Name: Ocena ryzyka i rozpowszechnienia raka jelita grubego za pomocą wykrywania integralności DNA kału (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę wykrywania zmian nowotworowych jelita grubego za pomocą zestawu FL-DNA. To szybkie narzędzie diagnostyczne poprawia skuteczność badań przesiewowych w połączeniu z testem iFOBT.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Pacjenci zostali zrekrutowani w Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) w Meldola (FC, Włochy) w latach 2013–2015. Włączeni pacjenci zostali objęci protokołem IRSTB02, zatwierdzonym przez Komitet Etyki IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, wersja 1). Wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Od wszystkich pacjentów uzyskano pisemną zgodę na udział w badaniu.
1. Izolacja DNA z kału
<ol>
	<li>Użyj zestawu do przygotowania próbek kału (patrz Tabela materiałów). Wybierz i opracuj materiał kałowy, przeprowadzając ekstrakcję zgodnie z instrukcjami producenta. DNA po oczyszczeniu można amplifikować bezpośrednio lub przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kontroli pozytywnej, standardów, DNA spike-in oraz próbek klinicznych
<ol>
	<li>Przygotowanie standardów i próbek
	<ol>
		<li>Aby przygotować kontrolę dodatnią, standardy, DNA spike-in oraz wszystkie próbki kliniczne, odwiruj alikwoty kontroli dodatniej, standardów i DNA spike-in, a następnie resuspenduj każdy odczynnik, dodając odpowiednią ilość dołączonej wody (patrz poniżej). Następnie ostrożnie wymieszaj kontrolę dodatnią, standard i DNA spike-in w wirówce typu vortex, a potem wiruj przez 10 s. Aby uzyskać pełną resuspensję suchych odczynników, przechowuj odczynniki w formie płynnej w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min przed użyciem.
		<ol>
			<li>Kontrola dodatnia to ludzkie DNA w formie suchej. Resuspenduj każdą alikwotę przy użyciu 750 µL wody.</li>
			<li>DNA spike-in to DNA łososia (Oncorhynchus keta), które służy jako egzogenna kontrola wewnętrzna do weryfikacji ewentualnej obecności inhibitorów w próbkach DNA wyizolowanych z kału. Resuspenduj każdą alikwotę przy użyciu 100 µL wody.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby przygotować krzywą standardową, wykonaj cztery rozcieńczenia 1:5, zaczynając od roztworu zapasowego. Punkty standardowe muszą wynosić 10 ng/reakcję, 2 ng/reakcję, 0,4 ng/reakcję oraz 0,08 ng/reakcję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 1x DNA spike-in
	<ol>
		<li>Przygotuj kontrolę DNA spike-in bezpośrednio przed użyciem.</li>
		<li>Przygotuj 1x kontrolę DNA spike-in, mieszając 5 µL FL-DNa spike z 20 µL sterylnej wody. Liczbę próbek 1x kontroli DNA spike-in należy przygotować zgodnie z liczbą próbek do analizy, powiększoną o kontrolę dodatnią.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek
	<ol>
		<li>Wymieszaj 75 µL próbek (próbek klinicznych lub kontroli dodatniej) z 25 µL 1x DNA spike-in, uzyskując objętość całkowitą 10 µL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Amplifikacja i oznaczenie wartości FL-DNA za pomocą qPCR Easy PGX
UWAGA: Gotowe mieszaniny do amplifikacji, zawierające specyficzne startery i sondy skierowane przeciwko ludzkiemu DNA oraz kontroli wewnętrznej, są dostarczane w formie liofilizowanej w paskach 8-dołkowych dla FL-DNA Mix A oraz FL-DNA Mix B. Standardy, kontrole dodatnie i ujemne oraz próbki muszą być amplifikowane przy użyciu obu liofilizowanych mieszanin. Wyłącznie próbki kliniczne muszą być amplifikowane w dubletach przy użyciu obu liofilizowanych mieszanin.
<ol>
	<li>Zapoznaj się z Tabelą Materiałów w celu uzyskania informacji o urządzeniu do qPCR i oprogramowaniu operacyjnym.
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie operacyjne i skonfiguruj płytkę oraz profil termiczny:
		<ol>
			<li>Skonfiguruj płytkę zgodnie z Tabelą 1.
			<ol>
				<li>Ustaw typ studzienki dla wszystkich ośmiu pozycji w kolumnie 1 na Standard.</li>
				<li>Ustaw typ studzienki dla studzienek A2 i B2 na NTC.</li>
				<li>Ustaw typ studzienki dla C2 i D2 (kontrole dodatnie) na Unknown.</li>
				<li>Ustaw typ studzienki dla wszystkich pozostałych pozycji na Unknown.</li>
				<li>Zaznacz wszystkie 96 pozycji i dodaj barwniki FAM oraz HEX. Kliknij Sync Plate.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Ustaw profil termiczny zgodnie z Tabelą 2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wiruj odpowiednią liczbę pasków przez 10 s, aby zgromadzić zawartość na dnie probówek.</li>
		<li>Ostrożnie usuń uszczelnienia z pasków, dbając o zachowanie zawartości, i dodaj do odpowiednich pasków: kontrola ujemna: 20 µL wody; próbka: 20 µL DNA; krzywa standardowa: 20 µL standardu 1, 2, 3 lub 4; kontrola dodatnia: 20 µL kontroli dodatniej.</li>
		<li>Starannie zamknij wszystkie paski za pomocą płaskich nakrętek optycznych do 8 pasków i wymieszaj wortexie przez kilka sekund.</li>
		<li>Wiruj paski przez 10 s i wprowadź je do urządzenia. Następnie uruchom pomiar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
UWAGA: Analiza danych może być przeprowadzona automatycznie lub ręcznie, w zależności od oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Po zakończeniu procesu należy wybrać kolumny A, C, E, G dla „FAM: FL-DNA-A" i "HEX: IC, a kolumny B, D, F, H dla „FAMFL-DNA-B" i "HEX: IC.</li>
	<li>Ustaw następujące parametry dla Standardowe ilości początkowe10 ng/reakcję dla studzienek A1 i B1, 2 ng/reakcję dla C1 i D1, 0,4 ng/reakcję dla E1 i F1 oraz 0,08 ng/reakcję dla G1 i H1.</li>
	<li>Zestaw Próg fluorescencji wartości do 150 dla obu kanałów: FAM (FL-DNA A i FL-DNA B) oraz HEX (IC).</li>
	<li>W pudełku Tabela wyników, kliknij Opcje kolumn | Zaznacz wszystko | Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. aby uzyskać wyniki w obu kanałach wraz z ich odpowiednimi wartościami Cq (∆R) oraz końcowymi wartościami ∆R. 
	UWAGA: Wartości te są dostarczane przez oprogramowanie instrumentu do Real Time PCR. ΔR last odpowiada wartości fluorescencji znormalizowanej do ostatniego cyklu amplifikacji.</li>
	<li>W polu Tabela wyników kliknij prawym przyciskiem myszy na tabelę, aby otworzyć menu kontekstowe, a następnie kliknij Wyślij do programu Excel aby wyeksportować surowe dane.</li>
	<li>Sprawdź wartości standardów, aby zweryfikować przydatność krzywej wzorcowej.</li>
	<li>Dla każdej mieszaniny FL-DNA należy sprawdzić wartość R2 wartości z kolumny [„R² (∆R)”] oraz wartości wydajności z kolumny [„Efficiency (%)”]. Jeśli mieszczą się one w dopuszczalnym zakresie, można przystąpić do analizy zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela 3).</li>
	<li>Jeśli wyniki w kanale FAM nie mieszczą się w oczekiwanym zakresie, pomiń jeden punkt krzywej standardowej i przeprowadź ponowną analizę serii.</li>
	<li>Wyznaczyć wartości kontroli negatywnej i pozytywnej, korzystając z poniższego wzoru, przyjmując wartości „No Cq” jako zero: 
	<img alt="Równanie równowagi statycznej, wzór obliczeniowy Q dla ilości mieszaniny DNA, analiza naukowa." src="/files/ftp_upload/59426/59426eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	<img alt="Wzór obliczeniowy FL-DNA, metoda kwantyfikacji fluorescencyjnej, równanie analizy molekularnej." src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"></li>
	<li>Porównaj otrzymane wartości z wartościami podanymi w Tabela 4.</li>
	<li>Jeśli wyniki kontroli reakcji mieszczą się w zakresie wartości oczekiwanych, należy przystąpić do analizy próbek. 
	UWAGA: Należy zweryfikować, czy uzyskane wartości Cq wynikają z rzeczywistej reakcji amplifikacji (sigmoidalna krzywa fluorescencji), a nie z artefaktu (liniowa krzywa fluorescencji).</li>
	<li>Aby przeanalizować przydatność próbki do każdej mieszaniny FL-DNA, należy porównać wartości Cq w kanale HEX. Jeśli wartość wynosi ≥16, można przystąpić do analizy próbek. Jeśli wartość wynosi &lt;16 lub nie uzyskano wartości Cq, prawdopodobnie wynika to z błędu podczas dozowania FL-DNA Spike. W związku z tym analiza próbek nie jest możliwa.</li>
	<li>Oblicz średnią z wartości Cq w kanale „HEX” dla kontroli pozytywnej, korzystając z następującego wzoru: 
	<img alt="Wzór na obliczenie CqHEX; średnia z Cq HEX mix A i Cq HEX mix B; równanie matematyczne." src="/files/ftp_upload/59426/59426eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"></li>
	<li>Oblicz średnią z wartości Cq w kanale „HEX” dla powtórzeń próbek, korzystając z następującego wzoru: 
	<img alt="Wzór obliczeniowy dla próbek CqHEX, wyrażenie matematyczne w kontekście analizy eksperymentalnej." src="/files/ftp_upload/59426/59426eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"></li>
	<li>Oblicz wartości ∆CqHEX zgodnie z następującym wzorem: 
	<img alt="Równowaga statyczna; równanie ΔCqHEX = CqHEX_sample - CqHEX_pos; formuła naukowa." src="/files/ftp_upload/59426/59426eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"></li>
	<li>Porównaj wartości ∆CqHEX próbek z wartościami podanymi w Tabela 5. </li>
	<li>Dla każdej mieszaniny (Mieszanina A i Mieszanina B) należy porównać wartości Cq w kanale FAM z wartościami podanymi w Tabela 6.</li>
	<li>Aby wyznaczyć wartość FL-DNA dla każdej odpowiedniej próbki, należy zastosować następujący wzór, przyjmując wartości „No Cq” jako zero: 
	<img alt="Równanie przedstawiające wzór na ilość DNA Q służący do porównywania powtórzeń w analizie molekularnej." src="/files/ftp_upload/59426/59426eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6"> 
	<img alt="Wzór obliczeniowy dla FL-DNA, metoda kwantyfikacji fluorescencji, równanie analizy molekularnej." src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
	UWAGA: Ryzyko i rozpowszechnienie raka jelita grubego są funkcją oceny iFOBT oraz FL-DNA zgodnie z wynikami nomogramu Fagana uzyskanymi przez Rengucciego i współpracowników.12 (Tabela 7).</li>
</ol>

<ol><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Genetics+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Genetics of Colorectal Cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Sears, C. L., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbes%2C+Microbiota%2C+and+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbes, Microbiota, and Colon Cancer.</a> Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).</li>
<li>SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html">http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html</a> (2019).</li>
<li>Levin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Surveillance+for+the+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Adenomatous+Polyps%2C+2008%3A+A+Joint+Guideline+From+the+American+Cancer+Society%2C+the+US+Multi-Society+Task+Force+on+Colorectal+Cancer%2C+and+the+American+College+of+Radiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology.</a> Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).</li>
<li>Bosch, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tests+for+colorectal+cancer+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Colorectal+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular tests for colorectal cancer screening.</a> Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).</li>
<li>Ahlquist, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+colorectal+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of colorectal neoplasia.</a> Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+multiple+molecular+tests+to+detect+colorectal+cancer+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+colorectal+cancer+by+a+quantitative+fluorescence+determination+of+DNA+amplification+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool.</a> Neoplasia. 6, 536-540 (2004).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+determination+of+long-fragment+DNA+in+stool+as+a+marker+for+the+early+detection+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer.</a> Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+DNA+for+noninvasive+diagnosis+of+colorectal+cancer+in+immunochemical+fecal+occult+blood+test-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).</li>
<li>De Maio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+and+stool+nucleic+acid+analysis+for+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).</li>
<li>Rengucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stool+DNA+integrity+method+for+early+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).</li>
</ol>

Maura Menghi jest pełnoetatowym pracownikiem Diatech Pharmacogenetics srl.

Wcześniejsze badania wykazały, że analiza integralności DNA stolca pobranego metodą ręczną i półautomatyczną może stanowić alternatywne narzędzie do wczesnego wykrywania zmian w jelitie grubym 7,8,9,10,11,12. Molekularne, nieinwazyjne testy przesiewowe zostały opracowane na przestrzeni lat w celu wykrywania raka jelita grubeg...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.
The first&#160;affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.

Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Rak jelita grubego (CRC) wywodzi się z wieloetapowego procesu, w którym zdrowy nabłonek powoli przekształca się w gruczolaki lub polipy, które z czasem przekształcają się w nowotwory złośliwe1,2. Pomimo wysokiej zachorowalności na CRC, w ciągu ostatniej dekady zaobserwowano tendencję spadkową w odsetku zgonów3. Rzeczywiście, wczesne narzędzia diagnostyczne przyjęte w programach badań przesiewowych doprowadziły do wczesnego wykrywania i usuwania gruczolaków lub polipów przednowotworowych4. Jednak ze względu na różne ograniczenia techniczne żadna z tych metod nie jest optymalna. Rzeczywiście, w celu poprawy czułości i swoistości, zaproponowano wiele testów DNA kału samodzielnie lub w połączeniu z obecnymi rutynowymi testami diagnostycznymi5,6.
Zazwyczaj, zdrowa błona śluzowa wydziela do strumienia kałowego apoptotyczne kolonocyty, podczas gdy chora błona śluzowa złuszcza nieapoptotyczne kolonocyty. Fragmenty o długości 200 pz lub większej charakteryzują nieapoptotyczne DNA. To DNA nazywa się długim DNA (L-DNA) i stało się użytecznym biomarkerem do wczesnej diagnozy raka jelita grubego. L-DNA można wyizolować z próbki kału i określić ilościowo metodą qPCR przy użyciu zestawu FL-DNA do diagnostyki in vitro7,8,9,10,11,12.
Test składa się z dwóch testów do wykrywania fragmentów FL-DNA w zakresie od 138 pz do 339 pz. Każdy test umożliwia amplifikację FL-DNA (FAM), a także kolce DNA (HEX). Aby zapewnić optymalną amplifikację wszystkich fragmentów, test został podzielony na dwa testy (nazwane "A" i "B"). Test A wykrywa dwa regiony eksonu 14 genu APC (NM_001127511) i fragment eksonu 7 genu TP53 (NM_001276760). Test B wykrywa fragment eksonu 14 genu APC (NM_001127511) oraz dwa regiony eksonów 5 i 8 genu TP53 (NM_001276760). Testy nie rozróżniają wykrytych regionów. Kolce w DNA odpowiadają DNA łososia Oncorhynchus keta i umożliwiają weryfikację, czy procedura została wykonana prawidłowo, oraz sprawdzenie ewentualnej obecności inhibitorów, co może dać fałszywie ujemne wyniki. Stężenie FL-DNA ocenia się za pomocą bezwzględnej kwantyfikacji przy użyciu metody krzywej standardowej i wyraża się je w ng/reakcję.
Metoda FL-DNA to nieinwazyjny i niedrogi test DNA kału, który w połączeniu z immunologicznym testem na krew utajoną w kale (iFOBT), jest obecnie używany w programach badań przesiewowych CRC i pozwala na lepsze przewidywanie zmian rakowych i/lub gruczolaka wysokiego ryzyka12.

<table><tbody><tr><td>Probówki z polipropylenu twist-lock o pojemności 1,5 ml i 2 ml (wolne od inhibitorów DNaz, RNaz, DNA i PCR)</td><td></td><td></td><td>Materiały eksploatacyjne wymagane do ekstrakcji DNA i Real Time PCR</td></tr><tr><td>Absolutny etanol (jakość stopnia analitycznego)</td><td></td><td></td><td>Odczynnik wymagany do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Maksymalna prędkość 20000 x g. Przyrząd wymagany do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy EasyPGX wersja 2.0.0</td><td>Oprogramowanie do analizy Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-SW</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EasyPGX Wirówka/wir 8-dołkowe paski</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT803</td><td>Instrument zalecany do testu Real Time PCR</td></tr><tr><td>EasyPGX qPCR 96&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-96</td><td>Instrument zalecany do testu Real Time PCR</td></tr><tr><td>EasyPGX ready FL-DNA</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT029</td><td>Zestaw wymagany do testu Real Time PCR</td></tr><tr><td>Mikropipety (objętości od 1 do 1.000 &mikro; L)</td><td></td><td></td> <td>Materiały eksploatacyjne wymagane do ekstrakcji DNA i Real Time PCR</td></tr><tr><td>Bezpudrowe rękawiczki</td><td></td><td></td><td>jednorazowe Materiały eksploatacyjne wymagane do ekstrakcji DNA i Real Time PCR</td></tr><tr><td>QIAamp Fast DNA Stool</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td>Zestaw zalecany do ekstrakcji i oczyszczania DNA ze stolca</td></tr><tr><td>Sterylne końcówki filtrujące Bez DNaz i RNaz (objętości od 1 do 1.000 &mikro; L)</td><td></td><td></td> <td>Materiały eksploatacyjne wymagane do ekstrakcji DNA i Real Time PCR</td></tr><tr><td>Blok termiczny, np. suchy blok EasyPGX</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT801</td><td>Przyrząd wymagany do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Vortex, np. Wirówka EasyPGX/vortex 1,5 ml&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT802</td><td>Instrument wymagany do ekstrakcji DNA</td></tr></tbody></table>

ocena ryzyka i rozpowszechnienia raka jelita grubego za pomocą wykrywania integralności dna kału

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Obecnie DNA kału może być izolowane i analizowane za pomocą kilku metod. Długie fragmenty DNA w kale można wykryć za pomocą testu qPCR, który zapewnia wiarygodne prawdopodobieństwo obecności zmian przednowotworowych lub nowotworowych jelita grubego. Metoda ta, zwana fluorescencyjną długą DNA (FL-DNA), jest szybką, nieinwazyjną procedurą, która stanowi ulepszenie systemu prewencji pierwotnej. Metoda ta opiera się na ocenie integralności DNA kału poprzez ilościową amplifikację określonych celów genomowego DNA. W szczególności ocena fragmentów DNA dłuższych niż 200 pz pozwala na wykrycie pacjentów ze zmianami w obrębie jelita grubego o bardzo wysokiej swoistości. Jednak ten system i wszystkie obecnie dostępne testy DNA kału wiążą się z pewnymi ogólnymi problemami, którymi należy się zająć (np. częstotliwość, z jaką należy przeprowadzać testy, i optymalna liczba próbek kału pobieranych w każdym punkcie czasowym dla każdej osoby). Jednak główną zaletą FL-DNA jest możliwość stosowania go w połączeniu z testem stosowanym obecnie w programie badań przesiewowych CRC, znanym jako immunochemiczny test na krew utajoną w kale (iFOBT). Rzeczywiście, oba testy można wykonać na tej samej próbce, co zmniejsza koszty i pozwala lepiej przewidzieć ostateczną obecność zmian w jelitie grubym.

Schemat postępowania w tym protokole przedstawiono na Rysunku 1. Schemat obejmuje dwa etapy kontrolne oraz różne działania w zależności od wyników tych etapów. Po pierwsze, jeśli próbka wykazuje niewłaściwe kontrole, należy powtórzyć amplifikację. Po drugie, jeśli amplifikacja jest zahamowana, próbka musi zostać poddana ponownej obróbce od samego początku lub zaklasyfikowana jako niewartościowa.
Rysunek 2 przedstawia krzywe fluorescencji uzyskane z próbek pozy...

Prezentowany zestaw diagnostyczny FL-DNA to oszczędzająca czas i przyjazna dla użytkownika metoda określania wiarygodnego prawdopodobieństwa wystąpienia zmian rakowych jelita grubego.

Ocena ryzyka i rozpowszechnienia raka jelita grubego za pomocą wykrywania integralności DNA kału

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Metoda ta pozwala na nieinwazyjne wykrycie pacjenta ze zmianą nowotworową jelita grubego. W szczególności test ten pozwala, w połączeniu z testami obecnie stosowanymi w programie badań przesiewowych w kierunku raka jelita grubego, lepiej przewidzieć obecność raka lub wyższe ryzyko wystąpienia nieprawidłowych zmian. Aby rozpocząć ten protokół, odwiruj porcję każdej kontroli pozytywnej, wzorcowego DNA i DNA z kolcem w suchym formacie przez 10 sekund na mini wirówce.Ponownie zawiesić kontrolę pozytywną za pomocą 750 mikrolitrów wody. Ponownie zawiesić kolce DNA, używane jako egzogenna kontrola wewnętrzna, w celu zbadania obecności inhibitorów, za pomocą 100 mikrolitrów wody. W przypadku krzywej wzorcowej ponownie zawiesić suchy wzorzec ze 100 mikrolitrami wody i wykonać cztery rozcieńczenia 1:5, zaczynając od roztworu podstawowego.Następnie ostrożnie wiruj odczynniki przez 15 sekund i odwiruj w mini wirówce przez 10 sekund. W celu całkowitego wymieszania, należy przechowywać płynne odczynniki w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed użyciem. Aby przygotować 1x kontrolę DNA z kolcem, wymieszaj pięć mikrolitrów kolca FL-DNA z 45 mikrolitrami sterylnej wody.W przypadku próbek wymieszaj 75 mikrolitrów każdej próbki z 50 mikrolitrami 1x kolca DNA, uzyskując całkowitą objętość 125 mikrolitrów. Najpierw otwórz oprogramowanie operacyjne qPCR. Aby ustawić płytę, należy ustawić Typ studni dla wszystkich ośmiu pozycji w kolumnie pierwszej, jako Standardowe.Ustaw typ studni dla studzienek A2 i B2 jako NTC. Ustaw typ studzienki dla kontroli pozytywnych, C2 i D2, jako Nieznany. I ustaw Typ studni dla wszystkich innych pozycji jako Nieznany.Zaznacz wszystkie 96 pozycji. Dodaj barwniki, FAM i HEX i kliknij Synchronizuj płytę. Następnie ustaw profil termiczny, jak podano.Przygotuj żądaną liczbę 8-dołkowych pasków zawierających kompletne liofilizowane mieszaniny amplifikacyjne, ze specyficznymi starterami i sondami ukierunkowanymi na ludzkie DNA i kontrolę wewnętrzną. Aby sprowadzić zawartość na dno probówek, odwiruj paski przez 10 sekund. Delikatnie usuń uszczelki z pasków, uważając, aby nie stracić granulki.Następnie dodaj 25 mikrolitrów wody do studzienek kontroli ujemnej. 25 mikrolitrów próbki DNA do studzienek do próbek i 25 mikrolitrów DNA kontroli dodatniej do studzienek kontroli dodatniej. W przypadku krzywej standardowej dodaj 25 mikrolitrów wzorca 1, 2, 3 i 4 do każdej dedykowanej studzienki.Użyj 8-paskowych płaskich nasadek optycznych, aby ostrożnie zamknąć wszystkie paski i wirować przez kilka sekund. Odwiruj paski przez 10 sekund, załaduj je do instrumentu i rozpocznij bieg. Na koniec serii, dla FAM FL-DNA A i HEX IC, wybierz kolumny A, C, E i G.Dla FAM FL-DNA B i HEX IC wybierz kolumny B, D, F i H. Dla standardowej ilości wyjściowej ustaw 10 nanogramów na reakcję dla studzienek A1 i B1, dwa nanogramy na reakcję dla C1 i D1, punkt cztery nanogramy na reakcję dla E1 i F1 oraz punkt zero osiem nanogramów na reakcję dla G1 i H1. Następnie zarówno dla kanałów FAM, jak i HEX ustaw wartości fluorescencji progowej na 150.W polu Tabela wyników kliknij pozycję Opcje kolumny, następnie wybierz wszystko, a następnie przycisk OK, aby uzyskać wyniki w obu kanałach z ich odpowiednimi ostatnimi wartościami Cq i delta R, które są dostarczane przez oprogramowanie przyrządu qPCR w czasie rzeczywistym. Delta R ostatnio odpowiada wartości fluorescencji znormalizowanej do ostatniego cyklu amplifikacji. W polu Tabela wyników kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę, aby otworzyć menu kontekstowe.Kliknij przycisk Wyślij do programu Excel, aby wyeksportować nieprzetworzone dane. A następnie prześlij plik Excel do dedykowanego oprogramowania analitycznego w celu automatycznego obliczenia ilości FL-DNA. Na podstawie kombinacji wartości iFOBT i FL-DNA oszacowano dla każdego pacjenta, ryzyko raka jelita grubego.Krzywe fluorescencji odpowiedniej próbki dodatniej pokazują sygnał próbki w kanale HEX, który jest kontrolą wewnętrzną, w dopuszczalnym zakresie. Sygnał dodatni znajduje się powyżej progu na kanale FAM, co świadczy o amplifikacji genów docelowych. Krzywe fluorescencji odpowiedniej próbki ujemnej pokazują sygnał próbki w dopuszczalnym zakresie w kanale HEX.Ujemny sygnał sterujący znajduje się poniżej progu na kanale FAM. Z drugiej strony, krzywe nieodpowiedniej próbki pokazują sygnał próbki, który nie mieści się w dopuszczalnym zakresie na kanale HEX. Najprawdopodobniej z powodu potencjalnego zahamowania.W związku z tym próbkę tę należy powtórzyć, rozpoczynając ekstrakcję. Tabela wyjściowa analizy oprogramowania przedstawia dane zarówno dla mieszanki A, jak i mieszanki B pod względem stężenia FL-DNA dla kontroli reakcji, próbek klinicznych i wyników kontroli jakości. Próbka numer cztery nie ma żadnych wyników, ponieważ nie przeszła kontroli jakości.Trzeba go powtórzyć i ponownie przeanalizować. Należy zachować ostrożność podczas ponownego zawieszania DNA pod kątem skoku w kontroli krzywej standardowej. A także podczas dystrybucji różnych DNA do pasków 8-dołkowych, a także podczas detekcji molekularnej w sekcji analizy wyników.Metodę tę należy wykonać w połączeniu z testem iFOBT, aby umożliwić lepszą ocenę zmian nowotworowych jelita grubego, należy ją przeprowadzić z tą samą próbką kału.

evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Zredukowana lub brakująca ekspresja Pms2 i/lub ERCC1 w całych kryptach jest częstym zjawiskiem w obszarze 10 cm po każdej stronie gruczolaków okrężnicy, co prawdopodobnie stanowi podstawę defektu pola o wysokiej zmienności i progresji do nowotworu. Niedobór Ku86 lub CcOI jest znacznie rzadszy w tych defektach pola.

Niedobory Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI w defektach polowych podczas progresji do raka jelita grubego

Opisaliśmy procedurę dysagregacji raka jelita grubego (CRC) w celu uzyskania żywotnych pojedynczych komórek, które następnie są wychwytywane na dostosowane mikrotablice przeciwciał rozpoznających antygeny powierzchniowe (mikrotablica DotScan CRC). Subpopulacje komórek związanych z mikrotablicą mogą być profilowane za pomocą multipleksowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi.

Profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego z wykorzystaniem mikrotablicy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego

Ten film opisuje protokół izolacji DNA z próbek kału myszy z guzem jelita grubego. Wyekstrahowane DNA jest amplifikowane za pomocą PCR, a produkt jest dalej czyszczony przy użyciu podejścia opartego na kulkach magnetycznych. Metodę tę można wykorzystać do określenia wpływu wzbogacenia środowiska na mikrobiotę jelita grubego i śmiertelność zwierząt.

Izolacja DNA drobnoustrojów kału: badanie wpływu wzbogacenia środowiska na różnorodność mikrobiomu w mysim modelu guza

Zgłaszamy znaczące ulepszenia w zakresie powtarzalnego pomiaru mutacji somatycznych komórek macierzystych okrężnicy po ekspozycji myszy na potencjalne czynniki uszkadzające DNA.

Kwantyfikacja mutacji komórek macierzystych okrężnicy

Zaproponowano metodę analizy integralności DNA w bezkomórkowej frakcji supernatantu próbek moczu. Metoda ta nadaje się do wczesnego wykrywania nowotworów urologicznych i okazała się skuteczna we wczesnej diagnostyce raka pęcherza moczowego.

Analiza integralności bezkomórkowego DNA w próbkach moczu

Wzbogacenie środowiska (EE) to środowisko przetrzymywania zwierząt, które służy do ujawniania mechanizmów leżących u podstaw powiązań między stylem życia, stresem i chorobami. Protokół ten opisuje procedurę, która wykorzystuje mysi model nowotworzenia jelita grubego i EE w celu szczegółowego zdefiniowania zmian w różnorodności biologicznej mikrobioty, które mogą mieć wpływ na śmiertelność zwierząt.

Metoda określania wpływu wzbogacania środowiska na bioróżnorodność biomu mikrobiomu jelita grubego w mysim modelu guza jelita grubego

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest użytecznym narzędziem do bardzo czułego wykrywania wariantów pojedynczych nukleotydów i wariantów liczby kopii DNA. W tym miejscu przedstawiamy kluczowe zagadnienia dotyczące pomiaru rzadkich wariantów w ludzkim genomie za pomocą cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube.

Cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy pod kątem zmienności genetycznej u pacjenta ze sporadyczną rodzinną polipowatością gruczolakowatą przy użyciu formatu chip-in-a-tube

Prezentowany tutaj jest protokół do odkrycia nadekspresji genów napędzających, które utrzymują ustalone rakopodobne komórki macierzyste pochodzące z komórek HT29 jelita grubego. Przeprowadzono sekwencję RNAseq z dostępnymi danymi bioinformatycznymi w celu zbadania i zbadania sieci ekspresji genów w celu wyjaśnienia potencjalnego mechanizmu związanego z przetrwaniem docelowych komórek nowotworowych.

Odkrycie genów sterujących w guzach przypominających łodygi raka jelita grubego pochodzących z HT29

Przedstawiamy elastyczny protokół generowania wysokiej jakości metagenomów o rozmiarze wirusa (viromów) z próbek ludzkiego kału. Pierwotnie opracowany do wiromiki gleby, tutaj ten protokół został z powodzeniem zastosowany do próbek kału, umożliwiając solidną charakterystykę wirusosfery ludzkiego jelit.

Metagenomika frakcji wirusa DNA dla próbek ludzkiego kału

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Poznaj nieinwazyjną metodę wykrywania zmian nowotworowych jelita grubego za pomocą zestawu FL-DNA. To szybkie narzędzie diagnostyczne poprawia skuteczność badań przesiewowych w połączeniu z testem iFOBT.

Ocena ryzyka i rozpowszechnienia raka jelita grubego za pomocą wykrywania integralności DNA kału

Przeglądaj więcej filmów