Chromatografia jonowymienna (IEX) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła (MALS) w celu separacji i charakterystyki białek

Protokół ten przedstawia jonowymienne MALs, nowatorską metodę kontroli i charakterystyki jakości białek, kontrolę jakości, która jest niezbędna dla spójności i integralności wyników badań w naukach przyrodniczych i rozwoju produktów farmaceutycznych. Jonowymienny MALS określa czystość białka, stan oligomeryczny, jednorodność, tożsamość, konformację, strukturę, modyfikacje po translacji i inne właściwości. Pomiary są nieniszczące i są wykonywane w roztworze w warunkach zbliżonych do fizjologicznych warunków buforowych.

Metoda ta dokładnie określa masę molową białek lub peptydów, stan oligomeryczny oraz stopień koniugacji, na przykład glikoprotein. Może być również stosowany do białek błonowych. IEX rozdziela makrocząsteczki według ich ładunku powierzchniowego.

Macierze wymiany anionowej, AIEX i kationowymienności, CIEX, wiążą odpowiednio warianty naładowane ujemnie i dodatnio. Dzięki dokładnemu oddzieleniu między populacjami białek, które mają stosunkowo zbliżoną masę lub kształt, IEX-MALS z powodzeniem określa masę molową każdego pojedynczego stanu białka w próbce mieszaniny. Na początek użyj filtra 0,1 mikrometra, aby przefiltrować wszystkie odczynniki, w tym płuczące i elucyjne.

Przefiltruj pierwsze 50 do 100 mililitrów buforu do butelki na odpady, aby wyeliminować cząstki stałe z suchych filtrów. W czystej, sterylnej butelce, która została dokładnie umyta przefiltrowaną wodą i zakryta, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu, przefiltruj pozostałą część buforu. Za pomocą buforu Tris o pH osiemowym i 50-milimolowym chlorku sodu rozcieńczyć próbkę BSA do sześciu miligramów na mililitr, aby pH i siła jonowa umożliwiły wiązanie się z kolumną jonowymienną.

Użyj strzykawki, aby wstrzyknąć co najmniej 0,3 do 0,5 miligrama BSA do jednomililitrowej kolumny, aby uzyskać dobrej jakości analizę MALS. Aby rozpocząć eksperyment MALS z wymianą jonową, otwórz Nowy, Eksperyment z metody w oprogramowaniu MALS i wybierz metodę online z folderu metod systemu rozpraszania światła. Jeśli moduł DLS jest dostępny i dane DLS mają zostać pobrane, wybierz metodę online z podfolderu Rozpraszanie światła, z QELS.

Aby ustawić parametry, w sekcji Konfiguracja najpierw ustaw natężenie przepływu pracy w sekcji Pompa ogólna na natężenie przepływu używane w FPLC jako 1,5 mililitra na minutę. W sekcji Solvent (Rozpuszczalnik) wprowadź lub sprawdź parametry buforu. W sekcji Wtryskiwacz wprowadź nazwę białka jako BSA, przyrost współczynnika załamania światła jako 0,185 mililitra na gram, a współczynnik ekstynkcji UV przy długości fali 280 nanometrów jako 0,66 litra na gram na centymetr.

Na karcie Próbka wprowadź stężenie próbki białka jako sześć miligramów na mililitr, a następnie wprowadź objętość próbki do wstrzykiwań również jako 170 mikrolitrów. W sekcji Procedury na karcie Kolekcja podstawowa zaznacz pole wyboru Wyzwalaj przy automatycznym wstrzykiwaniu i ustaw czas trwania przebiegu na 70 mililitrów, aby zbieranie danych było kontynuowane przez co najmniej pięć minut po osiągnięciu przez nachylenie wartości końcowej. Następnie w oprogramowaniu FPLC utwórz nowy eksperyment w zakładce Edytor metod.

W początkowym eksperymencie utwórz liniowy gradient soli lub pH, natomiast w przypadku metody zoptymalizowanej utwórz bardziej szczegółowy gradient lub program krokowy zgodnie z rękopisem. Dołącz sygnał impulsowy do metody, który uruchomi zbieranie danych w oprogramowaniu MALS. Następnie otwórz zawór pompy i przemyj 0,5-molowym wodorotlenkiem sodu w celu usunięcia silnie związanych zanieczyszczeń, a następnie przepłucz buforem neutralizującym

Następnie przepłukać kolumnę buforem Tris o pH osiem, zaworem A buforem myjącym, a zaworem B buforem elucyjnym. Użyć buforu płuczącego o niskim stężeniu soli jako końcowego przemywania do przepłukania kolumny, aby umożliwić związanie białka z matrycą kolumny. Przed wstrzyknięciem próbki, po przemyciu i na końcu elucji, linia podstawowa rozpraszająca światło musi być ustabilizowana, aby zapewnić niski poziom hałasu i całkowicie czyste rozcieńczenie.

Za pomocą strzykawki umieść próbkę białka w pętli. Rozpocznij eksperyment najpierw w oprogramowaniu MALS, klikając przycisk Uruchom, a następnie w oprogramowaniu FPLC. Dane będą zbierane po otrzymaniu sygnału impulsowego z instrumentu FPLC za pośrednictwem detektora MALS.

Jeśli jonowymienność MALS jest wykonywana ręcznie w trybie przepływu ciągłego, a nie metodą samodzielną, należy zastosować te same parametry przebiegu i instrukcje, jak opisano wcześniej. Po zweryfikowaniu i uruchomieniu końcowej metody należy wykonać dokładnie tę samą metodę, używając ślepej próby, ładując bufor zamiast próbki. Ważne jest, aby czas między impulsem automatycznego wstrzykiwania a gradientem ślepej próby był identyczny jak w przypadku serii próbki.

Aby rozpocząć analizę, w sekcji Procedury w oprogramowaniu MALS, użyj zakładki Despiking i poziomu Normalny, aby wygładzić chromatogramy. Jeśli emitują dużo hałasu, ustaw poziom na Ciężki. W widoku Linia bazowa zdefiniuj linię bazową dla wszystkich sygnałów, w tym detektorów LS, UV i RI.

W widoku Szczyty zdefiniuj szczyty do analizy. Sprawdź poprawność wartości przyrostu RI dn/dc i współczynnika ekstynkcji UV dla białka pod każdym pikiem. W widoku Masa molowa i promień od rozpraszania światła przeanalizuj masę molową i promień przy użyciu modelu Zimm i dopasuj stopień zerowy.

Jeśli QELS jest dostępny, w widoku Rh z QUELS obserwuj wartości Rh i jakość dopasowania funkcji korelacji. Sygnał RI zmienia się znacząco podczas przebiegu wymiany jonowej MALS ze względu na wzrost stężenia soli. Aby odjąć sygnał wyjściowy od ślepej próby, otwórz zarówno eksperymenty MALS z białkiem, jak i ślepą jonowymiennością.

Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę eksperymentu białkowego, wybierz opcję Zastosuj metodę i wybierz folder Odejmowanie linii bazowej z okna dialogowego pliku. Wybierz metodę online do standardowej analizy masy molowej. W widoku Odejmowanie linii bazowej kliknij przycisk Importuj puste miejsce, aby zaimportować sygnały pustego przebiegu.

W obszarze Przyrządy sprawdź wszystkie detektory, które chcesz odjąć. Aby skalibrować system wymiany jonowej MALS za pomocą monomeru BSA, w widoku Procedury i konfiguracja wyrównaj piki. W widoku Normalizacja wprowadź 3,0 nanometr jako wartość Rg, aby przeprowadzić normalizację.

Następnie, w obszarze Poszerzanie pasma na tej samej karcie Konfiguracja, wybierz szczyt i użyj przycisku Wykonaj dopasowanie, aby dopasować sygnały UV i LS do sygnału RI. Wykres wyników jest wyświetlany w widoku Dopasowanie wyników. Zmień skale osi i inne parametry wykresu, klikając wykres prawym przyciskiem myszy, wybierając opcję Edytuj, a następnie klikając przycisk Zaawansowane.

Aby mieć więcej opcji wyświetlania, wybierz kartę Wykres EASI, a następnie w górnej części okna z menu rozwijanego Wyświetlanie wybierz Masa molowa lub Wilgotność względna Q. Wszystkie wyniki, w tym masa molowa, promień, poziom czystości i inne, są dostępne w widoku Raport w sekcji Wyniki. Użyj przycisku Projektant raportów, aby dodać więcej wyników lub parametrów, a także liczb do raportu. W tym eksperymencie BSA analizowano na jonowymiennych MALS przy użyciu kolumny analitycznej anionitów.

Chromatogramy pokazywały UV na 280 nanometrach, rozpraszanie światła pod kątem 90 stopni, współczynnik załamania światła i krzywe przewodności wraz z masą molową każdego piku. Szeroki gradient liniowy składający się z 30 objętości kolumn od 75-milimolowych do 350-milimolowych chlorku sodu oddzielił monomery BSA od dimerów i wyższych oligomerów. Dalsza analiza MALS wykazała, że obliczona masa molowa monomeru wynosi 66,8 kilodaltonów, a obliczona masa molowa dimera wynosi 130 kilodaltonów.

Opierając się na przewodności buforowej w eluowanych pikach, gradient został zmieniony na inny program, długi krok 175-milimolowego chlorku sodu, a następnie gradient liniowy od 175-milimolowego do 500-milimolowego chlorku sodu. Nowy gradient znacznie poprawił rozdzielczość i zapewnił doskonałą separację między monomerem BSA a gatunkami o wyższej oligomerii. Zastosowano stopniowy program 200-milimolowego i 250-milimolowego chlorku sodu, aby skupić się również na gatunkach o wysokiej oligomeryce.

Doprowadziło to do doskonałej separacji między monomerem, dimerem i trimerem BSA. Zgodnie z tą procedurą, metody takie jak spektrometria mas, SDS-PAGE i testy stabilności mogą być przeprowadzone na każdym wariancie oddzielonym wymianą jonową w celu zidentyfikowania i dalszego scharakteryzowania każdego z nich. Odkryliśmy, że jonowymienny MALS rozszerza moc analizy MALS na próbki, które nie mogą być w pełni przeanalizowane przez SEC-MALS.

Separacja przez ładunek rozdziela odrębne gatunki, które koeluują w SEC.