Mikroskopia obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia w celu skutecznego rozróżniania sygnałów fluorescencyjnych
22 sierpnia 2019
Obrazowanie spektralne stało się niezawodnym rozwiązaniem do identyfikacji i separacji wielu sygnałów fluorescencyjnych w jednej próbce i może łatwo odróżnić interesujące sygnały od tła lub autofluorescencji. Obrazowanie hiperspektralne ze skanowaniem wzbudzenia ulepsza tę technikę, skracając niezbędny czas akwizycji obrazu przy jednoczesnym zwiększeniu stosunku sygnału do szumu.
Protokół ten jest istotny, ponieważ opisuje metodę, która może być użyta do rozdzielenia kilku sygnałów fluorescencyjnych w jednej próbce. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, wzbudzenie i skanowanie może zwiększyć szybkość eksperymentu i poprawić czułość danych. Dzięki zastosowaniu różnych źródeł oświetlenia, takich jak laser superkontinuum, metoda ta może być stosowana w systemach wirującego dysku lub laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.
Podczas wykonywania skanów wzbudzenia, mikroskopii obrazowania spektralnego, ważne jest, aby sprawdzić, czy pik wzbudzenia każdej etykiety fluorescencyjnej występuje na innej długości fali. Aby rozpocząć, ustaw odwrócony mikroskop fluorescencyjny i kamerę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie załaduj próbkę na stolik.
Z menu rozwijanego w oknie głównym mikromenedżera wybierz 475 nanometrów do początkowego przeglądania próbki. Następnie kliknij dwukrotnie pole obok ekspozycji i wprowadź 100, aby ustawić czas ekspozycji na 100 milisekund. Na koniec kliknij przycisk na żywo, aby wyświetlić przykład.
Teraz kliknij Auto. Przycisk automatycznego zakresu widzenia intensywności, aby przenieść minimalne i maksymalne wartości do znaczących, wizualnych zakresów. Następnie użyj pokręteł ostrości mikroskopu, aby ustawić ostrość próbki.
Po ustawieniu ostrości dostosuj położenie próbki tak, aby jej krawędź znajdowała się w środku pola widzenia. Następnie dostosuj ostrość. Próbka jest ostra, gdy elementy krawędzi obrazu wydają się ostre.
Teraz otwórz narzędzie do akwizycji wielowymiarowej. W menu kliknij przycisk ładowania i wybierz wstępnie ustawione ustawienie zawierające odpowiedni zakres długości fal do akwizycji spektralnej. Po potwierdzeniu ustawień akwizycji przejdź do pustego obszaru próbki i kliknij przycisk uzyskaj, aby zebrać stos obrazów spektralnych zawierający tło i szum, który można później odjąć.
Następnie poruszaj się po próbce, aby znaleźć najjaśniejsze obszary. Próbki mogą mieć intensywniejszą fluorescencję z dala od krawędzi próbki. Po zlokalizowaniu najjaśniejszego obszaru zrób pojedynczy stos obrazów.
Załaduj uzyskany obraz do obrazu J i użyj funkcji pomiaru obrazu J, aby potwierdzić, że żadne długości fal nie zawierają prześwietlonych pikseli. Jeśli konieczne jest skrócenie czasu naświetlania z powodu prześwietlenia, obraz tła należy również wykonać ponownie z nowym czasem naświetlania. Jeśli okaże się, że którykolwiek z obrazów zawiera górny limit wykrywalności kamery, dostosuj czas ekspozycji skanowania spektralnego, aby upewnić się, że maksymalny sygnał w całym zakresie widmowym nie przekracza zakresu dynamicznego kamery.
Po ustaleniu odpowiedniego czasu naświetlania, umieścić nieoznakowaną próbkę na stoliku. Uzyskaj dane obrazu spektralnego z nieznakowanej próbki, aby określić, czy pod spodem znajduje się autofluorescencja. Następnie umieść pojedynczą próbkę na stoliku.
Uzyskaj dane obrazu spektralnego z każdej z pojedynczo znakowanych próbek, aby użyć ich jako kontroli spektralnej w celu zbudowania biblioteki spektralnej. Wykonaj skanowanie dla każdej próbki kontrolnej przy użyciu identycznego zakresu długości fali, czasu ekspozycji i ustawień kamery. Następnie umieść szkiełko zawierające próbkę doświadczalną pod mikroskopem.
Wybierz pole widzenia, które ma odpowiednio oznaczone komórki i uzyskaj dane obrazu spektralnego z próbki, korzystając z określonych ustawień akwizycji. Koryguj obrazy do płaskiej odpowiedzi spektralnej, odejmując widmo tła od przykładowego obrazu i mnożąc obraz przez współczynnik korekcji. W tym przypadku skrypt MATLAB służy do szybkiego przetwarzania obrazów.
Następnie wygeneruj bibliotekę spektralną. Aby uzyskać najlepsze wyniki, znormalizuj każdy element końcowy do pasma długości fali o największym natężeniu, określając, które pasmo długości fali ma największą wartość i dzieląc pomiar w każdym paśmie długości fali przez tę wartość maksymalną. Następnie zapisz dane spektralne jako plik dat.
Po zakończeniu rozmieszaj dane obrazu spektralnego. Krok rozmieszania spowoduje wygenerowanie obrazu obfitości dla każdej etykiety fluorescencyjnej, gdzie obfitość to ilość względnego sygnału fluorescencyjnego na obrazie z prospektywnej etykiety. Następnie otwórz każdy niezmieszany obraz, aby wizualnie sprawdzić rozkład czystych składników.
Porównaj skalę obrazu błędu z rozmiarem obrazów niezmieszanych. Jeśli wielkość obrazu błędu jest podobna do obrazów niezmieszanych obfitości, sygnały w danych obrazu widmowego mogą nie być dokładnie uwzględnione. Na koniec sprawdź, czy nie ma niezidentyfikowanych szczątkowych struktur, porównując obraz błędu z niezmieszanymi obrazami.
Przy prawidłowym przeprowadzeniu procesu rozmieszania spektralnego umożliwia rozdzielenie stosu obrazów spektralnych na odpowiednie wkłady z każdej etykiety fluorescencyjnej. Tutaj niemieszany zestaw obrazów spektralnych z indywidualnymi obrazami podkreślającymi autofluorescencję komórek mięśni gładkich dróg oddechowych, sondę GCaMP i znacznik mitochondrialny. Istnieje wysoki błąd związany z obszarami jądrowymi i okołojądrowymi komórek, co wskazuje, że zmierzone widma tych regionów nie są dobrze uwzględnione w widmach w bibliotece spektralnej.
Czyste widma zebrane ze znakowanych komórek, które są również autofluorescencyjne, prawdopodobnie zanieczyszczą profil widmowy czystego składnika. Tutaj można zobaczyć różnicę między niemieszaniem z czystymi widmami zanieczyszczonymi autofluorescencją, a skorygowanymi czystymi widmami po odjęciu skalowanym. Właściwa akwizycja danych jest niezbędna podczas obrazowania wrażliwych próbek, ponieważ mogą one przetrwać tylko jedną sesję obrazowania, w przeciwieństwie do tła i kontroli, które mogą zostać ponownie zobrazowane.
Upewnij się, że odpowiedni sprzęt i ustawienia akwizycji są w jak największym stopniu określone. W kolejnym kroku filmy utworzone na podstawie danych poklatkowych uzyskanych za pomocą tego systemu mogą być wykorzystane do śledzenia źródeł fluorescencyjnych w dyskretnych lokalizacjach w czasie, takich jak lokalizacja sygnału drugiego komunikatora. Zachowaj ostrożność podczas korzystania z silnych źródeł światła, aby uniknąć ekspozycji oczu.
Pamiętaj również, aby nosić odpowiednie rękawice podczas pracy z etykietami biologicznymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę rozdzielania wielu sygnałów fluorescencyjnych w pojedynczej próbce z wykorzystaniem obrazowania hiperspektralnego z przeskanowaniem wzbudzenia. Technika ta zwiększa szybkość przeprowadzania eksperymentów i poprawia czułość danych w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Techniki obrazowania
- Przetwarzanie sygnałów
Wstęp
- Sygnały fluorescencyjne mogą być trudne do rozróżnienia ze względu na szum tła.
- Tradycyjne metody obrazowania mogą być powolne i mniej czułe.
- Skanowanie wzbudzenia w obrazowaniu hiperspektralnym stanowi rozwiązanie tych problemów.
- W celu uzyskania lepszych wyników można zastosować różne źródła oświetlenia.
Cel badania
- Aby zapewnić niezawodną metodę rozdzielania wielu sygnałów fluorescencyjnych.
- Aby zwiększyć szybkość i czułość eksperymentów z obrazowania fluorescencyjnego.
- Aby zademonstrować możliwość zastosowania tej metody w różnych systemach mikroskopowych.
Zastosowane metody
- Konfiguracja odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego oraz kamery.
- Wykorzystanie lasera superkontinuum jako źródła oświetlenia.
- Umieszczenie próbek na stoliku mikroskopu.
- Weryfikacja pików wzbudzenia przy różnych długościach fal dla każdego znacznika fluorescencyjnego.
Główne wyniki
- Obrazowanie hiperspektralne z przesuwaniem wzbudzenia znacznie skraca czas akwizycji.
- Poprawiony stosunek sygnału do szumu zwiększa jakość danych.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w systemach konfokalnych z dyskiem obrotowym lub skanowaniem laserowym.
- Wykazano skuteczną separację wielu sygnałów fluorescencyjnych.
Wnioski
- Hiperspektralne obrazowanie z przeskanowaniem wzbudzenia jest cennym narzędziem dla badaczy.
- Metoda ta może prowadzić do bardziej wydajnego i czułego obrazowania fluorescencyjnego.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć różne dziedziny badań biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Hyperspektralne obrazowanie z przeskanowaniem wzbudzenia rozwiązuje kluczowy problem w procesach odkrywania opartych na fluorescencji: brak możliwości szybkiego i czułego rozdzielenia nakładających się sygnałów z wielu sond w złożonych próbkach biologicznych. Dzięki poprawie szybkości akwizycji oraz stosunku sygnału do szumu, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i minimalizacji ryzyka mechanistycznego, szczególnie w wczesnym etapie screeningu fenotypowego, gdzie separacja sygnałów jest krytyczna. Jej kompatybilność ze standardowymi platformami mikroskopowymi umożliwia skalowalną integrację z zakładowymi potokami obrazowania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację sygnałów fluorescencyjnych z różnych sond, co pozwala na wyjaśnienie zaangażowania szlaków sygnałowych i swoistości celu.
- Wartość operacyjna: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną dzięki rozdzielaniu widm (spectral unmixing), wspierając funkcjonalną walidację celu za pomocą ilościowej dekonwolucji sygnału.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w identyfikacji wiodących związków (lead identification) poprzez minimalizację wyników fałszywie dodatnich wynikających z nakładania się widm lub interferencji autofluorescencji.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewania poprzez tworzenie bibliotek widmowych, co zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty.
- Skalowalność: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w różnych projektach dzięki standaryzowanym przepływom pracy w zakresie akwizycji i rozplatania widm, co skraca czas ponownego opracowywania analiz.
- Wynik ilościowy: Generuje obrazy obfitości dla każdego fluoroforu, umożliwiając precyzyjne porównanie intensywności sygnału w różnych warunkach w celu wyboru hitów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zachowuje wierność sygnału od etapu odkrycia po modele przedkliniczne poprzez korekcję autofluorescencji i zanieczyszczeń spektralnych.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go, dostarczając czyste, rozdzielone dane z kanałów, które odzwierciedlają rzeczywisty sygnał biologiczny, a nie artefakty.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Izoluje sygnały z organelli lub przedziałów komórkowych (np. mitochondriów, cytozolu), aby potwierdzić zaangażowanie celu w systemach istotnych dla danej choroby.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywania leków – od wczesnej walidacji celu po optymalizację związku wiodącego – w których wielokanałowe odczyty fluorescencyjne są wykorzystywane do oceny mechanizmu działania, toksyczności oraz modulacji szlaków sygnałowych. Pozwala ona na niezawodne przekazywanie wyników między zespołami biologicznymi a analitycznymi poprzez dostarczanie zestandaryzowanych i mierzalnych wyników obrazowania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez rozdzielanie sygnałów z wielu znaczników (np. GCaMP, barwnik mitochondrialny, autofluorescencja) w obrazowaniu żywych komórek.
- Przesiewanie: Zwiększa gotowość testów dzięki powtarzalnej akwizycji widm i odejmowaniu tła, co poprawia współczynnik Z-factor oraz pewność identyfikacji hitów.
- Analityka: Dostarcza mapy obfitości po rozdzieleniu sygnałów (unmixing) oraz metryki błędów, które umożliwiają statystyczne porównanie wkładu fluoroforów w różnych grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy się z walidacją przedkliniczną, zapewniając, że sygnały fluorescencyjne wykorzystywane jako biomarkery nie są zaburzone przez przenikanie widmowe (spectral bleed-through) lub autofluorescencję.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy scentralizowaną bibliotekę widm oraz SOP dla akwizycji hiperspektralnej, co sprzyja spójności między projektami i ogranicza redundantny rozwój metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności widmowej i poprawę wierności sygnału.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i przepustowość dzięki szybszej akwizycji oraz standaryzowanej kalibracji z wykorzystaniem oświetlenia superkontinuum.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając uzyskanie większej ilości danych z jednej próbki i redukując liczbę powtórnych obrazowań wynikających ze słabej separacji sygnałów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka, dostarczając czystsze i bardziej interpretowalne dane obrazowe dla etapów decyzyjnych między fazą odkryć a etapami przedklinicznymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej, obrazowania spektralnego oraz narzędzi do przetwarzania obrazów, takich jak ImageJ i MATLAB.
- Zależne od strojonych źródeł oświetlenia (np. lasera superkontinuum) oraz detektorów o odpowiednim zakresie dynamicznym i czułości.
- Wymaga standaryzacji ustawień akwizycji, czasów ekspozycji oraz generowania bibliotek spektralnych pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Należy uwzględnić autofluorescencję w próbkach biologicznych, co wymaga pomiarów kontrolnych i odejmowania widm, aby uniknąć zanieczyszczenia widm czystych komponentów.
- Ograniczone ryzykiem fototoksyczności w zastosowaniach z żywymi komórkami, co wymusza staranne zarządzanie ekspozycją w celu zachowania żywotności próbek podczas akwizycji.
