Name: Chromatografia jonowymienna (IEX) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła (MALS) w celu separacji i charakterystyki białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj chromatografię jonowymienną sprzężoną z MALS do analizy białek i peptydów. Ta metoda pozwala precyzyjnie określić masę molową, stan oligomeryczny i czystość próbek w warunkach fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Tsafi Danieli (Wolfson Centre for Applied Structural Biology, Hebrew University) za jej rady i współpracę. Autorzy dziękują również firmie Danyel Biotech Ltd. (Rehovot, Izrael) za pomoc i ustanowienie analitycznego systemu FPLC-MALS wykorzystanego w tym badaniu.

1. Przygotowanie systemu
<ol>
	<li>Zainstalować system szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) i detektory MALS/indeksu refrakcji (RI) (patrz tabela materiałów) wraz z odpowiednimi pakietami oprogramowania do sterowania, gromadzenia danych i analizy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Podłącz detektory MALS i RI za detektorami UV i przewodności FPLC. Pomiń detektor pH, chyba że jest to absolutnie konieczne w przypadku gradientów pH, aby zminimalizować objętość między detektorami UV i MALS. Należy użyć rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0.25–0.5 mm (id) między kolumną a detektorami oraz rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0.75 mm na wyjściu detektora RI do kolektora odpadów lub frakcji.</li>
	<li>Upewnij się, że zostały ustanowione niezbędne połączenia sygnałowe między FPLC a detektorami, w tym wyjście analogowe UV z detektora FPLC do wejścia MALS Aux i wyjście cyfrowe z FPLC do MALS Autoinject In, za pośrednictwem skrzynki I/O.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki i bufora
<ol>
	<li>Przefiltrować wszystkie odczynniki, w tym płuczące i elucyjne, za pomocą filtra 0,1 μm. Przefiltruj pierwsze 50–100 ml buforu do butelki na odpady, aby wyeliminować cząstki stałe z suchych filtrów, a pozostałą część buforu przechowuj w czystej, sterylnej butelce, która została dokładnie umyta przefiltrowaną wodą i zakryta, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu.</li>
	<li>Dostosuj próbkę BSA do pH i siły jonowej (np. pH = 8, 50 mM NaCl), które umożliwiają wiązanie się z kolumną IEX podczas procedur rozcieńczania, ultrafiltracji lub wymiany buforu. 
	UWAGA: Zaleca się wstępną filtrację próbki białka do najmniejszego rozmiaru porów, który nie usuwa interesującego materiału (0,02–0,1 μm). Alternatywnie próbkę można odwirować z dużą prędkością (13 000–16 000 x g) przez 10 minut, aby umożliwić wytrącanie dużych cząstek.</li>
	<li>Przygotować co najmniej 0,3–0,5 mg BSA (patrz Tabela Materiałów) do wstrzyknięcia w kolumnie o pojemności 1 ml (5/50 mm) w celu uzyskania dobrej jakości analizy MALS. Należy pamiętać, że objętość wstrzyknięcia jest nieograniczona.</li>
</ol>
3. Wybór i rozwój metody IEX dla białka
<ol>
	<li>Oblicz punkt izoelektryczny (pI) białka na podstawie sekwencji pierwszorzędowej, dla której można użyć serwerów, takich jak narzędzie Protparam na stronie internetowej ExPASy15. Należy zauważyć, że liczba pI BSA wynosi 5,8.</li>
	<li>Wybierz typ kolumny i parametry bufora.
	<ol>
		<li>Należy stosować różne dla AIEX i CIEX, w zależności odpK a buforu i jonowego charakteru buforu. Używaj kationowych podczas uruchamiania kolumny AIEX i anionowych podczas uruchamiania kolumny CIEX z małymi przeciwjonami. W tym przykładzie należy użyć 20 mM buforu Tris-HCl o pH 8 do analizy BSA na kolumnie AIEX.</li>
		<li>W przypadku białka o pI niższym niż 7, takiego jak BSA, należy użyć kolumny AIEX i buforu o pH wyższym niż pI o co najmniej dwie jednostki. W przypadku białka o pI wyższym niż 7 należy użyć kolumny CIEX i buforu o pH niższym niż pI białka o co najmniej dwie jednostki.</li>
		<li>Zoptymalizuj pH buforu zgodnie z siłą wiązania między białkiem a matrycą kolumny. Jeśli białko nie wiąże się dobrze z kolumną, należy użyć pH dalszego od pI. Upewnij się, że białko jest stabilne przy zastosowanym pH.</li>
		<li>Użyć niskiego stężenia soli w wiązaniu i przepłukać, aby umożliwić wiązanie białka z matrycą, ponieważ wiązanie białka zależy od siły jonowej załadowanej próbki. Białka zwykle wymagają trochę soli ze względu na ich stabilność; dlatego należy użyć 50 mM NaCl (lub alternatywnej soli) podczas etapów ładowania białka i mycia kolumny.</li>
		<li>W przypadku buforu elucyjnego należy użyć maksymalnie 0,5 M NaCl w celu odłączenia białka od kolumny. 
		UWAGA: Wyższe stężenia soli nie są zalecane podczas pracy ze standardowym refraktometrem RI ze względu na ograniczony zasięg przyrządu. Można jednak zastosować model o wysokim stężeniu, który pomieści 2 M NaCl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj początkową metodę w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Załadować 1 mg BSA (170 μL z 6 mg/ml) w ~0,5 ml buforu ładującego 20 mM buforu Tris-HCl, pH 8, zawierającego 50 mM NaCl. Przemyć kolumnę tym samym buforem dla objętości 10–15 kolumny (CV), aby umożliwić całkowitą elucję niezwiązanych cząsteczek i cząstek z układu, aż do pełnej stabilizacji sygnałów rozpraszania światła (LS), UV i RI.</li>
		<li>Wykonać krótki, liniowy gradient soli 20–30 CV, używając buforu elucyjnego 20 mM Tris-HCl, pH 8, zawierającego 0,5 M NaCl w celu odłączenia białka od kolumny. Wykonać gradient 0%–100% (lub alternatywny gradient rozległy) buforu elucyjnego lub podzielić go na dwa gradienty: 0%–50% buforu elucyjnego, a następnie dodatkowy gradient 50%–100% buforu elucyjnego, każdy gradient dla 10–20 CV. W przypadku BSA należy zastosować szeroki gradient 15%–70% dla 30 CV dla metody początkowej. 
		UWAGA: W niektórych przypadkach metoda początkowa może zapewnić separację w celu uzyskania wiarygodnej analizy MALS i dodatkowe przebiegi nie są konieczne. W wielu przypadkach początkowa metoda zawiera jedynie wskazówki dotyczące dalszej optymalizacji metody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zoptymalizuj metodę IEX, aby zwiększyć rozdzielczość i poprawić separację pików poprzez zmianę różnych parametrów.
	<ol>
		<li>Zmień nachylenie i długość gradientu. Krótkie nachylenia z dużymi nachyleniami zapewniają intensywne szczyty z mniejszą separacją, podczas gdy długie nachylenia z łagodnymi zboczami zapewniają niższe szczyty z lepszą separacją. Znajdź równowagę między szczytową rozdzielczością a intensywnością sygnału, aby uzyskać optymalną analizę MALS. 
		UWAGA: Ładowanie większej ilości białka może zwiększyć sygnały LS, UV i RI, ale odbywa się to kosztem rozdzielczości.</li>
		<li>Do elucji należy użyć krokowego profilu stężenia soli. Pamiętaj, że powszechnie stosowana jest kombinacja kroków i gradientu liniowego.</li>
		<li>Zmniejsz natężenie przepływu, aby poprawić separację pików. 
		UWAGA: W przypadku matryc z bardzo małymi cząstkami nie jest to bardzo istotne.</li>
		<li>Zmień pH buforu, aby zwiększyć zmienność ładunku między populacjami białek w próbce i poprawić separację między tymi wariantami. Należy pamiętać, że białka, które nie są prawidłowo oddzielone przy jednym pH, mogą być oddzielone przy innym pH.</li>
		<li>Użyj gradientu pH, liniowego lub krokowego, aby odłączyć białka od kolumny IEX. W razie potrzeby należy użyć gradientów elucji, które łączą zarówno zmiany pH, jak i stężenia soli.</li>
		<li>Użyj silniejszych soli, takich jak MgCl2, lub słabszych soli, takich jak octan sodu, aby zwiększyć czułość i rozdzielczość16.</li>
		<li>Użyj dłuższych kolumn IEX lub innej matrycy kolumnowej z mniejszymi cząstkami, aby poprawić możliwości separacji.</li>
		<li>Zmień typ kolumny (AIEX/CIEX), aby zapewnić inny wzór separacji. Należy pamiętać, że dostępne są również matryce z silnymi, słabymi lub połączonymi (w trybie mieszanym) ligandami, które mogą poprawić rozdzielczość niektórych próbek.</li>
		<li>Użyj kolumny od innego dostawcy z tym samym ligandem, który jest przyłączony do różnych żywic matrycowych. Sama żywica, niezależnie od liganda, może w różny sposób oddziaływać z białkami i wpływać na profil separacji.</li>
		<li>Uwzględnij dodatki (cząsteczki, które stabilizują białko w roztworze) do, aby poprawić stabilność białka i uniknąć agregacji białek, aby usprawnić eksperyment IEX. 
		UWAGA: Przykładami takich dodatków są cukry, alkohole, mocznik, detergenty niejonowe lub obojdnio-jonowe oraz sole chaotropowe i kosmotropowe17,18.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Eksperyment IEX-MALS
<ol>
	<li>Otwórz New\Experiment from Method w oprogramowaniu MALS i wybierz metodę online z folderu metod systemowych Light Scattering. Jeśli moduł DLS jest dostępny i dane DLS mają zostać pobrane, wybierz metodę online z podfolderu Light Scattering\With QELS.</li>
	<li>Ustaw parametry przebiegu w sekcji Konfiguracja.
	<ol>
		<li>Ustaw natężenie przepływu biegu w sekcji Pompa ogólna na natężenie przepływu używane w FPLC (1.5 ml/min), a następnie wprowadź lub sprawdź parametry bufora w sekcji Rozpuszczalnik</li>.
		<li>Nazwę białka (BSA), przyrost indeksu refrakcji (dn/dc; wartość wzorcowa dla białek to 0,185 mL/g), współczynnik ekstynkcji UV przy długości fali 280 nm (0,66 g/L-1·cm-1) oraz stężenie próbki białka (6 mg/mL) należy wprowadzić w zakładce Próbka w sekcji Wtryskiwacz. W tej samej sekcji należy również umieścić objętość próbki do wstrzykiwań (170 μl).</li>
		<li>Na karcie Basic Collection, w sekcji Procedure, zaznacz pole wyboru Trigger on Autoinject i ustaw czas trwania przebiegu tak, aby zbieranie danych było kontynuowane przez co najmniej 5 minut po osiągnięciu przez nachylenie wartości końcowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw parametry eksperymentu w oprogramowaniu FPLC.
	<ol>
		<li>Utwórz nowy eksperyment na karcie Edytor metod. Początkowym eksperymentem będzie liniowy gradient soli lub pH (patrz krok 3.3). W przypadku metody zoptymalizowanej utwórz bardziej szczegółowy gradient lub program krokowy zgodnie z wynikami elucji podczas metody początkowej (patrz krok 3.4 i <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Dołącz sygnał impulsowy do metody, który uruchomi zbieranie danych w oprogramowaniu MALS.</li>
		<li>Przepłukać kolumnę i zawory odpowiednimi: 20 mM Tris-HCl, pH 8, z 50 mM NaCl dla buforu płuczącego (zawór A) i tym samym buforem z 500 mM NaCl dla buforu elucyjnego (zawór B). Upewnij się, że końcowe płukanie kolumny wykorzystuje bufor wiążący, zawierający niskie stężenie soli, aby umożliwić wiązanie białka z matrycą kolumny. W celu masowego przepłukania silnie związanych zanieczyszczeń należy użyć 0,5 M NaOH przed myciem odpowiednimi, a następnie przemyciem buforem neutralizującym.</li>
		<li>Umieścić próbkę białka w pętli za pomocą strzykawki. Jeśli załadowano więcej niż 10 ml próbki, należy użyć superpętli lub zaworu pompy przyrządu FPLC, omijając pompę filtrującą i mieszalnik FPLC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment najpierw w oprogramowaniu MALS, klikając przycisk Uruchom, a następnie w oprogramowaniu FPLC. Dane będą zbierane po otrzymaniu sygnału impulsowego z instrumentu FPLC za pośrednictwem detektora MALS.</li>
	<li>Zastosuj te same parametry przebiegu i instrukcje opisane w krokach 4.1–4.4, jeśli IEX-MALS jest wykonywany ręcznie w trybie ciągłego przepływu, a nie metodą autonomiczną.</li>
	<li>Po zweryfikowaniu i uruchomieniu końcowej metody należy wykonać dokładnie tę samą metodę, używając ślepej próby (ładowanie bufora zamiast próbki). Ważne jest, aby czas między impulsem automatycznego wstrzykiwania a gradientem ślepej próby był identyczny jak w przypadku serii próbki.</li>
</ol>
5. Analiza danych eksperymentalnych IEX-MALS
<ol>
	<li>Wykonaj analizę krok po kroku w sekcji Procedura w oprogramowaniu MALS. W widoku Kolekcja podstawowa jest wyświetlana kolekcja danych pierwotnych eksperymentu.
	<ol>
		<li>Użyj zakładki Despiking, aby wygładzić chromatogramy, jeśli wykazują one dużo szumu. Zwykle używaj normalnego poziomu.</li>
		<li>Zdefiniuj linię bazową dla wszystkich sygnałów (wszystkich detektorów LS, UV i RI) w widoku Linia bazowa.</li>
		<li>Zdefiniuj szczyty do analizy w widoku Szczyty. Sprawdź prawidłowe wartości dn/dc i współczynnika ekstynkcji UV dla białka pod każdym pikiem. 
		UWAGA: W przypadku białek zwykle stosuje się standardową wartość przyrostu RI wynoszącą 0,185 ml / g, ale w przypadku innych makrocząsteczek należy stosować różne wartości dn / dc, w zależności od charakteru cząsteczki. Średnia dn/dc polinukleotydów (DNA/RNA) wynosi 0,17 ml/g19, podczas gdy sacharydy, takie jak sacharoza, mają średnią wartość dn/dc 0,145 ml/g20, a wartości dn/dc lipidów i detergentów wahają się między 0,1–0,16 mL/g21.</li>
		<li>Analizuj masę molową i promień za pomocą parametrów dopasowania i funkcji korelacji pod Masą molową i promieniem z LS i Rh z widoków QELS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sygnał RI zmienia się znacznie podczas pracy IEX-MALS ze względu na wzrost stężenia soli. W związku z tym należy odjąć sygnał linii bazowej od ślepej próby w przypadku obliczeń masy, które wymagają danych RI.
	<ol>
		<li>Otwórz zarówno eksperymenty białkowe, jak i ślepe próby IEX-MALS. Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę eksperymentu białkowego, wybierz opcję Zastosuj metodę i wybierz folder Odejmowanie linii bazowej z okna dialogowego pliku. Wybierz odpowiedni typ metody (np. online) dla standardowej analizy masy molowej. Należy pamiętać, że parametry i ustawienia zdefiniowane dla eksperymentu białkowego zostaną zapisane w nowo otwartej metodzie.</li>
		<li>W widoku Odejmowanie linii bazowej kliknij przycisk Importuj puste miejsce, aby zaimportować sygnały pustego przebiegu. W obszarze Instrumenty (obok przycisku Importuj puste miejsce) zaznacz wszystkie detektory, które chcesz odjąć.</li>
		<li>W widoku Piki dostosuj wartości dn/dc (jeśli to konieczne) ze względu na przewodność roztworu w obszarze piku białka, ponieważ RI roztworu zmienia się podczas przebiegu12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skalibruj system IEX-MALS za pomocą monomeru BSA. 
	UWAGA: Zwykle system IEX-MALS jest okresowo kalibrowany pod kątem wyrównania pików, poszerzenia pasma i normalizacji detektorów kątowych do detektora 90° przy użyciu białka monodyspersyjnego o promieniu bezwładności (Rg) <10 nm, takiego jak monomer BSA. W tym przykładzie BSA służy zarówno jako cząsteczka kalibracyjna, jak i sama jest przedmiotem analizy masy molowej.
	<ol>
		<li>Wyrównaj szczyty w widoku Procedury > Konfiguracja.</li>
		<li>Wykonaj normalizację w widoku Normalizacja, wprowadzając 3,0 nm jako wartość Rg.</li>
		<li>W obszarze Poszerzanie pasma na tej samej karcie Konfiguracja wybierz szczyt i dopasuj sygnały UV i LS do sygnału RI, używając przycisku Wykonaj dopasowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykres wyników jest wyświetlany w widoku Dopasowanie wyników. Zmień skale osi i inne parametry wykresu, klikając wykres prawym przyciskiem myszy, wybierając opcję Edytuj, a następnie klikając przycisk Zaawansowane. Wykres z większą liczbą opcji wyświetlania jest również dostępny w zakładce Wykres EASI: wybierz Masa molowa z menu rozwijanego Wyświetlanie w górnej części okna.</li>
	<li>Należy pamiętać, że wszystkie wyniki, w tym masa molowa, promień, poziom czystości i inne, są dostępne w widoku Raport (podsumowaniu lub szczegółowym) w sekcji Wyniki. Użyj przycisku Projektant raportów, aby dodać więcej wyników lub parametrów, a także liczb do raportu.</li>
</ol>

<ol><li>Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Trip+Adviser+guide+to+the+protein+science+world%3A+a+proposal+to+improve+the+awareness+concerning+the+quality+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins.</a> BMC Research Notes. 7, 585(2014).</li>
<li>Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assessment+and+optimization+of+purified+protein+samples%3A+why+and+how%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how.</a> Microbial Cell Factories. 13, 180(2014).</li>
<li>Oliveira, C., Domingues, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+to+reach+high-quality+purified+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).</li>
<li>Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+evaluate+the+conformation+of+protein+products%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Tools to evaluate the conformation of protein products.</a> Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+light+scattering+measurement+in+the+biological+and+biopharmaceutical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences.</a> Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).</li>
<li>Sahin, E., Roberts, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Exclusion+Chromatography+with+Multi-angle+Light+Scattering+for+Elucidating+Protein+Aggregation+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms.</a> Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).</li>
<li>Ogawa, T., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+analyses+of+protein+dynamics+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multiple analyses of protein dynamics in solution.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).</li>
<li>Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Protein+Conjugate+Using+an+Asymmetrical-Flow+Field-Flow+Fractionation+and+a+Size-Exclusion+Chromatography+with+Multi-Detection+System%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System.</a> Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).</li>
<li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Monoclonal Antibodies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li>
<li>Hintersteiner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+heterogeneity%3A+Basic+antibody+charge+variants+with+increased+binding+to+Fc+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors.</a> mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).</li>
<li>Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycation+of+antibodies%3A+Modification%2C+methods+and+potential+effects+on+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions.</a> mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).</li>
<li>Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+Multi+Angle+Light+Scattering+to+Ion+Exchange+chromatography+%28IEX-MALS%29+for+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6907(2018).</li>
<li>Goyon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+size+exclusion+chromatography+columns+packed+with+sub-3%CE%BCm+particles+for+the+analysis+of+biopharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).</li>
<li>Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -L., Guillarme, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+chromatography+for+the+characterization+of+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+the+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+phase+selection+for+the+high-performance+ion-exchange+chromatography+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins.</a> Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).</li>
<li>Lebendiker, M., Danieli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+prone-to-aggregate+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Production of prone-to-aggregate proteins.</a> FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).</li>
<li>Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening+methodology+for+purifying+proteins+with+aggregation+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems.</a> Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).</li>
<li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+refractometry+using+field-based+light+scattering+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy.</a> Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).</li>
<li>Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+and+Light+Scattering+Studies+on+Ribosome+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles.</a> Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).</li>
<li>Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Detergent+Organization+around+Aquaporin-0+Using+Small-Angle+X-ray+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).</li>
<li>Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+analytical+method+for+evaluating+bovine+serum+albumin+concentrations+in+pharmaceutical+polymeric+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).</li>
<li>Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+arginine+on+multimodal+anion+exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).</li>
<li>Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+afifavidin+reveals+common+features+of+molecular+assemblage+in+the+bacterial+dimeric+avidins%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins.</a> The FEBS Journal. , (2018).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Particle+Content+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+Serotype+8+Vectors+by+Ion-Exchange+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).</li>
<li>Patel, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-angle+light+scattering+as+a+process+analytical+technology+measuring+real-time+molecular+weight+for+downstream+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control.</a> mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).</li>
</ol>

D.S. jest pracownikiem firmy Wyatt Technology Corporation, której produkty są wykorzystywane w tym protokole. A.T. jest pracownikiem firmy Danyel Biotech, dystrybutora instrumentów Wyatt i ÄKTA.

IEX-MALS to potężna metoda separacji i charakterystyki białek, która umożliwia dokładne oznaczanie masy molowej czystych białek, a także próbek niejednorodnych, charakteryzując natywne oligomery, nienatywne agregaty, kowalencyjne i niekowalencyjne kompleksy oraz białka sprzężone. Program składający się z gradientu liniowego lub serii kroków koncentracji soli może osiągnąć dobrą separację populacji białek i umożliwić właściwą analizę każdego pojedynczego piku przez MALS. Dalsza optymalizacja poprzez zmianę różnych parametrów, takich jak nachylenie gradientu (patrz krok 3.4 protokołu), może być przeprowadzona, jeśli wymagana jest lepsza rozdzielczość. IEX-MALS może być cennym testem kontroli jakości białka, ponieważ zapewnia dodatkowy, krytyczny poziom charakterystyki białka, uzupełniający inne metody, takie jak SEC-MALS.
Chociaż SEC-MALS jest standardową i powszechną techniką oznaczania masy molowej białek, stosunkowo niska rozdzielczość standardowych analitycznych kolumn SEC może ograniczać dokładne pomiary masy molowej osiągane przez MALS12. Niektóre przykłady ograniczeń SEC-MALS obejmują roztwory zawierające kolejne oligomery, wysokie poziomy agregacji, które nie są w pełni oddzielone od piku monomeru, oraz niejednorodne populacje o podobnych masach molowych, takie jak zmodyfikowane białka.
IEX jest bardziej złożoną metodą chromatograficzną do zaprojektowania i przeprowadzenia niż SEC, ale informacje uzyskane z eksperymentu IEX-MALS mogą uzupełniać, a czasem być nawet bardziej pouczające niż analiza SEC-MALS. W ramach projektu IEX-MALS udało się scharakteryzować warianty przeciwciał, które mają tę samą masę molową, oligomery, które nie są całkowicie oddzielone na SEC, oraz krótkie peptydy, które są trudne do analizy przez SEC12,24. Również zespoły makromolekularne, które są zbyt duże, aby można je było rozdzielić za pomocą SEC, takie jak pełne (zawierające wirusowe DNA) i puste cząstki wirusa związanego z adenowirusem (AAV), mogą być rozwiązane przez IEX25 przed analizą MALS. W porównaniu z SEC, IEX oferuje bardziej zróżnicowane możliwości separacji14 i ma elastyczność w dostosowywaniu kilku parametrów w celu zwiększenia rozdzielczości szczytowej, takich jak pH buforu, rodzaje soli, rodzaje i długość kolumny i inne. W przeciwieństwie do SEC, nie ma ograniczeń objętościowych dla wstrzykiwania próbki w IEX, a każda cząsteczka może być analizowana niezależnie od jej wielkości (patrz Tabela 1 w Amartely i wsp.12). Jest to ogromna zaleta IEX-MALS, głównie w przypadku próbek o niskiej intensywności LS, takich jak bardzo małe białka lub rozcieńczone białka z tendencją do agregacji po zagęszczeniu. Ponieważ kolumny analityczne IEX są bardziej stabilne i mają tendencję do uwalniania mniejszej liczby cząstek niż kolumny SEC, IEX-MALS wymaga bardzo krótkiego czasu równowagi, a sygnały LS są stabilizowane bardzo szybko. Pozwala to na przeprowadzenie poszczególnych eksperymentów zgodnie z opisem w niniejszym protokole i zatrzymanie przebiegu w razie potrzeby.
W przeciwieństwie do SEC, który zwykle zapewnia dokładne wyniki za pomocą tylko jednego eksperymentu (przy użyciu kolumny o odpowiednim zakresie frakcjonowania), IEX może wymagać kilku eksperymentów w celu osiągnięcia optymalnej rozdzielczości poprzez dostrojenie parametrów metody. W eksperymentach IEX-MALS, które są wykonywane z gradientem soli, przewodność buforu, a co za tym idzie, RI dramatycznie zmienia się podczas przebiegu, co w konsekwencji prowadzi do zmian sygnału RI. Wymaga to przeprowadzenia dodatkowej ślepej próby dla każdego doświadczenia IEX-MALS oraz analizy z odejmowaniem linii podstawowej (zgodnie z opisem w kroku 5.2 protokołu), chyba że analiza stężenia ogranicza się do wykrywania promieniowania UV (co wymaga wiedzy a priori na temat współczynników ekstynkcji dla każdego piku). Analiza z odejmowaniem linii bazowej jest solidna dla gradientów liniowych, mimo że dalszy rozwój metody jest nadal wymagany do pomyślnego odejmowania linii bazowej w programach krokowych soli. Wartości dn/dc każdego piku należy dostosować do właściwej przewodności buforowej na eluowanym piku (obliczenia można znaleźć w literaturze12). Jeśli białko jest eluowane przy stężeniu NaCl niższym niż 200 mM (jak w przykładzie BSA), dostosowanie to jest nieistotne.
Stosunkowo duża ilość białka użytego w IEX-MALS (jak opisano w kroku 2.3 protokołu) w porównaniu z SEC-MALS jest ważna dla przezwyciężenia dramatycznej zmiany sygnału RI spowodowanej gradientem soli i wahaniami RI spowodowanymi niedoskonałym mieszaniem gradientu. Jeśli do pomiaru masy używana jest tylko detekcja UV, można użyć mniejszych ilości. Ilość białka do wstrzyknięcia zależy od masy molowej białka, jednorodności, czystości i współczynnika ekstynkcji UV. Niezbędna masa wstrzyknięta powinna być wyższa dla mniejszych białek i niższa dla większych białek (~1 mg dla białka 20 kDa i ~0,2 mg dla białka 150 kDa). Próbki niejednorodne wymagają wstrzyknięcia większej próbki, ponieważ ilość jest dzielona między kilka populacji. Analityczna wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) może wymagać mniejszej ilości materiału niż system FPLC.
Ostatnio doniesiono o analizie in-line z wykorzystaniem MALS podczas procedur oczyszczania. Taka analiza w czasie rzeczywistym jest bardzo skuteczna w wykrywaniu produktów agregacji, które zachodzą podczas oczyszczania i może wyeliminować potrzebę dalszej analizy białka po oczyszczeniu26. Chromatografia IEX jest często stosowana jako pośredni etap oczyszczania; w związku z tym połączenie preparatywnych kolumn IEX z MALS może być przydatne nie tylko jako metoda charakterystyki analitycznej, ale także jako analiza w czasie rzeczywistym procedur oczyszczania na dużą skalę. Nieanalityczne kolumny IEX są również stabilne, o niskim stopniu uwalniania cząstek, dlatego mogą być używane z MALS. Inne techniki rozdzielania, takie jak chromatografia powinowactwa lub chromatografia z wymianą hydrofobową, mogą być również łączone z MALS po poddaniu ich stosunkowo czystym próbkom (w celu uniknięcia zanieczyszczenia detektorów MALS i RI). Będzie to wymagało adaptacji i optymalizacji metody w celu uzyskania nie tylko dobrej separacji pików, ale także wystarczająco czystych sygnałów LS i RI do udanej analizy MALS.

Ilościowa charakterystyka produktów białkowych jest coraz bardziej istotna jako środek kontroli jakości (QC), zarówno dla celów regulacyjnych w przemyśle biofarmaceutycznym, jak i dla zagwarantowania wiarygodności i integralności badań w dziedzinie nauk przyrodniczych1,2. Jak opisano na stronach internetowych sieci białkowych Partnerstwo na rzecz Produkcji i Oczyszczania Białek w Europie (P4EU) oraz Stowarzyszenie Zasobów Badań Biofizycznych w Europie i Biofizyki Molekularnej w Europie (ARBRE-MOBIEU) (odpowiednio https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs i https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control), kontrola jakości białka musi charakteryzować nie tylko czystość produktu końcowego, ale także jego stan oligomeryczny, jednorodność, tożsamość, konformację, struktura, modyfikacje potranslacyjne i inne właściwości3,4.
Jedną z najczęstszych metod charakteryzacji QC jest SEC-MALS. W tej metodzie analityczna kolumna SEC jest sprzężona z MALS oraz detektorami spektrofotometrycznymi i refraktometrycznymi, co umożliwia dokładne pomiary masy molowej białka każdego piku5. SEC-MALS określa masę molową eluowanych pików niezależnie od objętości elucji i przezwycięża niedokładność analitycznego SEC za pomocą kalibracji kolumnowej. Dodanie modułu dynamicznego rozpraszania światła (DLS) zwiększa możliwości pomiaru rozmiaru, umożliwiając określenie promienia hydrodynamicznego. W badaniach akademickich SEC-MALS jest zwykle używany do określania stanu oligomerycznego białka, jego konformacji, poziomu czystości, poziomu agregacji i zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny lub rozpuszczalne w tłuszczach białka błonowe (określanie masy molowej białka i sprzęganie składników indywidualnie)6,7,8.
W wielu przypadkach końcowe białko procesu oczyszczania nie jest dobrze zdefiniowanym gatunkiem molekularnym, ale raczej zawiera pewną niejednorodność. Białka w takiej mieszaninie mogą być zróżnicowane pod względem budowy (na przykład różnych form oligomerycznych), konformacji lub izoform białek. Niejednorodność białek może być również wynikiem niewielkich różnic chemicznych spowodowanych C-końcowym przetwarzaniem lizyny lub deaminacją asparaginy/glutaminy, co prowadzi do zmienności ładunku9,10. Różnice w modyfikacjach potranslacyjnych, takich jak glikozylacja, mogą również prowadzić do niejednorodnych próbek z różnicami ładunku9. Te różne rodzaje niejednorodności znajdują odzwierciedlenie w cechach biofizycznych białka i mogą wpływać na stabilność i aktywność biologiczną docelowego białka11.
Wiarygodne testy kontroli jakości takich niejednorodnych próbek wymagają wysoce precyzyjnej techniki analitycznego rozdzielania. Istnieją przypadki, w których osiągnięcie dobrej separacji za pomocą analitycznych kolumn SEC może być trudne ze względu na ich ograniczoną rozdzielczość i możliwości separacji12, co skutkuje wadliwą analizą SEC-MALS. Połączenie techniki separacji o wysokiej specyficzności, takiej jak IEX, z MALS może przezwyciężyć ograniczenia SEC-MALS w próbkach heterogenicznych i zapewnić komplementarną metodę charakterystyki białek (Tabela 1 w Amartely et al.12). W przeciwieństwie do SEC, który rozdziela makrocząsteczki według ich rozmiaru hydrodynamicznego13, IEX rozdziela makrocząsteczki według ich ładunku powierzchniowego14. Macierze wymiany anionowej (AIEX) i kationowymienności (CIEX) wiążą odpowiednio warianty naładowane ujemnie i dodatnio. Dzięki dokładnemu oddzieleniu między populacjami białek, które mają stosunkowo zbliżoną masę lub kształt, IEX-MALS z powodzeniem określa masę molową każdego pojedynczego stanu białka w próbce mieszaniny12.
Tutaj prezentujemy standardowy protokół przeprowadzania eksperymentu IEX-MALS w celu separacji i analizy oligomerycznych form BSA, które występują w tej samej próbce. Wybór kolumny IEX dla konkretnego białka jest ważny i omówiony, podobnie jak warunki pH i przewodności. Krok po kroku opisano również analizę danych doświadczalnych IEX-MALS. Chociaż separacja oligomerów BSA jest dobra i wystarczająca w SEC-MALS, BSA jest dobrym przykładem do pokazania możliwości IEX-MALS i zademonstrowania optymalizacji eksperymentu. Przykłady słabej separacji osiągniętej przez SEC-MALS oraz prawidłowej separacji i analizy możliwej przez IEX-MALS omówiono w poprzednim badaniu12.

<table><tbody><tr><td>&Auml; KTA pure</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-26</td><td>FPLC&nbsp;</td></tr><tr><td>0,02 &mikro; m Filtr Anotop Whatman 10 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-1002</td><td>Filtr próbek</td></tr><tr><td>0,1 i mikro; m Filtr Anotop Whatman 10 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-1012</td><td>Filtr próbek</td></tr><tr><td>0,1 i mikro; m Filtr Anotop Whatman 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-2012</td><td>Mobilny filtr fazowy</td></tr><tr><td>BSA (czystość >97%)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A1900</td><td>Albumina surowicy bydlęcej</td></tr><tr><td>miniDAWN TREOS&nbsp;</td><td>Wyatt Technology</td><td>WTREOS</td><td>MALS</td></tr><tr><td>mono Q HR 5/50 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>Kolumna analityczna z anionowymiennikiem</td></tr><tr><td>Optilab T-rEX</td><td>Wyatt Technology</td><td>WTREX</td><td>Refraktometr</td></tr><tr><td>0,1 mm PES 1000 mL Stericup</td><td>Millipore</td><td>SCVPU11RE</td><td>Ruchomy filtr fazowy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71382</td><td>Klasa HPLC NaCl</td></tr><tr><td>TRISMA baza</td><td>Sigma&nbsp;</td>Bufor <td>T-1503</td><td>TRIS</td></tr></tbody></table>

chromatografia jonowymienna (iex) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła (mals) w celu separacji i charakterystyki białek

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Chromatografia jonowymienna z wielokątowym rozpraszaniem światła (IEX-MALS) to skuteczna metoda separacji i charakterystyki białek. Połączenie techniki separacji o wysokiej specyficzności IEX z dokładną analizą masy molowej uzyskaną przez MALS pozwala na scharakteryzowanie niejednorodnych próbek białek, w tym mieszanin form oligomerycznych lub populacji białek, nawet o bardzo podobnych masach molowych. W związku z tym IEX-MALS zapewnia dodatkowy poziom charakterystyki białek i jest komplementarny ze standardową techniką chromatografii wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS).
Tutaj opisujemy protokół podstawowego eksperymentu IEX-MALS i demonstrujemy tę metodę na albuminie surowicy bydlęcej (BSA). IEX rozdziela BSA na jego formy oligomeryczne, umożliwiając analizę masy molowej każdej pojedynczej formy za pomocą MALS. Na BSA przedstawiono również i zademonstrowano optymalizację eksperymentu IEX-MALS, która pozwoliła uzyskać doskonałą separację między monomerami BSA a większymi oligomerami. IEX-MALS jest cenną techniką oceny jakości białka, ponieważ umożliwia zarówno dokładną separację, jak i określenie masy molowej wielu gatunków białek występujących w próbce.

BSA to powszechnie stosowane białko używane w chromatografii do kalibracji układu eksperymentalnego2, które bardzo dobrze nadaje się do ćwiczeń z technik IEX-MALS, jak i SEC-MALS. Jest ono głównie monomerem o teoretycznej masie monomeru 6.7 kDa i zazwyczaj zawiera niewielką liczbę dimerów oraz wyższych oligomerów23.
BSA przeanalizowano za pomocą IEX-MALS, wykorzystując analityczną kolumnę do wymiany anionowej (patrz Tabela materiałów). Szeroki gradient liniowy składający się z 30 CV od 75 mM do 350 mM NaCl oddzielił monomery BSA od wyższych oligomerów. Analiza MALS przeprowadzona w dalszym etapie pozwoliła na obliczenie masy molowej monomeru wynoszącej 6,8 ± 0,7 kDa oraz masy molowej dimeru wynoszącej 130 ± 5 kDa (Rysunek 1A).
Na podstawie przewodności buforu w momentach elucji pików, gradient zmieniono na inny program: długi stopień 175 mM NaCl, a następnie gradient liniowy od 175 mM do 50 mM NaCl. Nowy gradient znacząco poprawił rozdzielczość i zapewnił doskonałą separację między monomerem BSA (o obliczonej masie molowej 6,1 ± 0,7 kDa) a jego wyższymi gatunkami oligomerycznymi (o obliczonej średniej masie 132 ± 2 kDa) (Rysunek 1B). Aby skupić się również na wysokich gatunkach oligomerycznych i obliczyć masy molowe każdej poszczególnej formy oligomerycznej BSA, zastosowano program stopniowy z użyciem 20 mM i 250 mM NaCl. Eksperyment ten doprowadził do doskonałej separacji między monomerem BSA (o obliczonej masie 62,4 ± 0,4 kDa), dimerem (o obliczonej masie 130 ± 10 kDa) a trimerem (o obliczonej masie 170 ± 10 kDa) (Rysunek 1C). Wszystkie eksperymenty IEX-MALS wykazują, że BSA eluje głównie jako monomer z czystością 80%, co jest zgodne z wynikami SEC-MALS, w których monomery BSA eluują z czystością 85%12.
<img alt="Wykres chromatografii żelowej przedstawiający objętość elucji białek, masę molową oraz dane dotyczące intensywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59408/59408fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Optymalizacja eksperymentu IEX-MALS dla BSA. (A) eksperyment IEX-MALS BSA z programem gradientu 75–350 mM NaCl. (B) Eksperyment IEX-MALS dla BSA z programem obejmującym skok do 175 mM NaCl, a następnie program z gradientem liniowym od 175 do 500 mM NaCl. (C) eksperyment IEX-MALS dla BSA z programem skokowym 20 mM i 250 mM NaCl. Chromatogramy przedstawiają sygnał UV przy 280 nm (kolor niebieski), rozpraszanie światła przy a 90° kąt (czerwony), a także krzywe współczynnika refrakcji (różowa) i przewodnictwa (szara) wraz z masą molową każdego piku obliczoną metodą MALS (czarna). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59408/59408fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje użycie chromatografii jonowymiennej o wysokiej specyficzności z wielokątowym rozpraszaniem światła do dokładnego wyznaczania masy molowej białek, kompleksów białkowych i peptydów w heterogenicznej próbce. Metoda ta jest cenna dla oceny jakości, a także dla scharakteryzowania natywnych oligomerów, wariantów ładunku i próbek białek mieszanych.

Chromatografia jonowymienna (IEX) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła (MALS) w celu separacji i charakterystyki białek

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Protokół ten przedstawia jonowymienne MALs, nowatorską metodę kontroli i charakterystyki jakości białek, kontrolę jakości, która jest niezbędna dla spójności i integralności wyników badań w naukach przyrodniczych i rozwoju produktów farmaceutycznych. Jonowymienny MALS określa czystość białka, stan oligomeryczny, jednorodność, tożsamość, konformację, strukturę, modyfikacje po translacji i inne właściwości. Pomiary są nieniszczące i są wykonywane w roztworze w warunkach zbliżonych do fizjologicznych warunków buforowych.Metoda ta dokładnie określa masę molową białek lub peptydów, stan oligomeryczny oraz stopień koniugacji, na przykład glikoprotein. Może być również stosowany do białek błonowych. IEX rozdziela makrocząsteczki według ich ładunku powierzchniowego.Macierze wymiany anionowej, AIEX i kationowymienności, CIEX, wiążą odpowiednio warianty naładowane ujemnie i dodatnio. Dzięki dokładnemu oddzieleniu między populacjami białek, które mają stosunkowo zbliżoną masę lub kształt, IEX-MALS z powodzeniem określa masę molową każdego pojedynczego stanu białka w próbce mieszaniny. Na początek użyj filtra 0,1 mikrometra, aby przefiltrować wszystkie odczynniki, w tym płuczące i elucyjne.Przefiltruj pierwsze 50 do 100 mililitrów buforu do butelki na odpady, aby wyeliminować cząstki stałe z suchych filtrów. W czystej, sterylnej butelce, która została dokładnie umyta przefiltrowaną wodą i zakryta, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu, przefiltruj pozostałą część buforu. Za pomocą buforu Tris o pH osiemowym i 50-milimolowym chlorku sodu rozcieńczyć próbkę BSA do sześciu miligramów na mililitr, aby pH i siła jonowa umożliwiły wiązanie się z kolumną jonowymienną.Użyj strzykawki, aby wstrzyknąć co najmniej 0,3 do 0,5 miligrama BSA do jednomililitrowej kolumny, aby uzyskać dobrej jakości analizę MALS. Aby rozpocząć eksperyment MALS z wymianą jonową, otwórz Nowy, Eksperyment z metody w oprogramowaniu MALS i wybierz metodę online z folderu metod systemu rozpraszania światła. Jeśli moduł DLS jest dostępny i dane DLS mają zostać pobrane, wybierz metodę online z podfolderu Rozpraszanie światła, z QELS.Aby ustawić parametry, w sekcji Konfiguracja najpierw ustaw natężenie przepływu pracy w sekcji Pompa ogólna na natężenie przepływu używane w FPLC jako 1,5 mililitra na minutę. W sekcji Solvent (Rozpuszczalnik) wprowadź lub sprawdź parametry buforu. W sekcji Wtryskiwacz wprowadź nazwę białka jako BSA, przyrost współczynnika załamania światła jako 0,185 mililitra na gram, a współczynnik ekstynkcji UV przy długości fali 280 nanometrów jako 0,66 litra na gram na centymetr.Na karcie Próbka wprowadź stężenie próbki białka jako sześć miligramów na mililitr, a następnie wprowadź objętość próbki do wstrzykiwań również jako 170 mikrolitrów. W sekcji Procedury na karcie Kolekcja podstawowa zaznacz pole wyboru Wyzwalaj przy automatycznym wstrzykiwaniu i ustaw czas trwania przebiegu na 70 mililitrów, aby zbieranie danych było kontynuowane przez co najmniej pięć minut po osiągnięciu przez nachylenie wartości końcowej. Następnie w oprogramowaniu FPLC utwórz nowy eksperyment w zakładce Edytor metod.W początkowym eksperymencie utwórz liniowy gradient soli lub pH, natomiast w przypadku metody zoptymalizowanej utwórz bardziej szczegółowy gradient lub program krokowy zgodnie z rękopisem. Dołącz sygnał impulsowy do metody, który uruchomi zbieranie danych w oprogramowaniu MALS. Następnie otwórz zawór pompy i przemyj 0,5-molowym wodorotlenkiem sodu w celu usunięcia silnie związanych zanieczyszczeń, a następnie przepłucz buforem neutralizującym.Następnie przepłukać kolumnę buforem Tris o pH osiem, zaworem A buforem myjącym, a zaworem B buforem elucyjnym. Użyć buforu płuczącego o niskim stężeniu soli jako końcowego przemywania do przepłukania kolumny, aby umożliwić związanie białka z matrycą kolumny. Przed wstrzyknięciem próbki, po przemyciu i na końcu elucji, linia podstawowa rozpraszająca światło musi być ustabilizowana, aby zapewnić niski poziom hałasu i całkowicie czyste rozcieńczenie.Za pomocą strzykawki umieść próbkę białka w pętli. Rozpocznij eksperyment najpierw w oprogramowaniu MALS, klikając przycisk Uruchom, a następnie w oprogramowaniu FPLC. Dane będą zbierane po otrzymaniu sygnału impulsowego z instrumentu FPLC za pośrednictwem detektora MALS.Jeśli jonowymienność MALS jest wykonywana ręcznie w trybie przepływu ciągłego, a nie metodą samodzielną, należy zastosować te same parametry przebiegu i instrukcje, jak opisano wcześniej. Po zweryfikowaniu i uruchomieniu końcowej metody należy wykonać dokładnie tę samą metodę, używając ślepej próby, ładując bufor zamiast próbki. Ważne jest, aby czas między impulsem automatycznego wstrzykiwania a gradientem ślepej próby był identyczny jak w przypadku serii próbki.Aby rozpocząć analizę, w sekcji Procedury w oprogramowaniu MALS, użyj zakładki Despiking i poziomu Normalny, aby wygładzić chromatogramy. Jeśli emitują dużo hałasu, ustaw poziom na Ciężki. W widoku Linia bazowa zdefiniuj linię bazową dla wszystkich sygnałów, w tym detektorów LS, UV i RI.W widoku Szczyty zdefiniuj szczyty do analizy. Sprawdź poprawność wartości przyrostu RI dn/dc i współczynnika ekstynkcji UV dla białka pod każdym pikiem. W widoku Masa molowa i promień od rozpraszania światła przeanalizuj masę molową i promień przy użyciu modelu Zimm i dopasuj stopień zerowy.Jeśli QELS jest dostępny, w widoku Rh z QUELS obserwuj wartości Rh i jakość dopasowania funkcji korelacji. Sygnał RI zmienia się znacząco podczas przebiegu wymiany jonowej MALS ze względu na wzrost stężenia soli. Aby odjąć sygnał wyjściowy od ślepej próby, otwórz zarówno eksperymenty MALS z białkiem, jak i ślepą jonowymiennością.Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę eksperymentu białkowego, wybierz opcję Zastosuj metodę i wybierz folder Odejmowanie linii bazowej z okna dialogowego pliku. Wybierz metodę online do standardowej analizy masy molowej. W widoku Odejmowanie linii bazowej kliknij przycisk Importuj puste miejsce, aby zaimportować sygnały pustego przebiegu.W obszarze Przyrządy sprawdź wszystkie detektory, które chcesz odjąć. Aby skalibrować system wymiany jonowej MALS za pomocą monomeru BSA, w widoku Procedury i konfiguracja wyrównaj piki. W widoku Normalizacja wprowadź 3,0 nanometr jako wartość Rg, aby przeprowadzić normalizację.Następnie, w obszarze Poszerzanie pasma na tej samej karcie Konfiguracja, wybierz szczyt i użyj przycisku Wykonaj dopasowanie, aby dopasować sygnały UV i LS do sygnału RI. Wykres wyników jest wyświetlany w widoku Dopasowanie wyników. Zmień skale osi i inne parametry wykresu, klikając wykres prawym przyciskiem myszy, wybierając opcję Edytuj, a następnie klikając przycisk Zaawansowane.Aby mieć więcej opcji wyświetlania, wybierz kartę Wykres EASI, a następnie w górnej części okna z menu rozwijanego Wyświetlanie wybierz Masa molowa lub Wilgotność względna Q. Wszystkie wyniki, w tym masa molowa, promień, poziom czystości i inne, są dostępne w widoku Raport w sekcji Wyniki. Użyj przycisku Projektant raportów, aby dodać więcej wyników lub parametrów, a także liczb do raportu. W tym eksperymencie BSA analizowano na jonowymiennych MALS przy użyciu kolumny analitycznej anionitów.Chromatogramy pokazywały UV na 280 nanometrach, rozpraszanie światła pod kątem 90 stopni, współczynnik załamania światła i krzywe przewodności wraz z masą molową każdego piku. Szeroki gradient liniowy składający się z 30 objętości kolumn od 75-milimolowych do 350-milimolowych chlorku sodu oddzielił monomery BSA od dimerów i wyższych oligomerów. Dalsza analiza MALS wykazała, że obliczona masa molowa monomeru wynosi 66,8 kilodaltonów, a obliczona masa molowa dimera wynosi 130 kilodaltonów.Opierając się na przewodności buforowej w eluowanych pikach, gradient został zmieniony na inny program, długi krok 175-milimolowego chlorku sodu, a następnie gradient liniowy od 175-milimolowego do 500-milimolowego chlorku sodu. Nowy gradient znacznie poprawił rozdzielczość i zapewnił doskonałą separację między monomerem BSA a gatunkami o wyższej oligomerii. Zastosowano stopniowy program 200-milimolowego i 250-milimolowego chlorku sodu, aby skupić się również na gatunkach o wysokiej oligomeryce.Doprowadziło to do doskonałej separacji między monomerem, dimerem i trimerem BSA. Zgodnie z tą procedurą, metody takie jak spektrometria mas, SDS-PAGE i testy stabilności mogą być przeprowadzone na każdym wariancie oddzielonym wymianą jonową w celu zidentyfikowania i dalszego scharakteryzowania każdego z nich. Odkryliśmy, że jonowymienny MALS rozszerza moc analizy MALS na próbki, które nie mogą być w pełni przeanalizowane przez SEC-MALS.Separacja przez ładunek rozdziela odrębne gatunki, które koeluują w SEC.

ion-exchange-chromatography-iex-coupled-to-multi-angle-light

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii anionowo-wymiennej do oczyszczania ludzkiego białka wiążącego wapń S100A12 na podstawie ładunku powierzchniowego netto białka z hodowli Escherichia coli.

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii anionowej: technika rozdzielania mająca na celu wyizolowanie białka będącego przedmiotem zainteresowania z dializowanego lizatu bakteryjnego na podstawie ładunku netto

Ten film demonstruje technikę chromatografii kationowymiennej do izolowania rekombinowanego białka z lizatu białka komórki owada.

Chromatografia kationowymienna: technika izolowania docelowego białka rekombinowanego z lizatu komórek owadów na podstawie ładunku powierzchniowego netto

Ten film opisuje SEC-MALS, który wykorzystuje możliwości chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) i wielokątowego rozpraszania światła (MALS). W SEC-MALS SEC-MALS SEC rozdziela białka lub kompleksy białkowe na podstawie ich wielkości, a detektor MALS określa średnią masę cząsteczkową, mierząc intensywność światła rozproszonego przez cząsteczkę pod różnymi kątami.

Chromatografia wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła dla oligomerów białkowych

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Określenie struktury roztworu białka za pomocą rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) wymaga próbek monodyspersyjnych. W tym miejscu przedstawiamy dwie możliwości zapewnienia minimalnych opóźnień między przygotowaniem próbki a akwizycją danych: chromatografia wykluczania wielkości online (SEC) i chromatografia jonowymienna online (IEC).

Wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej SAXS

Ten protokół opisuje połączenie chromatografii wykluczającej rozmiar z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) dla absolutnej charakterystyki białek i kompleksów w roztworze. SEC-MALS określa masę cząsteczkową i wielkość czystych białek, natywnych oligomerów, heterokompleksów i zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny.

Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS)

Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Poznaj chromatografię jonowymienną sprzężoną z MALS do analizy białek i peptydów. Ta metoda pozwala precyzyjnie określić masę molową, stan oligomeryczny i czystość próbek w warunkach fizjologicznych.

Chromatografia jonowymienna (IEX) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła (MALS) w celu separacji i charakterystyki białek (Wideo) | JoVE Journal

Chromatografia jonowymienna (IEX) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła (MALS) w celu separacji i charakterystyki białek

Przeglądaj więcej filmów