Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

W tym protokole możemy zidentyfikować interakcje między białkami a DNA, ujawniając regulację transkrypcji genu. Pomaga to zrozumieć mechanizmy molekularne w komórkach. Modyfikujemy istniejące wcześniej protokoły, a następnie ustanawiamy prostsze i bardziej przejrzyste protokoły testowe.

Po prostu postępuj zgodnie z protokołem od pierwszego kroku, aby test mógł zostać wykonany z powodzeniem. Aby przygotować usieciowaną chromatynę, w dygestorium dodaj cztery mililitry pożywki do hodowli komórkowych 1% VCaP i 0,229 mililitra 18,5% PFA do sześciocentymetrowej naczynia. Delikatnie zakręć naczyniem, aby równomiernie rozprowadzić PFA.

Inkubować w temperaturze pokojowej dokładnie przez 10 minut. Następnie dodaj 0,47 mililitra 1,25-molowego roztworu glicyny do naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby zatrzymać dalsze sieciowanie. Po umyciu komórek zgodnie z rękopisem, zeskrob komórki i przenieś zawiesinę komórek do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Odwirować probówkę z zawiesiną komórek na 3 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby odzyskać osad komórkowy. Użyj pipety, aby całkowicie usunąć PBS. Zapisz liczbę komórek w probówce i przechowuj osad komórek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby przeprowadzić lizę komórek, najpierw rozmrozić przechowywane granulki komórek VCaP na lodzie. Dodać 300 mikrolitrów przygotowanego buforu do lizy komórek ChIP uzupełnionego do każdej probówki i dokładnie zawiesić osad. Wirować probówkę przez 15 sekund i inkubować zawiesinę na lodzie przez 10 minut.

Wirować z prędkością 9 000 g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Całkowicie usunąć supernatant i dodać 300 mikrolitrów buforu do wytrawiania MNazy w celu ponownego zawieszenia osadu. Rozcieńczyć MNazę buforem wytrawiającym MNazy w 1,5-mililitrowej probówce, aby uzyskać 50 jednostek żelu na mikrolitr.

Dodać rozcieńczoną MNazę do zawiesiny i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza dokładnie przez 10 minut. Ustaw mieszanie przez odwrócenie co 2 1/2 minuty. Aby zakończyć trawienie MNazy, dodaj 30 mikrolitrów 0,5-molowego EDTA o pH ósmym i krótko

Po inkubacji przez pięć minut na lodzie, odwirować przy 9 000 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach przygotowanego buforu rozcieńczającego ChIP uzupełnionego. Następnie, na sonikatorze wyposażonym w sondę z mikrokońcówką, ustaw warunki sonikacji na amplitudę dwójkową, czas przetwarzania 15 sekund, impuls WŁĄCZONY na pięć sekund i impuls WYŁĄCZONY na 30 sekund.

Sonikować zawiesinę na lodzie. Narysuj jeden mikrolitr zawiesiny i umieść na szkiełku szkiełkowym. Pod mikroskopem obserwuj, czy struktura komórkowa jest prawie uszkodzona.

Odwirować probówkę o ciśnieniu 9 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Zachowaj 20 mikrolitrów strawionej chromatyny w 1,5-mililitrowej probówce śrubowej do dalszej obróbki, a resztę przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po pierwsze, do każdej 1,5-mililitrowej probówki śrubowej dodaj 75 mikrolitrów wody, cztery mikrolitry pięciomolowego chlorku sodu i jeden mikrolitr proteinazy, K.To usunąć sieciowanie między białkiem a DNA, dodaj 20 mikrolitrów strawionej chromatyny z każdego stanu trawienia MNazy do probówki śrubowej.

Zamknij szczelnie nakrętkę, całkowicie wymieszaj i inkubuj probówkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Rano, po odwirowaniu probówki na dwa do 3 000 razy g przez kilka sekund, dodaj 100 mikrolitrów PCI. Energicznie wirować, aby utworzyć emulsję.

Ponownie odwirować probówkę z maksymalną prędkością przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj dwie 1,5-mililitrowe probówki wirówkowe na warunek. Dodaj 100 mikrolitrów PCI do jednej probówki.

Dodaj 10 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu o pH 5,2 i dwa mikrolitry glikogenu do innej probówki. Z probówki wyjętej z wirówki ostrożnie pobrać górną fazę zawierającą DNA i dodać ją do probówki zawierającej PCI. Energicznie wirować i odwirowywać probówkę z maksymalną prędkością przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś górną fazę do probówki zawierającej octan sodu i glikogen przygotowane wcześniej. Dodaj 250 mikrolitrów etanolu i wymieszaj przez odwrócenie. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Wirować probówkę z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Potwierdź granulki na spodzie tuby. Ostrożnie usuń supernatant, aby nie naruszyć osadu, i dodaj 500 mikrolitrów 70% etanolu.

Wirować probówkę z maksymalną prędkością przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Całkowicie usunąć sklarowany osad i suszyć osad przez około pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 20 mikrolitrów TE, aby rozpuścić osad.

Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV. Po przygotowaniu strawionej chromatyny rozmrozić wszystkie próbki na lodzie. Dodać 1200 mikrolitrów przygotowanego buforu rozcieńczającego ChIP uzupełnionego w celu rozcieńczenia strawionej chromatyny do stężenia pięciu mikrogramów na 500 mikrolitrów.

Dodaj pięć mikrolitrów rozcieńczonej, strawionej chromatyny do 1,5-mililitrowej rurki śrubowej jako próbkę wejściową. Przechowywać próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Dodaj po 500 mikrolitrów rozcieńczonej strawionej chromatyny do 1,5-mililitrowej rurki śrubowej jako próbkę immunoprecypitacyjną.

Dodać dwa mikrogramy przeciwciała do każdej probówki i zamknąć nakrętkę. Inkubuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, delikatnie mieszając na kołyszącej się platformie. Rano dodaj 30 mikrolitrów kulek magnetycznych białka G klasy ChIP do każdej probówki.

Ponownie inkubować probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, delikatnie mieszając. Następnie krótko zakręć rurkę z prędkością od dwóch do 3 000 g i umieść probówkę w stojaku polietylenowym zawierającym magnesy neodymowe na jedną minutę. Następnie ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację.

Następnie dodaj 0,5 mililitra niskosolnego buforu do płukania kompleksu odpornościowego do każdej probówki. Krótko przekręć rurkę, aby rozproszyć koraliki. Inkubować probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, delikatnie mieszając na kołyszącej się platformie.

Powtórz pranie z kompleksem odpornościowym o wysokiej zawartości soli i kompleksem immunologicznym chlorku litu zgodnie z rękopisem. Po całkowitym usunięciu pozostałego supernatantu dodać do probówki 150 mikrolitrów buforu elucyjnego. Wiruj rurkę, aby całkowicie rozproszyć koraliki.

Zamknij nakrętkę i inkubuj probówkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby dokładnie rozprowadzić koraliki, mieszaj przez odwrócenie co pięć minut. Podczas inkubacji należy przygotować 1,5-mililitrową rurkę śrubową i dodać sześć mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i dwa mikrolitry proteinazy K. Rozmrozić 1% próbkę wejściową wcześniej przygotowaną na lodzie.

Do próbki wejściowej dodać 150 mikrolitrów buforu elucyjnego, sześć mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i dwa mikrolitry proteinazy K. Po inkubacji probówki zawierającej koraliki odwirować. Umieścić probówkę w stojaku magnetycznym na jedną minutę i przenieść supernatant do probówki śrubowej zawierającej chlorek sodu i proteinazę K. Reprezentatywne mikrofotografie usieciowanych osadów komórkowych przed i po sonikacji pokazują wyraźne różnice.

Bez sonikacji struktura komórki pozostaje nienaruszona, co wskazuje, że chromatyna jest obecna w jądrach. Krótka sonikacja rozbija strukturę komórki. Usieciowaną chromatynę przygotowano z komórek VCaP i trawiono różnymi ilościami MNazy.

Bez dodatku MNazy pojawił się wzór rozmazu o bardzo dużej masie cząsteczkowej. Dodanie MNazy dało wzór drabinkowy, który pokazuje, że MNaza trawi międzynukleosomy. Tylko stan, w którym wytworzyły się fragmenty chromatyny do 900 pz, można uznać za prawidłowe trawienie, podczas gdy nieprawidłowy wzorzec trawienia wskazuje, że nadmierne trawienie skutkowało głównie produkcją mononukleosomów.

Wzorzec trawienia chromatyny w komórkach VCaP wskazuje na prawidłowe trawienie chromatyny. Najwyższe zagęszczenie H3K4metylo3 zaobserwowano około 0,5 kilobazy i jednej kilobazy przed AR-TSS. Regiony położone na głębokości 19 kilobaz i 8 kb w górę rzeki i 12 kilobaz poniżej AR-TSS miały jednak niewielkie zajęcie H3K4metylo3, co wskazuje, że mogą one być używane jako regiony ujemne.

Najważniejsze jest określenie warunków trawienia MNazy. Utrzymuj liczbę komórek, objętość buforu i ilość enzymów w każdym eksperymencie. Warunek musi być zidentyfikowany dla każdego typu komórki.

Możemy przeprowadzić sekwencjonowanie ChIP dla globalnego zajętości czynników i wychwytywania konformacji chromatyny w celu określenia interakcji między dystalnymi zmianami genomowymi. Metoda ta może ujawnić mechanizmy procesowe transkrypcji. Test ChIP jest potężnym narzędziem do badania regulacji transkrypcji, ale jest kłopotliwy i niepowtarzalny.

Nasza metoda zachęca badaczy do rutynowego i łatwego przeprowadzania testu.