Name: Projektowanie podwiązania i nakłucia jelita ślepego oraz podwójnego modelu infekcji donosowej immunosupresji wywołanej sepsą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj techniki podwiązania i nakłucia jelita ślepego oraz podwójnej infekcji donosowej w myszach. Ten model sepsy umożliwia badanie zakażeń wtórnych u pacjentów z immunosupresją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 i AI097532-01A1 dla M. W. Podstawowe obiekty Uniwersytetu Północnej Dakoty były wspierane przez granty NIH (INBRE P20GM103442 i COBRE P20GM113123). Prace te były również wspierane przez Kluczowy Program Narodowej Fundacji Nauk o Przyrodzie Chin (81530063) dla Jianxin Jianga. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy Marvinowi Leierowi (Center for Rural Health, University of North Dakota) za nakręcenie filmu.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały wykonane zgodnie z Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Północnej Dakoty (IACUC).
1. Podwiązanie i nakłucie jelita ślepego
UWAGA: Samice myszy C57BL/6 (waga, 18-22 g; wiek, 6-8 tygodni) są losowo podzielone na sześć grup: grupa kontrolna (Ctrl), grupa infekcji (SA dla S. aureus), dwie grupy pozorowane i dwie grupy CLP. Zwierzęta Ctrl są pozostawione bez operacji i wtórnych urazów infekcyjnych. Zwierzęta SA są poddawane zakażeniu płuc S. aureus bez operacji. Zwierzęta operowane pozorami poddawane są tej samej laparotomii z ekspozycją jelita ślepego (z wyjątkiem tego, że jelito ślepe nie jest ani podwiązane, ani nakłute). Osiem myszy na grupę wykorzystuje się do analizy przeżycia, a trzy do pięciu myszy wykorzystuje się do oceny stanu zapalnego w różnych punktach czasowych.
<ol>
	<li>Przed zabiegiem należy wysterylizować wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne w autoklawie przez 20 minut. Oczyść i zdezynfekuj stół operacyjny chusteczkami dezynfekującymi. Aby ustalić sterylne warunki podczas operacji, należy przykryć całe pola operacyjne odpowiednimi sterylnymi obłożeniami chirurgicznymi i nosić osłonę na włosy, maskę chirurgiczną, okulary ochronne, fartuch chirurgiczny i sterylne rękawiczki.</li>
	<li>Zważyć i znieczulić mysz za pomocą 0,1 ml/mysz mieszaniny ketaminy (80 mg/kg), ksylazyny (10 mg/kg) podawanej dootrzewnowo. Kciukiem i palcem wskazującym lewej ręki tworzącymi pozycję w kształcie litery U zbliż się do szyi myszy od tyłu płynnie i delikatnie, a następnie przytrzymaj szyję bezpośrednio za uszami, tak aby głowa myszy była mocno skrępowana. Użyj małego palca, aby przytrzymać prawą tylną nogę myszy i użyj palca środkowego i serdecznego (wszystkie palce lewej ręki), aby przytrzymać ciało.</li>
	<li>Sprawdź intensywność znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, aż do momentu zginania kończyny.</li>
	<li>Ogol dolne ćwiartki brzucha za pomocą elektrycznej maszynki do golenia i zdezynfekuj obszar jodem.</li>
	<li>Umieść mysz na sterylnej powierzchni w pozycji leżącej, z głową skierowaną od operatora. Owiń mysz sterylnym ręcznikiem z otworem nad planowanym nacięciem chirurgicznym, aby utrzymać sterylne pola.</li>
	<li>Wykonaj podłużne nacięcie skóry (o długości około 0,5 cm) skalpelem w lewej dolnej części brzucha. Użyj małych nożyczek, aby przedłużyć nacięcie (1-2 cm). 
	UWAGA: Uważaj, aby nie przeniknąć do jamy otrzewnej.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie domięśniowe, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej i umożliwić odsłonięcie jelita ślepego z sąsiednim jelitem.</li>
	<li>Odizoluj jelito ślepe po lewej stronie brzucha (w większości przypadków odbywa się to za pomocą kleszczy anatomicznych) i usuń je na sterylnym serwowaniu, pozostawiając jelito cienkie i grube w jamie otrzewnej. 
	UWAGA: Unikaj uszkodzenia naczyń krwionośnych krezki.</li>
	<li>Podwiązać jelito ślepe w dystalnej pozycji 25%, aby stworzyć przedłużoną infekcję o stosunkowo niskiej śmiertelności. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie podwiązywać zastawki krętniczo-kątniczej.</li>
	<li>Przedziurawić jelito ślepe igłą 21 G 1 1/2 przez pojedyncze nakłucie na wylot (dwa otwory) w połowie odległości między podwiązaniem a końcem jelita ślepego w najmniej unaczynionym obszarze. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie przebić naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Wyjąć igłę. Delikatnie wyciśnij niewielką ilość kału z otworów penetracyjnych, aby zapewnić perforację o pełnej grubości. 
	UWAGA: Należy uważać, aby podczas zabiegu nie zasłaniać ciągłości jelit</li>.
	<li>Zamień jelito ślepe do jamy brzusznej.</li>
	<li>Zamknij brzuch w dwóch warstwach za pomocą nylonowych szwów chirurgicznych 4-0. Zamknij mięśnie brzucha, stosując proste szwy biegowe i zamknij skórę, nakładając proste szwy przerywane. Oczyść skórę jodem.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 1 ml podskórnie podgrzanego (37 °C) 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej (NS) na plecy, aby uzupełnić utratę trzeciej przestrzeni i umieścić ją na ciepłej podkładce, aby wyzdrowieć.</li>
	<li>Umieść myszy w klatce w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22 °C) z 12-godzinnymi cyklami światła/ciemności i swobodnym dostępem do jedzenia i wody. Monitoruj myszy co 0,5 godziny przez co najmniej 2 godziny, następnie co 6 godzin przez co najmniej 2 dni, a następnie co 12 godzin przez 3 dni lub poddaj je eutanazji w stanie agonalnym w celu analizy przeżycia. 
	UWAGA: Analgezja przed- i pooperacyjna (buprenorfina, 50 μg/kg podskórnie co 12 h) jest zalecana przez 24 h przed zabiegiem do 48 h po zabiegu9,10.</li>
</ol>
2. Wtórne zakażenie płuc S. aureus
UWAGA: Z wyjątkiem grup Ctrl i SA, myszy, które przeżyły 3 dni po CLP w grupach pozorowanych i CLP, powinny być podawane donosowo z 30 μL zawiesiny bakteryjnej lub NS, odpowiednio. Myszy, które przeżyły w grupie SA, powinny być wkraplane donosowo z zawiesiną bakteryjną.
<ol>
	<li>Znieczulij mysz poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 μl roztworu ketaminy (45 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) i poczekaj, aż mysz zacznie powoli oddychać. Kąt nakłucia między igłą a ścianą jamy brzusznej jest mniejszy niż 30° w przypadku powolnego wstrzykiwania.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety powoli i donosowo wkraplanie 30 μl 1 x 107 jednostki tworzącej kolonię (CFU) S. aureus do odessania podczas inhalacji. Trzymając mysz za uszy w pozycji pionowej, za każdym razem powoli wsypuj 2-3 μl zawiesiny bakteryjnej do obu nozdrzy. Dostosuj szybkość zwalniania, aby umożliwić myszowi wdychanie bez tworzenia pęcherzyków i spadania.</li>
	<li>Podnieś mysz w górę iw dół, z głową do góry i ogonem w dół, aby pomóc bakteriom dostać się do tchawicy. Przesuń mysz szybko i mocno w górę, jednocześnie przesuwając ją w dół delikatnie i powoli, aby zwiększyć grawitację. Powtarzaj wkraplanie około 15 razy, aż wszystkie bakterie zostaną wdychane, co powinno zająć 10-15 minut na każdą mysz.</li>
	<li>Połóż mysz na plecach i głowę do góry na ustawionej pod kątem pościeli (około 35°) i obserwuj mysz, aż jej oddech wróci do normy i całkowicie wyzdrowieje po znieczuleniu i zabiegach.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22 °C) z 12-godzinnymi cyklami światła/ciemności i nieograniczonym dostępem do jedzenia i wody.</li>
	<li>Sprawdzaj stan myszy co 2 godziny przez pierwszy dzień i co 12 godzin po nim przez 4 dni po zabiegu. Poddaj je eutanazji w stanie agonalnym w celu analizy przeżycia lub 24 godziny po zakażeniu w celu oceny stanu zapalnego.</li>
</ol>
3. Analizowane parametry
<ol>
	<li>Przeżywalność myszy
	<ol>
		<li>Monitoruj myszy przez 7 dni. Poddaj się eutanazji w stanie agonalnym i wygeneruj krzywe przeżycia za pomocą metod Kaplana-Meiera11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liczba bakterii
	<ol>
		<li>24 godziny po wstrzyknięciu SA należy pobrać krew, płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) i płyn z płukania otrzewnej (PLF) od myszy. Następnie dodać 100 μl rozcieńczalników do płytek z agarem odżywczym i hodować je w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, aby określić liczbę kolonii bakteryjnych11,12,13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytokiny 
	UWAGA: Stężenia cytokin prozapalnych IL-1β, IL-6 i TNFα w surowicy i BALF od myszy należy oceniać za pomocą zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Pokryj 96-dołkową płytkę ELISA 100 μl/basenik innego roztworu roboczego przeciwciał wychwytujących, aby uruchomić wzorce w dwóch egzemplarzach i próbki w trzech egzemplarzach. Uszczelnić płytkę i pozostawić ją na noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj płytkę trzykrotnie 255 μl/dobrze popłukiwacz (1x PBS, 0,05% Tween-20).</li>
		<li>Aby zablokować niespecyficzne wiązanie, dodać 200 μl/rozcieńczalnik. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przygotować roztwór wzorcowy: Osiem dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń z 1000 pg/ml.</li>
		<li>Dodać 100 μl/basenik wzorców lub próbek do odpowiednich studzienek i 100 μl/basenik rozcieńczalnika do studzienek ślepych. Zamknąć płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć płytkę 5x 255 μl/dobrze przepłukać buforem do mycia.</li>
		<li>Dodać 100 μl/studzienkę roztworu roboczego przeciwciał o różnym wykrywaniu do odpowiednich studzienek. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przemyć płytkę 5x 255 μl/dobrze przepłukać buforem do mycia.</li>
		<li>Dodać 100 μl/studzienkę rozcieńczonego roztworu HRP do wszystkich studzienek. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Przemyć płytkę 5x 255 μl/dobrze przepłukać buforem do mycia.</li>
		<li>Dodać 100 μl/dobrze rozcieńczony roztwór TMB. Inkubować płytkę z dala od światła w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać 50 μl/roztwór zatrzymujący basenik (1 M H3PO4). Odczyt absorbancji przy 450 nm za pomocą czytnika płytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometria przepływowa
	<ol>
		<li>Uzyskaj całkowitą liczbę komórek z BALF. Lizować erytrocyty za pomocą buforu lizującego ACK i przemywać 2x za pomocą PBS.</li>
		<li>Następnie przeanalizuj zawiesiny jednokomórkowe za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej11. Do barwienia powierzchni neutrofile (CD11b+GR-1+) barwić przeciwciałami anty-mysimi CD11b i anty-mysimi Gr-1 (Ly-6G/Ly-6C). Zbierz co najmniej 3 x 104 żywe, niegruzowe komórki do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Delano, M. J., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system%27s+role+in+sepsis+progression%2C+resolution%2C+and+long-term+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome.</a> Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).</li>
<li>Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of severe sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 4-11 (2014).</li>
<li>Fleischmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Global+Incidence+and+Mortality+of+Hospital-treated+Sepsis.+Current+Estimates+and+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).</li>
<li>Reinhart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+Sepsis+as+a+Global+Health+Priority+-+A+WHO+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recognizing Sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).</li>
<li>Boomer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+patients+who+die+of+sepsis+and+multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure.</a> JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).</li>
<li>Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis-induced+immunosuppression%3A+from+cellular+dysfunctions+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).</li>
<li>Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture%3A+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis?</a> Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).</li>
<li>Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodesign+of+experimental+sepsis+by+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.</a> Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).</li>
<li>Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tramadol+and+buprenorphine+on+select+immunologic+factors+in+a+cecal+ligation+and+puncture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model.</a> Shock. 34 (3), 250-260 (2010).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2+Modulates+ROS+and+Impacts+Inflammatory+Response+via+IL-17+Signaling+in+Polymicrobial+Sepsis+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice.</a> PLoS Pathogens. 12 (7), 23(2016).</li>
<li>Pu, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg7+Deficiency+Intensifies+Inflammasome+Activation+and+Pyroptosis+in+Pseudomonas+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis.</a> Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).</li>
<li>Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+resuscitation+influences+cardiovascular+performance+and+mortality+in+a+murine+model+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).</li>
<li>Chin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macromolecular+approach+to+eradicate+multidrug+resistant+bacterial+infections+while+mitigating+drug+resistance+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset.</a> Nature Communications. 9 (1), 917(2018).</li>
<li>Nascimento, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-33+contributes+to+sepsis-induced+long-term+immunosuppression+by+expanding+the+regulatory+T+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population.</a> Nature Communications. 8, 14919(2017).</li>
<li>Deng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+investigation+on+the+turning+point+of+over-inflammation+to+immunosuppression+in+CLP+mice+model+and+their+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics.</a> International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w finansowym konflikcie interesów.

Jako złoty standard w badaniach nad sepsą CLP ma kombinację trzech urazów, w tym urazu tkanki spowodowanego laparotomią, martwicy spowodowanej podwiązaniem jelita ślepego i infekcji w wyniku wycieku mikrobiologicznego, który powoduje zapalenie otrzewnej z translokacją bakterii do krwi8. W związku z tym CLP naśladuje złożoność sepsy u ludzi lepiej niż wiele innych modeli. Jednak głównym ograniczeniem obecnego modelu CLP jest niemożność odzwierciedlenia bardziej przedłużonej fazy sepsy obserwowanej ...

Sepsa inicjuje złożone współdziałanie procesów prozapalnych i przeciwzapalnych gospodarza i charakteryzuje się reakcją hiperzapalną i następującą po niej dysfunkcją immunologiczną1,2. Sepsa stanowi globalny priorytet zdrowotny i powoduje dużą liczbę zgonów na oddziałach intensywnej terapii (OIOM)3. Szacuje się, że częstość występowania sepsy przekracza 30 milionów przypadków rocznie na całym świecie, a śmiertelność sięga 30%, pomimo postępów w leczeniu OIOM-ów4,5. W 2017 roku Światowa Organizacja Zdrowia przyjęła rezolucję mającą na celu poprawę profilaktyki, diagnostyki i leczenia tej śmiertelnej choroby5. Jednak ostatnie badania wykazały, że śmierć nie wynika z pierwotnego zakażenia u pacjentów z ciężkim septycznym zakażeniem, ale raczej z wtórnego zakażenia szpitalnego (zwłaszcza zapalenia płuc) spowodowanego immunosupresją6,7. Dlatego pilnie potrzebne jest zrozumienie mechanizmów, u których u pacjentów z sepsą rozwija się wtórna infekcja i odkrycie skuteczniejszych metod leczenia. W artykule opisano model dualny, znany również jako model podwójnego trafienia, służący do badania zjawiska immunosupresyjnego występującego u pacjentów z przewlekłą sepsą. 
Jako złoty standard eksperymentalnego modelu w badaniach nad posocznicą wielomikrobiologiczną, podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP) to operacja charakteryzująca się podwiązaniem i perforacją jelita ślepego, co przyczynia się do wielobakteryjnego zapalenia otrzewnej i sepsy8,9. Proces patofizjologiczny i profile cytokin, wraz z kinetyką i wielkością, są podobne do posocznicy klinicznej. Umiejscowienie podwiązania, rozmiar igły użytej do nakłucia i liczba nakłuć jelita ślepego są głównymi czynnikami wpływającymi na śmiertelność po CLP.
Szpitalne zapalenie płuc jest główną przyczyną śmiertelności wśród krytycznie chorych pacjentów z sepsą. Do głównych typów organizmów powodujących ciężką sepsę należą Staphylococcus aureus (20,5%), gatunki Pseudomonas (19,9%), Enterobacteriacae (głównie E. coli, 16,0%) i grzyby (19%). Tymczasem ostatnie badania sugerują coraz częstsze występowanie organizmów Gram-dodatnich, które są obecnie prawie tak powszechne jak infekcje Gram-ujemne3.
Metoda opisana w tym protokole obejmuje CLP, wykonywane jako "pierwsze uderzenie" w celu wywołania subletalnego wielobakteryjnego zapalenia otrzewnej, które objawia się stanem immunosupresyjnym. Procedura obejmuje również późniejsze donosowe wkroplenie S. aureus jako "drugiego uderzenia", aby zapewnić klinicznie istotną platformę badawczą.

<table><tbody><tr><td>21 G 1 &frac12; Igła</td><td>BD</td><td>BD305167</td><td></td></tr><tr><td>bufor lizujący ACK</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101201</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)</td><td>Myszy Biolegend</td><td>108401</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6&nbsp;</td><td>Harlan (Indianapolis)</td><td>C57BL/6NHsd</td><td></td></tr><tr><td>Lampka biurkowa</td><td>Zaopatrzenie ogólne</td><td>Dostawa</td><td></td>ogólna</tr><tr><td>Chusteczki dezynfekujące</td><td>Clorox</td><td>B07NV5JMCS</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczna maszynka do</td><td>golenia Zaopatrzenie ogólne Ogólne</td><td>zaopatrzenie</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy ELISA (mysz IL-1&beta;, IL-6 i TNF&alpha;)</td><td>Invitrogen</td><td>88-7013, 88-7064 i 88-7324</td><td></td></tr><tr><td>Jod</td><td>Dynarex</td><td>B003U463PY</td><td>PVP Chusteczki jodowe</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>FORT DODGE</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>Chlorowodorek aminy do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Waga laboratoryjna Zaopatrzenie</td><td>ogólne</td><td>Dostawa ogólna LB</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td>Genetyka molekularna, proszek</td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>ErgoOne</td><td>7100-1100</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna Sól fizjologiczna Zaopatrzenie</td><td></td><td>ogólne Ręcznik</td><td></td></tr><tr><td>z polietyczną podszewką</td><td>CardinalHealth, Konwertery</td><td>3520</td><td>Obłożenie chirurgiczne, sterylne, tylko do jednorazowego użytku</td></tr><tr><td>Szew jedwabny, 4-0</td><td>DAVIS & GECK</td><td>1123-31</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igły dla małych zwierząt</td><td>Zaopatrzenie</td><td>ogólne Zaopatrzenie</td><td></td>ogólne</tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne dla małych zwierząt</td><td>Zaopatrzenie</td><td>ogólne Kleszcze</td><td></td></tr><tr><td>chirurgiczne dla małych zwierząt</td><td>Zaopatrzenie</td><td>ogólne Zaopatrzenie ogólne Dostawa ogólna</td> <<td></td></tr><tr><td>em>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC</td><td>13301</td><td></td></tr><tr><td>Ciepła podkładka</td><td>Zaopatrzenie ogólne</td><td>Zaopatrzenie ogólne</td> Ksylazyna <td></td></tr><tr><td></td><td>Alfa Aesar</td><td>7361-61-7</td><td></td></tr></tbody></table>

projektowanie podwiązania i nakłucia jelita ślepego oraz podwójnego modelu infekcji donosowej immunosupresji wywołanej sepsą

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsa, ciężka i skomplikowana infekcja zagrażająca życiu, charakteryzuje się brakiem równowagi między reakcjami pro- i przeciwzapalnymi w wielu narządach. Wraz z rozwojem terapii większość pacjentów przeżywa fazę hiperzapalną, ale przechodzi w fazę immunosupresyjną, co zwiększa pojawianie się wtórnych infekcji. W związku z tym lepsze zrozumienie patogenezy leżącej u podstaw wtórnych zakażeń szpitalnych w fazie immunosupresyjnej podczas sepsy ma ogromne znaczenie. Przedstawiono tutaj model do testowania wyników infekcji poprzez tworzenie infekcji podwójnego trafienia u myszy. Standardowa procedura chirurgiczna jest stosowana w celu wywołania wielobakteryjnego zapalenia otrzewnej poprzez podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP), a następnie donosowe zakażenie Staphylococcus aureus w celu symulacji zapalenia płuc występującego w supresji immunologicznej, które często obserwuje się u pacjentów sepistycznych. Ten podwójny model może odzwierciedlać stan immunosupresyjny występujący u pacjentów z przedłużającą się sepsą i podatnością na wtórne zakażenie szpitalnym zapaleniem płuc. W związku z tym model ten zapewnia proste podejście eksperymentalne do badania patofizjologii wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc wywołanego sepsą, które może zostać wykorzystane do odkrycia nowych metod leczenia sepsy i jej powikłań.

W zależności od projektu eksperymentalnego i procedur, myszy C57BL/6 poddano zabiegowi CLP, a po 3 dniach podano im bakterie donosowo (Rysunek 1). Jak pokazano na Rysunku 2, myszy zaczęły ginąć około 12 h po indukowaniu zapalenia otrzewnej. Dwie myszy w grupie CLP+SA oraz trzy myszy w grupie CLP+NS padły przed donosowym wlewem S. aureus. Nie odnotowano śmiertelności u niezainfekowanych myszy grupy kontrolnej ani grupy po...

Ten protokół opisuje techniki pomiaru wyników infekcji leżących u podstaw wtórnych zakażeń szpitalnych w stanie immunosupresyjnym, najpierw poprzez ustalenie podwiązania/nakłucia jelita ślepego, a następnie prowokację ich infekcją donosową, aby stworzyć klinicznie istotny model sepsy immunosupresyjnej.

Projektowanie podwiązania i nakłucia jelita ślepego oraz podwójnego modelu infekcji donosowej immunosupresji wywołanej sepsą

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Przygotuj mysz do zabiegu chirurgicznego. Wygol dolne kwadranty brzucha za pomocą maszynki do golenia i zdezynfekuj ten obszar jodyną. Połóż mysz na plecach na czystej powierzchni roboczej, tak aby głowa była skierowana w stronę przeciwną do operatora.Wykonaj podłużne nacięcie skóry o długości około pół centymetra w lewym dolnym kwadrancie brzucha. Należy uważać, aby nie przebić otrzewnej. Za pomocą małych nożyczek poszerz nacięcie do około jednego lub dwóch centymetrów.Wykonaj nacięcie domięśniowe, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej. W większości przypadków ślepa kiszka znajduje się po lewej stronie brzucha. Wyizoluj ślepą kiszkę.Używając tępych pęset anatomicznych, delikatnie i ostrożnie odsłoń ślepą kiszkę przez nacięcie. Krok czwarty to ligacja. Położenie ligacji na ślepej kiszce determinuje stopień ciężkości sepsy.Podwiązanie około 75% kątnicy wywołuje ciężką sepsę. Podwiązanie 50% kątnicy wywołuje sepsę o średnim nasileniu, natomiast podwiązanie 25% lub mniejszej części kątnicy skutkuje lekką sepsą.Przewiązać kątnicę w wyznaczonym miejscu. Należy upewnić się, że zastawka krezkowo-kątnicza nie została przewiązana. Krok piąty polega na nakłuciu kątnicy.Za pomocą igły wykonaj

design-cecal-ligation-puncture-intranasal-infection-dual-model-sepsis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mysi model podwiązania i perforacji kątnicy jako wartościowe narzędzie do badania sepsy u ludzi.

Procedura ligacji i punkcji kątnicy

Sepsis to zespół ogólnoustrojowej reakcji zapalnej wynikający z infekcji mikrobiologicznej, który można symulować za pomocą techniki chirurgicznej zwanej podwiązaniem i nakłuciem kątnicy (CLP). W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę wykorzystania modelu zwierzęcego indukowanego CLP do przesiewowego badania ziół leczniczych w celu poszukiwania czynników terapeutycznych.

Wykorzystanie modelu zwierzęcego sepsy do oceny nowych terapii ziołowych

Eksperymentalna sepsa może być wywołana u myszy za pomocą metody podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP). Aktualne protokoły oceny autofagii in vivo w kontekście sepsy wywołanej CLP przedstawiono tutaj: Protokół pomiaru autofagii przy użyciu myszy (GFP)-LC3 oraz protokół pomiaru tworzenia autofagosomów za pomocą mikroskopii elektronowej.

Podwiązanie jelita ślepego i sepsa wywołana nakłuciem jako model do badania autofagii u myszy

Ten protokół dostarcza niezbędnych kroków do ustalenia i oceny sepsy noworodków u 7-dniowych myszy.

Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

Zakażenie noworodków myszy bioluminescencyjnym E. coli O1:K1:H7 powoduje infekcję septyczną ze znacznym zapaleniem płuc i patologią płuc. W tym miejscu opisano procedury modelowania i dalszego badania sepsy noworodków za pomocą podłużnego obrazowania przyżyciowego równolegle z wyliczaniem ogólnoustrojowych obciążeń bakteryjnych, profilowaniem stanu zapalnego i histopatologią płuc.

Noworodkowy model obrazowania posocznicy bakteryjnej Gram-ujemnej

Tutaj prezentujemy skuteczną i efektywną metodę wstrzykiwania żył ogonowych gryzoni za pomocą unikalnie zaprojektowanego urządzenia rozgrzewającego/krępującego. Usprawniając inicjację procesów rozszerzania naczyń krwionośnych i ograniczania, protokół ten umożliwia dokładne i terminowe wstrzyknięcia dożylne dużym grupom zwierząt przy minimalnym stresie.

Nowoczesne urządzenie rozgrzewające/ograniczające do skutecznych iniekcji żył ogonowych w mysim modelu sepsy grzybiczej

Ten protokół przedstawia szczegóły operacyjne podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP) w mysim modelu sepsy. CLP jest jedną z najczęściej stosowanych technik tworzenia zwierzęcego modelu sepsy. W związku z tym do uzyskania wiarygodnych wyników badań wymagany jest ustandaryzowany protokół CLP.

Ocena wiarygodnego biomarkera w mysim modelu sepsy wywołanym podwiązaniem i nakłuciem jelita ślepego

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Tu przedstawiamy protokół do ustanowienia modelu immunosupresji z powodu wstrzyknięcia Klebsiella pneumoniae do nosa u myszy i zweryfikowaliśmy model za pomocą różnych wskaźników.

Ustanowienie modelu immunosupresji wywołanej przez sepsy u myszy poprzez wewnątrznosowe wprowadzanie bakterii

Niedawno opracowany nowoczesny test aglutynacji cząsteczek (PA) z wykorzystaniem cząsteczki receptora wirusowego umożliwił szybką i łatwą identyfikację poliwirusa (PV). W niniejszym artykule przedstawimy procedurę testu PA służącą do identyfikacji PV.

Metoda aglutynacji cząsteczek w identyfikacji poliwirusa

Poznaj techniki podwiązania i nakłucia jelita ślepego oraz podwójnej infekcji donosowej w myszach. Ten model sepsy umożliwia badanie zakażeń wtórnych u pacjentów z immunosupresją.

Projektowanie podwiązania i nakłucia jelita ślepego oraz podwójnego modelu infekcji donosowej immunosupresji wywołanej sepsą

Przeglądaj więcej filmów