Name: Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii superrozdzielczej 3D-SIM do wizualizacji germinosomów w zarodnikach Bacillus subtilis. Technika umożliwia identyfikację domen błony wewnętrznej z niespotykaną dotąd dokładnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Christiaanowi Zeelenbergowi za pomoc podczas obrazowania karty SIM. JW dziękuje Chińskiej Radzie Stypendialnej za stypendium doktoranckie i dziękuje Irene Stellingwerf za pomoc podczas pierwszego etapu obrazowania.

1. B. subtillis Sporulation (czas: 7 dni przed obserwacją mikroskopową)
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Umieść kulturę bakteryjną na płytce agarowej Luria-Bertani Broth (LB) (1% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 1% NaCl, 1% agaru)13 i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C, aby uzyskać pojedyncze kolonie. Użyj szczepu B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKA gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) i jego macierzystego szczepu tła B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) zgodnie z wcześniejszym opisem7. 
		nuta: Użycie zarodników z tłem ΔcotEΔgerE jest niezbędne w wizualizacji germinosomów, w celu zminimalizowania autofluorescencji warstw płaszcza zarodnikowego7.</li>
		<li>Wysterylizuj wszystkie media, probówki, pipety i inne materiały hodowlane, które mają być użyte, odpowiednimi metodami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię w 5 ml pożywki LB wcześnie rano i inkubować kulturę pod ciągłym mieszaniem w probówce z nakrętką z nakrętką przy 200 obr./min i temperaturze 37 °C, aż OD600 osiągnie 0,3-0,4 (około 7 godzin).</li>
		<li>Przygotować 500 ml pożywki MOPS (pH 7,5) zawierającej 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O, 0,276 mM K2SO4, 0,01 mM FeSO4·7H2O, 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM MOPS, 4 mM Tricine, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-glukoza jednowodna i 10 mM NH4Cl.</li>
		<li>Przygotować w probówkach z nakrętką 10-1-10-7 seryjnych rozcieńczeń kultury LB w pożywce MOPS o pojemności 5 ml każda i inkubować kultury przez noc pod ciągłym mieszaniem przy 200 obr./min i temperaturze 37 °C. 
		nuta: Przygotowane tutaj seryjne rozcieńczenia mają na celu uzyskanie rozcieńczenia we wczesnej fazie wykładniczej następnego ranka. Ten krok i następny krok są konieczne, aby umożliwić komórkom przystosowanie się do buforowanej pożywki wzrostowej MOPS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3
	<ol>
		<li>Wybierz jedno z rozcieńczeń MOPS o średnicy zewnętrznej600 0,3-0,4. Zaszczepić 0,2 ml kultury do wstępnie ogrzanych (37 °C) 20 ml pożywki MOPS w stożkowej kolbie o pojemności 250 ml i inkubować w ciągłym mieszaniu, aż OD600 osiągnie 0,3-0,4 (~ 7 h).</li>
		<li>Zaszczepić pożywkę zarodnikową na bazie MOPS (250 ml) 1% (v/v) kultury wstępnej z kroku 1.3.1 i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C w stożkowej kolbie litrowej pod ciągłym mieszaniem. W przypadku barwienia zarodników PS4150 FM4-64 za pomocą FM4-64 należy dodać 2 μg/ml sondy FM4-64 (patrz Tabela materiałów) 1 lub 2 godziny po osiągnięciu szczytowej wartości OD600 wzrostu wegetatywnego (zwykle około 2) i pozwolić kulturze na późniejsze zarodnikowanie, jednocześnie chroniąc ją przed światłem5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 7: Zbieranie zarodników
	<ol>
		<li>Określ wydajność zarodnikowania (zarodniki kontra komórki wegetatywne) za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego przy 100-krotnym powiększeniu, aby odróżnić jasne zarodniki fazowe od ciemnych komórek fazowych i ewentualnie niedojrzałych zarodników. Oczekuje się, że plon jasnych zarodników w fazie 90 %.</li>
		<li>Osadzaniki osadzać w temperaturze 4 270 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w probówkach wirówkowych z okrągłym dnem. Umyj osad zarodników 2-3 razy 40 ml sterylnej, ultraczystej demineralizowanej wody typu 1 w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml (patrz tabela materiałów). Odkręcać przy każdym praniu przy 4 270 x g przez 15 min (4 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 7: Oczyszczanie zarodników
	<ol>
		<li>Oczyszczanie zarodników: Zawiesić osad zarodników w 750 μl 20% pożywki o gradientowym poziomie gęstości niejonowej (patrz tabela materiałów) i załadować na 800 μl pożywki o gradionym gradiencie gęstości niejonowej 50% w wysterylizowanych probówkach do mikrowirówek. Wirować przez 60 minut przy 21 500 x g. Otrzymany osad zawiera wolne zarodniki. Zawiesić osad zarodników w 200 μl 20% pożywki o gradientzie gęstości niejonowej i załadować na 1 ml pożywki o gradiencie gęstości niejonowej 50% w probówce do mikrowirówki i wirować przez 15 minut przy 21 500 x g.</li>
		<li>Mycie końcowego przygotowania i przechowywania zarodników: Otrzymany osad zawiera oczyszczone uśpione zarodniki. Umyj osad zarodników 2-3 razy 1,5 ml sterylnej, ultraczystej wody typu 1 (patrz tabela materiałów) i odwiruj w międzyczasie w temperaturze 9 560 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Na koniec zawiesić osad w sterylnej, ultraczystej wodzie typu 1 do końcowego OD600 około 30. Podwielokrotności zarodników mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez 8 tygodni14.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Usuwanie powłok
<ol>
	<li>Zarodniki PS4150 należy traktować 0,1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% dodecylosiarczanu sodu (SDS)/0,1 M ditiotreitolu (DTT) w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę. Umyj zarodniki 10 razy wysterylizowaną ultraczystą wodą typu 115,16. W ten sposób każda zaadsorbowana sonda FM4-64 w zewnętrznej błonie zarodnika i zewnętrznych warstwach zostanie usunięta.</li>
</ol>
3. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych i preparatów11 (czas: 1 h przed obserwacją)
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy wstępnie oczyścić o wysokiej precyzji (patrz tabela materiałów) 1 M HCl przez 30 minut w delikatnie wstrząsającej kąpieli wodnej. Umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie w ultraczystej wodzie typu 1 i przechowuj je w 100% (vol/vol) EtOH. Pozwól im wyschnąć i sprawdź ich klarowność przed użyciem. Wstępnie wyczyść szkiełka w 70% EtOH. Pozwól im wyschnąć i sprawdź ich klarowność przed użyciem.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek fluorescencyjnych mikrosfer lub zarodników w ramce genu Slajd10 (Czas 15 min)
<ol>
	<li>Wstępnie ogrzej dwa szkiełka szklane oczyszczone w 70% EtOH i wysuszone na powietrzu (patrz tabela materiałów) przez kilka sekund na bloku grzewczym o temperaturze 70 °C, upuść 65 μl sterylizowanej 2% agarozy utrzymywanej w temperaturze 70 °C na jedno szkiełko podstawowe i umieść drugie szklane szkiełko na wierzchu, aby rozprowadzić agarozę między szkiełkami. Plaster agarozy wyschnie w ciągu około 5 minut.</li>
	<li>Pokrój plaster agarozowy na odcinek o wymiarach 1 x 1 cm po usunięciu jednego ze szkiełek podstawowych, dodaj 0,4 μl próbki (mikrosfery fluorescencyjne lub zarodniki ~108/ml) i przenieś plaster na szkiełko nakrywkowe o wysokiej precyzji, umieszczając szkiełko nakrywkowe na plastrze i zsuwając je.</li>
	<li>Na wysuszonym szkiełku przymocować ramkę genową (1,5 x 1,6 cm2, 65 μl), na której umieszcza się szkiełko nakrywkowe, zamykając wszystkie rogi ramy, kończąc w ten sposób szkiełko do użytku w mikroskopii.</li>
</ol>
5. Obrazowanie11,17(Czas: 1 godzina)
<ol>
	<li>Uchwyć obrazy transmisyjne i fluorescencyjne zarodników, a także mieszaniny czerwonych i żółto-zielonych mikrosfer fluorescencyjnych modyfikowanych karboksylanem na mikroskopie oświetlenia strukturalnego (patrz tabela materiałów) wyposażonym w obiektyw olejowy 100x (apertura numeryczna = 1,49), kamerę CCD i oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Generuj wszystkie obrazy w temperaturze pokojowej bez zakłóceń światła otoczenia. Upewnij się, że zawsze czyścisz obiektyw 100x i szkiełko 75% etanolem przed obrazowaniem.</li>
	<li>Skoncentruj się na mikrosferach fluorescencyjnych o średnicy 100 nm i zoptymalizuj funkcję rozproszenia punktowego (psf), regulując pierścień korekcyjny na obiektywie 100x, aż do uzyskania symetrycznego psf, minimalizując w ten sposób rozmycie obrazu. PSF to odpowiedź impulsowa lub odpowiedź systemu obrazowania na źródło punktowe lub obiekt punktowy.</li>
	<li>Wybierz pole widzenia z około 10 okrągłymi mikrosferami fluorescencyjnymi. Zastosuj siatkową regulację ostrości zarówno dla długości fali wzbudzenia 561 nm, jak i 488 nm jako przewodnik dla oprogramowania do analizy obrazu.</li>
	<li>Skoncentruj zarodniki w świetle transmisyjnym i uchwyć obraz światła transmisyjnego w trybie średniej 16× z ekspozycją 200 ms dla każdego obrazu.</li>
	<li>Uchwyć surowe fluorescencyjne obrazy zarodników w 3D-SIM w trybie oświetlenia "3D-SIM", ustawieniach aparatu na tryb odczytu Wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów (EM) 10 MHz przy 14 bitach i wzmocnienie EM przy 175. Wzbudz sondę FM4-64 w zarodnikach PS4150 światłem laserowym o długości fali 561 nm przy 20% mocy lasera i czasie świecenia 400 ms.</li>
	<li>Wzbudzić zarodniki GerKB-mCherry i GerD-GFP w KGB80 odpowiednio światłem laserowym o długości fali 561 nm przy 30% mocy lasera przez 1 s i światłem laserowym o długości fali 488 nm przy 60% mocy lasera przez 3 s. Ustawienia Z-Stack są w trybie od góry do dołu, 0,2 μm/krok, 7 kroków i 20 kroków dla analizy germinosomów i IM, odpowiednio. 
	nuta: Te parametry lasera zostały zastosowane w celu zapewnienia maksymalnej wartości jasności okna histogramu wynoszącej około 4 000.</li>
</ol>
6. Zrekonstruuj surowe obrazy 3D-SIM zarodników poplamionych FM4-64 PS4150
<ol>
	<li>Wykonaj rekonstrukcję N-SIM Slice dla surowych danych zarodników PS4150 barwionych FM4-64. Kliknij przycisk Param opcji Reconstruct Slice (Rekonstruuj plasterek) na karcie N-SIM pad tab (Karta karty N-SIM pad Reconstruction), aby otworzyć okno N-SIM Slice Reconstruction.</li>
	<li>Ustaw parametry rekonstrukcji w oknie N-SIM Slice Reconstruction. Aby uzyskać idealnie zrekonstruowane obrazy, postępuj zgodnie z sugestią zawartą w instrukcjach N-SIM i kliknij odpowiednie elementy sterujące w oknie N-SIM Slice Reconstruction, aby ustawić kontrast modulacji oświetlenia (IMC) na Auto, tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości (HRNS) na 1,00 i Out of Focus Blur Suppression (OFBS) na 0,05 jako punkty początkowe.</li>
	<li>Kliknij przycisk Reconstruct Slice (Rekonstruuj plasterek) w oknie N-SIM Slice Reconstruction, aby zrekonstruować obraz. Oceń jakość zrekonstruowanych obrazów za pomocą obrazów z szybką transformacją Fouriera (FFT) i wyniku rekonstrukcji, który jest wyświetlany po rekonstrukcji12.</li>
	<li>Dostosuj HRNS od 0,10 do 5,00 i OFBS od 0,01 do 0,50, klikając odpowiednie elementy sterujące w oknie N-SIM Slice Reconstruction, aż zostaną uzyskane najlepsze ustawienia parametrów.</li>
	<li>Kliknij przycisk Apply (Zastosuj) w oknie N-SIM Slice Reconstruction, aby zastosować zmienione parametry. Kliknij przycisk Zamknij, aby zamknąć okno.</li>
	<li>Uaktywnij surowy obraz zarodników PS4150 zabarwionych FM4-64 i kliknij przycisk Reconstruct Slice na arkuszu zakładek N-SIM Pad, aby wykonać Rekonstrukcję Slice. Zapisz zrekonstruowany obraz.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Konwertuj obrazy pseudo-szerokokątne germinosomu KGB80
	<ol>
		<li>Konwertuj surowe obrazy 3D-SIM KGB80 na obrazy Pseudo-Widefield, aktywując lewym przyciskiem myszy narzędzie ImageJ plugin SIMcheck Raw Data SI to Pseudo-Widefield12. Pseudo-Widefield uśrednia obrazy z surowych danych SIM i zestawia, dla porównania, obraz odpowiadający konwencjonalnemu oświetleniu szerokokątnemu12. Aby zapoznać się z samym ImageJ, zobacz https://imagej.net/Welcome. Losowo wybierz ~25 zarodników w każdym obrazie odwróconej transmisji do późniejszej analizy germinosomów na fluorescencyjnych obrazach Pseudo-Widefield.</li>
		<li>Wybierz w sumie około 350 (w tym przykładzie 346) zarodników KGB80 w 14 polach view z dwóch slajdów. Liczba ognisk fluorescencyjnych GerD-GFP i GerKB-mCherry w wybranych zarodnikach KGB80 powinna być policzona niezależnie przez dwóch badaczy. Badacz może odwołać się do surowych obrazów 3D-SIM w przypadku wątpliwości co do obecności oddzielnych fluorescencyjnych ognisk germinosomy w zarodnikach.</li>
		<li>Oceń maksymalną intensywność każdego ogniska GerD-GFP i GerKB-mCherry oraz zintegrowaną intensywność obrazu 3D każdego zarodnika KGB80 za pomocą ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza obrazów pseudoszerokokątnych germinosomu KGB80
	<ol>
		<li>Użyj średniej zintegrowanej wartości intensywności 7 stosów jako zintegrowanej intensywności sygnału zarodnika KGB80. Określ intensywność tła, obrazując odkształcenie tła PS4150 przy użyciu identycznych ustawień. Plamki fluorescencyjne w poszczególnych zarodnikach KGB80 należy traktować jako ogniska germinosomowe, gdy są one wyraźnie odróżnialne od tła.</li>
		<li>Zastosuj jednoczynnikowe testy ANOVA do określania istotności za pomocą oprogramowania Origin 9.0, uznając wartości P <0,05 za statystycznie istotne. Użyj współczynnika korelacji rang Spearmana18, aby ocenić korelację liczby ognisk GerD-GFP i GerKB-mCherry oraz pomiary intensywności zintegrowanego sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li>
<li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li>
<li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li>
<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summer+meeting+2013%E2%80%93when+the+sleepers+wake%3A+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li>
<li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li>
<li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores%3A+a+molecular+rotor%2FFLIM+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li>
<li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li>
<li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290(2016).</li>
<li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores%3B+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972(2013).</li>
<li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915(2015).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.%3A+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293(1951).</li>
<li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li>
<li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li>
<li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Malawi+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li>
<li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li>
<li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores%2C+using+membrane+potential+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li>
<li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li>
<li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li>
<li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636(2016).</li>
<li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li>
<li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li>
<li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li>
<li>Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388(2018).</li>
<li>Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li>
<li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li>
<li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22One-Pot%22+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169(2018).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiony protokół zawiera standardową procedurę 3D-SIM do analizy zarodników B. subtilis barwionych FM4-64, która obejmuje procesy zarodnikowania, przygotowania szkiełek i obrazowania. Ponadto protokół opisuje zmodyfikowany proces obrazowania 3D wspomagany SIMcheck (ImageJ) do mikroskopii SIM germinosomów zarodników B. subtilis znakowanych fluorescencyjnymi reporterami. Ten ostatni zabieg pozwolił nam zaobserwować tę słabą strukturę podłoża ze zwiększonym kontrastem. Łącząc dwie procedury obrazowan...

Zarodniki z rzędów Bacillales i Clostridiales są metabolicznie uśpione i niezwykle odporne na surowe reżimy dekontaminacji, ale jeśli nie wykiełkują, nie mogą powodować szkodliwych skutków u ludzi1. W przypadku kiełkowania zarodników Bacillus subtilis (B. subtilis) wywołanego przez kiełkowanie składników odżywczych zdarzeniem inicjującym jest wiązanie kiełkowania z receptorami kiełkowania (GR) znajdującymi się w wewnętrznej błonie zarodnika (IM). Następnie GR transdukują sygnały do białka kanału SpoVA znajdującego się również w IM. Powoduje to początek wymiany rdzenia zarodników kwasu pirydyno-2,6-dikarboksylowego (kwas dipikolinowy; DPA; składający się w 20% z suchego rdzenia zarodników) do wody przez kanał SpoVA. Następnie uwolnienie DPA wyzwala aktywację hydrolizy peptydoglikanu w korze mózgowej, a po tym następuje dodatkowy pobór wody2,3,4. Zdarzenia te prowadzą do naprężeń mechanicznych warstw powłoki, jej późniejszego zerwania, początku wzrostu i wreszcie wzrostu wegetatywnego. Jednak dokładne szczegóły molekularne procesu kiełkowania są nadal dalekie od wyjaśnienia.
Główne pytanie dotyczące kiełkowania zarodników dotyczy biofizycznych właściwości lipidów otaczających białka kiełkowania IM, jak również białek kanału IM SpoVA. Ta w dużej mierze nieruchoma dwuwarstwa lipidowa IM jest główną barierą przepuszczalności dla wielu małych cząsteczek, w tym toksycznych chemicznych środków konserwujących, z których niektóre wywierają swoje działanie w rdzeniu zarodników lub cytoplazmie komórki wegetatywnej5,6. Dwuwarstwa lipidowa IM jest prawdopodobnie w stanie żelowym, chociaż istnieje znaczna frakcja ruchomych lipidów w klasie IM<sup="xref">5. IM zarodnika ma również potencjał do znacznego rozszerzenia5. W ten sposób powierzchnia IM zwiększa się 1,6-krotnie po wykiełkowaniu bez dodatkowej syntezy błony i towarzyszy jej utrata charakterystycznej dla tej błony niskiej przepuszczalności i bezruchu lipidów5,6.
Podczas gdy szczegóły molekularne aktywacji białek kiełkujących i organizacji lipidów IM w zarodnikach są atrakcyjnymi tematami do badań, mały rozmiar zarodników B. subtilis i stosunkowo niska obfitość białek kiełkujących stanowią wyzwanie dla analiz mikroskopowych. Griffiths i in. przekonujące dowody z mikroskopu epifluorescencyjnego, wykorzystujące fluorescencyjne reportery połączone z białkami kiełkującymi, sugerują, że w zarodnikach B. subtilis białko rusztowania GerD organizuje trzy podjednostki GR (A, B i C) dla GR GerA, B i K, w klastrze7. Ukuli termin "germinosom" dla tego klastra białek kiełkujących i opisali struktury jako ~300 nm duże IM protein foci8. Po zainicjowaniu kiełkowania zarodników, fluorescencyjne ogniska germinosomów ostatecznie zmieniają się w większe rozproszone wzory fluorescencyjne, przy czym >75% populacji zarodników wykazuje ten wzór w zarodnikach kiełkujących przez 1 godzinę z L-waliną8. Zauważ, że wspomniany powyżej artykuł wykorzystał uśrednione obrazy z dziesiątek kolejnych obrazów fluorescencyjnych, aby uzyskać moc statystyczną i pokonać przeszkodę w postaci niskich sygnałów fluorescencyjnych obserwowanych podczas obrazowania. Ta wizualizacja tych struktur w zarodnikach bakteryjnych była na granicy tego, co jest technicznie wykonalne przy użyciu klasycznych narzędzi mikroskopowych i ani ocena ilości ognisk w pojedynczym zarodniku, ani ich bardziej szczegółowa lokalizacja subkomórkowa nie była możliwa przy tym podejściu.
Tutaj demonstrujemy użycie Mikroskopii Oświetlenia Strukturalnego (SIM) w celu uzyskania szczegółowej wizualizacji i kwantyfikacji germinosomu (zarodników) w zarodnikach B. subtilis, jak również ich domen lipidowych IM9. Protokół zawiera również instrukcje dotyczące zarodnikowania, przygotowania preparatów i analizy obrazu przez SIMcheck (v1.0, wtyczka imageJ), a także ImageJ10,11,12.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka szklane suszone na powietrzu</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>630-2870</td><td></td></tr><tr><td>APO TIRF N20R8 100&razy; obiektyw olejowy (NA=1.49)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B. subtilis PS4150 (PS832 &Delta; gerE::spc, &Delta; cotE::tet)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera 1 L</td><td>Kolby Sigma-Aldricha</td><td>Z567868</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera 250 ml</td><td></td> Mikrosfery modyfikowane karboksylanem <td>Sigma-Aldrich</td> Z723088 <td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Invitrogen, 0,1 &mu; m</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Histodenz nonionic density gradient medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXON3 DU-897 X-6515 Kamera CCD</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>https://imagej.net/Welcome</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrofug 1,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3451PK</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego</td><td>Nikon, Japonia</td><td>NIS-Element AR 4.51.01</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Ultraczysta woda demineryzowana</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q IQ 7003</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>Nikon Eclipse Ti</tr><tr><td>Butelka z polipropylenową nakrętką 180 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75003800</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe precyzyjne</td><td>Paul Marienfeld</td><td>117650</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z okrągłym dnem 15 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Nunc TM</td></tr><tr><td>Probówki z nakrętką 50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Nunc TM</td></tr></tbody></table>

wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach bacillus subtilis

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Mały rozmiar zarodników i stosunkowo niska obfitość białek kiełkujących, powodują trudności w ich mikroskopowych analizach przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej. Trójwymiarowa mikroskopia oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości (3D-SIM) jest obiecującym narzędziem do pokonania tej przeszkody i ujawnienia molekularnych szczegółów procesu kiełkowania zarodników Bacillus subtilis (B. subtilis). W tym miejscu opisujemy zastosowanie zmodyfikowanego procesu obrazowania 3D z asystentem SIMcheck (ImageJ) i fluorescencyjnych białek reporterowych do mikroskopii SIM germinosomów zarodników B. subtilis, klastra (skupiska) białek kiełkowania. Przedstawiamy również (standardową) procedurę obrazowania 3D-SIM do barwienia błon przetrwalnikowych B. subtilis za pomocą FM4-64. Stosując te procedury, uzyskaliśmy niezrównaną rozdzielczość lokalizacji germinosomów i wykazaliśmy, że >80% uśpionych zarodników B. subtilis KGB80 uzyskanych po zarodnikowaniu na określonym minimalnym pożywce MOPS ma jedno lub dwa ogniska GerD-GFP i GerKB-mCherry. Jasne ogniska zaobserwowano również na obrazach 3D-SIM zarodników barwionych FM4-64, co sugeruje, że prawdopodobnie istnieją domeny lipidowe błony wewnętrznej o różnej płynności. Możliwe są dalsze badania, w których wykorzystuje się procedury podwójnego znakowania barwnikami błonowymi i germinosomowymi białkami reporterowymi w celu oceny kolokalizacji, a tym samym uzyskania optymalnego przeglądu organizacji białek kiełkowania Bacillus w wewnętrznej błonie przetrwalników.

Niniejszy protokół przedstawia procedurę obrazowania zarodników bakteryjnych za pomocą mikroskopu SIM. Procedury sporulacji i przygotowania preparatów przeprowadzono zgodnie z Rysunkiem 1 przed przystąpieniem do obrazowania. Następnie procedury obrazowania i analizy zastosowano zarówno dla próbek zarodników słabo świecących (białka germinacji znakowane białkami fluorescencyjnymi), jak i jasno świecących (błona wewnętrzna barwiona sondą lipofilową), zgodnie z ...

Białka receptora germinantu skupiają się w 'germinosomach' w wewnętrznej błonie zarodników Bacillus subtilis. Opisujemy protokół wykorzystujący mikroskopię super rozdzielczości i fluorescencyjne białka reporterowe do wizualizacji germinosomów. Protokół identyfikuje również wewnętrzne domeny błony zarodnikowej, które są preferencyjnie barwione barwnikiem błonowym FM4-64.

Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Mikroskopia oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości, 3D-SIM, jest innowacyjną techniką wizualizacji fluorescencyjnych białek reporterowych klastrów receptorów kiełkowania w błonach przetrwalnikowych. Korzystając z tych procedur, można osiągnąć niezrównaną rozdzielczość lokalizacji germinosomu i domen lipidowych błony wewnętrznej zarodników. Technika zostanie zademonstrowana przez doktoranta Juana Wena i magistra Raymonda Pasmana z naszego laboratorium.Przed rozpoczęciem zabiegu należy czyścić precyzyjne szkiełka nakrywkowe jednomolowym kwasem solnym przez 30 minut w delikatnie wstrząsającej kąpieli wodnej, a następnie przemyć je w ultraczystej wodzie typu 1 po upływie pięciu minut. Po drugim praniu umieść szkiełka nakrywkowe w 100% etanolu na około trzy minuty przed wysuszeniem szkiełek nakrywkowych i sprawdzeniem ich czystości. Następnie wyczyść szklane szkiełka mikroskopowe 70% etanolem przez jedną minutę przed pozostawieniem szkiełek do wyschnięcia i sprawdzeniem ich czystości.W przypadku obrazowania mikrosfery fluorescencyjnej i zarodników, najpierw podgrzej dwie szkiełka na bloku grzewczym o temperaturze 70 stopni Celsjusza przez kilka sekund, a następnie dodaj kroplę sterylizowanej 2% agarozy o temperaturze 70 stopni Celsjusza i 65 mikrolitrów na jedno z szkiełek. Umieść drugie szkiełko na górze, aby rozprowadzić agarozę między szkiełkami. Po pięciu minutach wyjmij jedno ze szkiełek i pokrój wysuszoną agarozę na odcinek jeden na centymetr.Dodaj jeden raz 10 do ósmych fluorescencyjnych mikrosfer lub zarodników w 0,4 mikrolitra sterylnej, ultraczystej wody typu 1 do agarozy i umieść bardzo precyzyjne szkiełko nakrywkowe na plastrze za pomocą szkiełka nakrywkowego, aby zsunąć plaster ze szkiełka nakrywkowego na powierzchnię szkiełka nakrywkowego. Następnie przymocuj ramkę genową o pojemności 65 mikrolitrów i wymiarach 1,5 na 1,6 centymetra na wysuszonym szkiełku podstawowym i umieść szkiełko nakrywkowe na ramie, zamykając wszystkie rogi ramy. Aby zobrazować próbki, umieść szkiełko w mikroskopie oświetlenia strukturalnego wyposażonym w 100-krotny obiektyw olejowy i skup się na 100-nanometrowych mikrosferach fluorescencyjnych.Wyreguluj pierścień korekcyjny na obiektywie 100x, aż uzyskasz funkcję symetrycznego rozproszenia punktów, aby zminimalizować rozmycie obrazów, i wybierz pole widzenia z około 10 okrągłymi mikrosferami fluorescencyjnymi. Zastosuj siatkową regulację ostrości dla wyznaczonych długości fal wzbudzenia, w tym przypadku 561 i 488 nanometrów, jako wskazówkę dla oprogramowania do analizy obrazu przed ustawieniem ostrości na zarodnikach światła transmisyjnego. Uchwyć obraz w świetle transmisyjnym w trybie 16-krotnej średniej z 20-milisekundową ekspozycją dla każdego obrazu.Następnie uchwyć surowe obrazy fluorescencyjne zarodników za pomocą mikroskopu oświetlenia strukturalnego 3D w trybie oświetlenia 3D-SIM. W celu rekonstrukcji przekroju kliknij przycisk Param na arkuszu karty panelu oświetlenia strukturalnego, aby otworzyć okno Rekonstrukcja plasterków N-SIM. Postępuj zgodnie z sugerowanymi instrukcjami i kliknij odpowiednie elementy sterujące, aby ustawić kontrast modulacji oświetlenia na automatyczny, tłumienie szumów w wysokiej rozdzielczości na jeden, a tłumienie rozmycia nieostrego na 0,05 jako punkty początkowe.Następnie kliknij przycisk Reconstruct Slice (Rekonstruuj wycinek), aby zrekonstruować obraz i ocenić jakość zrekonstruowanych obrazów na podstawie szybko przekształconych obrazów Fouriera i wyniku rekonstrukcji, które są wyświetlane po rekonstrukcji. Dostosuj szum o wysokiej rozdzielczości od 0,1 do pięciu i tłumienie rozmycia nieostrości od 0,01 do 0,5, aż do uzyskania najlepszych ustawień parametrów. Następnie kliknij przycisk Zastosuj, aby zastosować zmiany.Kliknij przycisk Zamknij, aby zamknąć okno. Otwórz surowy obraz zarodników PS4150 wybarwionych FM4-64. Następnie kliknij przycisk Reconstruct Slice (Rekonstruuj plasterek), aby wykonać rekonstrukcję przekroju i zapisać zrekonstruowany obraz.Aby przekonwertować surowe obrazy 3D-SIM geminosomu KGB80 na obrazy pseudo-szerokokątne, kliknij lewym przyciskiem myszy wtyczkę ImageJ SIMcheck i wybierz Raw Data SI i Pseudo Widefield. Losowo wybierz około 25 zarodników w każdym obrazie odwróconej transmisji do późniejszej analizy germinosomów na fluorescencyjnych obrazach pseudoszerokokątnych, aż wybierzesz około 350 zarodników. Następnie użyj ImageJ, aby ocenić maksymalną intensywność dla każdego sygnału fluorescencyjnego wyrażonego przez każdą grupę zarodników oraz zintegrowaną intensywność każdego obrazu zarodników 3D.Aby przeanalizować pseudoszerokokątne obrazy germinosomu KGB80, użyj średniej zintegrowanej wartości intensywności siedmiu stosów jako zintegrowanej intensywności sygnału zarodnika KGB80. Następnie określ intensywność tła, obrazując szczep tła PS4150 przy użyciu identycznych ustawień i traktuj fluorescencyjne plamki w poszczególnych zarodnikach KGB80 jako ogniska germinosomów, gdy są one wyraźnie odróżnialne od tła. W tym reprezentatywnym eksperymencie dwa ogniska zarodników fluoryzujących GerD-GFP pojawiły się w różnych stosach, przy czym w komdodatnim stosie Z3 zaobserwowano trzy całkowite ogniska GerD-GFP.Tutaj zaobserwowano zarodnik z tylko jednym ogniskiem GerD-GFP w zarodniku. W sumie około 40 do 50% zarodników miało odpowiednio dwa lub jeden klaster GerD-GFP i GerKB-mCherry. Podczas gdy zintegrowana intensywność białka rusztowania GerD-GFP była różna w różnych populacjach, zintegrowana intensywność GerKB-mCherry była mniej więcej taka sama w różnych populacjach.Gdy zarodnik miał wiele ognisk, maksymalna intensywność fluorescencji ognisk GerD-GFP i GerKB-mCherry miała tendencję do zmniejszania się, a maksymalna fluorescencja wszystkich jasnych plam, uważanych za ogniska germinosomowe, była wyższa niż maksymalna autofluorescencja zarodników PS4150. Warto zauważyć, że jaśniejsze plamki FM4-64 podobne do ognisk germinosomy pojawiają się zarówno w nienaruszonych, jak i niepowlekanych zarodnikach PS4150, co sugeruje, że te jaśniejsze plamki FM4-64 mogą być zaangażowane w grupowanie białek germinosomu w błonie wewnętrznej. Dodawanie zarodników do agarozy i umieszczanie agarozy w ramie wymaga ciągłego i ostrożnego ruchu płynnego dla tych materiałów miniaturowych.Konwersja surowych obrazów 3D-SIM germinosomu KGB80 na obrazy pseudoszerokokątne i ich interpretacja wymaga specjalistycznej wiedzy z zakresu biologii przetrwalników. Nasza procedura mikroskopii oświetlenia strukturalnego może być stosowana do obrazowania białek o niskiej zawartości lub reporterów o słabej fluorescencji w różnych bakteriach lub innych materiałach pasmowych. Organizacja germinosomu może być teraz badana przy użyciu procedur podwójnego znakowania w celu oceny kolokalizacji białek kiełkowania Bacillus i określonych domen błonowych.

visualization-germinosomes-inner-membrane-bacillus-subtilis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Źródło: Figueroa, D. M., et al. Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu scharakteryzowania lokalizacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia krok po kroku procedurę generowania protoplastów z bakterii Gram-dodatniej Bacillus megaterium.

Generowanie protoplastów z bakterii Gram-dodatniej Bacillus megaterium

Źródło: Wen, J., Pasman, et al., Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii oświetlenia strukturalnego do uzyskania trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych, które ujawniają organizację białek kiełkujących w zarodnikach bakterii.

Wizualizacja białek kiełkujących w błonie wewnętrznej zarodników bakterii

Tutaj opisujemy test kolorymetryczny do wykrywania obecności cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakterii.

Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Ten protokół ilustruje ważne kolejne kroki wymagane do oceny znaczenia monitorowania parametrów żywotności i procesów naprawy DNA w ożywianiu zarodników Bacillus subtilis po leczeniu osoczem niskociśnieniowym poprzez śledzenie znakowanych fluorescencyjnie białek naprawczych DNA za pomocą czasowo-rozdzielczej mikroskopii konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Badanie szkodliwego wpływu niskociśnieniowej sterylizacji plazmowej na przeżywalność zarodników Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii żywych komórek

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Ten protokół skupia się na wykorzystaniu cytometrii przepływowej i liczenia koralików do ilościowego oznaczania zarodników bakterii znakowanych bromkiem etydyny. Metoda ta jest również skuteczna w analizie kowalencyjnego sprzężenia białek na powierzchni nienaruszonych zarodników.

Poprawa liczenia zarodników Bacillus subtilis i analizy znaczników w cytometrii przepływowej

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Poznaj metodę mikroskopii superrozdzielczej 3D-SIM do wizualizacji germinosomów w zarodnikach Bacillus subtilis. Technika umożliwia identyfikację domen błony wewnętrznej z niespotykaną dotąd dokładnością.

Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis

Przeglądaj więcej filmów