Name: Chromogenna hybrydyzacja in situ jako narzędzie do diagnostyki raka głowy i szyi związanego z HPV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj chromogenną hybrydyzację in situ RNA HPV do wykrywania aktywnych infekcji w nowotworach głowy i szyi. Technika ta wizualizuje ekspresję mRNA E6-E7 HPV z precyzyjną lokalizacją przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Departamentowi Patologii Hopital Européen Georges Pompidou i Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel i Gisèle Legall); platformie Histologicznej PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark za redakcję językową; Alexandra Elbakyan za jej wkład.

Protokół jest zgodny z wytycznymi etycznymi i został zatwierdzony przez Komitet Etyki (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotowanie 1x bufora do płukania
	<ol>
		<li>Przygotuj 3 l 1x buforu do płukania, dodając 2,94 l wody destylowanej i jedną butelkę (60 ml) buforu do płukania (50x) (patrz tabela materiałów) do dużego balonu. Dobrze wymieszaj. 
		UWAGA: Bufor do mycia 1x można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynników do barwienia przeciwbarwiącego
	<ol>
		<li>Przygotuj 50% hematoksyliny.
		<ol>
			<li>W dygestorium dodać 100 ml hematoksyliny Gilla I (patrz tabela materiałów) do 100 ml wody destylowanej w naczyniu barwiącym. 
			UWAGA: 50% roztwór do barwienia hematoksyliny może być ponownie użyty przez okres do 1 tygodnia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować 0,02% (w/v) wody amoniakalnej (odczynnik do niebieszczenia).</li>
		<li>W dygestoriach dodać 1,43 ml wodorotlenku amonu 1 N do 250 ml wody destylowanej w butli miarowej lub innym pojemniku. Uszczelnij cylinder folią parafinową. Dobrze wymieszaj jego zawartość, aby uzyskać 3x–5x. 
		UWAGA: Do oznaczania ilościowego kluczowe znaczenie ma użycie wodorotlenku amonu. Odczynniki mogą być przygotowane z wyprzedzeniem. Upewnij się, że wszystkie pojemniki pozostają przykryte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 1x odczynnika do odzyskiwania celu
	<ol>
		<li>W dużej zlewce dodać 70 ml 10-krotnego odczynnika do odzyskiwania tarczy (patrz tabela materiałów) do 630 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Umieść zlewkę na płycie grzewczej z mieszadłem magnetycznym. Przykryj folią aluminiową.</li>
		<li>Gotować jego zawartość w temperaturze 100 °C przez 10–15 min. 
		UWAGA: Nie pozwól, aby wrze dłużej niż 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Równoważenie odczynników
	<ol>
		<li>Upewnij się, że piekarnik do hybrydyzacji jest włączony i ma temperaturę 40 °C. Umieść mokry papier nawilżający na dnie tacy. 
		UWAGA: Do kroków od 3.4 do 4.2 potrzebny jest piec do hybrydyzacji (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Wyjmij odczynniki do amplifikacji (AMP1–AMP6, patrz tabela materiałów) z lodówki i przechowuj je w temperaturze pokojowej, co najmniej 30 minut przed odpowiednim etapem inkubacji.</li>
		<li>Przed każdym użyciem ogrzewać sondę celowniczą i/lub kontrolną przez co najmniej 10 minut w temperaturze 40 °C w piecu, łaźni wodnej lub inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zwiększenie przyczepności i deparafinizacja w dygestoriach
UWAGA: Rozpocznij protokół od próbek histologicznych o grubości 3-5 μm zamontowanych na niebarwionych szkiełkach.
<ol>
	<li>W celu zwiększenia przyczepności piecz szkiełka w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę lub w temperaturze 40 °C przez noc w piekarniku.</li>
	<li>Naładuj stojak na szkiełka niezabarwionymi szkiełkami histologicznymi. Zanurz ruszt do szkiełka na 5 minut w świeżym ksylenie znajdującym się w naczyniu barwiącym, od czasu do czasu mieszając. Powtórz ze świeżym ksylenem.</li>
	<li>Zanurz ruszt do szkiełków na 3 minuty w świeżym 100% etanolu zawartym w naczyniu barwiącym, stale mieszając. Powtórz ze świeżym 100% etanolem.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 2 minuty w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Nie należy ponownie używać odczynników do deparafinowania do odwadniania szkiełek po teście.</li>
</ol>
3. Wstępne leczenie tkanek
UWAGA: Te kroki są zgodne ze "standardowym" zaleceniem obróbki wstępnej zgodnie z instrukcjami producenta dla próbek głowy i szyi. Czas wykonania sekcji 3.1 i 3.2 może wymagać dostosowania w zależności od manipulowanej tkanki.
<ol>
	<li>Blokada aktywności peroksydazy
	<ol>
		<li>Dodać 4-6 kropli nadtlenku wodoru (patrz tabela materiałów) do każdego szkiełka i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Myj szkiełka 2x przez 2 min w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zerwanie wiązań RNA/tkankowych 
	<ol>
		<li>Za pomocą pazura usunąć folię aluminiową z wrzącego odczynnika do odzyskiwania 1x celu (TTR1x) z sekcji 1.3 i przestać mieszać. Zanurz ruszt na szkiełka powoli i bardzo ostrożnie na 15 minut. Ponownie przykryj zlewkę folią aluminiową. 
		UWAGA: Gotowanie na wolnym ogniu musi trwać na tym etapie. 
		UWAGA: Użyj pazura do manipulowania folią aluminiową i stojakiem na prowadnice, aby uniknąć oparzeń. Upewnij się, że nosisz odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i fartuch laboratoryjny.</li>
		<li>Za pomocą pazura natychmiast przenieś gorący stojak na szkiełka do kąpieli destylowanej i myj go przez 2 min. 
		UWAGA: Upewnij się, że próbki nie ostygną w TTR1x.</li>
		<li>Myj szkiełka w świeżym 100% etanolu przez 2 minuty.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie barier
	<ol>
		<li>Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego (patrz Tabela materiałów) narysuj barierę wokół próbki. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 5 minut. 
		UWAGA: Pozwól, aby bariera naprawdę wyschła. Jeśli zużyje się podczas zabiegu, nie wahaj się go ponownie narysować. Unikać dotykania chusteczki wstrzykiwaczem. W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie proteazy
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka na stojaku na szkiełka i dodaj ~4 krople Protease Plus na próbkę (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Przykryj tackę do kontroli wilgotności pokrywką i włóż ją do pieca do hybrydyzacji na 30 minut w temperaturze 40 °C. 
		UWAGA: Aby zapobiec parowaniu, upewnij się, że pokrętło jest całkowicie obrócone do pozycji zablokowanej.</li>
		<li>Wyjmij blachę z piekarnika i wyjmij ruszt przesuwny.</li>
		<li>Szkiełko po szkiełku szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym wodą destylowaną.</li>
		<li>Myj szkiełka 2x przez 2 min w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej. Ciągle mieszać.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przeprowadzanie testu
UWAGA: Nie pozwól, aby sekcje wyschły pomiędzy etapami inkubacji.
<ol>
	<li>Hybrydyzacja sondy HPV 
	UWAGA: Upewnij się, że sondy są wstępnie ogrzane, aby rozpuścić wszelkie opady przed użyciem. Na tym etapie zamiast sondy HPV można również zastosować izomerazę peptydylo-prolilową B (PPIB) do kontroli pozytywnej lub reduktazę dihydrodipikolinianową (DAPB) do kontroli ujemnej (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Dotknij i/lub przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu i umieść je w stojaku na slajdy. Dodaj ~ 4 krople sondy HPV, aby całkowicie pokryć każdą sekcję.</li>
		<li>Przykryj blachę pokrywką i wstaw do piekarnika na 2 godziny w temperaturze 40 °C. 
		UWAGA: Aby zapobiec parowaniu, upewnij się, że końcówka skrętu jest całkowicie obrócona do pozycji zablokowanej.</li>
		<li>Wyjmij blachę z piekarnika i wyjmij ruszt przesuwny.</li>
		<li>Szkiełko po szkiełku szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym 1x buforem do mycia.</li>
		<li>Myć szkiełka w 1x buforze do mycia przez 2 minuty w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu. Powtórz to ze świeżym buforem do mycia 1x.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja AMP1, AMP2, AMP3 i AMP4 
	UWAGA: Kroki te obejmują hybrydyzację w piecu do hybrydyzacji i AMP1–AMP4 z zakupionego zestawu (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Dotknij i/lub przesuń, aby usunąć nadmiar płynu ze szkiełek i umieścić je w stojaku na slajdy. Dodaj ~4 krople AMP1, aby całkowicie pokryć każdą sekcję.</li>
		<li>Przykryj blachę pokrywką i wstaw do piekarnika na 30 minut w temperaturze 40 °C.</li>
		<li>Wyjmij blachę z piekarnika i wyjmij ruszt przesuwny.</li>
		<li>Szkiełko po szkiełku szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym 1x buforem do mycia.</li>
		<li>Myć szkiełka w 1x buforze do mycia przez 2 minuty w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu. Powtórz to ze świeżym buforem do mycia 1x.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.2.1–4.2.5, ale użyj ~4 kropli AMP2 zamiast AMP1 i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 40 °C. Myj szkiełka 2x przez 2 min, za każdym razem w buforze do świeżego mycia.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.2.1–4.2.5, ale użyj ~4 kropli AMP3 zamiast AMP1 i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 40 °C. Myj szkiełka 2x przez 2 min, za każdym razem w buforze do świeżego mycia.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.2.1–4.2.5, ale użyj ~4 kropli AMP4 zamiast AMP1 i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 40 °C. Myj szkiełka 2x przez 2 min, za każdym razem w buforze do świeżego mycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja AMP5 i AMP6 
	UWAGA: Te kroki nie obejmują hybrydyzacji w piekarniku, ale hybrydyzację w temperaturze pokojowej. AMP5 i AMP6 pochodzą z zakupionego zestawu (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Dotknij i/lub przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu i umieść je w stojaku na slajdy. Dodaj ~4 krople AMP5, aby całkowicie pokryć każdą sekcję.</li>
		<li>Przykryj tacę pokrywką i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Szkiełko po szkiełku, szybko usuń nadmiar płynu i umieść go w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym 1x buforem do mycia.</li>
		<li>Myć szkiełka w 1x buforze do mycia przez 2 minuty w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu. Powtórz to ze świeżym buforem do mycia 1x.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.3.1–4.3.4, ale użyj ~4 kropli AMP6 zamiast AMP5 i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka 2x przez 2 min, za każdym razem w buforze do świeżego mycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Detekcja sygnału za pomocą 3,3'-diaminobenzydyny
UWAGA: Diaminoferydyna (DAB) jest toksyczna. Postępuj zgodnie z odpowiednimi środkami ostrożności i wytycznymi bezpieczeństwa podczas utylizacji i obchodzenia się z tą substancją chemiczną.
<ol>
	<li>Wymieszać równe objętości DAB-A i DAB-B (patrz Tabela Materiałów) w probówce o odpowiedniej wielkości, dozując taką samą liczbę kropli każdego roztworu. Przygotuj ~120 μl substratu DAB na sekcję (~2 krople każdego odczynnika/łącznie 4). Dobrze wymieszaj 3x–5x.</li>
	<li>Wyjmij każde szkiełko, pojedynczo, ze stojaka na szkiełka i dotknij i/lub przesuń, aby usunąć nadmiar płynu przed umieszczeniem go w stojaku na szkiełka.</li>
	<li>Odpipetować ~120 μL DAB na każdy fragment tkanki. Upewnij się, że sekcje są przykryte i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pozostałą część DAB należy zutylizować zgodnie z lokalnymi przepisami i włożyć szkiełko do stojaka na slajdy zanurzonego w naczyniu do barwienia wypełnionym wodą z kranu.</li>
</ol>
6. Przeciwbarwienie
<ol>
	<li>Przenieś ruszt do szkiełka do naczynia barwiącego zawierającego 50% roztworu barwiącego hematoksylinę, pozwól mu odpocząć przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Pamiętaj, że slajdy zmienią kolor na fioletowy.</li>
	<li>Natychmiast przenieś ruszt na szkiełka z powrotem do naczynia do barwienia zawierającego wodę z kranu i umyj szkiełka 3x–5x, przesuwając ruszt w górę iw dół.</li>
	<li>Powtarzaj krok mycia świeżą wodą z kranu, aż szkiełka będą czyste, a sekcje pozostaną fioletowe.</li>
	<li>Zastąp wodę z kranu w naczyniu do barwienia 0.02% wodą amoniakalną. Przesuwaj stelaż w górę i w dół 2x–3x. Zwróć uwagę, że sekcja tkanki powinna zmienić kolor na niebieski.</li>
	<li>Zastąp wodę amoniakalną wodą z kranu. Umyj szkiełka 3x–5x.</li>
</ol>
7. Odwodnienie
<ol>
	<li>Przenieś stojak na szkiełka do naczynia do barwienia zawierającego 70% etanolu w dygestoriach i pozostaw na 2 minuty z okazjonalnym mieszaniem.</li>
	<li>Przenieś ruszt do szkiełka do pierwszego naczynia do barwienia zawierającego 100% etanolu i pozostaw go na 2 minuty z okazjonalnym mieszaniem.</li>
	<li>Przenieś ruszt do szkiełka do drugiego naczynia do barwienia zawierającego 100% etanolu i pozostaw na 2 minuty z okazjonalnym mieszaniem.</li>
	<li>Przenieś ruszt do szkiełka do naczynia do barwienia zawierającego ksylen i pozwól mu odpocząć przez 5 minut, od czasu do czasu mieszając.</li>
</ol>
8. Montaż na suwaku
<ol>
	<li>Wyjmij prowadnice ze stojaka na prowadnice i ułóż je płasko sekcjami skierowanymi do góry w dygestorium.</li>
	<li>Montuj po jednym szkiełku na raz, dodając 1 kroplę medium montażowego na bazie ksylenu do każdego szkiełka i ostrożnie umieszczając szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm na sekcji. Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Suszyć szkiełka na powietrzu przez ≥5 min.</li>
</ol>
9. Ocena próbki
<ol>
	<li>Zbadaj skrawki tkanek pod standardowym mikroskopem jasnego pola w powiększeniu 20x–40x.</li>
</ol>

<ol><li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+HPV-associated+cancer+globally%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prevention+Research.%28Philadelphia%2C+PA%29%22%5BJournal%5D)">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li>
<li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer%3A+Time+to+Change+the+Game%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li>
<li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+intact+HPV16+E6%2FE7+gene+expression+in+head+and+neck+cancers+with+unaltered+p53+status+and+perturbed+pRb+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control.</a> Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).</li>
<li>Ndiaye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPV+DNA%2C+E6%2FE7+mRNA%2C+and+p16INK4a+detection+in+head+and+neck+cancers%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).</li>
<li>Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HR-HPV+E6%2FE7+mRNA+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).</li>
<li>Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+chromogenic+in+situ+hybridization+assay+with+clinical+automated+platform+is+a+sensitive+method+in+detecting+high-risk+human+papillomavirus+in+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma.</a> Human Pathology. 63, 184-189 (2017).</li>
<li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+HPV+driven+oropharyngeal+cancers%3A+Comparing+p16+based+algorithms+with+the+RNAscope+HPV-test%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test.</a> Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Papillomavirus+Testing+in+Head+and+Neck+Carcinomas%3A+Guideline+From+the+College+of+American+Pathologists%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).</li>
<li>Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPV+E6%2FE7+mRNA+In+Situ+Hybridization+in+the+Diagnosis+of+Cervical+Low-grade+Squamous+Intraepithelial+Lesions+%28LSIL%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL).</a> The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).</li>
<li>El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEl-Naggar%2C+A+%22WHO+Classification+of+Head+and+Neck+Tumours%22">WHO Classification of Head and Neck Tumours</a>. , International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2017).</li>
<li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).</li>
<li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li>
<li>Outh-Gauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+in+head+and+neck+cancers%3A+a+new+challenge+for+immunologists%2C+pathologists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reviews%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians.</a> Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).</li>
<li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+HPV-driven+head+and+neck+cancer+with+a+single+test+in+routine+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice.</a> Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).</li>
<li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Transcriptionally+Active+High-risk+HPV+in+Patients+With+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+as+Visualized+by+a+Novel+E6%2FE7+mRNA+In+Situ+Hybridization+Method%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li>
<li>Hsieh, M. -S., Lee, Y. -H., Jin, Y. -T., Huang, W. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+SOX10+expression+in+human+papillomavirus-related+multiphenotypic+sinonasal+carcinoma%3A+report+of+6+new+cases+validated+by+high-risk+human+papillomavirus+mRNA+in+situ+hybridization+test%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test.</a> Human Pathology. 82, 264-272 (2018).</li>
<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Prognostic+Value+of+HPV16+E6+mRNA+Compared+With+In+Situ+Hybridization+for+Human+Oropharyngeal+Squamous+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).</li>
<li>Kuo, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma%E2%80%94molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li>
<li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+%28p16+immunochemistry%2C+PCR%2C+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization%29+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers%3A+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li>
<li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+%28HPV%29+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li>
<li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li>
<li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPV+E6%2FE7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142(2014).</li>
<li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+practical+proposal%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li>
<li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li>
</ol>

CB: tablice, seminaria: MSD, BMS, Astrazeneca, Roche

HPV RNA CISH wykonywane za pomocą zakupionego zestawu jest potężnym narzędziem do wykrywania transkryptów wirusowych i wskazuje na aktywne zakażenie HPV. Wykonywane ręcznie, kroki protokołu są ogólnie łatwe do wykonania, a zakupiony zestaw jest wygodny. Technika ta pozwala na barwienie jednorazowo 19 próbek histologicznych plus jedno szkiełko kontrolne, a test trwa około 8 godzin. Bardzo ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia próbek między etapami, chyba że zaznaczono inaczej. Warunki wstępnego leczenia mogą wymagać...

HPV RNA CISH to potężne narzędzie do wykrywania aktywnej infekcji HPV, które może okazać się kluczowe w przypadku łagodnych lub złośliwych zmian w różnych miejscach, takich jak ustno-gardło lub szyjka macicy. Wykrycie aktywnego zakażenia wirusem HPV może pomóc w rozpoznaniu zmiany wywołanej przez HPV, a tym samym wpłynąć na jej leczenie i rokowanie.
HPV jest najczęstszą infekcją przenoszoną drogą płciową, a ponad 100 genotypów wirusowych zostało opisanych1. Schematycznie wiadomo, że genotypy niskiego ryzyka, takie jak genotypy 6 i 11, wywołują brodawki narządów płciowych, nawracające brodawczakowatości dróg oddechowych i inne łagodne zmiany, podczas gdy genotypy wysokiego ryzyka, takie jak genotypy 16 i 18, są odpowiedzialne za większość nowotworów szyjki macicy i raka odbytu i odgrywają rolę w onkogenezie HNSCC w zmiennych proporcjach, zgodnie z regionalnymi danymi epidemiologicznymi2.
Dostępnych jest kilka narzędzi do wykrywania infekcji HPV. Ponieważ zakażenie HPV wysokiego ryzyka prowadzi do ekspresji wirusowych białek onkogennych E6 i E73, wykrywanie transkryptów E6 i E7 jest powszechnie postrzegane jako złoty standard identyfikacji aktywnego zakażenia HPV4. HPV RNA CISH można wykonać na próbkach FFPE, które dość łatwo można uzyskać od pacjentów cierpiących na różne choroby związane z HPV. Jego działanie zostało ocenione w płaskonabłonkowej śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy, odbytu i pochwy oraz w inwazyjnym raku płaskonabłonkowym szyjki macicy, odbytu i górnego odcinka przewodu pokarmowego5: osiąga czułość ponad 98% wśród przypadków dodatnich w reakcji łańcuchowej polimerazy DNA (PCR) HPV. Jest to nieco lepsze niż barwienie immunologiczne p16 (93%) i hybrydyzacja in situ DNA HPV (DNA ISH: 97%), które są częściej stosowane. W innej kohorcie 57 pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym (SCC) wywodzącym się z okolicy głowy i szyi, narządów płciowych, skóry i dróg moczowych, w porównaniu z HPV DNA ISH, HPV RNA CISH osiągnęło lepszą czułość (100% w porównaniu z 88%) i swoistość (87% w porównaniu z 74%)6.
Barwienie immunologiczne P16 jest pośrednim markerem odzwierciedlającym zakłócenie cyklu komórkowego, które może być spowodowane (ale nie wyłącznie) przez infekcję HPV4,7. Ten ekonomiczny test ma dobrą czułość i ujemną wartość predykcyjną i jest zalecany jako zastępczy marker wysokiego ryzyka zakażenia HPV w raku jamy ustnej i gardła (OPC) przez College of American Pathologists (CAP) i przez Unię Międzynarodowej Kontroli Raka (UICC)8.
Chociaż ten artykuł skupia się wyłącznie na wykrywaniu HPV w HNSCC, HPV RNA CISH jest klinicznie istotny w różnych innych stanach związanych z infekcją HPV. Na przykład technika ta może poprawić dokładność diagnozy płaskonabłonkowych zmian śródnabłonkowych szyjki macicy o niskim stopniu złośliwości (LSIL, wcześniej znana jako śródnabłonkowa neoplazja szyjki macicy, stopień 1 [CIN1]) w przypadkach niejednoznacznych morfologicznie9. Jeśli chodzi o SCC jamy ustnej i gardła, RNA HPV CISH pozwala na identyfikację SCC związanego z HPV, oznaczonego jako odrębny od SCC jamy ustnej i gardła niezwiązanego z HPV w ostatnim, ósmym wydaniu Klasyfikacji TNM Raka Głowy i Szyi (Unii Międzynarodowej Kontroli Nowotworów [UICC])10. Ponieważ SCC związany z HPV wykazuje lepsze rokowanie z dłuższym przeżyciem i zwiększoną czułością radioterapii i chemioterapii niż SCC11,12,13, wykrycie zakażenia HPV może mieć wpływ na postępowanie z pacjentem14,15. Poza tym HPV RNA CISH może być stosowany do diagnozowania wielofenotypowego raka zatok przynosowych związanego z HPV o wyższym sygnale niż DNA HPV CISH16. Kilka wielowymiarowych analiz sugeruje, że wykrycie transkryptów E6 i E7 jest skorelowane z lepszym rokowaniem w SCC jamy ustnej i gardła ogółem7,15,17,18 oraz w podgrupie p16-dodatniego SCC19,20.
Tutaj prezentujemy protokół ręcznego HPV RNA CISH wykonywanego na preparatach FFPE za pomocą zestawu otrzymanego od producenta.

<table><tbody><tr><td>Roztwór hematoksyliny, Gill No. 1</td><td>Merck</td><td>GHS132</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Oven (110v)</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.</td><td>321710</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na prowadnice HybEZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td></td><td></td>300104</tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobowe pióro barierowe</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td></td><td></td>310018</tr><tr><td>Odczynniki do wykrywania RNAscope 2.5 HD-BROWN</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>322310</td><td>Ten zestaw zawiera odczynniki do amplifikacji AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 i AMP6 oraz odczynniki do wykrywania DAB-A i DAB-B</td></tr><tr><td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>320871</td><td></td></tr><tr><td>Sonda kontroli pozytywnej DAPB RNAscope 3-Plex</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.</td><td>320861</td><td>PPIB</td></tr><tr><td>RNAscope H202 & Odczynnik Proaaza Plus</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.</td><td>322330</td><td>Nadtlenek wodoru x2 i proteaza Plus x 1</td></tr><tr><td>Sonda RNAscope - HPV16/18</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.</td><td></td><td></td>311121</tr><tr><td>Odczynniki do odzyskiwania celu RNAscope</td><td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td><td>322000</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki buforowe do płukania RNAscope</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.</td><td></td><td>Bufor do płukania 310091 50X x4</td></tr></tbody></table>

chromogenna hybrydyzacja in situ jako narzędzie do diagnostyki raka głowy i szyi związanego z hpv

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) jest głównym czynnikiem ryzyka dla podtypu raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i gardła (OPSCC), który zwykle wiąże się z lepszymi wynikami niż OPSCC związane z alkoholem i tytoniem. Chromogenna hybrydyzacja in situ (CISH) wirusowego RNA wirusa HPV może pozwolić na półilościową ocenę wirusowych transkryptów białek onkogennych E6 i E7 oraz wizualizację in situ z dobrą rozdzielczością przestrzenną. Technika ta pozwala na rozpoznanie aktywnej infekcji z wizualizacją transkrypcji HPV w komórkach nowotworowych zakażonych HPV. Zaletą tej techniki jest uniknięcie zanieczyszczenia nienowotworowymi komórkami zakażonymi HPV sąsiadującymi z guzem. Ogólnie rzecz biorąc, jego dobre wyniki diagnostyczne sprawiają, że jest uważany za złoty standard w identyfikacji aktywnego zakażenia HPV. Ponieważ interakcja białek wirusa E6 i E7 z białkami komórkowymi pRb i p53 jest niezbędna do transformacji komórek, HPV RNA CISH jest funkcjonalnie istotny i wyraźnie odzwierciedla aktywne onkogenne zakażenie HPV. Technika ta jest również istotna klinicznie, ponieważ "niskie" lub "wysokie" poziomy transkrypcji HPV pomogły zidentyfikować dwie grupy rokowania wśród pacjentów z rakiem głowy i szyi z p16 związanym z HPV. W niniejszej części przedstawiamy protokół do manualnego badania HPV RNA CISH wykonywanego na preparatach parafinowych utrwalanych w formalinie (FFPE) za pomocą zestawu uzyskanego od producenta. Zamiast objawienia chromogenicznego, hybrydyzacja RNA in situ może być również przeprowadzona za pomocą objawienia fluorescencyjnego (RNA FISH). Można go również łączyć z konwencjonalnym barwieniem immunologicznym.

Jak opisano w tym miejscu, w przypadku raka płaskonabłonkowego głowy i szyi, przypadek uznaje się za pozytywny przy obecności brązowego, punktowego barwienia w cytoplazmie lub jądrach komórek nowotworowych. W większości badań sygnał klasyfikuje się jako „pozytywny” lub „niewykryty”14. Opisywano metody półilościowej oceny sygnału, jednak brakuje w nich standaryzacji pomiędzy zespołami badawczymi. Na przykład w niektórych badaniach sygnały oceniano jako 1+ przy 1–3 kropkach na komórkę nowotworową, 2...

Chromogeniczna hybrydyzacja in situ RNA wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) jest uważana za jeden ze złotych standardów wykrywania aktywnego zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego w obrębie nowotworów. Pozwala na wizualizację ekspresji mRNA HPV E6-E7 wraz z lokalizacją i półilościową oceną jego sygnału.

Chromogenna hybrydyzacja in situ jako narzędzie do diagnostyki raka głowy i szyi związanego z HPV

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

HPV RNA CISH pozwala na wykrycie aktywnego zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego. Ponieważ hybrydyzacja in situ jest ukierunkowana na RNA HPV, technika ta pozwala na wizualizację aktywnej transkrypcji wirusa. Charakteryzuje się precyzyjną rozdzielczością przestrzenną i dobrymi wynikami diagnostycznymi.Wykrycie wirusa HPV może pomóc w rozpoznaniu kilku zmian związanych z HPV, takich jak rak płaskonabłonkowy jamy ustnej i gardła lub nowotworowość szyjki macicy. Może to mieć również wpływ na rokowanie. Po przygotowaniu i odczynników przeciwbarwiących, przygotuj jeden x odczynnik do odzyskiwania celu w dużej zlewce, dodając 70 mililitrów 10x odczynnika do odzyskiwania celu do 630 mililitrów wody destylowanej.Umieść zlewkę na płycie grzewczej z mieszadłem magnetycznym i przykryj ją folią aluminiową. Gotuj jego zawartość w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut, uważając, aby nie gotować go dłużej niż 30 minut. Aby zablokować aktywność peroksydazy na szkiełkach z sekcjami tkanek uprzednio odparafinowanymi i umieszczonymi w stojaku na szkiełka, dodaj cztery do sześciu kropli nadtlenku wodoru do każdego szkiełka, tylko tyle, aby pokryć próbkę, i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Umyj szkiełka dwa razy przez dwie minuty w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej. Aby przełamać więzy tkankowe RNA w skrawkach tkanki RNA, najpierw wyjmij folię aluminiową z wrzącego x TRR za pomocą pazura i przestań mieszać. Zanurz stojak na slajdy powoli i bardzo ostrożnie.Ponownie przykryj zlewkę folią aluminiową i inkubuj przez 15 minut. Użyj pazura, aby natychmiast przenieść gorący ruszt do szkiełka do kąpieli destylowanej i myć go przez dwie minuty. Następnie umyj szkiełka w świeżym 100% etanolu przez dwie minuty i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez dwie minuty.Następnie użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować barierę wokół każdej próbki i pozwól jej wyschnąć przez co najmniej pięć minut. W celu trawienia proteazy umieść szkiełka na tacy o kontrolowanej wilgotności i dodaj około czterech kropli Protease Plus na próbkę. Przykryj blachę pokrywką i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.Wyjmij blachę z piekarnika i wyjmij ruszt przesuwny. Pracując pojedynczo, szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym wodą destylowaną. Myć szkiełka dwa razy przez dwie minuty w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu.Aby rozpocząć hybrydyzację, dotknij i przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu i umieść je z powrotem w stojaku na szkiełka. Wyjmij wstępnie podgrzaną sondę HPV z piekarnika i dodaj około czterech kropli, aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Przykryj blachę pokrywką i wstaw do piekarnika na dwie godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza.Po zakończeniu inkubacji wyjmij blachę z piekarnika i wyjmij ruszt do slajdów. Szkiełko po szkiełku, szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym jednym buforem do płukania, myjąc szkiełka przez dwie minuty w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu i powtórz ze świeżym buforem do płukania jeden x mycie. Stuknij i przesuwaj, aby usunąć nadmiar płynu ze szkiełek, a następnie ponownie umieść je w stojaku na slajdy.Dodaj około czterech kropli AMP1 w temperaturze pokojowej na sekcję, aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Przykryj blachę pokrywką i wstaw do piekarnika na 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Po wyjęciu blachy z piekarnika wyjmij ruszt przesuwny.Pracując pojedynczo, szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzone w naczyniu barwiącym wypełnionym jednym x buforem do mycia, myjąc przez dwie minuty w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu i powtórz ze świeżym buforem do płukania x. Dozuj taką samą liczbę kropli każdego roztworu DAB-A i DAB-B do probówki o odpowiedniej wielkości, aby uzyskać około 120 mikrolitrów substratu DAB na sekcję i wirować. Wyjmij każde szkiełko, pojedynczo, ze stojaka na slajdy, a następnie dotknij i przesuń, aby usunąć nadmiar płynu, a następnie umieść je z powrotem w stojaku na slajdy.Odpipetować około 120 mikrolitrów mieszaniny DAB na każdy fragment tkanki, upewniając się, że skrawki są zakryte. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przystąpić do barwienia przeciwstawnego. Umieść jedną kroplę medium montażowego na szklaną listwę, a następnie umieść listwy na prowadnicach i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.Po kilku godzinach przystąp do oceny przy użyciu mikroskopu optycznego, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Jak opisano tutaj w przypadku raka płaskonabłonkowego głowy i szyi, obecność brązowego barwienia punktowego w cytoplazmie lub w jądrach komórek nowotworowych określała przypadek pozytywny. Wyniki podzielono na dwa wyniki, wysoki i niski wynik RNA CISH, obserwowany przy 20-krotnym obiektywie.Barwienie RNA CISH jest uważane za niskie, gdy obserwuje się je w mniej niż 50% komórek nowotworowych i obejmuje mniej niż 80% powierzchni komórki. Z drugiej strony, wynik RNA CISH jest wysoki, gdy obserwuje się go w ponad 50% barwionych komórek rakowych lub z powierzchnią barwienia przekraczającą 80% w ponad 30% komórek nowotworowych. Nigdy nie należy dopuścić do wyschnięcia szkiełek w celu hybrydyzacji.Nie zapomnij podgrzać sondy. Dla każdej próbki należy przeprowadzić kontrolę dodatnią i ujemną w celu oceny jakości RNA.

chromogenic-situ-hybridization-as-tool-for-hpv-related-head-neck

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.

Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

W tym filmie, komórki zainfekowane wirionami MCPyV zostały poddane reakcji łańcuchowej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia specyficznych genomów MCPyV. Co więcej, technikę DNA-HCR połączono z FISH w celu wizualizacji DNA MCPyV w zakażonych ludzkich komórkach skóry.

HCR-DNA FISH: Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania wirusowego DNA w zakażonych komórkach

Ten film pokazuje kroki związane z wstępną obróbką próbek tkanek FFPE pod kątem chromogenicznej hybrydyzacji RNA in situ. Proces obróbki wstępnej pomaga utrzymać integralność kwasów nukleinowych w komórkach i ogólną morfologię tkanek.

Wstępna obróbka tkanek FFPE dla RNA CISH: procedura przetwarzania skrawków tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie do chromogenicznej hybrydyzacji RNA in situ

Ten film opisuje strategię sekwencyjnej hybrydyzacji, która polega na hybrydyzacji sond mRNA do określonego docelowego mRNA. Po hybrydyzacji sondy przeprowadza się wzmocnienie sygnału w celu zwiększenia rozdzielczości poprzez zmniejszenie stosunku sygnału do szumu podczas RNA-CISH próbek histologicznych.

Hybrydyzacja sondy i wzmocnienie sygnału w hybrydyzacji RNA in situ: technika wykrywania określonych sekwencji RNA w skrawkach tkanek

Ten film przedstawia protokół wykrywania sygnału podczas chromogenicznej hybrydyzacji RNA in situ. Technika ta może być stosowana do wizualnego diagnozowania aktywnej infekcji onkogennej w nienaruszonej próbce tkanki.

Wykrywanie sygnału RNA CISH: technika wykrywania sygnałów chromogennych podczas hybrydyzacji RNA in situ w nienaruszonych próbkach tkanek

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Obecność HPV wysokiego ryzyka w tkance nowotworowej głowy i szyi wiąże się z korzystnymi wynikami. Niedawno opracowana technika hybrydyzacji RNA in situ zwana RNAscope umożliwia bezpośrednią wizualizację mRNA HPV E6/E7 w skrawkach tkanek FFPE.

RNAscope do wykrywania in situ transkrypcyjnie aktywnego wirusa brodawczaka ludzkiego w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

Wieloparametrowa immunohistochemia fluorescencyjna może być wykorzystana do oceny liczby, względnego rozmieszczenia i lokalizacji populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza. Niniejszy manuskrypt opisuje zastosowanie tej techniki do analizy subpopulacji komórek T w raku jamy ustnej i gardła.

Czterokolorowa immunohistochemia fluorescencyjna subpopulacji komórek T w archiwalnych próbkach ludzkiego raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i gardła utrwalonego w formalinie, zatopionych w parafinie

Opisujemy protokół wykorzystujący fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wizualizacji wielu herpeswirusowych RNA w litycznych infekowanych komórkach ludzkich, zarówno w zawiesinie, jak i w adherentach. Protokół ten obejmuje kwantyfikację fluorescencji wytwarzającą stosunek nukleocytoplazmatyczny i może być rozszerzony o jednoczesną wizualizację białek gospodarza i wirusa za pomocą immunofluorescencji (IF).

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Poznaj chromogenną hybrydyzację in situ RNA HPV do wykrywania aktywnych infekcji w nowotworach głowy i szyi. Technika ta wizualizuje ekspresję mRNA E6-E7 HPV z precyzyjną lokalizacją przestrzenną.

Chromogenna hybrydyzacja in situ jako narzędzie do diagnostyki raka głowy i szyi związanego z HPV

Przeglądaj więcej filmów