Oszczędzający pracę i powtarzalny protokół ekranowy sygnalizacji siły dotyku do badania tigmomorfogenezy modelowej rośliny Arabidopsis thaliana
August 6th, 2019
Delikatna maszyna do ładowania dotykiem zbudowana jest ze szczotek do włosów ludzkich, ramion robota i kontrolera. Szczotki do włosów są napędzane przez ramiona robotyczne zainstalowane na maszynie i poruszają się okresowo, aby wywierać siłę nacisku na rośliny. Siła dotyku włosów sterowanych maszynowo jest porównywalna z siłą dotyku nakładanego ręcznie.
Budujemy automatyczną maszynę do pomiaru siły dotyku do obserwacji morfogenezy sygnału rośliny. Ramiona robotyczne zainstalowałem ze szczotkami do ludzkich włosów, aby wywierać delikatną siłę dotyku na rośliny. W porównaniu z dotykiem ludzkiego palca, automatyczna maszyna do dotykania ludzkich włosów może zapewnić większą oszczędność pracy, równomierne obciążenie siłą dotyku.
Czas potrzebny na jedną rundę siłowego obciążenia można ograniczyć do kilku minut. W porównaniu z kilkugodzinnym dotykiem palca i wacikiem, zrobotyzowana maszyna może znacznie poprawić badania nad reakcją handlową roślin. Zwiększając wydajność i populację badanych roślin, przewidujemy, że automatyczna maszyna dotykowa znajdzie zastosowanie w czterech ekranach sygnalizacyjnych mutantów i badaniach odpowiedzi merkantylnej zarówno u roślin, jak i zwierząt.
Na początek przetestuj zdolność kiełkowania każdego genotypu po wyhodowaniu nasion na 8% płytce agarowej z podłożem MS przez siedem dni. W zależności od szybkości kiełkowania przygotuj nasiona cztery do pięciu razy więcej niż pożądana liczba roślin do wyprodukowania. Zanurz nasiona w zimnej wodzie w 1,5 mililitrowych plastikowych rurkach i przykryj folią aluminiową, aby zachować ciemność.
Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wchłonięcia nasion. Pięć do siedmiu dni po spożyciu wybierz odpowiednią glebę do wzrostu roślin. Unikaj dużych grudek i użyj widelca, aby je jednorodnie wymieszać.
Przygotuj 24 plastikowe kubki o pojemności 207 mililitrów i średnicy górnej krawędzi 7,4 centymetra. Wywierć trzy okrągłe otwory na dnie kubków w celu nawadniania. Napełnij te plastikowe kubki mieszaną ziemią.
Pozwól, aby gleba ułożyła się do około jednego centymetra wyżej niż krawędź kubka i użyj linijki, aby miękko spłaszczyć powierzchnię usypanej gleby. Przełóż 24 filiżanki do plastikowej tacy. Ustaw natężenie światła w komorze wzrostowej w zakresie od 180 do 240 mikroeinsteinów na sekundę na metr kwadratowy, które jest wyższe niż aktywne promieniowanie fotosyntetyczne dla szybkiego wzrostu roślin.
Ustaw warunki oświetlenia na stałe przez 24 godziny. Ustaw temperaturę komory wzrostu na 23,5 plus minus 1,5 stopnia Celsjusza i wilgotność między 35 a 45%Dodaj 2,5 litra wody do każdej tacy. Pozwól glebie wchłonąć wodę z otworów znajdujących się na dnie kubków i poczekaj, aż powierzchnia gleby opadnie do poziomu krawędzi kubka.
Dwie godziny później wysiej trzy do czterech nasion w jedno miejsce i cztery równomiernie rozmieszczone miejsca w filiżance. Umieść przezroczystą plastikową osłonę nad każdą tacą i pozwól nasionom kiełkować przez tydzień. Następnie zdejmij pokrywę i pozwól sadzonkom rosnąć przez kolejny tydzień.
Nawadniaj rośliny 1,5 litra wody co drugi dzień po wykiełkowaniu nasion. Dziewięć do 10 dni po wysianiu nasion usuń dodatkowe pędy przez przerzedzenie. Użyj małych nożyczek do cięcia zsypów i unikaj bezpośredniego wyciągania całej rośliny z gleby.
Trzy do czterech osobników roślin o podobnej wielkości w każdej filiżance. Aby zainstalować szczotki do włosów dotykowych na ramionach robota, najpierw użyj kleju, aby równomiernie przymocować jedną warstwę ludzkich włosów do stalowej linijki o długości 330 milimetrów. Długość włosów wynosi 126 milimetrów.
Za pomocą dwóch metalowych zacisków przymocuj te stalowe linijki do ramion robota. Na panelu sterowania ustaw wysokość ramion maszyny wzdłuż wymiaru pionowego, naciskając Jog F plus, aby podnieść i Jog R minus, aby opuścić ramiona robota i szczotki. Końcówka szczotek do włosów powinna znajdować się 5 centymetrów niżej niż krawędź miseczki.
Naciśnij Inc, F plus lub R minus, aby uruchomić maszynę w jednym lub dwóch cyklach, aby upewnić się, że dotykane są wszystkie osoby roślinne. Przed oficjalnym eksperymentem użyj wagi elektronicznej, aby zmierzyć siłę dotyku. Dostosuj wysokość ramion maszyny, aby utrzymać siłę dotyku w zakresie od jednego do dwóch miliniutonów.
Następnie należy ręcznie ustawić pozycję początkową ramion maszyny wzdłuż wymiaru poziomego. Pozwól, aby szczotki do włosów zwisały na krawędzi każdej tacy. Naciśnij Jog F plus lub Jog R minus, aby stopniowo przesuwać ramię maszyny w poziomie, aby upewnić się, że żadna roślina nie jest dotykana przed rozpoczęciem eksperymentu dotykania.
Ustaw odległość przesuwu szczotki do włosów w wymiarze poziomym na 365 milimetrów, naciskając przycisk skoku. Nacisnąć Inc F plus lub R minus, aby przesunąć ramiona maszyny, aby uzyskać pełną odległość przesuwu i upewnić się, że wszystkie traktowane rośliny są dotykane. Następnie naciśnij przycisk automatycznej prędkości, aby ustawić prędkość ruchu wzdłuż osi x ramion maszyny na 5000 milimetrów na minutę.
Naciśnij przycisk małego cyklu, aby ustawić czas dotyku na 20 prób, co równa się 40 dotknięciom na rundę. Ustaw interwał powtarzania rundy dotykowej na 480 minut dziennie, naciskając przycisk głównej kropki, który pozwala szczotkom do włosów dotykać roślin przez trzy rundy dziennie w odstępie ośmiu godzin. Maszyna automatycznie rozpocznie nową rundę dotyku, gdy odliczanie zmieni się na zero.
Ustaw główny cykl na 12 prób, aby maszyna mogła dotknąć roślin przez 12 rund w ciągu czterech dni. Naciśnij przycisk start, aby zainicjować zaprogramowany program. Dostosuj i skalibruj szczotki i końcówki włosów do tej samej wysokości codziennie przez cały okres dotykania.
Aby prześledzić dzień zakręcenia każdej rośliny w ramach wzruszającego eksperymentu, codziennie obserwuj pierwszą łodygę kwiatostanową każdej rośliny. Zmierz długość i zapisz czas trwania wzrostu, gdy osiągnie jeden centymetr, co oznacza, że przeszedł z fazy wegetatywnej do fazy rozrodczej. Miara promienia rozety, zrób zdjęcia całej tacy od góry.
Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby zmierzyć odległość od środka rozety do czubka najdłuższego liścia z brzegiem miseczki jako linijką. Aby zmierzyć obszar rozety, najpierw usuń kwiatostan, nie wpływając na resztę narządów rozety. Rób zdjęcia ze szczytu każdej rośliny wraz z linijką wagi umieszczoną w pobliżu.
W oprogramowaniu do przetwarzania obrazu zmierz poziomą dwuwymiarową powierzchnię liści rozety. W tym eksperymencie ręczne leczenie dotykowe wacikiem bawełnianym porównano z maszynowym leczeniem włosów na dzikich roślinach kontrolnych Columbia zero. Kotwienie opóźnione o 1,7 dnia po ciągłym leczeniu dotykowym wacikiem.
Podobnie w przypadku automatycznego dotyku włosów napędzanych maszyną zaobserwowano opóźnione kotwienie. Jednoczynnikowa analiza zagrożeń Coxa pokazuje, że ryzyko zakotwienia roślin w grupie dotykowej wynosi odpowiednio 31% i 52% w porównaniu z roślinami w grupie kontrolnej. Jednak tego opóźnienia nie zaobserwowano w przypadku mutantów insercyjnych tDNA, NKK jeden i NKK dwa.
Jednowymiarowy model proporcjonalnego hazardu Coxa pokazuje, że tylko dziki typ Columbia zero wykazywał znaczącą różnicę między roślinami kontrolnymi i dotykowymi z szacowanym HR wynoszącym 41. Jeśli chodzi o zmiany morfologiczne, dzika roślina Columbia zero wykazała znacznie mniejszy promień rozety i krótszą długość liści po trzech dniach ciągłego i powtarzalnego automatycznego dotyku włosów napędzanego maszynowo. Projektowana powierzchnia rozety została zmieniona z 20 na 16 centymetrów kwadratowych po 13 dniach dotyku.
Aby mieć pewność, że obciążenie siłą dotyku nie doprowadzi do zranienia, należy ostrożnie ustawić odpowiednią siłę dotyku. Zestaw odpowiednich warunków wzrostu jest potrzebny do wyprodukowania odpowiedniej rośliny Arabidopsis do testu reakcji na dotyk. Na przykład do obserwacji morfogenezy sygnału potrzebne są 24 godziny natężenia światła od 180 do 240 mikroeinsteinów na metr kwadratowy na sekundę.
Aby rozszerzyć na inne formy obciążenia siłami mechanicznymi, maszynę można również zmodyfikować za pomocą dyszy zraszającej wodą lub dmuchaw wiatru, aby w przyszłości naśladować odpowiednio efekty deszczu lub wiatru.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie prezentuje zautomatyzowaną maszynę do ładowania sił dotyku wykorzystującą szczotki z ludzkich włosów i ramiączka robotyczne w celu zbadania morfogenezy sygnałów roślin. Urządzenie umożliwia jednolite nakładanie siły dotyku na rośliny, znacznie zwiększając efektywność w porównaniu z metodami manualnymi.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Sygnalizowanie i reakcja roślin
- Automatyzacja w badaniach biologicznych
- Skuteczne metody leczenia roślin
Tło
- Tradycyjne metody nakładania sił dotyku na rośliny są pracochłonne i czasochłonne.
- Rozwój systemów robotycznych może poprawić spójność i szybkość eksperymentów.
- Celem tego badania jest poprawa reakcji roślin na stymulacje mechaniczne poprzez automatyzację.
Stosowane metody
- Rozwój robotycznej maszyny do ładowania sił dotyku z szczotkami z ludzkich włosów do spójnego nakładania sił.
- Badania skupione na roślinach Arabidopsis w różnych fazach rozwoju.
- Podejścia technologiczne obejmują zautomatyzowane cykle dotyku i kontrolowane warunki środowiskowe.
Główne wyniki
- Zautomatyzowany system zapewnia siły dotyku porównywalne z manualnym nakładaniem.
- Ulepszenia efektywności zauważono zarówno w czasie leczenia, jak i w populacjach reakcji roślin.
- Udana implementacja wykazała potencjał dla szerszych zastosowań w badaniach mutantów sygnałowych.
Konkluzje
- To badanie podkreśla skuteczność robotycznej automatyzacji w badaniach fizjologii roślin.
- Wyniki sugerują, że zmechanizowany dotyk może znacznie usprawnić procesy badawcze, pomagając w badaniach genetycznych i sygnałowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated mechanical stimulation platforms address bottlenecks in phenotypic screening for mechanotransduction pathways, enabling higher throughput and reproducibility in target validation studies. By reducing labor-intensive manual force application, the method supports scalable assessment of genetic mutants in mechanosensitive signaling networks. This positions the technology as a enabling tool for early discovery workflows focused on force-sensing mechanisms in model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of touch-force signaling mutants such as MKK1 and MKK2 to clarify mechanistic roles in mechanotransduction.
- Operational Value: Provides repeatable, quantifiable touch-force application reducing variability from manual handling.
- Predictive Value: Supports phenotypic comparison of wild-type and mutant lines under standardized mechanical stress to de-risk target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological outputs (e.g., rosette radius, bolting timing) for high-content phenotypic screening.
- Operational Value: Allows unlimited touch rounds with adjustable force strength, enabling dose-response-like experimental designs.
- Assay Readiness: Compatible with alternative touch materials (e.g., animal hair, silk) and environmental simulators (rain, wind) for assay flexibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular mutants to organism-level phenotypic changes under mechanical stress, supporting pathway validation.
- Mechanistic De-risking: Enables statistical evaluation of touch response differences between genotypes, informing target confidence.
- Model Relevance: Uses Arabidopsis thaliana as a genetically tractable system to study conserved mechanosensitive signaling principles.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery pipelines by providing a standardized mechanical stimulus for phenotypic screening of signaling mutants prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of kinase-dependent touch signaling pathways through controlled force application and phenotypic readouts.
- Screening: Enables reproducible, high-throughput touch-force delivery for mutant screening campaigns with measurable growth and developmental outputs.
- Analytics: Facilitates quantitative measurement of bolting delay, rosette area, and leaf length for statistical comparison across genotypes.
- Translational Research: Connects molecular phenotypes (e.g., MKK1/MKK2 mutants) to whole-plant mechanomorphogenic responses, supporting target validation.
- Enterprise Reuse: Platform design allows adaptation to other mechanical stimuli (wind, rain) and model systems, supporting cross-project utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in force-sensing pathways through standardized, repeatable phenotypic assays.
- Operational Value: Increases experimental throughput by reducing touch-force application time from hours to minutes per round.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in target validation by minimizing false positives from manual force variability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanosensitive targets based on reproducible phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant growth conditions, mechanical stimulation protocols, and image-based phenotyping.
- Needs robotic arm system, custom touch-material fixtures, and environmental control chambers for reproducible results.
- Demands standardization of touch force (1–2 mN), timing intervals, and environmental conditions across users and sites.
- Adaptation considerations include exchanging touch materials (hair, silk, cotton) and adding nozzles for rain/wind simulation.
- Practical limitations include dependency on consistent plant size and developmental stage for comparable touch response measurements.
