Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis

Mikroskopia oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości, 3D-SIM, jest innowacyjną techniką wizualizacji fluorescencyjnych białek reporterowych klastrów receptorów kiełkowania w błonach przetrwalnikowych. Korzystając z tych procedur, można osiągnąć niezrównaną rozdzielczość lokalizacji germinosomu i domen lipidowych błony wewnętrznej zarodników. Technika zostanie zademonstrowana przez doktoranta Juana Wena i magistra Raymonda Pasmana z naszego laboratorium.

Przed rozpoczęciem zabiegu należy czyścić precyzyjne szkiełka nakrywkowe jednomolowym kwasem solnym przez 30 minut w delikatnie wstrząsającej kąpieli wodnej, a następnie przemyć je w ultraczystej wodzie typu 1 po upływie pięciu minut. Po drugim praniu umieść szkiełka nakrywkowe w 100% etanolu na około trzy minuty przed wysuszeniem szkiełek nakrywkowych i sprawdzeniem ich czystości. Następnie wyczyść szklane szkiełka mikroskopowe 70% etanolem przez jedną minutę przed pozostawieniem szkiełek do wyschnięcia i sprawdzeniem ich czystości.

W przypadku obrazowania mikrosfery fluorescencyjnej i zarodników, najpierw podgrzej dwie szkiełka na bloku grzewczym o temperaturze 70 stopni Celsjusza przez kilka sekund, a następnie dodaj kroplę sterylizowanej 2% agarozy o temperaturze 70 stopni Celsjusza i 65 mikrolitrów na jedno z szkiełek. Umieść drugie szkiełko na górze, aby rozprowadzić agarozę między szkiełkami. Po pięciu minutach wyjmij jedno ze szkiełek i pokrój wysuszoną agarozę na odcinek jeden na centymetr.

Dodaj jeden raz 10 do ósmych fluorescencyjnych mikrosfer lub zarodników w 0,4 mikrolitra sterylnej, ultraczystej wody typu 1 do agarozy i umieść bardzo precyzyjne szkiełko nakrywkowe na plastrze za pomocą szkiełka nakrywkowego, aby zsunąć plaster ze szkiełka nakrywkowego na powierzchnię szkiełka nakrywkowego. Następnie przymocuj ramkę genową o pojemności 65 mikrolitrów i wymiarach 1,5 na 1,6 centymetra na wysuszonym szkiełku podstawowym i umieść szkiełko nakrywkowe na ramie, zamykając wszystkie rogi ramy. Aby zobrazować próbki, umieść szkiełko w mikroskopie oświetlenia strukturalnego wyposażonym w 100-krotny obiektyw olejowy i skup się na 100-nanometrowych mikrosferach fluorescencyjnych.

Wyreguluj pierścień korekcyjny na obiektywie 100x, aż uzyskasz funkcję symetrycznego rozproszenia punktów, aby zminimalizować rozmycie obrazów, i wybierz pole widzenia z około 10 okrągłymi mikrosferami fluorescencyjnymi. Zastosuj siatkową regulację ostrości dla wyznaczonych długości fal wzbudzenia, w tym przypadku 561 i 488 nanometrów, jako wskazówkę dla oprogramowania do analizy obrazu przed ustawieniem ostrości na zarodnikach światła transmisyjnego. Uchwyć obraz w świetle transmisyjnym w trybie 16-krotnej średniej z 20-milisekundową ekspozycją dla każdego obrazu.

Następnie uchwyć surowe obrazy fluorescencyjne zarodników za pomocą mikroskopu oświetlenia strukturalnego 3D w trybie oświetlenia 3D-SIM. W celu rekonstrukcji przekroju kliknij przycisk Param na arkuszu karty panelu oświetlenia strukturalnego, aby otworzyć okno Rekonstrukcja plasterków N-SIM. Postępuj zgodnie z sugerowanymi instrukcjami i kliknij odpowiednie elementy sterujące, aby ustawić kontrast modulacji oświetlenia na automatyczny, tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości na jeden, a tłumienie rozmycia nieostrego na 0,05 jako punkty początkowe.

Następnie kliknij przycisk Reconstruct Slice (Rekonstruuj wycinek), aby zrekonstruować obraz i ocenić jakość zrekonstruowanych obrazów na podstawie szybko przekształconych obrazów Fouriera i wyniku rekonstrukcji, które są wyświetlane po rekonstrukcji. Dostosuj szum o wysokiej rozdzielczości od 0,1 do pięciu i tłumienie rozmycia nieostrości od 0,01 do 0,5, aż do uzyskania najlepszych ustawień parametrów. Następnie kliknij przycisk Zastosuj, aby zastosować zmiany.

Kliknij przycisk Zamknij, aby zamknąć okno. Otwórz surowy obraz zarodników PS4150 wybarwionych FM4-64. Następnie kliknij przycisk Reconstruct Slice (Rekonstruuj plasterek), aby wykonać rekonstrukcję przekroju i zapisać zrekonstruowany obraz.

Aby przekonwertować surowe obrazy 3D-SIM geminosomu KGB80 na obrazy pseudo-szerokokątne, kliknij lewym przyciskiem myszy wtyczkę ImageJ SIMcheck i wybierz Raw Data SI i Pseudo Widefield. Losowo wybierz około 25 zarodników w każdym obrazie odwróconej transmisji do późniejszej analizy germinosomów na fluorescencyjnych obrazach pseudoszerokokątnych, aż wybierzesz około 350 zarodników. Następnie użyj ImageJ, aby ocenić maksymalną intensywność dla każdego sygnału fluorescencyjnego wyrażonego przez każdą grupę zarodników oraz zintegrowaną intensywność każdego obrazu zarodników 3D.

Aby przeanalizować pseudoszerokokątne obrazy germinosomu KGB80, użyj średniej zintegrowanej wartości intensywności siedmiu stosów jako zintegrowanej intensywności sygnału zarodnika KGB80. Następnie określ intensywność tła, obrazując szczep tła PS4150 przy użyciu identycznych ustawień i traktuj fluorescencyjne plamki w poszczególnych zarodnikach KGB80 jako ogniska germinosomów, gdy są one wyraźnie odróżnialne od tła. W tym reprezentatywnym eksperymencie dwa ogniska zarodników fluoryzujących GerD-GFP pojawiły się w różnych stosach, przy czym w komdodatnim stosie Z3 zaobserwowano trzy całkowite ogniska GerD-GFP.

Tutaj zaobserwowano zarodnik z tylko jednym ogniskiem GerD-GFP w zarodniku. W sumie około 40 do 50% zarodników miało odpowiednio dwa lub jeden klaster GerD-GFP i GerKB-mCherry. Podczas gdy zintegrowana intensywność białka rusztowania GerD-GFP była różna w różnych populacjach, zintegrowana intensywność GerKB-mCherry była mniej więcej taka sama w różnych populacjach.

Gdy zarodnik miał wiele ognisk, maksymalna intensywność fluorescencji ognisk GerD-GFP i GerKB-mCherry miała tendencję do zmniejszania się, a maksymalna fluorescencja wszystkich jasnych plam, uważanych za ogniska germinosomowe, była wyższa niż maksymalna autofluorescencja zarodników PS4150. Warto zauważyć, że jaśniejsze plamki FM4-64 podobne do ognisk germinosomy pojawiają się zarówno w nienaruszonych, jak i niepowlekanych zarodnikach PS4150, co sugeruje, że te jaśniejsze plamki FM4-64 mogą być zaangażowane w grupowanie białek germinosomu w błonie wewnętrznej. Dodawanie zarodników do agarozy i umieszczanie agarozy w ramie wymaga ciągłego i ostrożnego ruchu płynnego dla tych materiałów miniaturowych.

Konwersja surowych obrazów 3D-SIM germinosomu KGB80 na obrazy pseudoszerokokątne i ich interpretacja wymaga specjalistycznej wiedzy z zakresu biologii przetrwalników. Nasza procedura mikroskopii oświetlenia strukturalnego może być stosowana do obrazowania białek o niskiej zawartości lub reporterów o słabej fluorescencji w różnych bakteriach lub innych materiałach pasmowych. Organizacja germinosomu może być teraz badana przy użyciu procedur podwójnego znakowania w celu oceny kolokalizacji białek kiełkowania Bacillus i określonych domen błonowych.