Name: Test zabijania opsonofagocytarnego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom bakteryjnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj test zabijania opsonofagocytarnego do oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko Streptococcus pneumoniae. Ta metoda pozwala badać skuteczność przeciwciał i aktywność fagocytarną komórek układu odpornościowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) za jego nieocenioną pomoc w ustanowieniu testów OPKA w naszym laboratorium. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health Grant 1R01AI123383-01A1 dla FYA.

1. Hodowla, różnicowanie i walidacja komórek HL-60

<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych HL-60 składającą się z 500 ml RPMI z L-glutaminą i 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej. Nie należy dodawać antybiotyków, ponieważ może to wpływać na różnicowanie komórek HL-60.</li>
	<li>Do rozmnażania/utrzymania komórek HL-60 należy hodować 5 x 106 komórek w 10 ml pożywki do hodowli komórek HL-60 w kolbach wentylowanych o długości 75 cm2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Pasaż komórek co 3-4 dni, aby utrzymać optymalne stężenie komórek. 
	nuta: Stężenie komórek nie powinno przekraczać 5 x 106/ml.</li>
	<li>Generowanie zapasów roboczych komórek HL-60 poprzez porcjowanie około 1 x 106 komórek/ml w pożywce hodowlanej HL60 z 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) do probówek kriogenicznych o pojemności 1 ml. 
	nuta: Zapas roboczy może być przechowywany w temperaturze -80 °C. Materiał wzorcowy należy przechowywać w temperaturze -120 °C.</li>
	<li>Różnicować komórki HL-60 poprzez hodowlę 1,5 x 107 komórek w 15 ml pożywki do hodowli komórek HL-60 z 0,6% N,N-dimetyloformamidem (DMF) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sterylnych kolbach o średnicy 75 cm2 z filtrem przez 3 dni przed OPKA.</li>
	<li>Sprawdź, czy komórki HL-60 zostały pomyślnie zróżnicowane i są odpowiednie do użycia w teście OPKA, testując markery żywotności i powierzchni komórek zgodnie z ustalonymi protokołami cytometrii przepływowej16,17,18,19. Po różnicowaniu zbierz komórki HL-60 i wybarwij około 1 x 104 komórek fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami/barwnikami dla CD71, CD35, aneksyny V i jodku propidyny. 
	nuta: Zróżnicowane komórki powinny mieć ≥65% żywotności, ≥55% CD35+ i ≤20% CD71+, zgodnie z ustalonymi protokołami walidacji14 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>

2. Przygotowanie i odczynników OPKA

<ol>
	<li>Przygotuj 50 ml sterylnego buforu opsonizacyjnego B (OBB), mieszając 42,5 ml sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z Ca2 + / Mg2+, 5 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i 2,5 ml 0,1% sterylnej żelatyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zaopatrzyć się w uzupełnienie dla młodego królika i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Uzyskać lub przygotować płytki do hodowli bakterii (tj. 15 x 100 mm2 5% płytki agarowe z krwią owczą).</li>
</ol>

3. Przygotowanie próbek bakteryjnych

<ol>
	<li>Uzyskać zapas szczepu(-ów) bakteryjnego(-ych), który ma być poddany(-e) badaniu. 
	nuta: W tym protokole stosuje się serotyp 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, hojnie dostarczony przez dr Moon Nahma).</li>
	<li>Hoduj szczep bakterii w odpowiednim bulionie (tj. bulionie Todda-Hewitta + 0,5% ekstraktu drożdżowego dla tego szczepu WU2) przez około 2−4 godziny w temperaturze 37 °C. 
	nuta: Gęstość optyczna kultury przy 600 nm (OD600) powinna wynosić od 0,6 do 0,8.</li>
	<li>Osadzaj bakterie przez odwirowanie przy 6 000 x g przez 2 minuty i ponownie zawieś komórki w 10-30 ml 15% glicerolu w odpowiednim bulionie. Porcję kultury bakteryjnej (500 μl na podwielokrotność) przelać do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Rozmrozić jedną fiolkę z wywarem bakteryjnym w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Osadzać komórki bakteryjne i ponownie zawijać w 500 μl OBB w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Przygotować różne rozcieńczenia materiału bakteryjnego w OBB (tj. 10 μl bez rozcieńczenia, 10 μl z 1:10, 10 μl z 1:100 itd.). Wykonać test OPKA (sekcje 4–6, w tym kokultura HL-60/dopełniacza) zgodnie z opisem poniżej, używając różnych rozcieńczeń nieleczonego materiału bakteryjnego. Hodować płytki przez noc w temperaturze 30 °C (bez CO2 ). 
	nuta: Temperatura 30 °C jest specyficzna dla WU2, aby zapobiec przerostowi; inne szczepy/serotypy mogą rosnąć optymalnie w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Policzyć kolonie dla każdego rozcieńczenia niepoddanego działaniu substancji bakteryjnej hodowanej jednocześnie z komórkami HL-60 i dopełniaczem. Określ, które rozcieńczenie bakterii daje optymalną liczbę policzalnych kolonii (około 80-120 CFU dla nieleczonych bakterii hodowanych wspólnie z komórkami HL-60). Należy zwrócić uwagę na to rozcieńczenie dla przyszłych OPKA zawierających ten szczep bakteryjny.</li>
</ol>

4. Leczenie i hodowla bakterii

<ol>
	<li>Rozmrozić jedną probówkę wywaru bakteryjnego przygotowanego w kroku 3.3. Bakterie w osadach (6 000 x g przez 2 min) i ponownie zawiesić osad komórkowy w OBB w optymalnym rozcieńczeniu, jak określono w kroku 3.6.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl zawieszonego rozcieńczenia bakteryjnego na basenie na okrągłodennej 96-dołkowej płytce do hodowli komórek.</li>
	<li>Dodać 20 μl odpowiedniego przeciwciała lub leczenia farmakologicznego do każdej studzienki doświadczalnej w dwóch egzemplarzach. 
	nuta: W tym protokole przeciwciało specyficzne dla serotypu wytworzone u myszy dodaje się jako leczenie X, a enzym hydrolazy glikozydowej, o którym wiadomo, że degraduje kapsułkę polisacharydową serotypu 3, dodaje się jako leczenie Y (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2) < klasa sup = "xref">4,< klasa sup = "xref">20. W przypadku studzienek kontrolnych należy użyć 1x PBS lub OBB, w zależności od buforu używanego do studzienek leczniczych.</li>
	<li>Potrząsać płytką z próbką z prędkością około 90 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dostosuj te warunki w zależności od optymalnej temperatury lub warunków wstrząsania testowanych zabiegów.</li>
</ol>

5. Współkultura bakterii HL-60

<ol>
	<li>Przygotować komórki HL-60, zbierając zróżnicowane komórki HL-60, które są traktowane DMF trzy dni wcześniej (patrz krok 1.4) do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Osadzać komórki (500 x g, 3 min), wyrzucić supernatant i przemyć co najmniej 10 ml 1x PBS.</li>
	<li>Umyte komórki należy otopić (500 x g, 3 min), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w OBB (zacząć od 1 ml OBB i dostosować do końcowego stężenia 1 x 107/ml po zliczeniu komórek).</li>
	<li>Dodać dopełniacz dla młodego królika (sterylna, nierozcieńczona surowica dla młodego królika, w wieku 3-4 tygodni) w końcowej objętości 1:5. 
	nuta: Końcowe stężenie mieszaniny HL-60-dopełniacza powinno wynosić 1 x 107/ml. W przypadku badania zależności od dopełniacza można użyć drugiego roztworu zawierającego aktywne komórki HL-60 z inaktywowanym termicznie dopełniaczem (dopełniacz można inaktywować przez inkubację w łaźni wodnej w temperaturze >55 °C przez co najmniej 30 minut).</li>
	<li>Po zakończeniu 1-godzinnej hodowli bakteryjnej (etap 4.4) podzielić każdą próbkę (tj. 10 μl z każdej studzienki o pojemności 30 μl do dwóch nowych studzienek) do zduplikowanych studzienek dla dwóch grup (tj. użyć tylko 20 μl oryginalnej kokultury o pojemności 30 μl, aby uwzględnić błąd pipetowania): jeden zestaw będzie współhodowany z dopełniaczem HL-60, a jeden będzie zawierał tylko bakterie. Dodać 50 μl mieszaniny dopełniacza HL-60 (z kroku 5.3) do każdego zestawu studzienek doświadczalnych (delegowany +HL-60); dodać 50 μl samego OBB do samych studzienek bakterii (delegowane -HL-60). 
	nuta: W tym przykładzie do początkowej kohodowli z 5 x 10 komórkami HL-60 o pojemności 5/50 μl wykorzystuje się około 800 bakteryjnych CFU. Jeśli ta wielokrotność infekcji jest zbyt wysoka lub zbyt niska, jak wskazują końcowe liczby kolonii, dostosuj początkowe rozcieńczenie bakterii w przeciwieństwie do liczby komórek HL-60.</li>
	<li>Wstrząsać 96-dołkową płytką w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (bez CO2 ).</li>
</ol>

6. Posiewanie próbek i inkubacja przez noc

<ol>
	<li>Rozcieńczyć każdą studzienkę w stosunku 1:5 środkiem OBB, tak aby każda próbka miała objętość co najmniej 50 μl.</li>
	<li>Pobrać pipetą 50 μl każdej próbki bezpośrednio na wyznaczony obszar płytki do hodowli bakterii, zapewniając odpowiednie odstępy między próbkami. W przypadku okrągłych płytek agarowych o wymiarach 15 x 100 mmnależy odpipetować około 4 próbek na jedną płytkę.</li>
	<li>Przykryj próbki i pozostaw do wyschnięcia na około 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwrócić płytki i kulturę przez noc w temperaturze 30 °C (bez CO2 ). Alternatywnie, hodowla jest umieszczana na płytkach w słoikach beztlenowych, aby sprawdzić, czy warunki beztlenowe wpływają na wzrost bakterii lub kontrolować morfologię.</li>
	<li>Po całonocnej hodowli należy policzyć kolonie w każdym wyznaczonym obszarze próbki. Analizuj dane, porównując liczbę żywych komórek w każdym zestawie z odpowiednią kontrolą i/lub próbkami, które nie otrzymują kohodowli komórek HL-60 (wskazujące na 100% przeżycia komórek, 0% zabijania komórek).</li>
</ol>

<ol><li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li>
<li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li>
<li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li>
<li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li>
<li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).</li>
<li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li>
<li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li>
<li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li>
<li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li>
<li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li>
<li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li>
<li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonophagocytic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li>
<li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li>
<li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost%2C+high-throughput%2C+automated+counting+of+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li>
<li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).</li>
<li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+annexin+V%2Fpropidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).</li>
<li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells%3A+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li>
<li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

OPKA odgrywają zasadniczą rolę w ocenie odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez szczepienia za pośrednictwem przeciwciał 6,8. Głównym znaczeniem tego uproszczonego OPKA jest zdolność adaptacji w warunkach, które mają być badane (tj. przeciwciała, leczenie enzymatyczne itp.). W tym sensie, chociaż test ten może być wykorzystany do zbadania udziału opsonin (tj. przeciwciał) w fagocytozie, może być również wykorzystany do oceny sposobów przezwyciężenia czynników ...

Test zabijania opsonofagocytarnego (OPKA) jest kluczowym narzędziem do łączenia zmian w strukturze lub funkcji bakterii z późniejszymi zmianami w odpowiedzi immunologicznej i funkcji. W związku z tym jest często stosowany jako test uzupełniający w celu określenia odpornościowej skuteczności leczenia przeciwciałami, kandydatów na szczepionki, optymalizacji enzymów itp. Podczas gdy testy in vivo są niezbędne do określenia skutecznego klirensu lub ochrony w modelu infekcji bakteryjnej, OPKA może być używany do oceny wkładu immunologicznego w śmierć komórek bakteryjnych w najbardziej podstawowych składnikach: bakteriach, komórkach odpornościowych i eksperymentalnych terapiach. Wcześniejsze badania wykazały, że OPKA mogą być modyfikowane i stosowane w przypadku różnych bakterii i serotypów, w tym Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Co więcej, te zoptymalizowane testy mogą być wykorzystane do oceny różnych eksperymentalnych metod leczenia, w tym zdolności enzymu do uczynienia bakterii bardziej dostępnym dla komórek odpornościowych za pośrednictwem dopełniacza4 oraz leczenia przeciwciałami w celu poprawy opsonizacji5. Klasycznie test OPKA jest z powodzeniem stosowany w badaniach podstawowych i klinicznych jako potężny wskaźnik ochrony indukowanej przez przeciwciała specyficzne dla patogenu6,7,8,9.
Różne typy komórek odpornościowych mogą być używane do oceny zabijania opsonofagocytarnego. Jedną z powszechnie stosowanych populacji fagocytarnych jest ludzka linia komórkowa białaczki HL-60. Ta linia komórkowa może być utrzymywana w hodowli jako inaktywowane promielocyty; Mogą one jednak być zróżnicowane w różne stany aktywowane poprzez różne terapie farmakologiczne10,11. Traktowanie HL60 N,N-dimetyloformamidem różnicuje linię komórkową w aktywowane neutrofile o silnej aktywności fagocytarnej11. Podczas gdy komórki HL-60 zostały zoptymalizowane i są często używane do tych testów fagocytozy10, inne pierwotne leukocyty wielojądrzaste mogą być używane jako ramię immunologiczne eksperymentu12.
Dodatkowo, te testy można uprościć13 lub multiplexed14, aby przyjrzeć się wielu opornym na antybiotyki szczepom bakterii, które mają być testowane. Metoda multipleksowa stała się bardziej wykonalna dzięki opracowaniu oprogramowania, które może skutecznie zliczać jednostki tworzące kolonie bakteryjne (CFU) na miejsce na płytce agarowej15. Tutaj opisujemy uproszczoną metodę wykorzystującą jeden szczep bakterii, komórki HL-60, dopełniacz małego królika i płytki z agarem z krwią. Dzięki tej metodzie można szybko ocenić wiele metod leczenia, aby odpowiedzieć na konkretne pytania badawcze dotyczące tego, w jaki sposób można modulować wrodzoną odpowiedź immunologiczną na infekcję bakteryjną.

<table><tbody><tr><td>Aneksyna V (sprzężona z APC)</td><td>BioLegend</td><td>640919</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD35, ludzka (skoniugowana z PE)</td><td>BioLegend</td><td>333405</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD71, ludzka (skoniugowana z PE)</td>Szczep bakteryjny <td>BioLegend</td><td>334105</td><td></td></tr> do <tr><td>użycia (tj. Streptococcus pneumoniae, WU2)</td><td>Referencyjne Laboratorium Bakteryjne Układu Oddechowego (Dr. Moon Nahm)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki agarowe z krwią</td><td>Hardy Diagnostic</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica klonów</td><td>HyClone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma</td><td>G9012-1L</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HL-60</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypu IgG (sprzężona PE)</td><td>BioLegend</td><td>400907</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid (DMF)</td><td>Fisher Chemiczny</td><td>UN2265</td><td></td></tr><tr><td>jodek propidyny</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RPMI z L-glutaminą</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

test zabijania opsonofagocytarnego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom bakteryjnym

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Kluczowym aspektem odpowiedzi immunologicznej na bakteryjną kolonizację gospodarza jest fagocytoza. Test zabijania opsonofagocytarnego (OPKA) to procedura eksperymentalna, w której komórki fagocytarne są hodowane wspólnie z jednostkami bakteryjnymi. Komórki odpornościowe będą fagocytozę i zabijać kultury bakteryjne w sposób zależny od dopełniacza. Skuteczność zabijania komórek za pośrednictwem układu odpornościowego zależy od wielu czynników i może być wykorzystana do określenia, jak różne kultury bakteryjne wypadają w porównaniu z odpornością na śmierć komórki. W ten sposób można ocenić skuteczność potencjalnych terapii opartych na odporności w stosunku do określonych szczepów bakterii i/lub serotypy. W tym protokole opisujemy uproszczony OPKA, który wykorzystuje podstawowe warunki hodowli i zliczania komórek w celu określenia żywotności komórek bakteryjnych po jednoczesnej hodowli z warunkami leczenia i komórkami odpornościowymi HL-60. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w przypadku wielu różnych serotypów pneumokoków, szczepów otoczkowych i torebkowych oraz innych gatunków bakterii. Zaletami tego protokołu OPKA są jego prostota, wszechstronność (ponieważ test ten nie ogranicza się do leczenia przeciwciałami jako opsoninami) oraz minimalizacja czasu i odczynników do oceny podstawowych grup eksperymentalnych.

Walidację różnicowania HL-60 należy przeprowadzić przed rozpoczęciem OPKA. Można to osiągnąć za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia zewnątrzkomórkowej ekspresji CD11b, CD35, CD71 oraz aneksyny V (Rysunek 1). Jako marker żywotności można również zastosować jodek propidyny. Po 3-dniowej inkubacji z DMF ekspresja CD35 powinna wzrosnąć (≥5% wszystkich komórek), a ekspresja CD71 powinna zmaleć (≤20% wszystkich komórek). Łączny procent komórek aneksyna V+ oraz jodek propidyny (PI+) po...

Ten test zabijania opsonofagocytarnego służy do porównywania zdolności komórek odpornościowych fagocytarnych do reagowania i zabijania bakterii w oparciu o różne metody leczenia i/lub warunki. Klasycznie test ten służy jako złoty standard do oceny funkcji efektorowych przeciwciał podniesionych przeciwko bakterii jako opsonina.

Test zabijania opsonofagocytarnego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom bakteryjnym

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Test ten łączy modulację struktury i funkcji bakterii z aktywnością przeciwbakteryjną opartą na komórkach odpornościowych. W związku z tym kluczowa immunoterapia potencjalnego leczenia może być oceniana w celu określenia prawdopodobieństwa poprawy klirensu bakteryjnego. Test zabijania opsonofagocytarnego tradycyjnie służy jako złoty standard do oceny skutecznych funkcji przeciwciał podniesionych przeciwko bakterii jako obsonantowi.Protokół ten oferuje prostotę i wszechstronność w porównaniu z istniejącymi standaryzowanymi testami o wysokiej przepustowości. W tym protokole badamy wpływ leczenia farmakologicznego na paciorkowcowe zapalenie płuc i jak te efekty przekładają się na poprawę fagocytozy bakterii. Tutaj nakładamy OPKA na komórki paciorkowcowego zapalenia płuc.Jednak protokół ten można przyjąć do oceny fagocytarnego zabijania innych patogenów przez komórki odpornościowe. Poświęć czas na optymalizację zapasów bakterii i upewnienie się, że końcowe CFU, które mają zostać policzone, mieszczą się w optymalnym zakresie. Zdecydowanie zalecamy stosowanie cytometrii przepływowej, aby upewnić się, że komórki HL60 są żywotne i aktywne, oraz wypróbowanie różnych warunków hodowli, aby zapewnić funkcjonalnie aktywne komórki.Demonstracja wizualna pozwoli lepiej zrozumieć, w jaki sposób należy posiać próbkę i jak uzyskać policzalne próbki. Na początek przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych HL60 składającą się z 500 mililitrów RPMI uzupełnionych L-glutaminą i 15 mililitrów inaktywowanej płodową surowicą bydlęcą. W celu rozmnażania i utrzymania komórek HL60 należy wyhodować pięć milionów komórek w 10 mililitrach pożywki do hodowli komórkowych HL60 w 75 centymetrach kwadratowych wentylowanych kolbach o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla.Aby wygenerować zapasy robocze komórek HL60, dodaj około miliona komórek na mililitr w pożywce hodowlanej HL60 uzupełnionej 10% dimetylosulfotlenkiem do jednomililitrowych probówek kriogenicznych. Aby zróżnicować komórki HL60, należy hodować 1,5 razy 10 do siedmiu komórek w 15 mililitrach pożywki do hodowli komórkowych HL60 uzupełnionej 0,6% DMF w sterylnych kolbach o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni przed OPKA. Aby przygotować podstawowe próbki bakterii, hoduj szczep bakteryjny WU2 w odpowiednim bulionie przez około dwie do czterech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie osadzaj bakterie przez wirowanie w temperaturze sześciu tysięcy razy G przez dwie minuty i ponownie zawieś komórki w 10 do 30 mililitrach 15% glicerolu w odpowiednim bulionie. Przenieś kulturę bakterii do sterylnych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Następnie rozmrozić jedną fiolkę z wywarem bakteryjnym w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Osadzaj komórki bakteryjne i ponownie zawieś w 500 mikrolitrach OBB w sterylnych warunkach. Rozcieńczyć płytkę niepoddanego działaniu bakterii na płytkach z agarem z krwią i hodować płytki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po etapie inkubacji należy policzyć kolonie dla każdego rozcieńczenia niepoddanego działaniu substancji bakteryjnej hodowlanej wspólnie z komórkami HL60.Zapisz, które rozcieńczenie bakterii daje optymalną liczbę policzalnych kolonii dla przyszłych OPKA z tym zasobem bakteryjnym. Rozmrozić jedną tubkę bulionu bakteryjnego. Osadzaj bakterie w ilości sześciu tysięcy razy G przez dwie minuty i ponownie zawieś osad komórkowy w OBB w optymalnym rozcieńczeniu uzyskanym w poprzednim kroku.Odpipetować 10 mikrolitrów zawieszonego rozcieńczenia bakteryjnego na studzience na okrągłej płytce do hodowli komórkowej z 96 dołkami. Następnie dodaj 20 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała lub leczenia farmakologicznego do każdej studzienki doświadczalnej w dwóch egzemplarzach. W przypadku studzienek kontrolnych należy użyć 1XPBS lub OBB w zależności od buforu użytego do studzienek uzdatniających.Potrząsać płytką do pobierania próbek z prędkością około 90 obr./min w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Aby zebrać zróżnicowane komórki HL60, które są traktowane DMF trzy dni wcześniej, należy granulować komórki w temperaturze 500 razy G przez trzy minuty. Wyrzucić supernatant i przemyć osad co najmniej 10 mililitrami 1XPBS.Granulować umyte komórki w temperaturze 500 razy G przez trzy minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w OBB. Dodać sterylną, nierozcieńczoną surowicę młodego królika w końcowej objętości od jednej do pięciu.Po godzinnej hodowli bakteryjnej podziel każdą próbkę do zduplikowanych studzienek dla dwóch grup. Następnie dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny dopełniacza HL60 do każdego eksperymentalnego zestawu studzienek i 50 mikrolitrów OBB tylko do studzienek bakterii. Potrząsaj płytką 96-dołkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Aby rozłożyć próbki na płytkę, rozcieńczyć każdą studzienkę OBB w końcowej objętości od jednego do pięciu, tak aby każda próbka miała objętość co najmniej 50 mikrolitrów. Następnie należy odpipetować 50 mikrolitrów każdej próbki bezpośrednio na wyznaczony obszar płytki do hodowli bakterii, zapewniając odpowiednie odstępy między próbkami. Przykryj próbki i pozostaw do wyschnięcia na około 15 minut w temperaturze pokojowej.Odwróć płytki i kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Alternatywnie, hodowla jest umieszczana na płytkach w słoikach beztlenowych, aby sprawdzić, czy warunki beztlenowe wpływają na wzrost bakterii lub kontrolować morfologię. Po całonocnej hodowli policz kolonie w każdym wyznaczonym obszarze próbki i przystąp do analizy danych, porównując liczbę żywych komórek w każdym zestawie z odpowiednimi kontrolami.Najtrudniejszym aspektem ustanowienia tej techniki po raz pierwszy będzie prawdopodobnie optymalizacja początkowych CFU w stadzie bakteryjnym, a także zapewnienie skutecznego różnicowania komórek HL60. Przed rozpoczęciem OPKA walidację różnicowania HL60 przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej z jodkiem propidyny jako markerem żywotności. Po leczeniu DMF przez trzy dni ekspresja CD35 była zwiększona, a ekspresja CD71 zmniejszona.Średni odsetek bakteryjnych CFU w grupach leczonych HL60 w porównaniu z odpowiadającymi im grupami bez HL60 wykorzystano do porównania przeżywalności komórek bakteryjnych po różnych terapiach. Wyniki pokazały, że przy skutecznym leczeniu liczba kolonii była różna między kokulturą HL60 a brakiem komórek HL60, co wskazuje na bardziej wydajną fagocytozę. Wyniki pokazały, że gdy rozcieńczenie bakterii nie było zoptymalizowane lub wzrost kolonii nie był dokładnie obserwowany po posiewaniu, przerost kolonii może uniemożliwić dokładne zliczenie kolonii.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest dokładne monitorowanie inkubacji bakterii, aby uniknąć przerostu CFU. Testy in vivo można wykorzystać do oceny skutecznego usuwania bakterii w organizmie gospodarza. Testy te mogą być wykorzystane do potwierdzenia skuteczności immunologicznej obserwowanej za pomocą OPKA, które można przetłumaczyć na modele ludzkie lub zwierzęce.Test zabijania opsonofagocytarnego był stosowany z dużym skutkiem w poprzednich znaczących badaniach naukowych w celu powiązania terapii przeciwbakteryjnych z fagostycznymi odpowiedziami immunologicznymi. Praca z patogenami bakteryjnymi może być niebezpieczna. Podczas tego testu należy nosić ochronny sprzęt osobisty.

opsonophagocytic-killing-assay-to-assess-immunological-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej do określania aktywności fagocytarnej przeciwciał swoistych dla antygenu z próbek klinicznych, z wykorzystaniem kuleczek pokrytych fluorescencyjnym antygenem oraz linii komórkowej monocytów wykazującej ekspresję wielu receptorów Fc, co pozwala na standaryzowane i powtarzalne określanie wykorzystania receptorów oraz aktywności fagocytarnej dla dowolnego wybranego antygenu.

Oznaczanie aktywności fagocytarnej próbek przeciwciał klinicznych

Źródło: Nagre, N. i inni. Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i usuwanie bakterii u myszy. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje ocenę fagocytozy pośredniczonej przez receptory komplementacyjne przy użyciu czerwonych krwinek owiec opsonowanych IgM i dopełniakiem, a następnie ich przyjmowania przez mysie makrofagi. Zakres fagocytozy mierzy się poprzez pomiar niebieskiego produktu chromogenicznego powstałego w wyniku katalyzowanej przez hemoglobinę utleniania diaminofluorenu.

Modelowanie fagocytozy podleganej komplementem za pomocą opsonizowanych czerwonych krwinek in vitro

Źródło: Seman, B. G., et.al. Model obrazowania noworodków sepsy bakteryjnej Gram-ujemnej. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje izolację neutrofilów i zapalnych monocytów z noworodkowych śledzion myszy oraz ich zastosowanie w luminescencyjnym teście zabijającym bakterie. Obejmuje mechaniczną dysocjację, lizę czerwonych krwinek, wzbogacanie komórek oparte na kulkach magnetycznych, inkubację bakterii oraz ochronę antybiotykową. Pomiary luminescencji czasowej wskazują na początkową internalizację...

Ocena in vitro zabijania bakterii przez fagocyty śledziony noworodków myszy

Ten film demonstruje technikę oceny działania bakteriobójczego przeciwciał obecnych w surowicy, w którym pośredniczy dopełniacz. Podejście to łączy wyizolowaną surowicę z bakteriami chorobotwórczymi i egzogennymi białkami dopełniacza. Podczas inkubacji bakterie są hodowane na płytce agarowej, a wytworzone kolonie są oznaczane ilościowo w celu zmierzenia miana bakteriobójczego surowicy.

Test bakteriobójczy surowicy na działanie bakteriobójcze przeciwciał za pośrednictwem dopełniacza

W tym filmie demonstrujemy test do wykrywania cytotoksyczności zjadliwych i mniej zjadliwych szczepów Staphylococcus aureus przeciwko ludzkim neutrofilom po fagocytozie za pomocą cytometrii przepływowej.

Test cytotoksyczności szczepów Staphylococcus aureus na neutrofilach po fagocytozie

Wideo pokazuje test zabijania in vitro opsonofagocytarnego przy użyciu kohodowli ludzkich neutrofili ze Streptococcus pneumoniae. Przeciwciała i białka dopełniacza ułatwiają opsonizację bakterii, umożliwiając neutrofilom rozpoznawanie i zabijanie bakterii, wykazując skuteczną aktywność opsonofagocytarną neutrofili.

Ocena zabijającej aktywność opsonofagocytarną wobec patogenów bakteryjnych

Ten film demonstruje test opsono-adherencji do badania interakcji między opsonizowanymi bakteriami a komórkami odpornościowymi. Bakterie znakowane fluorescencyjnie, potraktowane surowicą testową zawierającą przeciwciała antykapsułkowe, inkubuje się z makrofagami. Po zabarwieniu makrofagów fluorescencją, przyczepione bakterie na powierzchni makrofagów obserwuje się pod mikroskopem w celu wizualizacji.

Test adherencji opsonowej do oceny opsonizacji bakterii otoczkowanych przez przeciwciała antykapsułkowe

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru zjadliwości bakterii planktonowych lub przyczepionych powierzchniowo przy użyciu D. discoideum (ameba) jako gospodarza. Wirulencję mierzy się przez okres 1 godziny, a zabijanie gospodarza określa się ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizy obrazu. Demonstrujemy ten protokół za pomocą bakterii P. aeruginosa.

Szybki test zjadliwości bakterii oparty na obrazie przy użyciu ameby

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru aktywności Shigellacidal przeciwciał w surowicy. Surowicę miesza się z bakteriami i egzogennym dopełniaczem, inkubuje, a mieszaninę reakcyjną posiewa się na płytkach agarowych. Żywe bakterie tworzą kolonie, które są zliczane za pomocą automatycznego enumeratora kolonii i wykorzystywane do określenia miana bakteriobójczego.

Wysokoprzepustowy test bakteriobójczy specyficzny dla Shigella

Test opsono-adherencji jest alternatywną metodą do oceny opsono-fagocytarnych metod zabijania, aby ocenić opsoniczne funkcje przeciwciał w procesie opracowywania szczepionek.

Test opsono-adherencji w celu oceny funkcjonalnych przeciwciał w procesie opracowywania szczepionki przeciwko Bacillus anthracis i innym otoczkowanym patogenom

Poznaj test zabijania opsonofagocytarnego do oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko Streptococcus pneumoniae. Ta metoda pozwala badać skuteczność przeciwciał i aktywność fagocytarną komórek układu odpornościowego.

Test zabijania opsonofagocytarnego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom bakteryjnym

Przeglądaj więcej filmów