania odpowiednich aminokwasów12. Jeśli gen bogaty w rzadkie kodony koduje marker selekcyjny lub przesiewowy, szczepy wykazujące odpowiednie fenotypy mogą być łatwo zidentyfikowane i prawdopodobnie są nadproducentami docelowych aminokwasów.
Powyższa strategia jest stosowana do ustanowienia systemu selekcji i selekcji w celu identyfikacji nadproducentów aminokwasów. System selekcji wykorzystuje geny oporności na antybiotyki (np. kanR) jako markery, podczas gdy system przesiewowy wykorzystuje geny kodujące białka fluorescencyjne (np. białko zielonej fluorescencji [GFP]) lub chromogenne (np. PrancerPurple). Geny markerowe w obu układach są modyfikowane poprzez zastąpienie określonej liczby wspólnych kodonów dla docelowego aminokwasu jego synonimiczną rzadką alternatywą. Szczepy w bibliotece mutacji, które zawierają gen markerowy bogaty w rzadkie kodony, są selekcjonowane lub badane w odpowiednich warunkach, a nadproducenci docelowych aminokwasów mogą być łatwo zidentyfikowani. Proces pracy rozpoczyna się od budowy systemu genów markerowych bogatych w rzadkie kodony, następnie następuje optymalizacja warunków pracy, a następnie identyfikacja i weryfikacja nadproducentów aminokwasów. Ta niezależna od analogów strategia opiera się na dogmacie dotyczącym translacji białek i została praktycznie zweryfikowana, aby umożliwić dokładną i szybką identyfikację nadproducentów aminokwasów. Teoretycznie można by go bezpośrednio zastosować do aminokwasów z rzadkimi kodonami i do wszystkich mikroorganizmów. Ogólnie rzecz biorąc, strategia oparta na rzadkich kodonach będzie służyć jako skuteczna alternatywa dla konwencjonalnego podejścia opartego na analogach, gdy odpowiednie analogi dla określonych aminokwasów są niedostępne lub gdy głównym problemem jest wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich. Poniższy protokół wykorzystuje rzadki kodon leucyny, aby zademonstrować tę strategię w identyfikacji nadproducentów L-leucyny Escherichia coli.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>Thermo</td><td>51101</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit</td><td>Transgen</td><td>EM111-01</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure Zestaw do szybkiej ekstrakcji żelu</td><td>Transgen</td><td>EG101-01</td><td></td></tr><tr><td>Gibson assembly master mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>L-leucyna</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>n-heksan</td>: <td></td><td>Thermo H3061</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fenylu</td><td>Sigma</td><td>P1034</td><td></td></tr><tr><td>PrancerPurple CPB-37-441</td><td>ATUM</td><td>CPB-37-441</td><td></td></tr><tr><td>TransStar FastPfu Polimeraza DNA muchy</td><td>Transgen</td><td>AP231-01</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-wysokowydajna chromatografia cieczowa</td><td>Agilent</td><td>1290 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Typ dziki C. glutamicum</td><td>ATCC</td><td>13032</td><td></td></tr><tr><td>XL10-Gold E. coli kompetentna</td><td>komórka Agilent</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 kolumna</td><td>Agilent</td><td>959759-902K</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Aby zaspokoić stale rosnący rynek aminokwasów, potrzebne są wysokowydajne szczepy produkcyjne. Nadproducenci aminokwasów są konwencjonalnie identyfikowani poprzez wykorzystanie konkurencji między aminokwasami a ich analogami. Jednak ta metoda oparta na analogach ma niską dokładność, a właściwe analogi dla określonych aminokwasów są ograniczone. W tym miejscu przedstawiamy alternatywną strategię, która umożliwia dokładne, czułe i wysokoprzepustowe badania przesiewowe nadprodukcji aminokwasów przy użyciu markerów bogatych w rzadkie kodony. Strategia ta jest inspirowana zjawiskiem tendencyjności użycia kodonów w translacji białek, dla której kodony są klasyfikowane jako powszechne lub rzadkie na podstawie ich częstości występowania w kodującym DNA. Translacja rzadkich kodonów zależy od odpowiadających im rzadkich transferowych RNA (tRNA), które nie mogą być w pełni naładowane przez pokrewne aminokwasy pod wpływem głodu. Teoretycznie rzadkie tRNA mogą być ładowane, jeśli występuje nadmiar aminokwasów po naładowaniu synonimicznych powszechnych izoakceptorów. W związku z tym opóźnione translacje spowodowane rzadkimi kodonami mogą zostać przywrócone przez karmienie lub wewnątrzkomórkową nadprodukcję odpowiednich aminokwasów. Przy takim założeniu ustanawia się system selekcji lub badań przesiewowych w celu identyfikacji nadprodukcji aminokwasów poprzez zastąpienie wspólnych kodonów docelowych aminokwasów ich synonimicznymi rzadkimi alternatywami w genach oporności na antybiotyki lub genach kodujących białka fluorescencyjne lub chromogenne. Wykazaliśmy, że ekspresja białek może być znacznie utrudniona przez włączenie rzadkich kodonów i że poziomy białek korelują dodatnio ze stężeniami aminokwasów. Korzystając z tego systemu, nadproducenci wielu aminokwasów mogą być łatwo odsiewani z bibliotek mutacji. Ta strategia oparta na rzadkich kodonach wymaga tylko jednego zmodyfikowanego genu, a gospodarz ma mniejsze szanse na uniknięcie selekcji niż w przypadku innych metod. Oferuje alternatywne podejście do pozyskiwania nadproducentów aminokwasów.

W systemie selekcyjnym należy zaobserwować gwałtowny spadek wartości OD600 u szczepów zawierających rzadkie kodony w genie oporności na antybiotyk w porównaniu ze szczepem zawierającym gen oporności typu dzikiego podczas hodowli w odpowiednim medium (Rycina 1a). W tych samych warunkach spadek wartości OD600 komórek staje się bardziej wyraźny wraz ze wzrostem liczby rzadkich kodonów w genie oporności na antybiotyk (Ry...

To badanie przedstawia alternatywną strategię do konwencjonalnej metody opartej na toksycznych analogach w identyfikacji nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony, aby osiągnąć jednocześnie dokładność, czułość i wysoką przepustowość.

Identyfikacja nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Metoda ta stanowi skuteczną alternatywę dla konwencjonalnego podejścia opartego na analogach w pozyskiwaniu nadproducentów aminokwasów. Technika ta przewyższa tradycyjną metodę analogową, zapewniając jednocześnie dokładność, czułość i wysoką przepustowość. Metoda ta rzuca nowe światło na zrozumienie siły nadprodukcji aminokwasów i translacji rzadkich kodonów i teoretycznie może być zastosowana do wszystkich mikroorganizmów.Protokół ten opiera się głównie na podstawowych molekularnych operacjach eksperymentalnych, które są łatwe do wykonania, ale mogą wymagać wielu prób w celu osiągnięcia odpowiedniego doboru rygorystycznych warunków naprężania. Wizualna demonstracja tej techniki pozwala na bezpośrednie docenienie wydajności selekcji i systemu badań przesiewowych w identyfikacji producentów aminokwasów. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj wektor we fragmentach markera, na lodzie, w stosunku molowym od jednego do jednego do siedmiu punktów pięć mikrolitrów mieszanki montażowej do całkowitej objętości dziesięciu mikrolitrów.Inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę. Przekształć pięć mikrolitrów produktu montażowego w 50 mikrolitrów ogniw składowych w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Odzyskaj komórki w bulionie Super Optimal z pożywką kataboliczną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Następnie połóż je na pożywce LB Agar i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia użyj preferowanego zestawu komercyjnego, aby wyizolować plazmid. Najpierw przekształć 50 mikrolitrów kompetentnych komórek w jeden mikrolitr plazmidu, który przenosi KanR typu dzikiego.Przekształć drugi zestaw kompetentnych komórek z plazmidem zawierającym KanR RC 29 ze wszystkimi kodonami leucyny zastąpionymi rzadkim kodonem CTA. Płytkę i inkubować kulturę komórkową zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieś kolonie, które zawierają gen markera selekcyjnego typu dzikiego w pochodnej bogatej w rzadkie kodony, indywidualnie do pięciu mililitrów pięciokrotnie rozcieńczonej pożywki LB zawierającej kanamycynę w stężeniu 50 mikrogramów na mililitr.Próbki należy inkubować w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 250 obr./min. Następnie przenieś 200 mikrolitrów każdej z kultur komórkowych na 96-dołkową płytkę w trzech powtórzeniach w określonych punktach czasowych. Użyj czytnika płytek, aby zmierzyć OD600.Zaszczepić barwniki zawierające gen markera KanR RC 29 w dwóch zestawach po pięć mililitrów pożywki 0,2 x LB, która zawiera kanamycynę, z lub bez dostarczania L-leucyny. Dodaj L-leucynę do jednego z pożywek do końcowego stężenia jednego grama na litr. Próbki należy inkubować w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 250 obr./min i mierzyć zawartość OD600 dla każdej kultury w określonych punktach czasowych.Na początek przekształć 50 mikrolitrów szczepu rodzicielskiego użytego do mutagenezy w jeden mikrolitr plazmidu, który przenosi GFP typu dzikiego lub PPG typu dzikiego. Płytkie i inkubować kultury komórkowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieś kolonie pojedynczo do pięciu mililitrów odpowiednio rozcieńczonej pożywki LB.Próbki należy inkubować w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 250 obr./min. W przypadku markerów fluorescencyjnych przenieś 200 mikrolitrów kultur komórkowych na 96-dołkową przezroczystą dolną tylną płytkę w trzech egzemplarzach w określonych punktach czasowych. Zmierz OD600 we fluorescencji i oblicz intensywność fluorescencji.W przypadku markerów chromogennych zmierz rozwój koloru kultur komórkowych. Wykonaj test karmienia zgodnie z wcześniejszym opisem i zmierz intensywność fluorescencji lub rozwój koloru w określonych punktach czasowych. Najpierw przekształć 50 mikrolitrów zmutowanych komórek za pomocą jednego mikrolitra plazmidu przenoszącego marker selekcyjny KanR RC 29 lub markery przesiewowe GFP RC lub PPG RC. Następnie odwiruj kultury komórkowe w temperaturze 4000 razy G przez pięć minut.W celu selekcji odrzucić supernatant i dodać pięć mililitrów pożywki 0,2 x LB zawierającej kanamycynę do komórek zawierających marker selekcyjny. Próbkę inkubować przez noc w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia umieść nocną kulturę na pożywce agarowej o grubości 0,2 x LB zawierającej kanamycynę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin.Do badań przesiewowych należy umieścić odpowiednią liczbę komórek, w których znajduje się marker przesiewowy, na pożywce agarowej LB zawierającej odpowiedni antybiotyk. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem godzin. Następnie zaszczepij pożywkę LB zawierającą odpowiedni antybiotyk każdą pojedynczą kolonią z płytki.Próbki należy inkubować w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 250 obr./min. Zmierz OD600 i fluorescencję i oblicz intensywność fluorescencji, jeśli używany jest GFP RC. Zmierz rozwój barwy kultur komórkowych, jeśli używany jest PPG RC.Aby zweryfikować produktywność aminokwasów kandydujących szczepów, przygotuj kulturę nasion, zaszczepiając pięć mililitrów pożywki LB każdym z kandydujących szczepów i pozwól komórkom rosnąć przez noc w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min i w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zbierz komórki z jednego mililitra kultury komórkowej, wirując w temperaturze 4000 razy G przez dwie minuty. Wyrzuć supernatant i ponownie zamieszaj paletę jednym mililitrem sterylnej wody.Zaszczepić 20 mililitrów pożywki M9 zawierającej cztery procent glukozy za pomocą 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i inkubować w 250-mililitrowym wytrząsarce przy 250 obr./min i w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia odwirować jeden mililitr pożywki hodowlanej w temperaturze 4000 razy G przez pięć minut. Przenieś 200 mikrolitrów supernatantu do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Przygotować roztwory wzorcowe L-leucyny w podanych tutaj stężeniach. W dygestorium dodać 100 mikrolitrów jednego milimolowego trietyloaminy i 100 mikrolitrów jednego molowego izotiocyjanianu fenylu zarówno do supernatantu, jak i do wzorców. Delikatnie wymieszaj roztwory i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez godzinę.Następnie dodaj 400 mikrolitrów n-heksanu do tej samej probówki i wiruj przez dziesięć sekund. Dolna faza zawiera pochodne aminokwasów i jest używana do analizy HPLC. Przefiltruj dolną fazę przez membrany politetrafluoroetylenowe o pojemności 0,2 mikrolitra.Następnie uruchom jeden mikrolitr próbki na ultra HPLC wyposażonej w kolumnę C18 o natężeniu przepływu 0,42 mililitra na minutę i przy temperaturze kolumny 40 stopni Celsjusza. Użyj detektora diodowego, aby wykryć docelowe aminokwasy w odległości 254 nanometrów i obliczyć ich stężenia, mapując obszary pików pod krzywą standardową. W tym badaniu nadprodukcja aminokwasów jest identyfikowana przy użyciu rzadkich markerów bogatych w kodony, aby jednocześnie osiągnąć dokładność, czułość i wysoką przepustowość.W przypadku systemu selekcji należy zaobserwować gwałtowny spadek OD600 dla szczepów zawierających rzadki gen oporności na antybiotyki bogaty w kodony w porównaniu ze szczepem zawierającym typ dziki. Hamowanie rzadkiego kodonu na ekspresję białek odbywa się głównie w warunkach głodu. Po dodatkowym podaniu odpowiedniego aminokwasu, OD600 dla szczepu zawierającego rzadki gen oporności na antybiotyki bogaty w kodony znacznie wzrasta.W przypadku systemu badań przesiewowych intensywność fluorescencji w liczbie komórek fluorescencyjnych jest znacznie niższa w przypadku szczepu, który wyraża białko fluorescencyjne z rzadkiego genu bogatego w kodony niż w przypadku genu typu dzikiego. Podawanie odpowiedniego aminokwasu przywróci ekspresję białek z rzadkich genów bogatych w kodony. W przypadku stosowania fioletowego białka, kolor rozwinięty z rzadkiego PPG bogatego w kodony jest jaśniejszy niż z genu typu dzikiego.Nierozcieńczona pożywka LB umożliwia powolną ekspresję rzadkiego PPG bogatego w kodony bez podawania L-leucyny w eksprymowanym fioletowym białku, które staje się widoczne po granulowaniu komórek. Nie ukrywa to jednak faktu, że ekspresja genu z rzadkiego, bogatego w kodony PPG jest wzmacniana przez podawanie L-leucyny. Strategia oparta na rzadkich kodonach może zidentyfikować nadproducentów docelowych aminokwasów z biblioteki mutacji, a mutanty te powinny wytwarzać większe ilości docelowych aminokwasów niż szczepy rodzicielskie.Próbując tej procedury, ważne jest, aby dostosować częstotliwość rzadkich kodonów, aby uzyskać wyraźne rozróżnienie w OD lub kolorze między komórkami zawierającymi markery typu dzikiego a rzadkimi pochodnymi bogatymi w kodony. Analiza transkryptomu i sekwencjonowanie genomu mogą być zastosowane do wybranych szczepów w celu zbadania mechanizmu związanego z produkcją aminokwasów. Korzystając z tej techniki, można by skutecznie zidentyfikować nadprodukcję aminokwasów, a analiza ich informacji genetycznej dostarczyłaby nowych informacji na temat mechanizmów stojących za nadprodukcją aminokwasów.Derywatyzacja aminokwasów może być szkodliwa. Upewnij się, że nosisz rękawice i odzież ochronną i wykonaj te czynności w dygestorium.

identifying-amino-acid-overproducers-using-rare-codon-rich-markers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Powiązania genetyczne często pozostają niewyjaśnione na poziomie funkcjonalnym. Niniejsza metoda ma na celu ocenę wpływu markerów genetycznych powiązanych z fenotypem na ekspresję genów poprzez analizę komórek heterozygotycznych w obrębie transkrybowanych SNP. Technologia ta umożliwia precyzyjny pomiar za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF w celu ilościowego oznaczenia produktów specyficznego dla alleli przedłużania starterów.

Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów w celu zbadania funkcjonalnych podstaw powiązań genetycznych

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Przedstawiamy protokół do oceny funkcjonalnej kompleksowych bibliotek mutagenezy saturacji pojedynczym miejscem białek wykorzystujących sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Co ważne, podejście to wykorzystuje ortogonalne pary starterów do budowy i sekwencjonowania bibliotek multipleksowych. Przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu TEM-1 β-laktamazy dobranej w klinicznie istotnej dawce ampicyliny.

Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji metabolitów ze Staphylococcus aureus i ich późniejszej analizy za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas.

Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy metabolitów Staphylococcus aureus

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Analiza sygnału do szumu na poziomie aminokwasów określa rozpowszechnienie zmienności genetycznej na danej pozycji aminokwasu, znormalizowanej do zmienności genetycznej tła danej populacji. Pozwala to na identyfikację wariantowych "gorących punktów" w sekwencji białka (sygnału), która wzrasta powyżej częstości występowania rzadkich wariantów występujących w populacji (szum).

Określanie prawdopodobieństwa patogenności wariantów za pomocą analizy zmienności genetycznej na poziomie aminokwasów

Translacja rybosomów dekoduje trzy nukleotydy na kodon na peptydy. Ich ruch wzdłuż mRNA, wychwycony przez profilowanie rybosomów, wytwarza ślady wykazujące charakterystyczną okresowość trypletową. Protokół ten opisuje, w jaki sposób używać RiboCode do rozszyfrowania tej wyróżniającej się cechy na podstawie danych profilowania rybosomów w celu identyfikacji aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu na poziomie całego transkryptomu.

De novo Identyfikacja aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu z danymi profilowania rybosomów

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić znakowanie białek specyficznych dla typu komórki za pomocą azydonorleucyny (ANL) przy użyciu linii myszy wyrażającej zmutowaną syntetazę tRNA L274G-metioniny (MetRS*) oraz niezbędne kroki do izolacji białek specyficznych dla znakowanego typu komórki. Przedstawiamy dwie możliwe drogi podawania ANL żywym myszom poprzez (1) picie wody i (2) wstrzyknięcia dootrzewnowe.

Oczyszczanie i identyfikacja białek specyficznych dla typu komórki ze złożonych tkanek przy użyciu zmutowanej linii myszy syntetazy tRNA metioniny

Opisany tutaj protokół zawiera szczegółowe instrukcje, jak analizować interesujące regiony genomu pod kątem potencjału kodowania mikrobiałek za pomocą PhyloCSF w przyjaznej dla użytkownika przeglądarce genomu UCSC. Ponadto zaleca się stosowanie kilku narzędzi i zasobów w celu dalszego zbadania charakterystyki sekwencji zidentyfikowanych mikrobiałek w celu uzyskania wglądu w ich przypuszczalne funkcje.

Zintegrowane podejście do identyfikacji mikrobiałek i analizy sekwencji

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Poznaj metodę identyfikacji nadproducentów aminokwasów przy użyciu markerów bogatych w rzadkie kodony. Technika zapewnia dokładność, czułość i wysoką przepustowość jednocześnie, przewyższając tradycyjne podejścia oparte na analogach toksycznych.

Identyfikacja nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony

Przeglądaj więcej filmów