Name: Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Poznaj metody testów wybuchu oksydacyjnego i hamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana. Szybkie i niezawodne techniki pozwalają porównywać odpowiedzi immunologiczne różnych genotypów roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w naszym laboratorium jest finansowana przez Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader's Fund, oraz Queen's University. KS i IS są wspierane przez tandemowe stypendia dla absolwentów Ontario i stypendia dla absolwentów NSERC Canada dla studentów studiów magisterskich (CGS-M).

1. Wykrywanie wyrzutu ROS w krążkach liści Arabidopsis po wywołaniu odpowiedzi immunologicznej
<ol>
	<li>Wzrost i pielęgnacja roślin.
	<ol>
		<li>Aby zsynchronizować kiełkowanie, przeprowadź stratyfikację nasion Arabidopsis , zawieszając około 50 nasion w 1 mL sterylnego 0,1% agaru [w/v] i przechowując w temperaturze 4 °C (bez dostępu światła) przez 3-4 dni. 
		UWAGA: Stratyfikuj kontrolę z linii typu dzikiego (np. Col-0) oraz genotypy o wysokiej i niskiej odpowiedzi immunologicznej (odpowiednio cpk28-1 i bak1-5, ) w celu wykorzystania ich jako kontrol wewnętrznych.</li>
		<li>Wysiej nasiona do gleby i inkubuj w standardowych warunkach krótkiego dnia (22 °C, 10 h światła, natężenie światła 150 μE/m2/s oraz wilgotność względna 65-70%).</li>
		<li>Po około 7 dniach za pomocą pęsety przesadź poszczególne siewki do nowych doniczek, zachowując odstęp co najmniej 4 cm, aby umożliwić pełny rozwój rozety. Przesadź 6-12 siewek na genotyp i przywróć standardowe warunki krótkiego dnia. Regularnie podlewaj i nawoź rośliny (1 g/L nawozu 20-20-20 co 2 tygodnie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie krążków liściowych do płytek 96-dołkowych w celu regeneracji nocnej.
	<ol>
		<li>W 4-5 tygodniu po kiełkowaniu (Rycina 1A), za pomocą ostrego wycinaka do biopsji o średnicy 4 mm pobierz jeden krążek liścia z każdej rośliny, unikając nerwu głównego i uważając, aby ograniczyć uszkodzenia tkanki (Rycina 1B). Umieść krążki liściowe w nieużywanej płytce luminometru 96-dołkowej zawierającej 100 μL ddH2O, stroną adaksjalną skierowaną do góry, aby zapobiec wysychaniu22 (Rycina 1C). W przypadku oceny wielu elicytorów, pobierz po jednym krążku z tego samego liścia dla każdego rodzaju obróbki elicytorem. 
		UWAGA: Pobieraj liście w pełni rozwinięte, od trzeciego do piątego od góry rozety, o zbliżonej wielkości i wieku, aby ograniczyć zmienność. Jeśli to możliwe, przed regeneracją nocną przetnij krążki liściowe na pół za pomocą żyletki, co zwiększy powierzchnię wystawioną na działanie roztworu elicytora23.</li>
		<li>Pozostaw do regeneracji przez noc w temperaturze pokojowej, aby zapobiec interferencji ROS produkowanych w wyniku uszkodzeń powstałych podczas pobierania krążków liściowych. Przykryj płytki pokrywką, aby zapobiec parowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzenie obróbki elicytorem i pomiar produkcji ROS.
	<ol>
		<li>Zaprogramuj czytnik płytek przed dodaniem roztworu reakcyjnego, co skróci czas między inicjacją wyrzutu ROS a pierwszymi zarejestrowanymi pomiarami. Użyj odpowiedniego oprogramowania komercyjnego do danego czytnika płytek. W naszym przypadku (patrz Spis treści), kliknij Settings i wybierz kartridż LUM96 oraz typ odczytu Kinetic. Kliknij kategorię Read Area i przeciągnij, aby zaznaczyć podzbiór dołków lub całą płytkę do odczytu. W zakładce PMT and Optics ustaw czas integracji na 1 000 ms. W zakładce Timing ustaw całkowity czas pomiaru (Total Run Time) na 40-60 min oraz odstęp (Interval) na 2 min.</li>
		<li>Usuń wodę z każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. 
		UWAGA: Nie przebijaj krążków liściowych, ponieważ może to spowodować stres związany z uszkodzeniem tkanki i doprowadzić do bardziej zmiennych wyników produkcji ROS.</li>
		<li>Przygotuj roztwór reakcyjny zawierający 100 μM luminolu, 10 μg/mL HRP oraz pożądane stężenie elicytora (np. elf18 w stężeniach 1 nM, 10 nM, 100 nM lub 1 000 nM) w sterylnej ddH2O, stosując 10 mL roztworu na jedną płytkę 96-dołkową. 
		UWAGA: Liofilizowane peptydy rozpuść w sterylnej H2O w probówkach o niskim wiązaniu (low-binding), aby przygotować roztwór zapasowy 10 mM, zamroź gwałtownie w ciekłym N2 i przechowuj w -80 °C. Przed użyciem rozcieńcz roztwory zapasowe w sterylnej H2O, aby uzyskać roztwór roboczy 100 μM i przechowuj go w -20 °C.</li>
		<li>Użyj pipety wielokanałowej, aby nanieść 100 μL mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka, dodając roztwór do wszystkich krążków liściowych poddanych tej samej obróbce w tym samym czasie22. Dla każdego genotypu uwzględnij reakcję kontrolną (bez elicytora), aby ocenić bazowy poziom ROS w przypadku braku stymulacji. Natychmiast zmierz emisję światła dla wszystkich długości fal w widmie widzialnym za pomocą czytnika mikropłytek. 
		UWAGA: Przygotuj i aplikuj roztwór reakcyjny przy słabym oświetleniu, ponieważ luminol i HRP są odczynnikami światłoczułymi. Odczynniki przechowuj w lodzie lub w -20°C, chyba że są używane.</li>
		<li>Mierz emisję światła z czasem integracji 1 000 ms w odstępach 2-minutowych przez okres 40-60 min w czytniku mikropłytek, aby zarejestrować dynamiczny wyrzut oksydacyjny (Rycina 1D). 
		UWAGA: Użyj dłuższego czasu integracji, aby zwiększyć czułość testu11, upewniając się jednocześnie, że wszystkie próbki na płytce 96-dołkowej mogą zostać zmierzone w obrębie jednego odstępu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Interpretacja danych.
	<ol>
		<li>Dla każdego genotypu użyj arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnią liczbę fotonów i błąd standardowy dla każdego punktu czasowego, a następnie przedstaw produkcję ROS jako funkcję czasu na wykresie rozrzutu. 
		<img alt="Wzór na średnią liczbę fotonów, metoda obliczeniowa, równania do analizy badań nad fotosyntezą." src="/files/ftp_upload/59437/59437eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		Gdzie t = poszczególny punkt czasowy</li>
		<li>Alternatywnie zsumuj liczbę fotonów dla każdego krążka liściowego i przedstaw średnią z tych wartości dla każdego genotypu za pomocą wykresu słupkowego z słupkami błędu standardowego lub wykresu pudełkowego. 
		<img alt="Równanie skumulowanej liczby fotonów Σ(liczba fotonów krążków liściowych), analiza pomiaru fotonów." src="/files/ftp_upload/59437/59437eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test hamowania wzrostu siewek
<ol>
	<li>Sterylizacja nasion i wysiew na płytki z pożywką Murashige i Skooga (MS).
	<ol>
		<li>Przygotować sterylną pożywkę MS o połowie stężenia (0.5x) (2.16 g/L) zawierającą 0.8% agaru [w/v]. Wlać pożywkę do płytek (90 x 15 mm) w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
		<li>Zsterylizować około 100 nasion w probówce do mikrocentryfugi, przemywając je 1 mL 70% etanolu przez 2 min, a następnie usunąć ciecz za pomocą aspiratora. Dodać 1 mL 40% roztworu wybielacza i delikatnie kołysać przez 17 min w temperaturze pokojowej. Usunąć wybielacz aspiratorem i przemyć trzy razy w 1 mL sterylnej wody przez 5 min. Zawiesić ponownie w 1 mL sterylnego 0.1% agaru. 
		UWAGA: Alternatywnie można zastosować protokół sterylizacji nasion chlorem gazowym24.</li>
		<li>Wysiać około 100 nasion na genotyp na płytkach z agarem MS za pomocą pipety i uszczelnić taśmą micropore w komorze z laminarnym przepływem powietrza. 
		UWAGA: Należy unikać sadzenia nasion zbyt blisko siebie, ponieważ utrudni to późniejsze przesadzanie siewek.</li>
		<li>Przeprowadzić stratyfikację nasion, umieszczając płytki w temperaturze 4 °C (bez światła) przez 3-4 dni w celu synchronizacji kiełkowania (Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesadzanie siewek do płytek 48-dołkowych zawierających peptydy elicytorów odporności.
	<ol>
		<li>Po stratyfikacji przenieść płytki w miejsce oświetlone w warunkach krótkiego dnia (22 °C, 10 h światła, natężenie światła 150 μE/m2/s oraz wilgotność względna 65-70%) na 3-4 dni, aby umożliwić kiełkowanie.</li>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotować rozcieńczenia peptydów elicytorów (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM i 1,000 nM) w sterylnej płynnej pożywce 0.5x MS zawierającej 1% sacharozy [w/v], używając 25 mL pożywki MS na każdą płytkę 48-dołkową. Przygotować płytki, pipetując 500 µL płynnej pożywki MS lub pożywki MS zawierającej peptydy do każdego dołka. Jeśli jest dostępny, użyć pipetora wielokanałowego w celu przyspieszenia przygotowania płytek. 
		UWAGA: Dla każdego genotypu należy hodować siewki na pożywce MS bez elicytora, aby uwzględnić wszelkie naturalne różnice we wzroście siewek.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie przesadzić jedną siewkę o tym samym rozmiarze i wieku do każdego dołka, dbając o to, aby nie uszkodzić siewki ani nie przerwać korzenia i aby korzeń był zanurzony w pożywce. Dla każdego genotypu przesadzić minimum 6-8 siewek do każdego rozcieńczenia peptydu (Rysunek 2B). 
		UWAGA: Przesadzać siewki w 4. dniu po kiełkowaniu, ponieważ krótkie korzenie są łatwiejsze w manipulacji, a starsze siewki mogą dawać mniej optymalne wyniki.</li>
		<li>Uszczelnić płytki taśmą micropore i przenieść z powrotem w miejsce oświetlone w standardowych warunkach krótkiego dnia (22 °C, 10 h światła, natężenie światła 150 μE/m2/s oraz wilgotność względna 65-70%). Pozostawić siewki do wzrostu na 8-12 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczenie procentowego zahamowania wzrostu.
	<ol>
		<li>Ostrożnie usunąć siewki z płytek 48-dołkowych i osuszyć, przykładając je do ręcznika papierowego. Zważyć siewki na wadze analitycznej i zapisać wartości. Jeśli jest dostępna, użyć wagi analitycznej z wyjściem USB, aby zapisywać wartości masy świeżej w arkuszu kalkulacyjnym. Przed ważeniem siewek wykonać zdjęcie, aby wizualnie przedstawić zahamowanie wzrostu (Rysunek 2C).</li>
		<li>Obliczyć procentowe zahamowanie wzrostu siewek traktowanych elicytorem w porównaniu do siewek hodowanych tylko na pożywce MS (Rysunek 2D) w następujący sposób: 
		<img alt="Wzór na procentowe zahamowanie wzrostu, stosunek masy siewki traktowanej do kontrolnej, równanie." src="/files/ftp_upload/59437/59437eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"></li>
		<li>Przedstawić dane na wykresie słupkowym z słupkami błędu standardowego lub na wykresie pudełkowym, aby lepiej zobrazować wariancję międzyeksperymentalną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

W artykule opisano dwie metody oznaczania odpowiedzi immunologicznych wyzwalanych wzorcem u Arabidopsis, oferując ilościowe podejścia do oceny wyniku immunologicznego bez użycia specjalistycznego sprzętu. W połączeniu, ROS i SGI wyzwalane wzorcem mogą być wykorzystywane do oceny odpowiednio wczesnych i późnych reakcji na percepcję drobnoustrojów.
Głównym ograniczeniem testu wybuchu oksydacyjnego jest zmienność. Z powodów, które nie są do końca zrozumiałe, bezwzględne RLU często różnią...

Aby dostrzec i obronić się przed patogenami, rośliny wykształciły receptory rozpoznawania wzorców związanych z błoną (PRR), które wykrywają konserwatywne cząsteczki drobnoustrojów na zewnątrz komórki, znane jako wzorce molekularne związane z mikrobami (MAMPs)1. Wiązanie MAMP z pokrewnymi im PRR inicjuje sygnalizację immunologiczną za pośrednictwem kinazy białkowej, co skutkuje odpornością na choroby o szerokim spektrum działania2. Jedną z najwcześniejszych reakcji po aktywacji PRR jest fosforylacja i aktywacja integralnych białek RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) błony komórkowej, które katalizują produkcję zewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS)3,4. ROS odgrywają ważną rolę w ustalaniu odporności na choroby, działając zarówno jako wtórni przekaźnikowie do propagacji sygnalizacji immunologicznej, jak i bezpośrednie środki przeciwdrobnoustrojowe5. Pierwsza obserwacja wybuchu oksydacyjnego wywołanego przez układ immunologiczny została opisana przy użyciu bulw ziemniaka odmiany siewnej. Rishiri po szczepieniu Phytophthora infestans6. Produkcja ROS została oceniona na kilku gatunkach roślin przy użyciu dysków liściowych7, kultur zawiesinowych komórek8 i protoplasts6. Opisana tutaj jest prosta metoda oznaczania produkcji ROS wywołanej wzorcem w krążkach liściowych Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
W odpowiedzi na percepcję MAMP, aktywowane białka RBOH katalizują produkcję rodników ponadtlenkowych (O2-), rodników hydroksylowych (•OH) i tlenu singletowego (1O2), które są przekształcane w nadtlenek wodoru (H2O2) w przestrzeni zewnątrzkomórkowej9. H2O2można określić ilościowo za pomocą chemiluminescencji na bazie luminolu w obecności czynnika utleniającego peroksydazy chrzanowej (HRP)10. HRP utleniaH2O2, generując jon wodorotlenkowy (OH−) i gazowy tlen (O2), które reagują z luminolem, tworząc niestabilny produkt pośredni, który uwalnia foton światła10. Emisja fotonów może być określana ilościowo jako względne jednostki światła (RLU) za pomocą czytnika mikropłytek lub imagera zdolnego do wykrywania luminescencji, które stały się standardowymi elementami wyposażenia w większości laboratoriów molekularnych. Mierząc światło wytwarzane w odstępach 40-60 minut, przejściowy wybuch oksydacyjny można wykryć już po 2-5 minutach od zabiegu elicytorem, osiągając szczyt po 10-20 minutach i powracając do poziomu podstawowego po ~60 minutach11. Skumulowane światło wytworzone w tym czasie może być wykorzystane jako miara siły immunologicznej odpowiadającej aktywacji białek RBOH 12. Dogodnie test ten nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani kłopotliwego przygotowania próbki.
Osiągając szczyt krótko po wykryciu MAMP, wybuch oksydacyjny jest uważany za wczesną odpowiedź immunologiczną, wraz z aktywacją MAPK i produkcją etylenu5. Późniejsze reakcje immunologiczne obejmują przeprogramowanie transkrypcji, zamknięcie aparatów szparkowych i odkładanie kalozy2,5. Długotrwała ekspozycja na MAMP nieustannie aktywuje kosztowną energetycznie sygnalizację immunologiczną, co skutkuje zahamowaniem wzrostu roślin, co wskazuje na kompromis między rozwojem a odpornością13. Hamowanie wzrostu siewek (SGI) jest szeroko stosowane do oceny produkcji immunologicznej u Arabidopsis i jest integralną częścią identyfikacji kilku kluczowych składników sygnalizacji immunologicznej, w tym PRRs14,15,16. W związku z tym w niniejszej pracy dodatkowo przedstawiono test na SGI wywołany wzorcem u rzodkiewnika, w którym siewki są hodowane na płytkach wielodołkowych zawierających standardowe pożywki lub pożywki uzupełnione elicytorem immunologicznym przez 8-12 dni, a następnie ważone za pomocą wagi analitycznej.
Aby zademonstrować, jak testy ROS i SGI mogą być używane do monitorowania sygnalizacji za pośrednictwem PRR, wybrano trzy genotypy, które reprezentują różne wyniki immunologiczne: (1) dziki typ Arabidopsis Columbia (Col-0), (2) dominująco-ujemny mutant bak1-5, w którym wielofunkcyjny koreceptor PRR BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) nie działa w sygnalizacji immunologicznej17, 18, oraz (3) recesywny mutant cpk28-1, który nie posiada białka regulatorowego CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) i wykazuje podwyższone odpowiedzi immunologiczne19,20. Testy ROS i SGI przedstawiono w odpowiedzi na syntetycznie wytworzony epitop peptydu elf18 bakteryjnego czynnika wydłużenia Tu (EF-Tu), rozpoznany u Arabidopsis przez PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Protokoły te mogą być używane z innymi elicytorami immunologicznymi, takimi jak białko ruchliwości bakteryjnej flagelina14 lub endogenne białka elicytorowe roślin (AtPeps)16, jednak należy zauważyć, że reakcja roślin różni się w zależności od elicitora21. Testy ROS i SGI mogą być wykorzystywane do szybkiej i ilościowej oceny wczesnych i późnych odpowiedzi za pośrednictwem PRR.

<table><tbody><tr><td>20-20-20 Nawóz</td><td>Prod dla roślin</td><td>10529</td><td>Wymieszaj 1 g/l w wodzie i stosuj na rośliny co 2 tygodnie dla optymalnego wzrostu.</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 4 mm</td><td>Medical Mart</td><td>232-33-34-P</td><td>Można również użyć zestawu świdrów korkowych o powierzchni 0,125 cm^2.</td></tr><tr><td>48-dołkowe sterylne płytki z pokrywką</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna z osłoną roboczą</td><td>VWR</td><td>VWR-225AC</td><td>Do testów inicjacji wzrostu można użyć dowolnej standardowej wagi analitycznej, jednak optymalne jest bezpośrednie wyjście komputerowe.</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa BioHit mLine Mechanical 12 (30-300 uL)</td><td>Sartorius</td><td>725240</td><td>Można użyć dowolnej pipety wielokanałowej, a w razie potrzeby także pipety pojedynczej.</td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>EZ Biolab</td><td>cp7211</td><td>Przechowuj 10 mM peptydu podstawowego w temperaturze -80C w probówkach o niskiej zawartości białka. Po rozmrożeniu przechowywać 100 uM zapasu roboczego w temperaturze -20C.</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Rozpuścić w czystej wodzie. Przechowywać w temperaturze -20C i z dala od światła.</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>rozpuszcza się w DMSO. Przechowywać w temperaturze -20C i z dala od światła.</td></tr><tr><td>Murisage and Skoog Basal Salts</td><td>Cedarlane Labs</td><td>MSP09-100LT</td><td>Przechowywać w temperaturze 4C.</td></tr><tr><td>Gleba</td><td>SunGrow Horticulture</td><td>Sunshine Mix #1</td><td>Inne rodzaje gleby mogą być również wykorzystywane do uprawy Arabidopsis. Wymieszaj z wodą podczas napełniania doniczek.</td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek SpectraMax Paradigm z modułem LUM</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Proszę poprosić o wycenę</td><td>Do tych testów można użyć dowolnego czytnika płytek zdolnego do wykrywania luminescencji.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Białe płytki 96-dołkowe z polistyrenu</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr></tbody></table>

testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Rośliny wykształciły silny system odpornościowy, który pozwala na rozpoznawanie patogenów i ochronę przed chorobami. W artykule opisano dwa testy, które można wykorzystać do pomiaru siły aktywacji immunologicznej Arabidopsis thaliana po leczeniu cząsteczkami elicytora. Na wstępie przedstawiono metodę wychwytywania szybko indukowanego i dynamicznego wybuchu oksydacyjnego, który można monitorować za pomocą testu opartego na luminolach. Druga przedstawiona jest metoda opisująca, w jaki sposób można zmierzyć indukowane przez układ immunologiczny hamowanie wzrostu siewek. Protokoły te są szybkie i niezawodne, nie wymagają specjalistycznego szkolenia ani sprzętu i są szeroko stosowane do zrozumienia genetycznych podstaw odporności roślin.

Rośliny mutantów cpk28-119,25 oraz bak1-517,18 zostały wykorzystane do zademonstrowania oczekiwanych wyników dla genotypów z odpowiednio wysoką i niską odpowiedzią immunologiczną w testach wyrzutu oksydacyjnego oraz SGI w stosunku do kontrolnego tła typu dzikiego (Col-0). W celu oceny efektów zależnych od dawki zastosowano 10-krotny szereg rozcieńczeń pep...

Ten artykuł opisuje dwie metody ilościowego określania reakcji obronnych u Arabidopsis thaliana po ekspozycji na elicytory immunologiczne: przejściowy wybuch oksydacyjny i zahamowanie wzrostu siewki.

Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Testy te można wykorzystać do oceny i porównania wyników immunologicznych różnych genotypów roślin. Główną zaletą tych technik jest to, że są szybkie, niezawodne i wykorzystują zwykły sprzęt laboratoryjny. Do testu zahamowania wzrostu sadzonki tej samej wielkości i w tym samym wieku powinny zostać przesadzone i całkowicie osuszone przed ważeniem, aby ograniczyć zmienność.Po czterech do pięciu tygodniach od wykiełkowania użyj ostrego, czteromilimetrowego stempla do biopsji, aby usunąć jeden krążek liściowy z każdej rośliny Arabidopsis, omijając żyłę środkową i uważając, aby ograniczyć zranienia. Zebrać krążki do indywidualnych studzienek nieużywanej 96-dołkowej płytki luminometrycznej zawierającej 100 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody na studzienkę, stroną adaksjalną do góry, aby zapobiec wysuszeniu. W przypadku oceny wielu elicytorów należy usunąć drugi krążek liściowy z tego samego liścia przy każdym działaniu elicytora i przykryć płytkę pokrywką, aby umożliwić krążkom liściowym regenerację przez noc w temperaturze pokojowej.Następnego ranka ustaw parametry czytnika mikropłytek na czas integracji 1000 milisekund w dwuminutowych odstępach w okresie od 40 do 60 minut, aby uchwycić dynamiczny wybuch oksydacyjny. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej zastąp wodę w każdej studzience 100 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu reakcyjnego, w tym kontrolną, bez reakcji elicytorowej dla każdego genotypu, aby ocenić poziomy form tlenu w reakcji podstawowej przy braku wywołania. Następnie natychmiast zmierz emisję światła dla wszystkich długości fal w widmie widzialnym na czytniku mikropłytek.Po czterech dniach od wykiełkowania załaduj każdą studzienkę 48-dołkowej płytki 500 mikrolitrami pożywki MS uzupełnionej rozcieńczeniem peptydu elicytorowego. Następnie użyj sterylnych kleszczy, aby ostrożnie przesadzić sześć do ośmiu sadzonek tej samej wielkości, wieku i genotypu do każdego rozcieńczenia peptydów, uważając, aby nie doszło do uszkodzenia sadzonki lub złamania korzenia i że korzeń jest zanurzony w podłożu. Gdy wszystkie sadzonki zostaną platerowane, uszczelnij płytki taśmą Micropore i umieść rośliny w standardowych warunkach dnia krótkiego na osiem do 12 dni.Aby określić procentowe zahamowanie wzrostu, zrób zdjęcie, aby wizualnie zarejestrować zahamowanie wzrostu przed ostrożnym wyjęciem sadzonek z każdej studzienki. Następnie przetrzyj korzenie ręcznikiem papierowym do wyschnięcia i zważ każdą sadzonkę na wadze analitycznej. W tym reprezentatywnym eksperymencie zmutowane rośliny z nadpobudliwą sygnalizacją immunologiczną wykazały wyższy skumulowany i średni wybuch oksydacyjny w porównaniu z roślinami Arabidopsis typu dzikiego, podczas gdy zmutowane rośliny z upośledzoną sygnalizacją immunologiczną wykazywały zmniejszony wybuch oksydacyjny w stężeniach od 10 do 1 000 nanomolowych.Oczekiwane różnice w hamowaniu wzrostu siewek można było również dostrzec między wszystkimi genotypami uprawianymi w stężeniach 100 i 1000 nanomolowych peptydów elicytorowych. Podczas uprawy w rozcieńczeniu peptydu 1000 nanomolowych, mutanty z nadpobudliwą sygnalizacją immunologiczną były znacznie mniejsze niż rośliny typu dzikiego uprawiane w tych samych warunkach, podczas gdy mutanty z upośledzoną sygnalizacją immunologiczną wykazywały słabe hamowanie wzrostu w porównaniu z roślinami typu dzikiego. Metody te dostarczają dowodów na wczesną i późną odpowiedź immunologiczną.Kilka innych technik, w tym testy kinazy MAP, ekspresja genów indukowana patogenem i testy infekcji, można wykorzystać do wyznaczenia tych szlaków. Techniki te zostały zmodyfikowane do stosowania w badaniach przesiewowych na dużą skalę, które z powodzeniem zidentyfikowały białka receptora patogenu i kilka innych składników sygnałowych.

pattern-triggered-oxidative-burst-seedling-growth-inhibition-assays

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano test oparty na śmierci komórek w celu badania PTI u roślin Nicotiana benthamiana.

Analiza odporności wywołanej przez wzorce molekularne związane z patogenami (PTI) u roślin

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Ten film pokazuje test do pomiaru wybuchu oksydacyjnego w liściach Arabidopsis po wywołaniu odporności. Krążki liściowe, wycięte z liści roślin, są inkubowane z peptydami bakteryjnymi działającymi jako wzorce molekularne związane z drobnoustrojami lub MAMP. Po wykryciu MAMP komórki roślinne indukują produkcję zewnątrzkomórkowego ROS, który jest wykrywany za pomocą testu chemiluminescencyjnego.

Test do wykrywania wybuchu oksydacyjnego w krążkach liści Arabidopsis po wywołaniu immunologicznym

Ten film demonstruje test hamowania wzrostu siewek w roślinie Arabidopsis thaliana. Określa się wpływ zwiększonego stężenia elicytora peptydów immunologicznych na wzrost siewek.

Pomiar indukowanego przez układ odpornościowy zahamowania wzrostu siewek

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Celem tego badania było określenie wpływu sterylizacji wybielaczem i chlorem gazowym na kiełkowanie nasion szeregu genotypów Arabidopsis uprawianych na sterylnych podłożach. Opracowano zoptymalizowane protokoły sterylizacji, aby zapobiec rozwojowi zanieczyszczeń mikrobiologicznych, zapewniając jednocześnie zadowalającą przeżywalność nasion.

Standaryzowana metoda wysokoprzepustowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Dostępny jest protokół o wysokiej przepustowości do powierzchniowej sterylizacji nasion Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optymalizujący etapy obsługi cieczy za pomocą prostego urządzenia ssącego zbudowanego z pompą próżniową. Setki próbek nasion można wysterylizować powierzchniowo w ciągu jednego dnia.

Wysokowydajna, wytrzymała i bardzo elastyczna w czasie metoda powierzchniowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Poznaj metody testów wybuchu oksydacyjnego i hamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana. Szybkie i niezawodne techniki pozwalają porównywać odpowiedzi immunologiczne różnych genotypów roślin.

Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana

Przeglądaj więcej filmów