Name: Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków. Ta metoda umożliwia identyfikację interakcji białko-DNA i badanie regulacji transkrypcji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania są wspierane przez tantiemy Genentech dla City of Hope. Prace te nie są wspierane w całości ani w części przez National Institutes of Health.

<ol><li>Nikolov, D. B., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+transcription+initiation%3A+a+structural+view%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II transcription initiation: a structural view.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+whole-cell+fixation+to+visualize+replicating+and+maturing+simian+virus+40%3A+identification+of+new+viral+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).</li>
<li>Jackson, V., Chalkley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+isolation+of+replicative+chromatin%3A+selective+deposition+of+histone+on+both+new+and+old+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA.</a> Cell. 23 (1), 121-134 (1981).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).</li>
<li>Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of Genomic DNA.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).</li>
<li>Crouse, J., Amorese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+Precipitation%3A+Ammonium+Acetate+as+an+Alternative+to+Sodium+Acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate.</a> Focus. 9 (2), 3-5 (1987).</li>
<li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+Precipitation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol Precipitation of DNA.</a> Focus. 7 (4), 1-2 (1985).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+landmark+and+transcription+initiation+at+most+promoters+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells.</a> Cell. 130 (1), 77-88 (2007).</li>
<li>Louie, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen-induced+recruitment+of+RNA+polymerase+II+to+a+nuclear+receptor-p160+coactivator+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+loop+mediated+by+protein+phosphatase+1alpha+mobilization+of+P-TEFb+and+basal+CDK1+drives+androgen+receptor+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+valid+reference+genes+for+mRNA+and+microRNA+normalisation+in+prostate+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines.</a> Scientific reports. 8 (1), 1949(2018).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nature. 1 (1), 179-185 (2006).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).</li>
<li>Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+features+of+lamin+A-interacting+chromatin+domains+mapped+by+ChIP-sequencing+from+sonicated+or+micrococcal+nuclease-digested+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin.</a> Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28microChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).</li>
<li>Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT-rich+interactive+domain+5B+regulates+androgen+receptor+transcription+in+human+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells.</a> Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż sonikacja jest powszechnie stosowana w celu uzyskania rozdrobnionej chromatyny, identyfikacja powtarzalnych warunków jest czasochłonna i kłopotliwa. W tym protokole zastosowaliśmy trawienie MNazy, ponieważ trawienie enzymatyczne powinno być łatwiejsze do zidentyfikowania powtarzalnych warunków. Krótki etap sonikacji po trawieniu MNazy (patrz krok 2.2) był konieczny do przerwania błony komórkowej i uwolnienia strawionej chromatyny. Dlatego moc sonikacji w naszym protokole powinna być jak najniższa. Używamy tych sa...

Ekspresja genów w komórkach ssaków jest ściśle i dynamicznie regulowana, a transkrypcja jest jednym z kluczowych etapów. Transkrypcja genów jest regulowana głównie przez czynniki transkrypcyjne i histony. Czynnik transkrypcyjny to białko, które wiąże się z określonymi sekwencjami DNA i kontroluje transkrypcję genów. Czynniki te albo promują, albo hamują rekrutację polimerazy RNA II (PolII), która inicjuje syntezę mRNA z genomowego DNA jako matrycy1. Modyfikacje histonów, takie jak acetylacja i metylacja reszt ogona histonów, pozytywnie i negatywnie wpływają na transkrypcję genów poprzez zmianę struktury chromatyny2. Ponieważ zmiany w ekspresji genów wpływają na kontekst komórkowy, konieczne jest zbadanie mechanizmów molekularnych, za pomocą których regulowana jest transkrypcja.
Do tej pory dostępnych jest kilka metod badania regulacji transkrypcji genów. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), zwany również testem przesunięcia żelu, służy do analizy interakcji białko-DNA3. Ekstrakt jądrowy z komórek będących przedmiotem zainteresowania inkubuje się z sondą DNA znakowaną radioaktywnym izotopem (na przykład 32P) i elektroforezą na żelu poliakrylamidowym. Autoradiogram pokazuje, że kompleks DNA-białko migruje wolniej niż sonda w żelu. W obecności przeciwciała przeciwko białku kompleks DNA-białko-przeciwciało migruje w żelu wolniej niż kompleks DNA-białko. To przesunięte prążki ujawniają specyficzne wiązanie między DNA a białkiem. Jednak EMSA określa tylko specyficzną interakcję DNA-białko w systemie bezkomórkowym, a zatem nie wiadomo, czy interakcja kontroluje transkrypcję w żywych komórkach. Przejściowy test reporterowy, powszechnie nazywany testem reporterowym lucyferazy, został opracowany w celu rozwiązania problemu regulacji ekspresji genów w komórkach. Zazwyczaj region genomowy genu będącego przedmiotem zainteresowania jest wprowadzany do plazmidu reporterowego, przejściowo transfekowany do komórek i mierzona jest aktywność reporterowa. Różnorodność mutantów delecyjnych pozwala na identyfikację regionów odpowiedzialnych za regulację genów. Mimo że test reporterowy jest użytecznym narzędziem do identyfikacji czynników transkrypcyjnych i wiązania sekwencji DNA kontrolujących transkrypcję, metoda ta ma główną wadę polegającą na tym, że plazmid reporterowy jest wolny od struktury chromatyny i nie odzwierciedla "prawdziwej" maszynerii transkrypcyjnej. Ponadto zmiany w modyfikacjach histonów nie mogą być określone przez system.
Rozwój metody immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) opierał się na raportach Jacksona i Chalkleya, że "cała komórka" utrwalanie formaldehydem zachowywało strukturę chromatyny4,5. Od tego czasu opracowano i udoskonalono wiele powiązanych technik6. W testach ChIP komórki są utrwalane formaldehydem w celu usieciowania DNA i białek. Chromatyna jest rozdrobniona, a następnie immunoprecypitowana za pomocą interesujących przeciwciał. Kompleks immunologiczny jest myty, a DNA oczyszczane. Amplifikacja PCR starterami ukierunkowanymi na określony region genomu ujawnia zajęcie interesujących białek w genomie.
Chociaż ChIP jest potężnym narzędziem do identyfikacji interakcji białek, takich jak czynniki transkrypcyjne i zmodyfikowane histony, metoda ta wiąże się w praktyce z pewnymi trudnościami, takimi jak etap fragmentacji chromatyny. Sonikacja jest szeroko stosowana do ścinania chromatyny; Identyfikacja powtarzalnych warunków jest jednak kłopotliwa. Leczenie nukleazą mikrokokową (MNazą) jest alternatywną metodą ścinania chromatyny. MNaza to endoegzonukleaza, która trawi dwuniciowe, jednoniciowe, koliste i liniowe DNA i RNA. Stosunkowo łatwo jest określić warunki, w tym ilość chromatyny i enzymu, temperaturę i czas inkubacji, dla optymalnej fragmentacji chromatyny. Zmodyfikowaliśmy i uprościliśmy istniejące protokoły oraz opracowaliśmy prostą i powtarzalną metodę. W artykule przedstawiono protokół testu ChIP z wykorzystaniem MNazy w komórkach ssaków.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>2x iQ SYBR Green supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1706862</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>50 pz drabinka DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr>Produkt badawczy<td>agarozy</td><td> </td><td>Międzynarodowy A20090</td><td></td></tr><tr><td>Rozgałęziony poli(etylenoksy)etanol oktylofenoksy</td><td>Millipore Sigma</td><td>I8896</td><td>IGEPAL CA-630</td></tr><tr><td>Kulki magnetyczne białka G klasy ChIP</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9006S</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do rozcieńczania chromatyny (ChIP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-153</td><td>Skład buforu: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl.</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Purple (6x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0724</td><td>Glikogen klasy elektroferezy</td></tr><tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>G1767</td><td>19-22 mg / ml</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy Halt, bez EDTA (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78445</td><td></td></tr><tr><td>Kompleks immunologiczny o wysokiej zawartości soli Bufor do płukania</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-155</td><td>Skład buforu: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl.</td></tr><tr><td>Przeciwciało histonowe H3K4me3 (pAb)</td><td>Aktywny motyw</td><td>39915</td><td></td></tr><tr><td>LiCl Immune Complex Bufor do płukania</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-156</td><td>Skład buforu: 0,25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% kwas dezoksycholowy (sól sodowa), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,1.</td></tr><tr><td>Low Salt Immune Complex Wash Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-154</td><td>Skład buforu: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl.</td></tr><tr><td>Stojak Magna GrIP (8 dołków)</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-400</td><td>Każdy rodzaj magnetycznych stojaków separacyjnych, które są kompatybilne z probówką 1,5 ml, jest w porządku.</td></tr><tr><td>Nukleaza mikrokokowa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>jest dostarczana z 10-krotnym buforem (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7,9 przy 25 &deg; C) i 100x BSA (10 mg / ml)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>JT Baker</td><td>3506-01</td><td></td></tr><tr><td>Normalny królik IgG</td><td>Millipore Sigma</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza</td><td>K Millipore Sigma</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96, C1000</td><td></td></tr><tr><td>RNA pol II CTD przeciwciało phospho Ser5</td><td>Aktywny motyw</td><td>39749</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>100155</td> Octan sodu <td>klasy elektroferezy</td></tr><tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator wyposażony w sondę mikrokońcówkową</td><td>QSONICA</td><td>Q700</td><td>Każdy rodzaj sonikatorów, które są kompatybilne z probówką 1,5 ml, jest w porządku.</td></tr><tr><td>UltraPure Phenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1, v/v)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15593031</td><td>pH 8,05</td></tr></tbody></table>

test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Aby wyrazić fenotypy komórkowe w organizmach, żywe komórki odpowiednio wykonują ekspresję genów, a programy transkrypcyjne odgrywają kluczową rolę w ekspresji genów. Komórkowa maszyneria transkrypcyjna i jej białka modyfikujące chromatynę koordynują się, aby regulować transkrypcję. Aby przeanalizować regulację transkrypcji na poziomie molekularnym, dostępnych jest kilka metod eksperymentalnych, takich jak przesunięcie ruchliwości elektroforetycznej, przejściowe badanie reporterowe i testy immunoprecypitacji chromatyny (ChIP). W tym artykule szczegółowo opisujemy zmodyfikowany test ChIP ze względu na jego zalety w bezpośrednim pokazywaniu modyfikacji histonów i interakcji między białkami a DNA w komórkach. Jednym z kluczowych kroków w udanym teście ChIP jest ścinanie chromatyny. Chociaż sonikacja jest powszechnie stosowana do ścinania chromatyny, trudno jest określić powtarzalne warunki. Zamiast ścinania chromatyny za pomocą sonikacji, zastosowaliśmy trawienie enzymatyczne za pomocą nukleazy mikrokokowej (MNazy), aby uzyskać bardziej powtarzalne wyniki. W tym artykule przedstawiamy prosty protokół testu ChIP przy użyciu MNazy.

Trawienie chromatyny jest jednym z kluczowych etapów analizy ChIP. Do trawienia chromatyny w celu uzyskania mieszaniny oligomerów nukleosomowych wykorzystaliśmy MNazę. W etapie trawienia MNaza może przenikać przez błonę jądrową i trawić chromatynę. Jednak strawiona chromatyna nie może przejść przez błonę i pozostaje w jądrach. Aby uwolnić strawioną chromatynę z jąder, konieczne jest krótkie sonikowanie. Na rysunku 1A przedstawiono mikrofotografie zawiesiny komórek VCaP przed i po sonikowaniu...

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

W tym protokole możemy zidentyfikować interakcje między białkami a DNA, ujawniając regulację transkrypcji genu. Pomaga to zrozumieć mechanizmy molekularne w komórkach. Modyfikujemy istniejące wcześniej protokoły, a następnie ustanawiamy prostsze i bardziej przejrzyste protokoły testowe.Po prostu postępuj zgodnie z protokołem od pierwszego kroku, aby test mógł zostać wykonany z powodzeniem. Aby przygotować usieciowaną chromatynę, w dygestorium dodaj cztery mililitry pożywki do hodowli komórkowych 1% VCaP i 0,229 mililitra 18,5% PFA do sześciocentymetrowej naczynia. Delikatnie zakręć naczyniem, aby równomiernie rozprowadzić PFA.Inkubować w temperaturze pokojowej dokładnie przez 10 minut. Następnie dodaj 0,47 mililitra 1,25-molowego roztworu glicyny do naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby zatrzymać dalsze sieciowanie. Po umyciu komórek zgodnie z rękopisem, zeskrob komórki i przenieś zawiesinę komórek do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Odwirować probówkę z zawiesiną komórek na 3 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby odzyskać osad komórkowy. Użyj pipety, aby całkowicie usunąć PBS. Zapisz liczbę komórek w probówce i przechowuj osad komórek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby przeprowadzić lizę komórek, najpierw rozmrozić przechowywane granulki komórek VCaP na lodzie. Dodać 300 mikrolitrów przygotowanego buforu do lizy komórek ChIP uzupełnionego do każdej probówki i dokładnie zawiesić osad. Wirować probówkę przez 15 sekund i inkubować zawiesinę na lodzie przez 10 minut.Wirować z prędkością 9 000 g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Całkowicie usunąć supernatant i dodać 300 mikrolitrów buforu do wytrawiania MNazy w celu ponownego zawieszenia osadu. Rozcieńczyć MNazę buforem wytrawiającym MNazy w 1,5-mililitrowej probówce, aby uzyskać 50 jednostek żelu na mikrolitr.Dodać rozcieńczoną MNazę do zawiesiny i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza dokładnie przez 10 minut. Ustaw mieszanie przez odwrócenie co 2 1/2 minuty. Aby zakończyć trawienie MNazy, dodaj 30 mikrolitrów 0,5-molowego EDTA o pH ósmym i krótko wiruj.Po inkubacji przez pięć minut na lodzie, odwirować przy 9 000 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach przygotowanego buforu rozcieńczającego ChIP uzupełnionego. Następnie, na sonikatorze wyposażonym w sondę z mikrokońcówką, ustaw warunki sonikacji na amplitudę dwójkową, czas przetwarzania 15 sekund, impuls WŁĄCZONY na pięć sekund i impuls WYŁĄCZONY na 30 sekund.Sonikować zawiesinę na lodzie. Narysuj jeden mikrolitr zawiesiny i umieść na szkiełku szkiełkowym. Pod mikroskopem obserwuj, czy struktura komórkowa jest prawie uszkodzona.Odwirować probówkę o ciśnieniu 9 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Zachowaj 20 mikrolitrów strawionej chromatyny w 1,5-mililitrowej probówce śrubowej do dalszej obróbki, a resztę przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po pierwsze, do każdej 1,5-mililitrowej probówki śrubowej dodaj 75 mikrolitrów wody, cztery mikrolitry pięciomolowego chlorku sodu i jeden mikrolitr proteinazy, K.To usunąć sieciowanie między białkiem a DNA, dodaj 20 mikrolitrów strawionej chromatyny z każdego stanu trawienia MNazy do probówki śrubowej.Zamknij szczelnie nakrętkę, całkowicie wymieszaj i inkubuj probówkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Rano, po odwirowaniu probówki na dwa do 3 000 razy g przez kilka sekund, dodaj 100 mikrolitrów PCI. Energicznie wirować, aby utworzyć emulsję.Ponownie odwirować probówkę z maksymalną prędkością przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj dwie 1,5-mililitrowe probówki wirówkowe na warunek. Dodaj 100 mikrolitrów PCI do jednej probówki.Dodaj 10 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu o pH 5,2 i dwa mikrolitry glikogenu do innej probówki. Z probówki wyjętej z wirówki ostrożnie pobrać górną fazę zawierającą DNA i dodać ją do probówki zawierającej PCI. Energicznie wirować i odwirowywać probówkę z maksymalną prędkością przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.Następnie przenieś górną fazę do probówki zawierającej octan sodu i glikogen przygotowane wcześniej. Dodaj 250 mikrolitrów etanolu i wymieszaj przez odwrócenie. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Wirować probówkę z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Potwierdź granulki na spodzie tuby. Ostrożnie usuń supernatant, aby nie naruszyć osadu, i dodaj 500 mikrolitrów 70% etanolu.Wirować probówkę z maksymalną prędkością przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Całkowicie usunąć sklarowany osad i suszyć osad przez około pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 20 mikrolitrów TE, aby rozpuścić osad.Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV. Po przygotowaniu strawionej chromatyny rozmrozić wszystkie próbki na lodzie. Dodać 1200 mikrolitrów przygotowanego buforu rozcieńczającego ChIP uzupełnionego w celu rozcieńczenia strawionej chromatyny do stężenia pięciu mikrogramów na 500 mikrolitrów.Dodaj pięć mikrolitrów rozcieńczonej, strawionej chromatyny do 1,5-mililitrowej rurki śrubowej jako próbkę wejściową. Przechowywać próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Dodaj po 500 mikrolitrów rozcieńczonej strawionej chromatyny do 1,5-mililitrowej rurki śrubowej jako próbkę immunoprecypitacyjną.Dodać dwa mikrogramy przeciwciała do każdej probówki i zamknąć nakrętkę. Inkubuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, delikatnie mieszając na kołyszącej się platformie. Rano dodaj 30 mikrolitrów kulek magnetycznych białka G klasy ChIP do każdej probówki.Ponownie inkubować probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, delikatnie mieszając. Następnie krótko zakręć rurkę z prędkością od dwóch do 3 000 g i umieść probówkę w stojaku polietylenowym zawierającym magnesy neodymowe na jedną minutę. Następnie ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację.Następnie dodaj 0,5 mililitra niskosolnego buforu do płukania kompleksu odpornościowego do każdej probówki. Krótko przekręć rurkę, aby rozproszyć koraliki. Inkubować probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, delikatnie mieszając na kołyszącej się platformie.Powtórz pranie z kompleksem odpornościowym o wysokiej zawartości soli i kompleksem immunologicznym chlorku litu zgodnie z rękopisem. Po całkowitym usunięciu pozostałego supernatantu dodać do probówki 150 mikrolitrów buforu elucyjnego. Wiruj rurkę, aby całkowicie rozproszyć koraliki.Zamknij nakrętkę i inkubuj probówkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby dokładnie rozprowadzić koraliki, mieszaj przez odwrócenie co pięć minut. Podczas inkubacji należy przygotować 1,5-mililitrową rurkę śrubową i dodać sześć mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i dwa mikrolitry proteinazy K. Rozmrozić 1% próbkę wejściową wcześniej przygotowaną na lodzie.Do próbki wejściowej dodać 150 mikrolitrów buforu elucyjnego, sześć mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i dwa mikrolitry proteinazy K. Po inkubacji probówki zawierającej koraliki odwirować. Umieścić probówkę w stojaku magnetycznym na jedną minutę i przenieść supernatant do probówki śrubowej zawierającej chlorek sodu i proteinazę K. Reprezentatywne mikrofotografie usieciowanych osadów komórkowych przed i po sonikacji pokazują wyraźne różnice.Bez sonikacji struktura komórki pozostaje nienaruszona, co wskazuje, że chromatyna jest obecna w jądrach. Krótka sonikacja rozbija strukturę komórki. Usieciowaną chromatynę przygotowano z komórek VCaP i trawiono różnymi ilościami MNazy.Bez dodatku MNazy pojawił się wzór rozmazu o bardzo dużej masie cząsteczkowej. Dodanie MNazy dało wzór drabinkowy, który pokazuje, że MNaza trawi międzynukleosomy. Tylko stan, w którym wytworzyły się fragmenty chromatyny do 900 pz, można uznać za prawidłowe trawienie, podczas gdy nieprawidłowy wzorzec trawienia wskazuje, że nadmierne trawienie skutkowało głównie produkcją mononukleosomów.Wzorzec trawienia chromatyny w komórkach VCaP wskazuje na prawidłowe trawienie chromatyny. Najwyższe zagęszczenie H3K4metylo3 zaobserwowano około 0,5 kilobazy i jednej kilobazy przed AR-TSS. Regiony położone na głębokości 19 kilobaz i 8 kb w górę rzeki i 12 kilobaz poniżej AR-TSS miały jednak niewielkie zajęcie H3K4metylo3, co wskazuje, że mogą one być używane jako regiony ujemne.Najważniejsze jest określenie warunków trawienia MNazy. Utrzymuj liczbę komórek, objętość buforu i ilość enzymów w każdym eksperymencie. Warunek musi być zidentyfikowany dla każdego typu komórki.Możemy przeprowadzić sekwencjonowanie ChIP dla globalnego zajętości czynników i wychwytywania konformacji chromatyny w celu określenia interakcji między dystalnymi zmianami genomowymi. Metoda ta może ujawnić mechanizmy procesowe transkrypcji. Test ChIP jest potężnym narzędziem do badania regulacji transkrypcji, ale jest kłopotliwy i niepowtarzalny.Nasza metoda zachęca badaczy do rutynowego i łatwego przeprowadzania testu.

chromatin-immunoprecipitation-assay-using-micrococcal-nucleases

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Test NU-ELISA (Nucleosome ELISA) jest czułą i ilościową metodą wykrywania ogólnych wzorców modyfikacji potranslacyjnych w preparatach natywnych, nienaruszonych nukleosomów. Modyfikacje te obejmują metylacje, acetylacje i fosforylacje w konkretnych resztach aminokwasowych histonów, dzięki czemu NU-ELISA stanowi globalny test proteomiczny ogólnego stanu modyfikacji chromatyny w określonych typach komórek.

Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych w natywnych, nienaruszonych nukleosomach metodą ELISA

Źródło: Mendez, F. M.  i inni., Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu. J. Vis. Exp. (2018). Ten film pokazuje izolację kompleksów białko-DNA z komórek neurosfery pochodzących z guza mózgu myszy przy użyciu natywnej immunoprecypitacji chromatyny. Szczegółowo opisuje etapy przygotowania chromatyny, immunoprecypitacji, płukania i trawienia białek w celu uwolnienia DNA do dalszej analizy.

Immunoprecypitacja chromatyny natywnej komórek neurosfery

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Ukierunkowane uszkodzenie DNA można osiągnąć poprzez przywiązanie czynnika uszkadzającego DNA do oligonukleotydu tworzącego triplex (TFO). Za pomocą zmodyfikowanych TFO, asocjacji białek specyficznych dla uszkodzenia DNA i modyfikacji topologii DNA można badać w komórkach ludzkich poprzez wykorzystanie zmodyfikowanych testów immunoprecypitacji chromatyny i testów superzwijania DNA opisanych w niniejszym dokumencie.

Narzędzia do badania roli architektonicznego białka HMGB1 w przetwarzaniu zniekształcających helisę, specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA

Ta praca opisuje protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) przy użyciu dojrzałej linii mysich komórek T. Protokół ten jest odpowiedni do badania rozkładu określonych znaczników histonowych w określonych miejscach promotora lub w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w liniach mysich limfocytów T

Mechanizmy epigenetyczne są często zmieniane w glejaku. Immunoprecypitacja chromatyny może być wykorzystana do badania konsekwencji zmian genetycznych w glejaku, które wynikają ze zmian w modyfikacjach histonów, które regulują strukturę chromatyny i transkrypcję genów. Protokół ten opisuje natywną immunoprecypitację chromatyny na neurosferach mysiego guza mózgu.

Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu

To jest metoda identyfikacji nowych białek oddziałujących z DNA w określonych docelowych loci, polegająca na specyficznym dla sekwencji wychwytywaniu usieciowanej chromatyny do kolejnych analiz proteomicznych. Nie jest wymagana żadna wcześniejsza wiedza na temat potencjalnych białek wiążących ani modyfikacji komórek. Początkowo opracowana dla drożdży, technologia została obecnie zaadaptowana do komórek ssaków.

Adaptacja wychwytywania hybrydyzacji białek związanych z chromatyną do proteomiki komórek ssaków

Tutaj opisujemy protokół efektywnej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA (ChIP-seq) brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) wyizolowanej od myszy. Protokół ten nadaje się zarówno do mapowania modyfikacji histonów, jak i badania lokalizacji w całym genomie białek niehistonowych będących przedmiotem zainteresowania in vivo.

Immunoprecypitacja chromatyny mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

CUT&amp;RUN i jego warianty mogą być używane do określania obecności białek na chromatynie. Protokół ten opisuje, w jaki sposób określić lokalizację białka na chromatynie za pomocą jednokomórkowego uliCUT&amp;RUN.

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

Protokół mapowania trójwymiarowej organizacji genomu z rozdzielczością nukleosomów przy użyciu metody przechwytywania konformacji chromosomów w całym genomie Micro-C-XL jest przedstawiony tutaj.

Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

Poznaj ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków. Ta metoda umożliwia identyfikację interakcji białko-DNA i badanie regulacji transkrypcji genów.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów