Name: Perfuzja ex vivo łożyska gryzonia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Poznaj technikę perfuzji ex vivo łożyska gryzonia do oceny transferu ksenobiotyków i leków przez barierę łożyskową. Metoda umożliwia badanie fizjologii łożyska oraz mechanizmów przenikania substancji do płodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Environmental Health Sciences (R00-ES024783), Rutgers Center for Environmental Exposures and Disease (P30-ES005022) oraz Rutgers Joint Graduate Program in Toxicology (T32-ES007148). Chcielibyśmy również podziękować dr Michaelowi Goedkenowi, Marianne Polunas i Pedro Louro za ich wiedzę techniczną oraz dr Adamowi Goodwillowi za pomoc w zaprojektowaniu naszego schematu perfuzji (<silna klasa="xfig">Rysunek 5).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Rutgers.
1. Przygotowanie przed eksperymentem
UWAGA: Te kroki mogą być wykonane w ciągu kilku dni/tygodni przed eksperymentem.
<ol>
	<li>Zmodyfikuj komorę naczynia. 
	UWAGA: <silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B pokazuje zmodyfikowaną komorę pojedynczego naczynia.
	<ol>
		<li>Przesuń czujnik termistora spod zacisku i zegnij go tak, aby swobodnie zwisał w kąpieli perfuzyjnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Zamontuj dwie 4-calowe igły ze stali nierdzewnej z końcówką ze standardowymi piastami połączeniowymi typu luer, jedną 25 G i jedną 23 G zabezpieczoną pod zaciskiem termistora i dodaj 3-kierunkowy kran odcinający, aby umożliwić kaniulację naczynia pępowinowego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1B). 
		UWAGA: Złącza luer o różnych rozmiarach są oznaczone kolorami. Ułatwia to identyfikację naczyń w trakcie i po eksperymencie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj dwie szklane mikropipety o średnicy 70−100 μm. Aby uzyskać więcej informacji na temat tych procedur, zapoznaj się z poniższymi źródłami10,11. 
	UWAGA: Średnica końcówki powszechnie stosowana w tych eksperymentach mieści się w zakresie 70−100 μm. Średnice końcówek większe niż ten zakres mogą utrudniać proces kaniulacji, podczas gdy średnice końcówki mniejsze niż 60 μm mogą przebić ścianę naczyniową podczas kaniulacji.</li>
	<li>Opaski należy przygotować ze sterylnego szwu nylonowego (na bliższy i dalszy koniec tętnicy macicznej) oraz z czarnego plecionego jedwabnego szwu niejałowego (na naczynia pępowinowe). Wykonaj pojedyncze wiązania przez zapętlenie szwu, aby zainicjować kwadratowy węzeł lub zawiązać but, jak opisano wcześniej11. 
	UWAGA: Pojedyncze krawaty są zwykle wykonywane i przechowywane na szalce Petriego wypełnionej niewielką warstwą gumy silikonowej, aby pomóc w pracy na lepkim tle.</li>
	<li>Przygotować 2 l roztworu soli fizjologicznej (PSS) zawierającego w mmol/l 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2PO4, 0,83MgSO4, 19 NaHCO3, 1,8 CaCl2 i 5,5 glukozy. Dostosować pH do 7,40 ± 0,02, powoli dodając kilka kropli kwasu (1 M kwasu solnego) lub zasady (1 N wodorotlenek sodu) do roztworu i odczekać co najmniej 20 s przed odczytaniem dostosowanego pomiaru pH. Przechowuj PSS w lodówce do momentu przygotowania do użycia, aby zmniejszyć zanieczyszczenie, ale nie przechowuj dłużej niż 2 tygodnie.</li>
	<li>Oznaczyć probówki do mikrowirówek do zbierania ścieków "matczynych" i "płodowych" w każdym punkcie czasowym, tj. "MBaseline, M10, M20, ..." do punktu czasowego 180 min. Przygotuj to samo dla ścieków płodowych (FBaseline, M10, M20, ....).</li>
	<li>Skalibruj wszystkie urządzenia używane w systemie, w tym temperaturę kąpieli krążącej i ciśnieniomierze krwi związane z utrzymaniem ciśnienia perfuzjatu w macicy (80 mmHg) i pępowinie (50 mmHg).</li>
	<li>Przygotuj komorę preparacyjną (4 cale średnicy x 1 cala głębokości) lub krążące naczynie grzewcze, wypełniając warstwę (< 0,25") gumy silikonowej. Ta modyfikacja musi być wykonana z wyprzedzeniem, ponieważ wyschnięcie gumy zajmie 12−24 godziny. 
	UWAGA: Dla początkujących chirurgów zaleca się stosowanie grzałki recyrkulacyjnej/naczynia chłodzącego, ponieważ naczynie nie będzie się poruszać, a tkanka będzie utrzymywać stałą temperaturę.</li>
</ol>
2. Przygotowanie stanowiska chirurgicznego i wyrównanie sprzętu
<ol>
	<li>Włącz wszystkie urządzenia, które obsługują system perfuzyjny, aby sprawdzić, czy działa prawidłowo. Wyjmij PSS z lodówki i ogrzej do temperatury pokojowej. PSS będzie używany zarówno jako perfuzat, jak i superfusat.</li>
	<li>Umieść mały bulgoczący kamień, aby dostarczyć mieszaninę gazów do zbiornika superfuzatu. Powszechnie stosowane mieszaniny obejmują 21%O2, 8%O2, 3% O2 i 0%O2. Włącz gaz, aby dostarczyć małe pęcherzyki do roztworu superbezpiecznika. Dostosuj dopływ gazu, aby uniknąć rozpryskiwania.</li>
	<li>Zorganizuj stację preparacyjną dla zwierząt, sprawdzając znieczulenie, organizując sprzęt chirurgiczny i przygotowując opaski do szwów. Przygotuj komorę sekcyjną, zbierając szpilki preparacyjne, włączając agregat chłodniczy (lub pobierając lód) i napełniając komorę sekcyjną (wyłożoną gumowym silikonem) zimnym PSS.</li>
	<li>Delikatnie napełnij wszystkie komory, igły, szklane mikropipety, rurki i zbiorniki podgrzanym PSS, uważnie obserwując i eliminując pęcherzyki powietrza, odsysając je pipetą do przenoszenia z cienką końcówką. Przekręć wszystkie 3-drogowe zawory odcinające z napisem "off" skierowanym w kierunku pipety, aby zabezpieczyć płyn w pipecie.</li>
	<li>Umieść pojedynczy krawat na każdej z dwóch szklanych mikropipet przygotowanych do kaniulacji macicy oraz na dwóch końcówkach igieł przeznaczonych do kaniulacji pępowinowej. Przymocuj wiązania do pipet i igieł z końcówką, aby zapobiec ich zgubieniu podczas ruchów komory (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
</ol>
3. Pobieranie łożysk
<ol>
	<li>Znieczulenie ciężarnej samicy szczura w 20 dniu ciąży 5% izofluranem przez około 4 minuty lub do momentu, gdy zwierzę zacznie oddychać z trudem. Przenieś zwierzę do stożka nosowego i podaj 2,5%-3% izofluranu, aby utrzymać znieczulenie. Potwierdzić utratę przytomności przez brak odruchu szczypania palców u stóp. 
	UWAGA: Wykorzystanie szczura w 20 dniu ciąży jest przedstawione w tym protokole. Jednak protokół pozostaje taki sam, jeśli warunki eksperymentalne wymagają, aby ocena łożyska odbyła się wcześniej w ciąży.</li>
	<li>Zidentyfikuj i wyizoluj wybrany róg macicy (prawy lub lewy), wyjmując i rozkładając go na zewnątrz tuszy szczura. Za pomocą plecionego jedwabnego szwu zwiąż tętnicę maciczną na końcu jajnika i pochwowym końcu rogu. Uwzględnij jajnik wewnątrz szwu z rogiem macicy.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych wytnij róg macicy, wykonując nacięcia po bliższej stronie krawata jajnika i dystalnej stronie krawata pochwowego, pozostawiając róg macicy związany szwami na obu końcach. Przenieś róg macicy do naczynia preparacyjnego wyłożonego gumą silikonową i wypełnionego zimnym (4°C) PSS. Niezależnie od tego, czy wybrano prawy czy lewy róg, utrzymuj tę samą stronę do selekcji w każdym eksperymencie dla spójności. 
	UWAGA: W celu znieczulenia płodu szczenięta są trzymane w lodowatym PSS. Dlatego temperatura PSS w komorze preparacyjnej jest utrzymywana przez schłodzoną kąpiel obiegową lub komora preparcyjna powinna być utrzymywana na lodzie. 
	UWAGA: W tym momencie znieczulona zapora może zostać poddana eutanazji zgodnie z laboratoryjnym zatwierdzeniem protokołu IACUC. W tym przypadku eutanazja następuje poprzez odmę opłucnową (poprzez przecięcie przepony) i usunięcie serca matki.</li>
	<li>Delikatnie wepchnij szpilkę preparacyjną przez róg macicy w gumę silikonową, stroną jajnika po lewej stronie, a stroną pochwy po prawej, aby uwidocznić unaczynienie macicy. Ustabilizuje to macicę i zapobiegnie przemieszczaniu się tkanki podczas preparacji przedziału płodowego. Wybierz jednostkę matczyno-łożyskowo-płodową centralną dla rogu i podwiąż tętnicę maciczną i żyłę za pomocą nożyczek chirurgicznych. Przeciąć mięsień macicy proksymalny i dystalny do wybranego łożyska i płodu. Mięsień macicy można cofnąć, pociągając go na bok; Ważne jest, aby pozostawić go nienaruszonym, ale odciągnąć go od zakrywania pupy płodu. 
	UWAGA: Wybór jednostki matczyno-łożyskowo-płodowej powinien opierać się na długości odcinka tętnicy macicznej po obu stronach tętnicy łukowatej. Dłuższe segmenty pozwolą na bardziej udaną kaniulację.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek usuń błonę owodniową z powierzchni płodu łożyska, uważając, aby ominąć pępowinę.</li>
	<li>Rozplątać i podwiązać pępowinę, aby oddzielić pępowinę.</li>
	<li>Zidentyfikuj tętnicę pępowinową (grubsze naczynie) i żyłę (cieńsze naczynie). Oznacz żyłę pępowinową w celu łatwej identyfikacji, przecinając ją nieco krótszą niż tętnica pępowinowa.</li>
	<li>Delikatnie oddziel tętnicę pępowinową i żyłę od siebie.</li>
	<li>Cała jednostka łożyskowa, w tym unaczynienie macicy, mięsień macicy, łożysko i pępowina, może zostać przecięta i usunięta. </li>
</ol>
4. Perfuzja łożyskowa
<ol>
	<li>Utrzymuj anatomiczny przepływ krwi, zachowując prawidłową dystalną i proksymalną orientację tętnicy macicznej, umieść jednostkę łożyskową (składającą się z unaczynienia macicy, mięśnia macicy, łożyska i pępowiny) w zmodyfikowanej izolowanej komorze naczynia wypełnionej ciepłym, natlenionym PSS.</li>
	<li>Używając pary cienkich kleszczyków w każdej ręce, nałóż proksymalny i dystalny koniec tętnicy macicznej na szklane mikropipety.</li>
	<li>Szczelnie zabezpiecz tętnicę maciczną za pomocą sterylnej nylonowej opaski do szwów, która była wcześniej przymocowana do mikropipety. 
	UWAGA: Mogą być konieczne dwie pętle (węzeł); Jednak pojedyncza pętelka do wiązania pozwala na większą regulację.</li>
	<li>Wprowadzić kaniulację tętnicy pępowinowej (przepływ krwi od płodu do matki) na igle 23 G (większej) i zabezpieczyć ją czarnym plecionym jedwabnym szwem.</li>
	<li>Wprowadzić żyłę pępowinową (przepływ krwi od matki do płodu) na igle o masie 25 G (mniejszej) i zabezpieczyć ją czarnym plecionym jedwabnym szwem.</li>
	<li>Przenieś się do stacji perfuzji łożyska i zasyp wszystkie kurki i rurki, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Podłącz wszystkie rurki zgodnie z Rysunek 2.</li>
	<li>Umieść małe łódeczki wagowe pod dystalną kaniulacją tętnicy macicznej matki i kaniulacją igłową żyły pępowinowej płodu, aby złapać ścieki, które pojawią się podczas zabiegu.</li>
	<li>Włącz pompę perystaltyczną, regulator ciśnienia i monitor ciśnienia i otwórz zawór odcinający, aby umożliwić przepływ płynu przez rurkę w kierunku przetwornika ciśnienia, ale jeszcze nie do łożyska. Powoli zwiększaj ciśnienie do 80 mm Hg.</li>
	<li>Powoli przekręć kran do łożyska, aby się otworzyło i obserwuj, czy nie ma wycieków wewnątrz komory i wokół opasek. 
	UWAGA: Jeśli pompa perystaltyczna pracuje z dużą prędkością, należy ponownie ocenić proksymalną kaniulację macicy i opaski pod kątem wycieków płynu. W przypadku stwierdzenia wycieków należy je usunąć. Należy również pamiętać, że podczas gdy średnie ciśnienie w tętnicy macicznej pozostanie stałe (ustawione na 80 mmHg), natężenie przepływu płynu może być zmienne w zależności od fizjologicznych reakcji naczyniowych i łożyskowych. Kwantyfikacja przepływu płynu może być zidentyfikowana jako zmienna doświadczalna w odpowiedzi na ekspozycję na ksenobiotyki.</li>
	<li>Przekręć kurek, aby umożliwić przepływ płynu do tętnicy pępowinowej. Ustaw ciśnienie na około 50 mmHg, które można zrealizować za pomocą pompy perystaltycznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3) lub kolumny hydrostatycznej.</li>
	<li>Napełnij wszystkie zbiorniki (maciczny, pępowinowy i superfuzyjny), aby utrzymać objętość płynu przez cały czas trwania eksperymentu. 
	UWAGA: Po rozpoczęciu perfuzji i rozpoczęciu eksperymentu, znieczulone młode pozostające w naczyniu preparacyjnym mogą być oceniane pod kątem żywotności poprzez dotykanie szczeniąt kleszczami w celu wywołania reakcji neurologicznej. Wykrwawienie szczeniąt nastąpi poprzez histerektomię rogu macicy; Dalsza eutanazja może być zakończona za pomocą zatwierdzonych protokołów IACUC. W tym przypadku otwarcie worka owodniowego w zimnym PSS i utworzenie odmy opłucnowej poprzez przecięcie żeber.</li>
</ol>
5. Próbny eksperyment
<ol>
	<li>Po kaniulacji i rozpoczęciu perfuzji PSS pozwól tkankom zrównoważyć się przez 30 minut, aby umożliwić dostosowanie się układu krwionośnego do nowego przepływu płynu. Zassać ścieki za pomocą pipety i zapisać je w odpowiednio oznakowanej probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Po zrównoważeniu ustalić perfuzję wyjściową, zbierając ścieki przez 10 minut z obu łódek wagowych w probówkach do mikrowirówek i mierząc objętość płynu, który wydostaje się przez tętnicę maciczną i żyłę pępowinową.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie próbek w 10-minutowych odstępach czasu, zbierając ścieki z dystalnej tętnicy macicznej i żyły pępowinowej. Na przykład, podaj dawkę bolusa 900 μl nanocząstek polistyrenu znakowanych rodaminą o długości 20 nm (8 x10 14 cząstek/ml) zawieszonych w 0,01% środku powierzchniowo czynnym do linii perfundującej tętnicę maciczną, aby zidentyfikować przejście nanocząstek ksenobiotycznych przez barierę łożyskową. 
	UWAGA: Te próbki ścieków pozwolą na pomiar zanieczyszczeń w płynie (ksenobiotyk, farmakologiczny lub metabolit) i zapewnią szybkość przepływu płynu przez tętnicę maciczną lub przez łożysko i do przedziału płodowego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Po infuzji bolusa należy pobierać próbki z dystalnej tętnicy macicznej i ścieków z żyły pępowinowej płodu co 10 minut, łącznie 180 minut po infuzji.</li>
</ol>
6. Czyszczenie sprzętu
<ol>
	<li>Po każdym eksperymencie wyjmij łożysko z pipet. Wszystkie szwy mogą zostać zachowane w celu ponownego wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Tkanka łożyska może zostać zachowana do dodatkowych badań histologicznych lub mechanistycznych.</li>
	<li>Oczyść wszystkie rurki i kaniule systemu perfuzyjnego 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną i wysusz próżniowo. 
	UWAGA: Jeśli rurki lub pipety zaczną się odbarwiać lub wyglądać na uszkodzone, wymień je przed następnym eksperymentem. Ponadto, po zakończeniu kohorty eksperymentalnej (np. wszystkich badań dotyczących pojedynczego zanieczyszczenia), wymień wszystkie rurki w komorze, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</li>
</ol>

<ol><li>Troen, P., Gordon, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+studies+of+the+human+placenta.+I.+Effect+of+estradiol+and+human+chorionic+gonadotropin+on+citric+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Perfusion studies of the human placenta. I. Effect of estradiol and human chorionic gonadotropin on citric acid metabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 37, 1516-1523 (1958).</li>
<li>Alexander, D. P., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep%3A+the+influence+of+concentration+gradient+upon+the+rates+of+hexose+formation+as+shown+in+umbilical+perfusion+of+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The placental transfer of sugars in the sheep: the influence of concentration gradient upon the rates of hexose formation as shown in umbilical perfusion of the placenta.</a> Journal of Physiology. 129, 367-383 (1955).</li>
<li>Alexander, D. P., Andrews, R. D., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep%3A+studies+with+radioactive+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The placental transfer of sugars in the sheep: studies with radioactive sugar.</a> Journal of Physiology. 129, 352-366 (1955).</li>
<li>Dancis, J., Money, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+sodium+and+iodo-antipyrine+across+guinea+pig+placenta+with+an+in+situ+perfusion+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Transfer of sodium and iodo-antipyrine across guinea pig placenta with an in situ perfusion technique.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 80, 215-220 (1960).</li>
<li>London, W. T., Money, W. L., Rawson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+Transport+of+I-131-Labeled+Thyroxine+and+Triiodothyronine+in+the+Guinea+Pig%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Placental Transport of I-131-Labeled Thyroxine and Triiodothyronine in the Guinea Pig.</a> Endocrinology. 73, 205-209 (1963).</li>
<li>Stulc, J., Stulcova, B., Svihovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+calcium+across+the+dually+perfused+placenta+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transport of calcium across the dually perfused placenta of the rat.</a> Journal of Physiology. 420, 295-311 (1990).</li>
<li>Goeden, N., Bonnin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+perfusion+of+mid-to-late-gestation+mouse+placenta+for+maternal-fetal+interaction+studies+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ex vivo perfusion of mid-to-late-gestation mouse placenta for maternal-fetal interaction studies during pregnancy.</a> Nature Protocols. 8, 66-74 (2013).</li>
<li>Bond, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+perfusion+of+the+fetal+circulation+of+the+in+situ+mouse+placenta%3A+methodology+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Artificial perfusion of the fetal circulation of the in situ mouse placenta: methodology and validation.</a> Placenta. 27, Suppl A, S69-75 (2006).</li>
<li>Illsley, N. P., Fox, H., Van der Veen, F., Chawner, L., Penfold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+placental+ultrastructure+after+in+vitro+dual+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Human placental ultrastructure after in vitro dual perfusion.</a> Placenta. 6, 23-32 (1985).</li>
<li>Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. Isolated, Perfused Microvessels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavis%2C+MJ+%22Clinically+Applied+Microcirculation+Research%22">Clinically Applied Microcirculation Research</a>. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. , 1 ed, CRC Press. Boca Raton. 435-456 (1995).</li>
<li>Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ex+vivo+isolated+skeletal+microvessel+preparation+for+investigation+of+vascular+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The ex vivo isolated skeletal microvessel preparation for investigation of vascular reactivity.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 3674(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ta metoda perfuzji pozwala na szybką ocenę bariery łożyskowej i funkcji fizjologicznej układu naczyniowego macicy i warstwy trofoblastu. Kaniulacja i perfuzja bliższych i dalszych końców tętnicy macicznej matki symuluje fizjologię przepływu krwi matki przez to główne naczynie odpowiedzialne za wysyłanie krwi do rozwijającego się płodu. Metodologia ta pozwala na fizjologiczną ocenę izolowanego układu naczyniowego matki, łożyska i pępowiny, a zatem zmiany w fizjologii można zidentyfikować jako patologię naczyniową; Unerwienie immunologiczne i nerwowe są usuwane w procedurze ex-vivo. Aby zapewnić prawidłową ocenę, bardzo ważne jest, aby starannie kaniulować te naczynia, aby nie tworzyć żadnych rozdarć ani przebić w ściankach naczynia oraz usunąć pęcherzyki powietrza. Zator gazowy może powodować uszkodzenie śródbłonka układu krwionośnego lub blokować naczynia krwionośne. Utrzymując połączenia naczyniowe między macicą, łożyskiem i płodem podczas sekcji, można zaobserwować ocenę płynu i translokacji do płodu. Po podaniu ksenobiotyku, w tym przypadku polistyrenu o długości fali 20 nm, kinetyka do dystalnego końca tętnicy macicznej i przez łożysko do przedziału płodowego może być oceniana poprzez analizę ścieków w czasie 180 minut.
Chociaż opisano model podwójnej perfuzji, a w tym artykule monitorowano transfer cząstek i płynu z przedziału matki do przedziału płodowego, oceny można również dokonywać w odwrotnej kolejności od przedziału płodowego do matczynego. Jednym z ograniczeń opisanej tutaj metody jest to, że dystalna żyła macicy nie została kaniulowana ani pobrana próbki. W przyszłych badaniach, zwłaszcza tych skoncentrowanych na transferze z płodu na matkę, ważne będzie kaniulowanie i pobieranie próbek z dystalnego naczynia macicy. Ścieki pobrane z tego próbnego eksperymentu wykorzystano do oceny transferu ksenobiotyków; Można jednak przeprowadzić szeroki zakres ocen dotyczących endokrynologicznych i molekularnych funkcji łożyska lub żywienia płodu.
Mocne strony tego protokołu znacznie przewyższają jego drobne ograniczenia. Preparat zachowuje fizjologiczną strukturę i integralność całego narządu w celu oceny warunków doświadczalnych. Perfuzja łożyska ex vivo jest naukowym postępem od komórkowego badania in vitro do narażenia całych zwierząt w celu prawidłowego określenia oceny ryzyka reprodukcyjnego. Można to uznać za cenną technikę w badaniach oceniających rozkład leków farmakologicznych łożyskowych, farmakokinetykę, toksykologię, fizjologię i medycynę matczyno-płodową.

Zachowując strukturę morfologiczną i fizjologiczną reaktywność, perfuzja narządów stała się akceptowanym podejściem systemowym lub tkankowym do analizy funkcji metabolicznych. Te techniki perfuzji pozwalają na badanie ex vivo reakcji nienaruszonych tkanek na różne bodźce farmakologiczne i mechaniczne. Perfuzja ludzkiego łożyska została po raz pierwszy opisana w 1958 roku w celu zidentyfikowania wpływu hormonów na aktywność metaboliczną cyklu kwasu cytrynowego; Troen i Gordon dostrzegli potrzebę wyjaśnienia aktywności endokrynologicznej przy użyciu nowatorskiego podejścia fizjologicznego1. W tej samej epoce strategie pojedynczej perfuzji (od matki do płodu lub od płodu do matki) zostały opisane w modelach zwierzęcych large2,3 i small4, aby zrozumieć przenoszenie cukrów, soli i leków antypirynowych przez łożysko. Opisano techniki podwójnej perfuzji in vivo i ex vivo (skoordynowana perfuzja matki i płodu) w celu dokładniejszego scharakteryzowania transferu łożyskowego przy użyciu metodologii in vivo5 i ex vivo6,7,8. Postęp technologiczny w transmisyjnej i skaningowej mikroskopii elektronowej pozwolił naukowcom zweryfikować strukturalną i funkcjonalną integralność ludzkich tkanek łożyska po perfuzji9.
Podczas gdy perfuzja ludzkich tkanek łożyskowych i pojedynczego liścienia jest najbardziej istotna, szybki rozwój środków farmakologicznych i zanieczyszczeń środowiskowych wymaga użycia zwierzęcego modelu perfuzji do wczesnego badania przesiewowego transferu ksenobiotyków przez barierę łożyskową. Ta metoda perfuzji łożyska pozwala na ocenę transferu przez barierę łożyskową przy użyciu łatwiej dostępnego i fizjologicznie istotnego łożyska szczura. Ponadto przepływ płynu przez barierę łożyskową przez pewien czas po ekspozycji można ocenić, mierząc objętość perfuzatu pochodzącego z tętnicy pępowinowej. Ze względu na to, że umożliwia perfuzję łożyskową zarówno z krążenia matczynego, jak i płodowego, to podejście z podwójnym przepływem całego narządu może być korzystne w porównaniu z obecnymi metodami in vitro i in vivo. Metoda ta pozwala na pomiar podawania ksenobiotyku przez aspekt matczyny na podstawie perfuzatu, który wyłania się przez łożysko przez żyłę pępowinową lub odwrotnie. Przedstawiony tutaj protokół będzie opisywał transfer polistyrenu o długości fali 20 nm (powszechnego nanoplastiku stosowanego w żywności i produktach medycznych) z tętnicy macicznej matki do przedziału płodowego i związane z tym zmniejszenie przepływu płynu przez łożysko, aby zilustrować zastosowanie tej metody w wielu warunkach fizjologicznych, farmakologicznych i toksykologicznych w celu oceny transferu łożyska, metabolizm i zmiany fizjologiczne wpływające na przepływ matki i/lub płodu.

<table><tbody><tr><td>pleciony jedwab niewchłanialny szew chirurgiczny niesterylny</td><td>Specjalizacje chirurgiczne Wygląd</td><td>AACO805</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>FST firmy Dumont Szwajcaria</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>FST firmy Dumont Szwajcaria</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Szklane opakowanie kaniuli</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych (LSI)</td><td>GCP-75-100</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Polipropylenowa probówka z podziałką 2,0 ml z pokrywką blokującą MIESZANE</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-299</td><td></td></tr><tr><td>Nieząbkowane, drobno zakrzywione, mikro zaciski zębatkowe</td><td>InterFocus</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>ISMATEC</td><td>ISM795C</td><td></td></tr><tr><td>Monitor ciśnienia</td><td>Tryb Oprzyrządowania systemów żywych (LSI)</td> <td>PM-4</td><td></td></tr><tr><td>Samonagrzewająca się komora</td> <td>pojedynczego naczyniaOprzyrządowanie systemów żywych (LSI)</td><td>CH-1</td><td></td></tr><tr><td>Serwopompa</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych (LSI)</td><td>ModelPS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>igła ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23</td><td>Component Supply Co.</td><td>04651-01</td><td></td></tr><tr><td>igła ze stali nierdzewnej o grubości 25 Component</td><td>Supply Co.</td><td>07116-01</td><td></td></tr><tr><td>STERYLNY szew nylonowy</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>T04A00N07-13</td><td></td></tr><tr><td>Zasób sedacji</td><td>kurka</td><td>6-205-04</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych (LSI)</td> <td>Model TC-09S</td><td></td></tr></tbody></table>

perfuzja ex vivo łożyska gryzonia

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Łożysko jest kluczowym organem podczas ciąży, który służy jako bariera dla ekspozycji płodu na ksenobiotyki i pośredniczy w wymianie składników odżywczych na odpady. Opisano tutaj test perfuzji izolowanego łożyska szczura i oceny translokacji ksenobiotyków z matki na płód ex vivo. Ponadto za pomocą tej metodologii można przeprowadzić ocenę procesów fizjologicznych, takich jak przepływ płynu do płodu i metabolizm łożyska. Technika ta jest odpowiednia do oceny kinetyki kandydatów farmaceutycznych lub zanieczyszczeń środowiskowych od matki do płodu. W przeciwieństwie do obecnych alternatywnych podejść, metodologia ta pozwala na ocenę izolowanego układu naczyniowego matki i płodu, z usuniętym ogólnoustrojowym zajęciem neuronalnym lub immunologicznym, co pozwala na przypisanie wszelkich zaobserwowanych zmian w funkcjach fizjologicznych czynnikom lokalnym w izolowanej tkance.

Rysunek 5 przedstawia eksperymenty sprawdzające zasadę działania z wykorzystaniem barwnika błękitu Evansa, co pozwoliło nam przetestować system oraz zwizualizować prawidłowe funkcjonowanie bariery płynnej i łożyskowej oraz zapobiec przeniesieniu substancji do przedziału płodowego. Barwnik błękitu Evansa dotarł do tkanki łożyska w tym systemie i ją perfundował (Rysunek 5A). Dalsza analiza wykazała, że błękit Evansa nie przedostał się do żylnej części pępowiny płodu (Rysunek 5B), co jest oczekiwanym rezultatem, ponieważ błękit Evansa wiąże się z albuminami.
Rysunek 6 przedstawia dane z eksperymentu kontrolnego opisanego w niniejszym protokole. Próbki odpływu z dystalnego końca tętnicy macicznej oraz z żyły pępowinowej płodu pobierano w każdym 10-minutowym przedziale czasowym, aby ocenić przepływ płynu w czasie po podaniu dawki bolusa do macicznej tętnicy matki (Rysunek 6). Stwierdzono zmniejszenie transferu płynu do przedziału płodowego w ciągu 10 minut po infuzji polistyrenu. Aby ilościowo określić transfer polistyrenu do przedziału płodowego w czasie jego występowania, 25 µL perfuzowanego płynu z każdego punktu czasowego naniesiono w duplikacie na płytkę 96-dołkową w celu pomiaru fluorescencji próbki. Fluorescencję określono za pomocą odczytu spektroskopowego przy 546/575 nm (ex/em) z wykorzystaniem mikroczytnika płytek fluorescencyjnych. Transfer polistyrenu do przedziału płodowego nastąpił w ciągu 10 minut, osiągnął szczyt w 20 minucie i trwał przez 90 minut (Rysunek 6B).
Podzbiór perfundowanych tkanek łożyska zachowano do badań histopatologicznych i ocen morfologicznych. Tkanki utrwalono w formalinie, zabarwiono hematoksyliną i eozyną, a następnie poddano analizie certyfikowany patolog weterynaryjny. Eksperci nie zidentyfikowali żadnych nieprawidłowości strukturalnych w łożyskach perfundowanych wyłącznie roztworem PSS lub roztworem PSS z dawką bolus polistyrenu znakowanego rodaminą.
<img alt="Układ do mikroiniekcji; schemat; proces dostarczania białka; wyposażenie obejmuje strzykawkę, szklaną igłę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zmodyfikowana komora z jednym naczyniem. (A) Przegląd zmodyfikowanej komory. (B) Powiększony obraz igieł o tępym czubku zamocowanych w komorze naczynia. Czerwona strzałka wskazuje klips termistora, który został zmodyfikowany tak, aby utrzymywać igły na miejscu podczas kaniulacji pępowiny. (C) Reprezentatywny obraz czterech kaniul przygotowanych do kaniulacji tkanki. Czerwone strzałki wskazują każdą z czterech kaniul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu dializy; pokazuje drogę przepływu płynu i zawory w procesie separacji molekularnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Powiększony widok komory do perfuzji łożyska. (A) Przedstawia dren podłączony do przetwornika ciśnienia i kaniulowany w proksymalnej macicznej tętnicy matki, czyli „wpływ”. Ciśnienie jest ustawione na stałą wartość 80 mmHg zgodnie z literaturą. (B) Przedstawia port odpływowy komory dla superfuzatu otaczającego tkankę łożyska podczas perfuzji. (C) Przedstawia wlot superfuzatu do komory w celu obmywania łożyska ogrzanym PSS podczas perfuzji. (D) Przedstawia dystalny port maciczny matki, w którym można zbierać effluent z perfuzji macicy. (E) Przedstawia port temperatury, gdzie komora naczyniowa może zostać podłączona do termometru i grzałki w celu utrzymania stałej temperatury przez cały czas trwania eksperymentu. (F) Przedstawia kaniulację tętnicy pępowinowej. Tętnica pępowinowa jest poddawana ciśnieniu 50 mmHg, aby umożliwić przepływ przeciwprądowy na poziomie łożyska. (G) Przedstawia zbiór effluentu z żyły pępowinowej. Płyn przepływający w kierunku przedziału płodowego podczas perfuzji będzie tu zbierany. (H) Jest to centrum systemu perfuzyjnego, w którym łożysko jest kaniulowane i utrzymywane przez cały proces perfuzji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja systemu chromatografii; mikroskop, pompy; oczyszczanie białek; rozmieszczenie sprzętu laboratoryjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Widok systemu perfuzji łożyskowej. (A i B) System kontroli ciśnienia używany do monitorowania i utrzymywania ciśnienia 80 mmHg perfuzatu w tętnicy macicznej. (C) Element odpowiedzialny za termoregulację komory perfuzyjnej. (D) Mikroskop. (E) Komora perfuzyjna. (F) Zestaw do perfuzji tętnicy pępowinowej zasilany grawitacyjnie, ustawiony na 50 mmHg. (G) Pompa perystaltyczna używana do napełniania i odprowadzania superfuzatu łożyskowego PSS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat perfuzji łożyska przedstawiający przepływ i ciśnienie w tętnicy macicznej dla układu pobierania próbek do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Schemat systemu perfuzji łożyska. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment z sekcji biologicznej; zestaw chirurgiczny, próbka tkanki i system podawania płynów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy eksperymentów dowodzących zasady działania z użyciem barwnika błękitu Evansa. (A i B) Dowód zasady działania, zgodnie z którym błękit Evansa perfunduje naczynia krwionośne macicy, mięsień macicy i łożysko, ale nie przekracza bariery łożyskowej ze względu na wiązanie z albuminą. Zielona strzałka wskazuje niebieski drenaż żylny z łożyska z powrotem do krążenia matki. Czerwona strzałka wskazuje odpływ z żyły pępowinowej w kierunku przedziału płodowego. Należy zwrócić uwagę na brak niebieskiego barwnika. (C) Reprezentatywny obraz zbierania odpływu z żyły pępowinowej. Czerwona strzałka wskazuje formowanie się kropli przed pobraniem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres porównawczy fluorescencji matczynej i płodowej, analiza intensywności fluorescencji w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Dane pochodzące z eksperymentu pozorowanego. Pomiary fluorescencji nanomateriałów polistyrenowych znakowanych rodaminą, znormalizowane do fluorescencji bazowej, przeprowadzone poprzez pobranie treści (A) tętnicy macicznej oraz (B) żyły pępkowej płodu. Średnia fluorescencja znormalizowana do wartości bazowej ± błąd standardowy (SE). *: p &lt; 0.05 oraz T: p &lt; 0.1 na podstawie analizy wariancji (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj przedstawiono protokół perfuzji naczyniowej ex vivo matczyno-płodowej, który umożliwia podanie artykułu testowego do układu naczyniowego matki i ocenę transferu przez łożysko cząsteczek ksenobiotycznych lub środków farmakologicznych oprócz zmian w fizjologii łożyska.

Perfuzja ex vivo łożyska gryzonia

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Skuteczne zastosowanie tych technik pozwoli na ocenę kinetyczną prób farmakologicznych lub przejście zanieczyszczeń ksenobiotycznych przez nienaruszone morfologicznie łożysko. Technika perfuzji łożyska u gryzoni pozwala na większą przepustowość badań farmakologicznych lub toksykologicznych, ponieważ wiele związków może być ocenianych przy użyciu tkanki jednej matki. Technikę zademonstruje Jeanine D'Errico, starsza doktorantka z mojego laboratorium.Przed rozpoczęciem zabiegu delikatnie napełnij wszystkie komory, igły, szklane mikropipety, rurki i zbiorniki podgrzanym roztworem soli fizjologicznej lub PSS, w razie potrzeby ostrożnie usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą pipety transferowej z cienką końcówką. Przekręć wszystkie trójdrożne zawory odcinające do pozycji wyłączonej, aby zabezpieczyć płyn w pipetach. Umieść pojedynczy krawat na każdej z dwóch szklanych mikropipet przygotowanych do kaniulacji macicy oraz na dwóch końcówkach igieł przeznaczonych do kaniulacji pępowinowej.Następnie zabezpiecz opaski, aby zapobiec zgubieniu się podczas ruchów komory. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej samicy ciężarnej szczura w 20. dniu ciąży, podnieś jeden róg macicy z brzucha i rozłóż róg wzdłuż na zewnątrz zwierzęcia. Użyj plecionych jedwabnych szwów, aby związać tętnicę maciczną na końcach pochwy i jajnika rogu, w tym jajnika wewnątrz szwu z rogiem macicy.Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcia po bliższej stronie krawata jajnika i po dystalnej stronie krawata pochwy. Przenieś róg macicy do naczynia preparacyjnego wyłożonego gumą silikonową i wypełnionego zimnym PSS. Trzymając jajnik po lewej stronie, a stronę pochwy po prawej, delikatnie wepchnij szpilkę preparacyjną przez róg macicy w gumę silikonową, aby ustabilizować macicę.Wybierz łożysko matki, jednostkę płodową centralnie przylegającą do rogu. Za pomocą cienkich kleszczyków i nożyczek usuń błonę owodniową z powierzchni płodu łożyska, uważając, aby ominąć pępowinę. Rozplątać i podwiązać pępowinę, aby oddzielić pępowinę.Po zidentyfikowaniu tętnicy pępowinowej i żyły delikatnie oddziel i podwiąż naczynia pępowinowe. Następnie przeciąć żyłę pępowinową nieco krótszą niż tętnica pępowinowa dla ułatwienia identyfikacji. I podwiązać tętnicę maciczną i żyłę nożyczkami chirurgicznymi.Utrzymując prawidłową orientację anatomicznego przepływu krwi w tętnicy macicznej, umieść jednostkę łożyskową w zmodyfikowanej izolowanej komorze naczynia wypełnionej ciepłym natlenionym PSS pod mikroskopem preparacyjnym. Używając jednej pary cienkich kleszczyków w każdej ręce, nałóż proksymalny i dystalny koniec tętnicy macicznej na szklane mikropipety. Szczelnie zabezpiecz tętnicę umieszczonym wcześniej sterylnym nylonowym szwem.Umieść tętnicę pępowinową na igle o rozmiarze 23. Następnie kaniulować i zabezpieczyć żyłę pępowinową na igle o rozmiarze 25 i zasypać wszystkie krany i rurki, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Pamiętaj, aby sprawdzić wszystkie zawory odcinające, kaniule i rurki pod kątem pęcherzyków powietrza, ponieważ bolus powietrzny w systemie doprowadzi do niepokoju komórkowego i wyeliminuje przepływ przeciwprądu w łożysku.Podłącz wszystkie rurki zgodnie z rysunkiem. Umieść małe łódeczki pod dystalną kaniulacją tętnicy macicznej matki i pod kaniulacją igłową żyły pępowinowej płodu, aby złapać ścieki, które pojawią się w trakcie zabiegu. Przygotuj płytkę zbiorczą dla ścieków do późniejszej analizy.Otwórz kurek, aby umożliwić przepływ płynu przez rurkę w kierunku łożyska i włącz pompę perystaltyczną, kontrolę ciśnienia i monitor ciśnienia. Powoli zwiększaj ciśnienie do 80 milimetrów słupa rtęci odczytanego na monitorze ciśnienia. Powoli otwórz zawór odcinający, aby umożliwić przepływ płynu do tętnicy macicznej.Napełnij wszystkie zbiorniki, aby utrzymać objętość płynu przez cały czas trwania eksperymentu. Po zrównoważeniu tkanek przez 30 minut, aby umożliwić naczyniu dostosowanie się do nowego przepływu płynu, ustal podstawową perfuzję, zbierając ścieki przez 10 minut z obu łodzi wagowych. Zmierz objętość płynu, który wydostaje się przez tętnicę maciczną i żyłę pępowinową.Pod koniec wyjściowego okresu pobierania należy podać eksperymentalne leczenie do tętnicy macicznej. Następnie pobieraj próbki z dystalnej tętnicy macicznej i ścieków z żyły pępowinowej płodu co 10 minut, w sumie 180 minut po infuzji. Zmierz zanieczyszczenia w próbkach płynu.Perfuzja z niebieskim barwnikiem Evansa w celu przetestowania systemu i wizualizacji odpowiedniej funkcji płynu i bariery łożyskowej zapobiegającej przenoszeniu zanieczyszczeń do przedziału płodu ujawnia, że barwnik dotarł i perfundował tkankę łożyska w tym układzie. Po bliższym zbadaniu staje się jasne, że niebieski barwnik Evansa nie dostał się do żyły pępowinowej płodu, czego można się spodziewać, ponieważ niebieski barwnik Evansa jest związany z albuminą. W tym reprezentatywnym eksperymencie stwierdzono zmniejszony transfer płynów do przedziału płodowego w ciągu 10 minut od infuzji polistyrenu.Transfer polistyrenu do przedziału płodowego osiągnął szczyt po 20 minutach i trwał przez 90 minut. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas kaniulacji, jest powolne działanie. Pipety i tkanka są bardzo delikatne i łatwo mogą ulec złamaniu lub rozerwaniu.Poprzez ważenie ścieków, metodologia ta może być wykorzystana do zbadania fizjologii łożyska, a także translokacji materiału.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film opisuje procedurę perfuzji wątroby myszy przez żyłę wrotną za pomocą roztworu kolagenazy przed izolacją komórek wątroby.

Perfuzja wątroby myszy in vivo: metoda podawania roztworu do wątroby gryzoni przez żyłę wrotną

Model podwójnej recyrkulacji ludzkiego łożyska ex vivo może być wykorzystany do zbadania transferu ksenobiotyków i nanocząsteczek przez ludzkie łożysko. W tym protokole wideo opisujemy sprzęt i techniki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia perfuzji łożyska.

Oznaczanie szybkości transportu ksenobiotyków i nanomateriałów przez łożysko przy użyciu modelu perfuzji łożyska człowieka ex vivo

Przedstawiamy szczegółową metodę badania fizjologii łożyska u człowieka in vivo w terminie. Metoda łączy pobieranie próbek krwi z naczyń przychodzących i odpływowych po stronie matczynej i płodowej łożyska z pomiarami ultrasonograficznymi objętości przepływu krwi i pobieraniem próbek tkanki łożyska.

Podejście do pobierania próbek z 4 naczyń w integracyjnych badaniach fizjologii łożyska człowieka in vivo

Opisujemy system, który wykorzystuje trzy metody do oceny bezpieczeństwa i skuteczności dostarczania leków ukierunkowanych na łożysko: obrazowanie in vivo do monitorowania akumulacji nanocząstek, ultradźwięki o wysokiej częstotliwości do monitorowania rozwoju łożyska i płodu oraz HPLC do ilościowego określania dostarczania leków do tkanek.

Kompleksowa ocena skuteczności i bezpieczeństwa podawania leków ukierunkowanych na łożysko przy użyciu trzech uzupełniających się metod

Protokół jest opisany dla perfuzji in situ dolnej części ciała myszy, w tym pęcherza, prostaty, narządów płciowych, kości, mięśni i skóry stóp.

Ustalanie in situ perfuzji w obiegu zamkniętym dolnych narządów jamy brzusznej i kończyn tylnych u myszy

Tutaj opisujemy metodę efektywnego manipulowania krytycznymi ścieżkami rozwojowymi w łożysku myszy in vivo. Odbywa się to poprzez wstrzyknięcie i elektroporację plazmidów CRISPR do łożysk ciężarnych matek w 12,5 dniu embrionalnym.

Mysz In Vivo Ukierunkowana manipulacja CRISPR

Tutaj prezentujemy protokół oceny heterotopowo wszczepionego serca po normotermicznym zachowaniu ex situ w modelu szczurzym.

Szczurzy model normomicznego heterotopowego przeszczepu serca z perfuzją ex-situ

Dla mysich wątrob stworzono normotermiczny system perfuzji wątroby ex vivo (NEVLP). System ten wymaga doświadczenia w mikrochirurgii, ale pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników perfuzji. Możliwość wykorzystania wątroby myszy ułatwia badanie szlaków molekularnych w celu identyfikacji nowych dodatków perfuzatu i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów skoncentrowanych na naprawie narządów.

Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

Przedstawiono protokół do oceny, czy małe EV (sEVs) wyizolowane z eksplantatów łożyskowych hodowanych w warunkach niedotlenienia (modelując jeden aspekt stanu przedrzucawkowego) naruszają barierę krew-mózg u dorosłych samic myszy niebędących w ciąży.

Przerwanie mysiej bariery krew-mózg przez małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z niedotlenionych ludzkich łożysk

Oto protokół hodowli eksplantatów łożyskowych w warunkach stałego przepływu. Podejście to wzmacnia tradycyjne statyczne systemy hodowli kosmków, umożliwiając replikację dynamicznych środowisk fizjologicznych.

Ex vivo Hodowla eksplantatów łożyskowych - naśladowanie dynamicznych warunków w macicy

Protokół ten opisuje przygotowanie roślin tkanki łożyskowej ludzkich hodowanych na styku powietrze-ciecz do badania infekcji wirusowych.

Ex vivo Hodowla ludzkich implantów łożyskowych do badania transmisji wirusa na styku matka-płod

Poznaj technikę perfuzji ex vivo łożyska gryzonia do oceny transferu ksenobiotyków i leków przez barierę łożyskową. Metoda umożliwia badanie fizjologii łożyska oraz mechanizmów przenikania substancji do płodu.

Perfuzja ex vivo łożyska gryzonia

Przeglądaj więcej filmów