Name: Onkogenny, indukowany hepatocytami, ortotopowy mysi model raka wątrobowokomórkowego powstającego w warunkach zapalenia i zwłóknienia wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Poznaj ortotopowy model raka wątrobowokomórkowego u myszy z włóknieniem wątroby i wstrzyknięciem wewnątrzśledzionowym. Ta metoda pozwala badać immunotolerancję indukowaną przez guz oraz odpowiedzi immunologiczne na leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) oraz NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).

UWAGA: Wszystkie procedury, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez IACUC na Uniwersytecie Missouri. Wszystkie myszy otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z kryteriami określonymi w "Przewodniku dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania". Poniższa procedura izolacji i inokulacji komórek powinna być wykonywana w kapturze. Wszyscy wykonawcy powinni nosić standardowe środki ochrony osobistej do obchodzenia się z myszami i tkankami.
1. Indukcja zwłóknienia wątroby i marskości wątroby za pomocą iniekcji IP czterochlorku węgla (CCl4)
UWAGA: Zobacz Rysunek 1. (CCl4 jest bardzo niebezpiecznym odczynnikiem, należy obchodzić się z nim ostrożnie i w rękawicach odpornych na chemikalia)
<ol>
	<li>Uzyskaj samce myszy C57BL/6J w wieku od sześciu do ośmiu tygodni (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotować 10% roztwórCCl 4 (v/v) w oleju kukurydzianym w probówce wirówkowej. Określ całkowitą objętość na podstawie liczby myszy do wstrzyknięcia (patrz krok 1.6).</li>
	<li>Użyj odpowiedniej techniki obchodzenia się z myszami, aby wybrać jedną mysz do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Ręcznie przytrzymuj mysz grzbietową (brzuszną) stroną do góry.</li>
	<li>Oczyścić miejsce wstrzyknięcia na ścianie brzucha myszy, szorując je 70% alkoholem.</li>
	<li>Wstrzyknąć samcom myszy C57BL/6J 160 μl 10% roztworuCCl 4 przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) za pomocą jednorazowej igły o rozmiarze 25.</li>
	<li>Upewnij się, że igła przechodzi tylko przez ścianę brzucha (około 4-5 mm) skośną stroną do góry i lekko pochyloną pod kątem 15-20 stopni.</li>
	<li>Wstrzykuj myszy dwa razy w tygodniu przez łącznie cztery tygodnie - każda mysz otrzyma w sumie osiem zastrzyków. 
	UWAGA: Dwa tygodnie po ostatnim wstrzyknięciu leczone myszy są gotowe do inokulacji ISPL hepatocytów onkogennych od myszy MTD2.</li>
</ol>
2. Izolowanie transgenicznych hepatocytów Tag-transgenicznych od myszy linii MTD2
UWAGA: Zobacz Tabelę 1 dla przepisów na roztwory.
<tabela dla:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Zbilansowany roztwór soli Earle'a bez Ca lub Mg (EBSS bez Ca lub Mg)</td>
			<td>4 g KCl 
			68 g NaCl 
			1,4 g NaH2PO4·H2O 
			10 g dekstrozy 
			Dodaj wodę do 1 litra, pH do 4,32 
			Filtr przechodzący przez</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozwiązanie 1</td>
			<td>20 ml 10x EBSS bez Ca lub Mg 
			44 g NaHCO3 
			1,33 ml 1,5 mln Hepes 
			10 ml 10 ml EGTA 
			Dodaj wodę do 200 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozwiązanie 2</td>
			<td>100 ml 10x EBSS 
			2,2 g NaHCO3 
			6,67 ml 1,5 M Hepes 
			Dodaj wodę do 1 litra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,75% roztwór kolagenazy</td>
			<td>15 mg kolagenazy typu 1 
			20 ml roztworu 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kompletny średni</td>
			<td>2 obr./min 
			50 ml FBS 
			5 ml 100x penicylina-streptomycyna</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przepisy na rozwiązania.
<ol>
	<li>Uzyskaj linię MTD2 myszy38, aby służyć jako źródło onkogennych hepatocytów.</li>
	<li>Znieczulenie 5-tygodniowych myszy MTD2 za pomocą 2,5% izofluranu. 
	UWAGA: Prawidłowe znieczulenie zostanie sprawdzone metodą szczypania palców u stóp. Krótko mówiąc, używając dwóch palców, dobrze ściśnij palec u nogi/stopę myszy. Jeśli nie ma reakcji odstawiennej, zwierzę jest oceniane na tyle głęboko, aby rozpocząć operację.</li>
	<li>Po odpowiednim uspokojeniu umieść myszy w pozycji leżącej na plecach i przymocuj kończyny taśmą, aby zapewnić odpowiednią ekspozycję powierzchni brzucha.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie laparotomii w linii środkowej za pomocą nożyczek wzdłuż długości linii białej, wystarczająco dużej, aby zapewnić odpowiednią ekspozycję wątroby.</li>
	<li>Przesuń jelita w lewo, aby zapewnić lepszą ekspozycję triady wątroby i wrotnej.</li>
	<li>Wypreparuj powyżej wątroby, aby odsłonić żyłę główną dolną (IVC).</li>
	<li>Podwiązać IVC nad wątrobą za pomocą zacisku tętniczego.</li>
	<li>Wracając do dolnej granicy wątroby, użyj igły motylkowej (patrz materiały), aby uzyskać dożylny dostęp do żyły wrotnej. Zamocuj cewnik ręcznie.</li>
	<li>Kolejno perfundować wątrobę myszy za pomocą strzykawki do wstrzykiwań w tempie 8,9 ml/min z 15 ml roztworu 1, 15 ml 0,75% roztworu kolagenazy 2 i 15 ml roztworu 2 przez cewnik.</li>
	<li>Zbierz perfundowaną wątrobę, tnąc i pobierając masę guza od myszy MTD2 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 10-15 ml PBS.</li>
	<li>Usunąć PBS i przemyć jeszcze raz PBS; na tym etapie nie odwirowywać.</li>
	<li>Pokrój wątrobę na mniejsze kawałki za pomocą nożyczek, a następnie ponownie umyj PBS 2x, aby usunąć pozostałą krew.</li>
	<li>Dodaj 5 ml kompletnej pożywki RPMI do stożkowej probówki i ciągle miel wątrobę nożyczkami na małe kawałki (<3 mm) - tkanka powinna płynnie przejść przez pipetę o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Dodaj cały RPMI do końcowej objętości 30 ml i zawiesić wątrobę za pomocą pipety o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Przefiltrować zmieszany roztwór za pomocą sitka o pojemności 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umyj sitko kilka razy z pełnym RPMI i dostosuj końcową objętość do 50 ml, dodając dodatkowe medium RPMI.</li>
	<li>Zawiesinę należy szybko odwirować za pomocą wirówki do maksymalnej prędkości 500 obr./min; po zwiększeniu prędkości do 50 x g wirówkę należy zatrzymać.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i zawiesić granulki w 20 ml PBS.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego i hemocytometru, a następnie dostosuj stężenie komórek do 2,5 x 106/ml dla następnego inokulacji komórek. 
	UWAGA: Oczekiwany plon z 5 gramów tkanki nowotworowej to 80 milionów hepatocytów o żywotności >95%.</li>
</ol>
3. Inokulacja hepatocytów od myszy MTD2 do wątroby myszy dzikiego typu C57BL/6J przez wstrzyknięcie ISPL
<ol>
	<li>We wszystkich procedurach należy stosować technikę aseptyczną</li>
	<li>Znieczulenie samców myszy C57BL/6J leczonych CCl4 2,5% izofluranem, myszy należy potraktować lubrykantem do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
	<li>Przygotować strzykawki z 200 μl hepatocytów do wstrzykiwań.</li>
	<li>Po odpowiednim uspokojeniu ustaw myszy lewą stroną do góry.</li>
	<li>Ogol cały lewy bok myszy, a następnie wyszoruj obszar, trzykrotnie dolewając na przemian 70% alkoholu i betadyny.</li>
	<li>Podawać 5 mg/kg karprofenu podskórnie przed nacięciem chirurgicznym.</li>
	<li>Wykonaj 1 cm nacięcie na lewym boku równolegle do 13. żebra od skrajności grzbietowej, zaczynając tuż poniżej mięśnia kręgosłupa.</li>
	<li>Zidentyfikuj śledzionę, a następnie zewnętrznij ją za pomocą tępo zakończonych kleszczy.</li>
	<li>Przytnij śledzionę dwoma średniej wielkości tytanowymi klipsami. Umieść oba klipsy między tętnicą śledzionową a żyłą, pozostawiając miejsce między klipsami do przecięcia później po zaszczepieniu. 
	UWAGA: Celem jest odizolowanie dolnego bieguna śledziony, aby zmniejszyć ryzyko wysiewu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 200 μl (0,5 miliona) przygotowanych hepatocytów do dolnego bieguna śledziony za pomocą igły 27 G.</li>
	<li>Przytnij dolną gałąź szypułki (dolne naczynia biegunowe śledziony) jednym średniej wielkości klipsem.</li>
	<li>Przetnij śledzionę między dwoma początkowo umieszczonymi klipsami.</li>
	<li>Usuń dolny biegun śledziony, do którego bezpośrednio wstrzyknięto komórki nowotworowe.</li>
	<li>Użyj przerywanego szycia poliglaktyny 3-0 910, aby zamknąć wewnętrzną warstwę mięśniową.</li>
	<li>Użyj wysterylizowanych stalowych klipsów do nawijania, aby zamknąć zewnętrzną warstwę skóry. 
	UWAGA: Stalowe klipsy są preferowane zamiast szwów, aby uniknąć przeżuwania szwów przez zwierzęta, pozostawiając otwartą ranę.</li>
	<li>Podawać 5 mg/kg karprofenu podskórnie po założeniu szwu.</li>
	<li>Umieść wszystkie zdrowiejące zwierzęta na poduszce grzewczej o kontrolowanej temperaturze i uważnie monitoruj, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.</li>
	<li>Daj myszom swobodny dostęp do wody po zabiegu. Jeśli mysz odwodni się podczas operacji, podaj płyny podskórne (<1 ml).</li>
	<li>Usuń klipsy skórne po 7-10 dniach od operacji.</li>
</ol>

<ol><li>O'Connor, S., Ward, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+-+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma - United States.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 59, 517-520 (2010).</li>
<li>Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+of+Hepatocellular+Carcinoma+Incidence+in+the+United+States+Forecast+Through+2030%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+oncology%3A+official+journal+of+the+American+Society+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030.</a> Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).</li>
<li>Greten, T., Lai, C., Li, G., Staveley-O'Carroll, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+and+Immune-based+Therapies+for+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted and Immune-based Therapies for Hepatocellular Carcinoma.</a> Gastroenterology. 156, 510-524 (2019).</li>
<li>Llovet, J., Zucman-Rossi, J., Pikarsky, E., Sangro, B., Schwartz, M., Sherman, M., Gores, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Disease+primers%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular Carcinoma.</a> Nature reviews. Disease primers. 2, 16018(2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+for+hepatocellular+carcinoma%3A+driver+mutations+and+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Precision medicine for hepatocellular carcinoma: driver mutations and targeted therapy.</a> Oncotarget. 8, 55715-55730 (2017).</li>
<li>Colombo, M., Maisonneuve, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+liver+cancer+mortality+on+a+global+scale%3A+still+a+long+way+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Controlling liver cancer mortality on a global scale: still a long way to go.</a> Journal of Hepatology. 67, 216-217 (2017).</li>
<li>Llovet, J., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 362, 1907-1917 (2003).</li>
<li>Parkin, D., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+world+cancer+burden%3A+Globocan+2000%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Estimating the world cancer burden: Globocan 2000.</a> International Journal of Cancer. 94, 153-156 (2001).</li>
<li>Thomas, M., Zhu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepocellular+carcinoma%3A+the+need+for+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Hepocellular carcinoma: the need for progress.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 2892-2899 (2005).</li>
<li>Llovet, J., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targeted+therapies+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 48, 1312-1327 (2008).</li>
<li>Bruix, J., Sherman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+hepatocellular+carcinoma%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Management of hepatocellular carcinoma: an update.</a> Hepatology. 53, 1020-1022 (2011).</li>
<li>Pang, T., Lam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+management+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Surgical management of hepatocellular carcinoma.</a> World Journal of Hepatology. 7, 245-252 (2015).</li>
<li>Llovet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+endpoints+of+clinical+trials+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institution%22%5BJournal%5D)">Design and endpoints of clinical trials in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of the National Cancer Institution. 100, 698-711 (2008).</li>
<li>Mueller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunology+and+immunotherapy.+Realizing+the+promise.+Introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunology and immunotherapy. Realizing the promise. Introduction.</a> Science. 348, 54-55 (2015).</li>
<li>Gajewski, T., Schreiber, H., Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14, 1014-1022 (2013).</li>
<li>Ribas, A., Wolchok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+cancer+immunotherapy+and+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combining cancer immunotherapy and targeted therapy.</a> Current Opinion in Immunology. 25, 291-296 (2013).</li>
<li>Postow, M., Callahan, M., Wolchok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+blockade+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%3A+Official+Journal+of+the+American+Society+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint blockade in cancer therapy.</a> Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33, 1974-1982 (2015).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VISTA+is+an+inhibitory+immune+checkpoint+that+is+increased+in+ipilimumab+therapy+in+patients+with+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased in ipilimumab therapy in patients with prostate cancer.</a> Nature Medicine. 23, 551-555 (2017).</li>
<li>Hahn, A., Gill, D., Pal, S., Agarwal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immune+checkpoint+cancer+therapy+after+PD-1+and+CTLA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The future of immune checkpoint cancer therapy after PD-1 and CTLA-4.</a> Immunotherapy. 9, 681-692 (2017).</li>
<li>Remon, J., Besse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+inhibitors+in+first-line+therapy+of+advanced+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint inhibitors in first-line therapy of advanced non-small cell lung cancer.</a> Current Opinion in Oncology. 29, 97-104 (2017).</li>
<li>Kudo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+blockade+in+hepatocellular+carcinoma%3A+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma: 2017 update.</a> Liver Cancer. 6, 1-12 (2017).</li>
<li>Kudo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+inhibition+in+hepatocellular+carcinoma%3A+Basics+and+ongoing+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma: Basics and ongoing clinical trials.</a> Oncology. 92, 50-62 (2017).</li>
<li>Breous, E., Thimme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+immunotherapy+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Potential of immunotherapy for hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Hepatology. 54, 830-834 (2011).</li>
<li>Sprinzl, M., Galle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facing+the+dawn+of+immunotherapy+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Facing the dawn of immunotherapy for hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Hepatology. 59, 9-10 (2013).</li>
<li>Liu, D., Staveley-O'Carroll, K., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-based+therapy+clinical+trials+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Cell+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune-based therapy clinical trials in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Clinical Cell Immunology. 6, 376(2015).</li>
<li>Greten, T., Wang, X., Korangy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+of+immune+based+treatments+for+patients+with+HCC%3A+from+basic+science+to+novel+treatment+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Current concepts of immune based treatments for patients with HCC: from basic science to novel treatment approaches.</a> Gut. 64, 842-848 (2015).</li>
<li>Koster, B., de Gruijl, T., van den Eertwegh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+and+future+challenges+in+immune+checkpoint+inhibitory+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Recent developments and future challenges in immune checkpoint inhibitory cancer treatment.</a> Current Opinion in Oncology. 27, 482-488 (2015).</li>
<li>Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+inhibitors+in+challenging+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint inhibitors in challenging populations.</a> Cancer. 123, 1904-1911 (2017).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death-1+%28PD-1%29+checkpoint+blockade+in+combination+with+an+mTOR+inhibitor+restrains+hepatocellular+carcinoma+growth+induced+by+hepatoma+cell-intrinsic+PD-1%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1.</a> Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).</li>
<li>Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mouse+models+for+hepatocellular+carcinoma+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research.</a> International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+inCVAX%2C+in+situ+cancer+vaccine%2C+and+its+immune+response+in+mice+with+hepatocellular+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer.</a> Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438(2016).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+radiofrequency+ablation+platform+in+a+clinically+relevant+murine+model+of+hepatocellular+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer.</a> Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sunitinib+represses+regulatory+T+cells+to+overcome+immunotolerance+in+a+murine+model+of+hepatocellular+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer.</a> Oncoimmunology. 7, 1372079(2017).</li>
<li>Staveley-O'Carroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+ligation+of+CD40+enhances+priming+against+the+endogenous+tumor+antigen+and+promotes+CD8%2B+T+cell+effector+function+in+SV40+T+antigen+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).</li>
<li>Avella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+established+hepatocellular+carcinoma+is+induced+by+chemoimmunotherapy+in+an+orthotopic+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model.</a> Hepatology. 55, 141-152 (2012).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+chemoimmunotherapy+against+hepatocellular+cancer+in+a+novel+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model.</a> Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliposome+C6-ceramide+increases+the+anti-tumor+immune+response+and+slows+growth+of+liver+tumors+in+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice.</a> Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).</li>
<li>Held, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+antigen+expression+and+tumorigenesis+in+transgenic+mice+containing+a+mouse+major+urinary+protein%2FSV40+T+antigen+hybrid+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene.</a> EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).</li>
<li>Hanahan, D., Weinber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
</ol>

Nie ma nikogo do zadeklarowania.

Dzięki temu protokołowi stworzyliśmy wiarygodny i powtarzalny mysi model HCC, który naśladuje inicjację i progresję HCC u ludzi. Klinicznie wiele czynników ryzyka kolejno indukuje uszkodzenie wątroby, zwłóknienie wątroby, marskość wątroby i końcowy etap HCC. W naszym protokole wstrzyknięcie IP CCl4 służy najpierw do wytworzenia zwłóknienia wątroby u myszy typu dzikiego, co pozwala kolejnym hepatocytom onkogennym na tworzenie guzów w warunkach zwłóknienia wątroby. Odkryliśmy, że tworzenie guza wystąpiło najskut...

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest najszybciej rozwijającym się typem nowotworu w Stanach Zjednoczonych (US)1,2,3. Każdego roku diagnozuje się około 850 000 nowych przypadków4,5 i 700 000 pacjentów umiera z powodu tej śmiertelnej choroby6,7,8,9,10, co czyni ją drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie. Leczenie HCC obejmuje resekcję chirurgiczną, przeszczep, ablację, chemoembolizację lub terapie ogólnoustrojowe, takie jak sorafenib11. Wczesna diagnoza i leczenie z resekcją chirurgiczną lub przeszczepem mają najwyższą korzyść w zakresie przeżycia całkowitego4. Niestety, większość pacjentów zgłasza się w późniejszym stadium i wymaga leczenia za pomocą ablacji, chemoembolizacji lub sorafenibu12. Sorafenib, receptorowy inhibitor kinazy tyrozynowej (RTKI), został zatwierdzony przez Agencję ds. Żywności i Leków w 2008 r. jako jedyna ogólnoustrojowa terapia lekowa dostępna w leczeniu nieoperacyjnego HCC. Chociaż lek zapewnia tylko niewielki wzrost całkowitego przeżycia, z 7,9 do 10,7 miesiąca13, zapewnił nową strategię terapeutyczną, którą można wykorzystać do leczenia HCC.
Manipulowanie układem odpornościowym w celu wyeliminowania istniejących nowotworów to szybko rozwijająca się dziedzina badań nad rakiem14. Badania nad immunologicznymi punktami kontrolnymi znacznie przyczyniły się do rozwoju leków immunoterapeutycznych w leczeniu raka15,16. FDA zatwierdziła stosowanie przeciwciał (Abs) przeciwko cytotoksycznemu antygenowi 4 limfocytów T (CTLA-4), białku programowanej śmierci komórki 1 (PD-1) i jego ligandowi PD-L1 w leczeniu czerniaka, raka płuc, raka głowy i szyi oraz raka pęcherza moczowego17,18,19,20. Badania kliniczne monoterapii lub terapii skojarzonej z wykorzystaniem jednego lub wielu przeciwciał przeciwko PD-1, PD-L1 lub CTLA-4 w leczeniu zaawansowanego HCC są w toku21,22,23, a niektóre badania wykazały korzystne wyniki. W 2017 roku FDA udzieliła przyspieszonego zatwierdzenia przeciwciała anty-PD-1 w leczeniu pacjentów z HCC, którzy są oporni na sorafenib, ale ogólny wskaźnik odpowiedzi na tę terapię wynosi tylko 14,3%. Inne strategie nie zostały jeszcze przełożone na praktykę kliniczną24,25. Przezwyciężanie głębokiej tolerancji immunologicznej wywołanej przez nowotwór w celu poprawy terapii immunologicznych punktów kontrolnych26; przewidywanie skuteczności terapii immunologicznych punktów kontrolnych; zapobieganie niepożądanym oddziałaniom immunologicznym; optymalizacja drogi podawania, dawkowania i częstotliwości; i znalezienie skutecznych kombinacji terapii27,28,29 pozostają niezwykle trudnymi zadaniami.
Obecnie istnieje kilka konwencjonalnych metod stosowanych do indukowania HCC w modelach mysich i są one stosowane w zależności od konkretnego pytania badawczego badacza30. Chemicznie indukowane mysie modele HCC ze związkami genotoksycznymi naśladują nowotwór złośliwy wywołany urazem. Modele ksenoprzeszczepów poprzez ektopową lub ortotopową implantację linii komórkowych HCC nadają się do badań przesiewowych leków. Pewna liczba genetycznie zmodyfikowanych myszy została zmodyfikowana w celu zbadania patofizjologii HCC. Myszy transgeniczne wykazujące ekspresję genów wirusowych, onkogenów i/lub czynników wzrostu pozwalają na identyfikację szlaków zaangażowanych w hepatokarcynogenezę. Ze względu na nieodłączne ograniczenia, modele te nie podsumowują typowych cech immunologicznych obserwowanych u ludzkiego HCC, co znacznie utrudniło wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw i opracowanie innowacyjnych strategii immunoterapeutycznych14,15. Niedawno stworzyliśmy klinicznie istotny model mysi. Ten nowatorski model nie tylko naśladuje inicjację i progresję HCC u ludzi, ale także odzwierciedla najbardziej typowe cechy choroby człowieka, w tym dysfunkcję immunologiczną. Scharakteryzowaliśmy jego charakterystykę biologiczną i immunologiczną. Wykorzystując ten nowatorski model, zbadaliśmy różne strategie immunoterapeutyczne w leczeniu HCC31,32,33,34,35,36,37. Ta unikalna platforma pozwala nam badać mechanizmy immunotolerancji indukowanej przez nowotwór i opracowywać strategie terapeutyczne potwierdzające słuszność koncepcji HCC w kierunku ostatecznego przełożenia klinicznego.

<table><tbody><tr><td>Aparat anestezjologiczny</td><td>VETEQUIP</td><td>IMPAC6</td> aparat <td>anestezjologiczny do zabiegu Igła</td></tr><tr><td>motylkowa</td><td>BD</td><td>8122963</td><td>Igła używana do perfuzji wątroby</td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6</td><td>Jackson Lab</td><td>000664&nbsp;</td><td>Myszy stosowane w prototolu</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>CRESCENT CHEMICAL</td><td>20402</td><td>karprofen do uwalniania bólu</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>REF 431751</td><td>Sitko do komórek, 70&micro; m, do izolacji hepatocytów</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td>Wirówka do izolacji komórek</td></tr><tr><td>Klipsy&nbsp;</td><td>Teleflex Medical</td><td>REF 523700</td><td>Tytanowe klipsy do śledziony</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Primovert&nbsp;</td><td>mikroskop do obserwacji komórek</td></tr><tr><td>Myszy Mtd2</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>Prezent od dr Williama A Odbył się w Roswell Park Cancer Institute w 2002 roku, utrzymywany w naszym laboratorium</td></tr><tr><td>Igła</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td>Igła BD Igła do precyzyjnego ślizgu, 27G x 1/2 (0,4 mm x 13 mm)</td></tr> <tr><td>Szew</td><td>ETHICON</td><td>J303H</td><td>powlekany szew VICRYL</td></tr><tr><td>SV40 T Ag</td> przeciwciało <td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>anty-SV40 anty-antygenowe antygenowe antygenowe SV40 do</td></tr><tr><td>strzykawki</td> IHC <td>BD</td><td>REF 309626</td><td>1 ml strzykawka TB do wstrzykiwań komórkowych</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>SIGMA</td><td>T 8154</td><td>Roztwór błękitu trypanowego do badania żywotności komórek</td></tr><tr><td>Klipsy do ran</td><td>Reflex</td><td>reflex9, nr kat. 201-1000</td><td>klipsy ze stali nierdzewnej do zamykania ran</td></tr></tbody></table>

onkogenny, indukowany hepatocytami, ortotopowy mysi model raka wątrobowokomórkowego powstającego w warunkach zapalenia i zwłóknienia wątroby

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

Brak klinicznie istotnego modelu zwierzęcego odnoszącego się do typowych cech immunologicznych raka wątrobowokomórkowego (HCC) znacznie utrudnił wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw i rozwój innowacyjnych strategii immunoterapeutycznych. Aby opracować idealny model zwierzęcy podsumowujący ludzki HCC, immunokompetentne samce myszy C57BL / 6J najpierw otrzymują zastrzyk z czterochlorku węgla (CCl4) w celu wywołania zwłóknienia wątroby, a następnie otrzymują histologicznie normalne hepatocyty onkogenne od młodych samców myszy transgenicznych z antygenem T SV40 (TAg) (MTD2) przez inokulację dośledzionową (ISPL). Androgen wytwarzany u samców myszy biorcy w okresie dojrzewania inicjuje ekspresję TAg pod kontrolą promotora specyficznego dla wątroby. W rezultacie przeniesione hepatocyty stają się komórkami rakowymi i tworzą masy guza w warunkach zwłóknienia wątroby/marskości wątroby. Ten nowatorski model naśladuje inicjację i progresję HCC u ludzi w kontekście zwłóknienia/marskości wątroby i odzwierciedla najbardziej typowe cechy HCC u ludzi, w tym dysfunkcję układu odpornościowego.

Onkogenne hepatocyty wyizolowane z myszy transgenicznych TAg (Rysunek 2) wszczepiono do wątroby myszy typu dzikiego poprzez wtryskiwanie dospleniczne (Rysunek 3). Przeszczepione hepatocyty skutecznie i wiarygodnie wytworzyły ortotopowe guzy HCC (Rysunek 4) z antygenem swoistym dla guza SV40 TAg (Rysunek 5) w warunkach zapalenia i włóknienia wątroby (Rysunek 1).
<img alt="Harmon...

Tutaj opisujemy rozwój klinicznie istotnego mysiego modelu raka wątroby, podsumowującego typowe cechy immunologiczne raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Onkogenny, indukowany hepatocytami, ortotopowy mysi model raka wątrobowokomórkowego powstającego w warunkach zapalenia i zwłóknienia wątroby

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

Użycie samego modelu do opracowania modelu masy raka wątrobowokomórkowego może pomóc ludziom wyjaśnić ich immunotolerancję wywołaną przez nowotwór i specyficzne odpowiedzi immunologiczne nowotworu wywołane leczeniem. Guz ortotopowy, który rozwija się w technice zwłóknienia wątroby, naśladuje cechy kliniczne ludzkiego raka wątroby. Metoda ta może stanowić użyteczne narzędzie w badaniach immunologicznych nad rakiem wątrobowokomórkowym.Wizualna demonstracja tej metody może zilustrować bardziej wymagające technicznie kroki, takie jak wstrzyknięcie dośledzionowe, które są niezbędne do pomyślnego wykonania tego protokołu. Następnie ręcznie przytrzymuj samca, sześcio- do ośmiotygodniowego C57 czarnego 6 myszy grzbietem do góry. Użyj naprzemiennie peelingów z 70% etanolem i betadyną, aby trzykrotnie oczyścić miejsce wstrzyknięcia.Następnie dostarcz myszowi 160 mikrolitrów czterochlorku węgla we wstrzyknięciu dootrzewnowym i wróć do klatki domowej. Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u nogi, u pięciomiesięcznej myszy transgenicznej z antygenem 40 T wirusa małpiego, ułóż mysz w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz kończyny taśmą. Wykonaj nacięcie laparotomii w linii ś

an-oncogenic-hepatocyte-induced-orthotopic-mouse-model-hepatocellular

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ksenografty ludzkich nowotworów u myszy z niedoborem odporności są cennymi narzędziami do badania biologii raka.  Opisano specyficzne protokoły generowania ksenoprzeszczepów podskórnych i wewnątrzwątrobowych z ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego lub fragmentów guza.  Regeneracja wątroby wywołana częściową hepatektomią u myszy biorców jest przedstawiana jako strategia ułatwiająca wszczepienie wewnątrzwątrobowe.

Wytwarzanie podskórnych i wewnątrzwątrobowych ksenoprzeszczepów ludzkiego raka wątrobowokomórkowego u myszy z niedoborem odporności

Przerzutowe rozprzestrzenianie się raka jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Przedstawiamy szczegółowy opis naszej metodologii chirurgii przeżycia w celu ustanowienia "podobnego do pacjenta" ortotopowego syngenicznego modelu myszy do badania mechanizmów przerzutów w guzach narządów litych.

"Podobny do pacjenta" ortotopowy syngeniczny mysi model przerzutów raka wątrobowokomórkowego

Ten protokół zapewnia niezawodną metodę tworzenia humanizowanych myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Podwójnie odtworzone myszy z niedoborem odporności uzyskane przez wstrzyknięcie dośledzionowe ludzkich hepatocytów i hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + są podatne na zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności-1 i rekapitulują uszkodzenie wątroby, jak obserwowano u pacjentów zakażonych wirusem HIV.

Opracowanie podwójnego humanizowanego modelu myszy TK-NOG dla patogenezy wątroby związanej z HIV

Szczegółowo opisujemy klinicznie istotny model raka jelita grubego z przerzutami do wątroby (CRLM) oraz wpływ reperfuzji niedokrwienia wątroby (I/R) na wzrost guza i przerzuty. Model ten może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw indukowanego przez operację wzrostu przerzutów do wątroby.

Mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego

Ortotopowe modele myszy z przerzutowym czerniakiem błony naczyniowej oka ludzkiej wątroby zostały stworzone przy użyciu technik chirurgicznej implantacji ortotopowej z technikami wstrzykiwania kawałków guza pochodzących od pacjenta i igieł z hodowanymi ludzkimi liniami komórkowymi czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej.

Generowanie ortotopowej platformy ksenoprzeszczepu ludzkiego czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej wątroby u myszy z niedoborem odporności

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Wstrzyknięcie organoidów raka jelita grubego (CRC) do żyły wrotnej powoduje przerzuty do wątroby bogate w zręb. Ten mysi model przerzutów do wątroby CRC stanowi użyteczne narzędzie do badania interakcji guz-zręb i opracowywania nowych terapii ukierunkowanych na zręb, takich jak terapie genowe za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem.

Wstrzyknięcie do żyły wrotnej organoidów raka jelita grubego w celu zbadania zrębu z przerzutami do wątroby

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia ortotopowych ksenoprzeszczepów raka wątrobowokomórkowego z podwiązaniem tętnicy wątrobowej i bez niej oraz wykonywania nieinwazyjnego obrazowania hipoksji guza za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) przy użyciu [18F]Fluoromisonidazolu ([18F]FMISO) i [18F]Fluorodeoksyglukozy ([18F]FDG).

Nieinwazyjne obrazowanie PET/MR w ortotopowym mysim modelu raka wątrobowokomórkowego

Organoidy generowane z guzów pacjenta są ortotopowo wstrzykiwane do wątroby myszy. Resekcja nienowotworowej tkanki wątroby prowadzi do środowiska regeneracyjnego w tkance wątroby, w której znajduje się guz.

Model ksenoprzeszczepu organoidalnego uzyskany od pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym w celu zbadania wpływu regeneracji wątroby na wzrost guza

Mysi model częściowej 2/3 (66%) hepatektomii jest dobrze opisany w literaturze, ale rzadko stosowano bardziej rozbudowane hepatektomie naśladujące zespół małego dla rozmiaru po przeszczepie wątroby. Opisujemy rozszerzoną 78% procedurę hepatektomii w modelu mysim, która powoduje około 50% śmiertelności pooperacyjnej u zdrowych myszy.

Rozszerzona 78% hepatektomia w mysim modelu chirurgicznym

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Poznaj ortotopowy model raka wątrobowokomórkowego u myszy z włóknieniem wątroby i wstrzyknięciem wewnątrzśledzionowym. Ta metoda pozwala badać immunotolerancję indukowaną przez guz oraz odpowiedzi immunologiczne na leczenie.

Onkogenny, indukowany hepatocytami, ortotopowy mysi model raka wątrobowokomórkowego powstającego w warunkach zapalenia i zwłóknienia wątroby (Wideo) | JoVE Journal

Onkogenny, indukowany hepatocytami, ortotopowy mysi model raka wątrobowokomórkowego powstającego w warunkach zapalenia i zwłóknienia wątroby

Przeglądaj więcej filmów