Name: Model in vitro do badania agregacji tau za pomocą transdukcji ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Poznaj model in vitro do badania agregacji tau w ludzkich neuronach transdukowanych lentiwirusem. Ta metoda umożliwia szybką ocenę toksyczności tau i potencjalnych terapii w porównaniu do badań na zwierzętach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Peterowi Daviesowi z Albert Einstein College of Medicine za dostarczenie przeciwciał PHF-1 i CP13 oraz dr Marc Diamond z University of Texas, Southwestern, za dostarczenie konstruktów tau. Praca ta była wspierana przez granty Stowarzyszenia Alzheimera (NIRG-14-322164) dla S.H.Y. oraz z Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej (TB1-01193) dla PR.

1. Przygotowanie pożywek i odczynników
<ol>
	<li>Rozmrozić powłokę matrycy błony podstawnej dla płytek hodowlanych w temperaturze 4 °C (nie dopuścić do rozgrzania się matrycy membrany podstawnej, ponieważ spowoduje ona zestalenie). Przygotować 1 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 °C lub -70 °C.</li>
	<li>Rozpuść zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w stężeniu 10 μg/ml i przygotuj 10 μl podwielokrotności. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Do nowej, nieotwartej, 500 ml butelki DMEM/F12 z glutaminą dodaj B27 (10 ml), N2 (5 ml) i penicylinę-streptomycynę (5 ml). Umieść 50 ml tej pożywki z nerwowych komórek macierzystych (NSC) w stożkowej probówce i dodaj 10 μl 10 μg/μL (2 μg/ml final) bFGF. Przechowywać pożywkę NSC (+)bFGF w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby zrobić pożywkę (-)bFGF, użyj tej samej receptury, jak opisano w kroku 1.3, ale nie dodawaj bFGF. Pożywka ta zostanie wykorzystana do różnicowania NSC do neuronów i do utrzymania kultur neuronalnych po różnicowaniu.</li>
</ol>
2. Konstrukty lentiwirusowe
UWAGA: Zanim rozpoczniesz pracę z konstruktami lentiwirusowymi, upewnij się, że laboratorium zostało zatwierdzone do stosowania środków o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Ponadto podczas pracy z wektorami lentiwirusowymi należy stosować kaptury hodowlane BSL-2, środki ochrony osobistej (PPE) i metody utylizacji.
<ol>
	<li>Uzyskaj konstrukty tau spakowane w lentiwirusa z preferowanego źródła (zobacz Sanders et al.10 dla informacji o konstrukcie).</li>
</ol>
3. Hodowla ludzkich nerwowych komórek macierzystych
UWAGA: NSC są zazwyczaj wysiewane po 100 000–150 000 komórek/cm2, a większość dostępnych na rynku NSC jest sprzedawana jako 1 x 106 komórek/fiolkę. Protokół ten został zoptymalizowany dla 10-centymetrowych naczyń do hodowli komórkowych (chociaż można stosować inne rozmiary szalek); w związku z tym, jeśli stosowane są dostępne na rynku NSC, może być konieczne rozszerzenie NSC poprzez uprzednie wyhodowanie w sześciodołkowych szalkach, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do zasiania 10-centymetrowych szalek. Protokół ten może być alternatywnie dostosowany do różnych rozmiarów naczyń do hodowli komórkowych (ale nie zawiera instrukcji dotyczących przechodzenia NSC, ponieważ te protokoły są dostępne gdzie indziej11,12).
<ol>
	<li>W celu przygotowania płytek do hodowli komórkowych należy usunąć jedną podwielokrotność zamrożonej powłoki macierzy błony podstawnej dla płytek do hodowli komórkowych i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze 4 °C (podwielokrotności można umieścić w temperaturze 4 °C na noc w dniu poprzedzającym wysiewanie komórek). Dodać 385 μl powłoki macierzy błony podstawnej do 5 ml pożywki DMEM/F12 + penicylina-streptomycyna. 
	UWAGA: 5 ml pożywki DMEM/F12 + penicylina-streptomycyna wystarcza do pokrycia pojedynczego 10-centymetrowego naczynia (1 ml tego roztworu do powlekania macierzy błony podstawnej wystarcza do pokrycia jednego dołka z sześciodołkowego naczynia). Alternatywnie, jeśli komórki mają być utrwalone i wybarwione immunologicznie lub wybarwione na tioflawinę, hoduj komórki na szklanych szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych szalkach hodowlanych.
	<ol>
		<li>Utrzymuj pożywkę i powłokę matrycy w niskiej temperaturze przed i podczas dodawania ich do naczyń hodowlanych. Dodać powłokę macierzy błony podstawnej do szalek hodowlanych i umieścić płytki w inkubatorze (w temperaturze 37 °C) na 1 godzinę. W celu uzyskania optymalnego powlekania nie należy inkubować macierzy błony podstawnej dłużej niż lub krócej niż 1 godzinę. Po 1 godzinie odessać powłokę macierzy błony podstawnej z szalek kultur komórkowych. Upewnij się, że zbiega się to w czasie z przygotowaniem NSC do platerowania. 
		nuta: Jeśli komórki nie są rozmrażane z zamrożonych zapasów, pomiń krok 3.2 i przejdź do kroku 3.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeżeli komórki są rozmrażane z zamrożonych zapasów NSC, należy pobrać fiolkę z zamrożonymi komórkami i ogrzać ją w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 37 °C, przesuwając fiolkę w przód i w tył w wodzie. Po rozmrożeniu spryskaj fiolkę 70% etanolem i umieść ją w kapturze do hodowli komórkowych. Przenieś komórki do ~10 ml pożywki DMEM/F12 + penicylina-streptomycyna i odwiruj probówkę w temperaturze pokojowej przy 1,000 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w pożywce NSC.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki w pożywce NSC, aby uzyskać odpowiednią gęstość wysiewu dla używanego naczynia do hodowli komórkowych. 
	nuta: Na przykład, jeśli NSC są posiewane na sześciodołkowej płytce - jedna studzienka na sześciodołkowej szalce hodowlanej ma powierzchnię 9 cm2 - do wysiewu potrzeba od 900 000 do 1 350 000 komórek. Tak więc jedna fiolka zawierająca 1 000 000 komórek może być ponownie zawieszona w 2 ml pożywki i dodana do pojedynczego dołka sześciodołkowego naczynia.</li>
	<li>Dodaj wystarczającą ilość komórek zawieszonych w pożywce NSC, aby wysiać szalki hodowlane pokryte matrycą błony podstawnej (100 000 komórek/cm2) i zmieniaj pożywkę co drugi dzień (jeśli używasz zamrożonego bulionu, zmieniaj pożywkę dzień po posiewaniu, a następnie co drugi dzień). Hoduj komórki, aż będą zlewać się w 75%–80%. 
	nuta: Komórki prawdopodobnie osiągną 75%-80% konfluencji wkrótce po posiewaniu, ale może to potrwać dłużej, jeśli używane są zamrożone zapasy.</li>
	<li>Gdy NSC zlewają się w 75%-80%, rozpocznij różnicowanie neuronów, usuwając pożywkę NSC (+)bFGF i zastępując ją pożywką NSC (-)bFGF. Hodować komórki w tej pożywce (wymieniając pożywkę co drugi dzień) przez co najmniej 4 tygodnie. 
	nuta: Komórki będą się dzielić przez kilka dni po wycofaniu bFGF; W związku z tym komórki mogą osiągnąć 90–100% konfluencji. Po 4 tygodniach hodowli komórki osiągną neuronalny los i będą gotowe do leczenia lentiwirusem.</li>
</ol>
4. Transdukcja i utrzymanie kultur neuronalnych
<ol>
	<li>Aby transdukować neurony za pomocą lentiwirusa, użyj liczby mian 3,4 x 105 jednostek transdukowalnych / komórkę (100% zlewająca się 10-centymetrowa miska będzie zawierała ~10 milionów neuronów). Rozcieńczyć jednostki transdukowalne do wymaganego stężenia w pożywce do hodowli komórkowych i dodać je do komórek (użyć normalnej objętości pożywki do naczynia do hodowli komórkowych). Dwa dni po dodaniu lentiwirusa umyj komórki 1x świeżą pożywką (-)bFGF (bez lentiwirusa) i kontynuuj hodowlę w pożywce (-)bFGF jak zwykle.</li>
	<li>W przypadku leczenia po lentiwirusie należy karmić transdukowane neurony, zmieniając pożywkę do hodowli komórkowej ([-]pożywkę bFGF) co drugi dzień. Utrzymuj komórki przez ~ 8 tygodni po transdukcji. Rutynowo wizualizuj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby zapewnić żywotność. 
	nuta: Rzadkość lub pęknięcia dendrytyczne są oznakami, że komórki nie są już zdolne do życia.</li>
</ol>
5. Obrazowanie komórek
<ol>
	<li>Obrazowanie żywych komórek 
	<ol>
		<li>Po transdukcji (4 dni po dodaniu lentiwirusa) obserwuj sygnały YFP pod mikroskopem fluorescencyjnym zdolnym do obrazowania żywych komórek. Wyjmij szalki z kultur komórkowych z inkubatora i upewnij się, że studzienki hodowlane pozostają sterylne, trzymając pokrywkę na szalkach hodowlanych. Wizualizacja komórek za pomocą obiektywu 10x o długości fali wzbudzenia ~514 nm i filtrze emisyjnym ~527 nm. 
		nuta: Agregaty są zwykle widoczne w transdukowanych hodowlach komórkowych 6–8 dni po zastosowaniu lentiwirusa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie komórek utrwalonych (znakowanie β-tubuliną III i barwienie tioflawiną)
	<ol>
		<li>Aby utrwalić komórki w paraformaldehydzie (PFA), usuń pożywkę hodowlaną z transdukowanych neuronów wyhodowanych na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Przemyj komórki 1x PBS, usuń płukanie i dodaj 300–500 μl (jeśli używasz płytek 24-dołkowych) 4% PFA (rozcieńczonego w PBS) do szkiełek nakrywkowych przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usuń PFA i umyj szkiełka nakrywkowe 2x PBS.</li>
		<li>Przygotować roztwór blokujący składający się z PBS, 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,3% Triton X-100. Dodać 300–500 μl roztworu do studzienek i inkubować szkiełka nakrywkowe przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Po 2 godzinach rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (w stężeniu przeciwciał 1:500) w roztworze blokującym i dodać 300–500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Umieść talerz na kołyszącej się lub obracającej się platformie (z małą prędkością) na noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyj szkiełka nakrywkowe 3x przez 5 minut każdy PBS. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w blokującym roztworze buforowym (o stężeniu 1:1 000) i dodać roztwór przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. Wybierz odpowiednie przeciwciało drugorzędowe za pomocą znacznika fluorescencyjnego, który nie nakłada się na sygnał YFP (na przykład CY-3). Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny na kołyszącej się lub obracającej się platformie. Po 2 godzinach usunąć roztwór przeciwciał wtórnych i przemyć szkiełka nakrywkowe 3x po 10 minut za pomocą PBS.</li>
		<li>Myć szkiełka nakrywkowe w podwójnie dejonizowanej wodzie (DDW) przez 10 minut. Usunąć DDW i dodać 300 μl/studzienkę 0,015% tioflawiny-S rozcieńczonej w 50% etanolu przez 10 minut. Usunąć roztwór tioflawiny i umyć szkiełka nakrywkowe 2x po 4 minuty 50% etanolem, a następnie jedno 4-minutowe płukanie 30% etanolem i dwa płukania po 5 minut każde 30% etanolem. Umyj szkiełka nakrywkowe 1x DDW przed montażem. 
		nuta: Barwienie tioflawiną opisane w kroku 5.2.4 jest fakultatywne.</li>
		<li>Aby zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych, umieść pojedynczą kroplę nośnika montażowego po stronie "+" szkiełka podstawowego. Usuń cały płyn z dołka zawierającego szklane szkiełko nakrywkowe i za pomocą drobnych kleszków ostrożnie usuń szklane szkiełko nakrywkowe, śledząc, po której stronie znajdują się hodowane komórki.</li>
		<li>Delikatnie dociśnij krawędź szkiełka nakrywkowego do Kimwiste, aby usunąć nadmiar wilgoci. Nadal chwytając szkiełko nakrywkowe cienkimi kleszkami, przyłóż krawędź (stroną z ogniwem skierowaną w stronę spadku nośnika montażowego) szkiełka nakrywkowego do nośnika montażowego, a następnie delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na podłożu montażowym (umieszczając hodowane komórki w podłożu montażowym i umieszczając je między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym). Pozwól nośnikowi montażowemu stwardnieć przez 30 minut przed obrazowaniem. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
		<li>Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i odpowiednich widm wzbudzenia/emisji (YFP = ~514/527 nm, CY-3 = ~555/568 nm i tioflawina S = ~390/426 nm).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Metody opcjonalne
<ol>
	<li>Co 2 dni zbierać kondycjonowane podłoża z kultur i przechowywać je w temperaturze -20 °C do przyszłych analiz gatunków tau uwolnionych przez kultury.</li>
</ol>

<ol><li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+in+2015%3A+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li>
<li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li>
<li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li>
<li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li>
<li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li>
<li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li>
<li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells%2C+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).</li>
<li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).</li>
<li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje generowanie modelu ludzkiej tauopatii in vitro, który wykazuje agregaty dodatnie do barwienia srebra i splątki neurofibrylarne tioflawinowo-dodatnie (NFT). Co więcej, transdukowane komórki wykazują patologie wywołane przez tau, takie jak defekty morfologiczne, zmniejszona synaptogeneza i zwiększona objętość lizosomów. Główną zaletą tego protokołu jest to, że zapewnia on dostępny i opłacalny model tauopatii neuronalnej, który może być wykorzystany do badań przesiewowych leków, a także do analizy toksy...

Patologiczna agregacja białka tau związanego z mikrotubulami jest cechą charakterystyczną wielu chorób neurodegeneracyjnych, w tym AD, otępienia czołowo-skroniowego (FTD), choroby Picka i postępującego porażenia nadjądrowego (PSP)1. W stanie niechorobowym tau wiąże się i stabilizuje włókna mikrotubul w aksonach neuronalnych2. Jednak związana z chorobą hiperfosforylacja tau sprzyja agregacji tau, dysocjacji od mikrotubul i toksyczności neuronalnej3. Toksyczne działanie zagregowanego tau może obejmować nieprawidłową aktywację cholinergicznego4 i receptorów glutaminergiczne5, co prowadzi do rozregulowania wewnątrzkomórkowego wapnia i ostatecznie do śmierci komórki. W modelach zwierzęcych zmniejszenie tau w mózgu poprawia patologię u myszy z AD6 oraz w mysich modelach powtarzających się łagodnych urazowych uszkodzeń mózgu7.
Coraz więcej dowodów pokazuje, że struktura i powinowactwo wiązania tau pochodzącego od myszy różnią się od tau pochodzącego od człowieka i że tau myszy nie nadaje się do modelowania ludzkich tauopatii8. Jednak modele tauopatii komórek ludzkich nie są powszechnie dostępne na rynku. Ogólnym celem tej pracy jest opisanie modelu agregacji tau in vitro, w którym ludzkie neurony są transdukowane wektorami pochodzącymi z lentiwirusa zawierającymi zmutowane ludzkie konstrukty tau9. Agregacja Tau powodująca konstrukty lentiwirusowe koduje domenę powtórzeń tau zawierającą mutacje P301L i V337M połączone z reporterem YFP (Tau-RDLM-YFP), podczas gdy kontrola konstruuje kod dla domeny powtórzeń tau typu dzikiego (Wt) połączonej z reporterem YFP (Tau-Wt-YFP). Kultury neuronalne transdukowane tą metodą wyrażają około dziewięć razy więcej tau niż kultury nietransdukowane. Chociaż ilość nadekspresji tau jest mniej więcej równa między komórkami transdukowanymi Tau-RDLM-YFP i Tau-Wt-YFP, tylko neurony transdukowane Tau-RDLM-YFP wykazują agregacje. Kultury transdukowane Tau-RDLM-YFP barwią się dodatnio dla tioflawiny i wykazują zmniejszenie długości aksonów i gęstości synaptycznej. Dlatego ten model komórkowy może być użytecznym narzędziem do badania agregacji tau in vitro.

<table><tbody><tr><td>Naczynia hodowlane 10 cm</td><td>Thermofisher</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>probówki 15 ml</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>Thermofisher</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki hodowlane</td><td>Thermofisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>probówki 50 ml</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-50</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol w butelce</td> <td>z rozpylaczemRóżne źródła</td><td>NA</td><td></td></tr>: <tr><td>suplement B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Macierz błony podstawnej (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Basic FGF</td><td>Biopioneer</td><td>HRP-0011</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Różne źródła</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Różne źródła</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pożywki hodowlane DMEM-F12 z glutaminą</td><td>Thermofisher</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (stężenie 50% lub wyższe)</td><td>Różne źródła</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie</td><td>Różne źródła, zależne od eksperymentu</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Różne źródła</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>Thermofisher</td><td>1254581</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Thermofisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie nerwowe komórki macierzyste</td><td>Różne źródła</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Wektory lentiwirusowe</td><td>Różne źródła</td><td>na zamówienie</td><td></td>niestandardowe</tr><tr><td>Media montażowe</td><td>Suplement Thermofisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td><td>Różne źródła, zależne od eksperymentu</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Platforma kołysząca lub obrotowa</td><td>Różne źródła</td><td>BRAK Sterylny</td><td></td></tr><tr><td>kaptur</td> <td>do hodowli komórkowychRóżne źródła</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavin S</td><td>Sigma</td><td>T1892-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Różne źródła</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

model in vitro do badania agregacji tau za pomocą transdukcji ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Nieprawidłowa agregacja białka tau jest patogennie zaangażowana w wiele chorób neurodegeneracyjnych, w tym chorobę Alzheimera (AD). Chociaż mysie modele tauopatii dostarczyły cennego źródła do badania neurotoksycznych mechanizmów zagregowanego tau, staje się coraz bardziej oczywiste, że ze względu na międzygatunkowe różnice w neurofizjologii, mózg myszy nie nadaje się do modelowania kondycji ludzkiej. Postępy w metodach hodowli komórkowych sprawiły, że ludzkie hodowle neuronów stały się dostępne do użytku eksperymentalnego in vitro i pomogły w opracowaniu neuroterapeutyków. Jednak pomimo adaptacji kultur ludzkich komórek nerwowych, modele ludzkiej tauopatii in vitro nie są jeszcze powszechnie dostępne. Protokół ten opisuje komórkowy model agregacji tau, w którym ludzkie neurony są transdukowane wektorami pochodzącymi z lentiwirusa, które kodują patogennie zmutowane tau połączone z reporterem żółtego białka fluorescencyjnego (YFP). Transdukowane kultury wytwarzają agregaty tau, które barwią się dodatnio dla tioflawiny i wykazują markery neurotoksyczności, takie jak zmniejszona długość aksonów i zwiększona objętość lizosomów. Procedura ta może być użytecznym i opłacalnym modelem do badania ludzkich tauopatii.

Neurony transdukowane Tau-RDLM-YFP zostały oznakowane fluorescencyjnie białkiem YFP, a hodowle transdukowane RDLM wykazywały obecność agregatów po transdukcji. Inkluzje te barwiły się dodatnio tioflawiną (Rysunek 1). Jak wykazuje Rysunek 1, protokół ten pozwala na uzyskanie hodowli neuronalnych wykazujących obecność dodatnich dla tioflawiny agregatów tau. W przypadku wstępnych eksperymentów zaleca się potwierdzenie różnicowania neuronalnego poprzez immunoznakowa...

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę, w której ludzkie kultury neuronalne są transdukowane za pomocą lentiwirusowych konstruktów kodujących zmutowane ludzkie tau. Transdukowane kultury wykazują agregaty tau i związane z nimi patologie.

Model in vitro do badania agregacji tau za pomocą transdukcji ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

W tym protokole szczegółowo opisujemy model tauopatii człowieka in vitro. Metoda ta wypełnia zapotrzebowanie na materiały, które mogą być przydatne w badaniach przesiewowych leków i mechanizmach choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że paradygmat hodowli komórkowej pozwala na szybszą ocenę toksyczności tau i potencjalnych terapii tau w porównaniu z badaniami na zwierzętach: Aby rozpocząć tę procedurę, należy rozmrozić powłokę macierzy błony podstawnej dla płytek hodowlanych w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zrób jednomililitrowe porcje i przechowuj je w temperaturze minus 20 lub minus 70 stopni Celsjusza. Następnie należy rozpuścić podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów w sterylnym PBS w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Przygotuj 10-mikrolitrowe porcje i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie wyłóż nową, nieotwartą 500-mililitrową butelkę DMEM-F12 z glutaminą. Dodaj 10 mililitrów witaminy B27, pięć mililitrów N2 i pięć mililitrów penicyliny-streptomycyny, aby przygotować pożywkę dla nerwowych komórek macierzystych. Umieść 50 mililitrów pożywki NSC w stożkowej probówce i dodaj 10 mikrolitrów przygotowanego bFGF.Przechowuj ten nośnik NSC i bFGF w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw należy usunąć z zamrażarki podwielokrotność zamrożonej powłoki macierzy błony podstawnej dla płytek do hodowli komórkowych i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj 385 mikrolitrów rozmrożonej powłoki macierzy błony podstawnej do pięciu mililitrów pożywki DMEM-F12 zawierającej penicylinę-streptomycynę.Jeśli komórki są rozmrażane z zamrożonych zapasów NSC, wyjmij fiolkę z zamrożonymi komórkami z zamrażarki i podgrzej ją w łaźni wodnej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza, przesuwając fiolkę w przód iw tył w wodzie. Następnie spryskać fiolkę 70% etanolem. Następnie pod kapturem do hodowli komórkowej przenieś komórki do około 10 mililitrów pożywki DMEM-F12 zawierającej penicylinę-streptomycynę.Wirować w temperaturze pokojowej 1 000 razy g przez pięć minut. Następnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w pożywce NSC. Rozcieńczyć komórki w pożywce NSC, aby uzyskać odpowiednią gęstość wysiewu dla używanego naczynia do hodowli komórek.Dodaj wystarczającą ilość komórek zawieszonych w pożywce NSC, aby zasiać naczynia hodowlane pokryte matrycą błony podstawnej. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aż osiągną 75 do 80% konfluencji, upewniając się, że zmieniasz podłoże co drugi dzień. Aby transdukować neurony za pomocą lentiwirusa, użyj liczby mian 340 000 jednostek transdukcyjnych na komórkę.Rozcieńczyć jednostki transdukowalne w pożywce do hodowli komórkowej do wymaganego stężenia i dodać je do komórek. Dwa dni po dodaniu lentiwirusa należy raz przemyć komórki świeżą pożywką, która nie zawiera bFGF. Kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w pożywce bez bFGF.Utrzymuj komórki przez około osiem tygodni po transdukcji, upewniając się, że zmieniasz pożywkę do hodowli komórkowych co drugi dzień. Użyj mikroskopu świetlnego, aby rutynowo zwizualizować komórki i zapewnić ich żywotność. Po transdukcji wyjmij szalki hodowlane z inkubatora, upewniając się, że zakrywasz je pokrywką, aby kultura była dobrze sterylna.Użyj mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do obrazowania żywych komórek, aby zwizualizować komórki pod obiektywem 10X ze wzbudzeniem 514 nanometrów i filtrem emisyjnym 527 nanometrów. W tym badaniu neurony transdukowane lentiwirusem tau-RDLM-YFP są fluorescencyjnie znakowane YFP. Obserwuje się, że kultury transdukowane RDLM wykazują agregaty po transdukcji.Inkluzje te mają dodatni wpływ na tioflawinę. Różnicowanie neuronów potwierdza się poprzez znakowanie immunologiczne specyficznego dla neuronu markera beta-tubuliny III w hodowlach. Ważne jest, aby pamiętać, że znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe powinny mieć widmo emisji wzbudzenia, które nie pokrywa się z widmem emisji YFP.Chociaż agregaty tau o żółtej fluorescencji będą widoczne przy braku barwienia, tioflawina powinna być również stosowana do obrazowania w celu potwierdzenia, że sygnał fluorescencyjny jest zagregowanym tau, a nie szczątkami komórkowymi. Po wygenerowaniu komórek z nadekspresją tau można przeprowadzić szereg ocen zdrowia neuronów i agregacji tau. Na przykład odkryliśmy, że komórki te wykazują zwyrodnienie aksonów.Oprócz badań nad hodowlami komórkowymi zastosowaliśmy tę metodę do zbadania patogenności tau pochodzącego z zewnątrzporodu.

an-vitro-model-for-studying-tau-aggregation-using-lentiviral-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film prezentuje test komórkowy określający ilościowo wychwyt Tau przez mysi mikroglej przy użyciu wrażliwych na pH, fluorescencyjnie znakowanych agregatów Tau, analizowanych za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu oceny ilościowej.

Test komórkowy do oceny wychwytu białka tau przez mikroglej

Ten film pokazuje proces indukowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania się w neurony poprzez transfekcję ich zmodyfikowanymi lentiwirusami przenoszącymi gen neurogennego czynnika transkrypcyjnego pod kontrolą elementu reagującego na tetracyklinę, a następnie leczenie pochodną tetracykliny i pożywką do dojrzewania.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronach przy użyciu zmodyfikowanych lentiwirusów

Ten film pokazuje proces transdukcji ludzkich komórek nerwowych za pomocą lentiwirusa kodującego zmutowane ludzkie białko tau oznaczone żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP) w celu zbadania agregacji białek. Przedstawia etapy od wniknięcia wirusa do ekspresji zmutowanego tau, których kulminacją jest tworzenie widocznych cytoplazmatycznych agregatów tau w neuronach.

Transdukcja ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa do analizy agregacji białka Tau

Niezmodyfikowane i hiperfosforylowane białka tau zostały użyte w dwóch testach agregacji in vitro, aby ujawnić kinetykę szybkiej agregacji zależnej od hiperfosforylacji. Testy te torują drogę do przyszłych badań przesiewowych dla związków, które mogą modulować skłonność hiperfosforylowanego tau do tworzenia włókienek, które leżą u podstaw postępu choroby Alzheimera.

In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Test agregacji tau opisany w tym manuskrypcie naśladuje przewidywane cechy błędnego fałdowania i agregacji tau in vivo.

In vitro Test do badania agregacji białka tau i badań przesiewowych leków

Tutaj opisujemy test komórkowy do ilościowej oceny wychwytu tau przez mikroglej w celu stworzenia narzędzia badawczego do lepszego scharakteryzowania mechanizmów działania przeciwciał anty-tau.

Test komórkowy do badania klirensu Tau za pośrednictwem przeciwciał przez mikroglej

Tau jest białkiem neuronalnym obecnym zarówno w cytoplazmie, gdzie wiąże mikrotubule, jak i w jądrze, gdzie pełni niekonwencjonalne funkcje, w tym modulację genów związanych z chorobą Alzheimera. W tym miejscu opisujemy metodę badania funkcji jądrowego Tau przy jednoczesnym wykluczeniu wszelkich zakłóceń pochodzących z cytoplazmatycznego Tau.

Modulacja lokalizacji subkomórkowej Tau jako narzędzie do badania ekspresji genów związanych z chorobą

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Atakie rdzeniowo-móżdżkowe poliglutaminowe są spowodowane ekspansjami CAG prowadzącymi do tworzenia białek predysponowanych do agregacji. Ten protokół opisuje produkcję wektorów, stereotaksyczne wprowadzenie oraz analizę inkluzji i utraty markerów neuronowych, zapewniając kontrolowaną platformę do badania mechanizmów i oceny ukierunkowanych terapii chorób neurodegeneracyjnych.

Choroba zwojów wzrokowych wywołana wirusem lentywirusowym jako prekliniczny model poliglutaminowyej rdzeniowo-móżdżkowej ataksji

Poznaj model in vitro do badania agregacji tau w ludzkich neuronach transdukowanych lentiwirusem. Ta metoda umożliwia szybką ocenę toksyczności tau i potencjalnych terapii w porównaniu do badań na zwierzętach.

Model in vitro do badania agregacji tau za pomocą transdukcji ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa

Przeglądaj więcej filmów