Name: Mikroskopia obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia w celu skutecznego rozróżniania sygnałów fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Poznaj metodę obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia do rozdzielania wielu sygnałów fluorescencyjnych w jednej próbce. Technika ta zwiększa szybkość eksperymentów i poprawia czułość danych w porównaniu do tradycyjnych metod mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 oraz Abraham Mitchell Cancer Research Fund.

Doktorzy Leavesley i Rich ujawniają udziały finansowe w start-upie SpectraCyte LLC, założonym w celu komercjalizacji technologii obrazowania spektralnego.

Optymalne wykorzystanie zestawu do obrazowania hiperspektralnego ze skaningiem wzbudzenia rozpoczyna się od budowy ścieżki światła. W szczególności wybór źródła światła, filtrów (przestrajalny i dichroiczny), metoda przełączania filtrów i kamera określają dostępny zakres spektralny, możliwą prędkość skanowania, czułość detektora i próbkowanie przestrzenne. Lampy łukowe rtęciowe oferują wiele szczytów długości fali wzbudzenia, ale nie zapewniają płaskiego wyjścia spektralnego i będą wymagały znacznej redukcji sygnału na p...

Obrazowanie spektralne może być wykonywane na różne sposoby i jest określane kilkoma terminami1,2,3,4. Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie spektralne odnosi się do danych uzyskanych w co najmniej dwóch wymiarach przestrzennych i jednym wymiarze spektralnym. Obrazowanie wielospektralne i hiperspektralne najczęściej rozróżnia się na podstawie liczby pasm długości fal lub tego, czy pasma widmowe są przyległe1. W tym zastosowaniu dane hiperspektralne definiuje się jako dane spektralne uzyskane w ciągłych pasmach długości fal uzyskanych przez odstępy między środkowymi długościami fal nie mniejszymi niż połowa pełnej szerokości przy połowie maksimum (FWHM) każdego filtra pasmowoprzepustowego używanego do wzbudzenia (tj. odstęp między długościami fali środkowej 5 nm dla filtrów pasmowoprzepustowych o szerokości pasma 14-20 nm). Ciągły charakter pasm danych pozwala na nadpróbkowanie zbioru danych, zapewniając, że kryteria Nyquista są spełnione podczas próbkowania domeny spektralnej.
Obrazowanie hiperspektralne zostało opracowane przez NASA w latach 70. i 80. w połączeniu z pierwszym satelitą Landsat5,6. Zebranie danych z kilku sąsiadujących ze sobą pasm spektralnych pozwoliło na wygenerowanie widma promieniowania każdego piksela. Identyfikacja i zdefiniowanie widma promieniowania poszczególnych składników umożliwiło nie tylko wykrycie materiałów powierzchniowych na podstawie ich charakterystycznych widm, ale także pozwoliło na usunięcie sygnałów interweniujących, takich jak zmiany sygnału spowodowane warunkami atmosferycznymi. Koncepcja wykrywania materiałów na podstawie ich charakterystycznych widm została zastosowana do systemów biologicznych w 1996 roku, kiedy Schröck i in. wykorzystali kombinacje pięciu różnych fluoroforów i ich znanych widm do rozróżnienia znakowanych chromosomów w procesie zwanym kariotypowaniem spektralnym7. Technika ta została opracowana w 2000 roku przez Tsurui i in. do obrazowania fluorescencyjnego próbek tkanek, przy użyciu siedmiu barwników fluorescencyjnych i dekompozycji wartości osobliwych w celu uzyskania separacji widmowej każdego piksela na liniowe kombinacje widm w bibliotece referencyjnej8. Podobnie jak w przypadku ich odpowiedników teledetekcyjnych, udział każdego znanego fluoroforu można obliczyć na podstawie obrazu hiperspektralnego, biorąc pod uwagę a priori informacje o widmie każdego fluoroforu.
Obrazowanie hiperspektralne było również wykorzystywane w obszarach rolnictwa9, astronomy10, biomedicine11, chemical imaging12, aplikacje środowiskowe13, eye care14, food science15, kryminalistyka16,17, medycyna18, mineralogy19 oraz surveillance20. Kluczowym ograniczeniem obecnych systemów obrazowania hiperspektralnego mikroskopu fluorescencyjnego jest to, że standardowa technologia obrazowania hiperspektralnego izoluje sygnały fluorescencyjne w wąskich pasmach poprzez: 1) najpierw filtrowanie światła wzbudzenia w celu kontrolowania wzbudzenia próbki, a następnie 2) dalsze filtrowanie emitowanego światła w celu rozdzielenia emisji fluorescencji na wąskie pasma, które później można później rozdzielić matematycznie21. Filtrowanie zarówno oświetlenia wzbudzenia, jak i emitowanej fluorescencji zmniejsza ilość dostępnego sygnału, co obniża stosunek sygnału do szumu i wymaga długich czasów akwizycji. Słaby sygnał i długie czasy akwizycji ograniczają możliwość zastosowania obrazowania hiperspektralnego jako narzędzia diagnostycznego.
Opracowano metodę obrazowania, która wykorzystuje obrazowanie hiperspektralne, ale wzmacnia dostępny sygnał, skracając tym samym niezbędny czas akwizycji21,22. Ta nowa metoda, zwana obrazowaniem hiperspektralnym ze skanowaniem wzbudzenia, pozyskuje dane obrazu spektralnego poprzez zmianę długości fali wzbudzenia i zbieranie szerokiego zakresu emitowanego światła. Wcześniej wykazano, że technika ta powoduje wzrost o rzędy wielkości stosunku sygnału do szumu w porównaniu z technikami skanowania emisji21,22. Wzrost stosunku sygnału do szumu wynika w dużej mierze z szerokiego pasma przepustowego (~600 nm) wykrywanego światła emisyjnego, podczas gdy specyficzność zapewnia filtrowanie tylko światła wzbudzającego zamiast emisji fluorescencji. Dzięki temu całe emitowane światło (dla każdej długości fali wzbudzenia) dociera do detektora21. Dodatkowo technika ta może być stosowana do odróżniania autofluorescencji od etykiet egzogennych. Co więcej, możliwość skrócenia czasu akwizycji dzięki zwiększonemu wykrywalnemu sygnałowi zmniejsza niebezpieczeństwo fotowybielania, a także umożliwia skanowanie spektralne z szybkością akwizycji, która jest akceptowalna dla spektralnego obrazowania wideo.
Celem tego protokołu jest służenie jako przewodnik po pozyskiwaniu danych do mikroskopii obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia. Ponadto dołączone są opisy, które pomagają zrozumieć ścieżkę światła i sprzęt. Opisano również implementację oprogramowania open-source dla mikroskopu obrazowania hiperspektralnego ze wzbudzeniem i skaningiem. Na koniec znajdują się opisy, jak skalibrować system do standardu identyfikowalnego przez NIST, dostosować ustawienia oprogramowania i sprzętu w celu uzyskania dokładnych wyników oraz rozdzielić wykryty sygnał na wkłady z poszczególnych komponentów.

<table><tbody><tr><td>Komórki mięśni gładkich dróg oddechowych</td><td>National Disease Research Interchange (NDRI)</td><td>Izolowane z ludzkich tkanek płuc uzyskane z NDRI</td><td>Wysoce autofluorescencyjne, wrażliwe na wapń komórki</td></tr><tr><td>Automated Shutter</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SHB1</td><td>Zdalnie sterowana migawka minimalizująca fotowybielanie</td></tr><tr><td>Zautomatyzowany stolik</td><td>Prior Scientific</td><td>H177P1T4</td><td>Zdalnie sterowany stolik do automatycznego zbierania obrazów z wieloma polami widzenia lub zszytych.</td></tr><tr><td>Zautomatyzowany kontroler stopnia (XY)</td><td>Prior Scientific</td><td>Proscan III (H31XYZE-US)</td><td>Do łączenia zautomatyzowanego stolika z komputerem i joystickiem</td></tr><tr><td>Bufor</td><td>Wykonane we własnym zakresie</td><td>Wykonane we własnym zakresie</td><td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glukozy, 1 mM MgCl2 i 1mM CaCl2, przy pH 7,3</td></tr><tr><td>Komora komórkowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>, A7816</td><td>Uchwyt szkiełka nakrywkowego wykonany z chirurgicznej stali nierdzewnej i gumowego pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym do uszczelniania mediów i zapobiegania zanieczyszczeniu próbki i/lub obiektywu</td></tr><tr><td>Filtry wzbudzenia</td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-378/16</td><td>Środkowy zakres długości fali (340-378 nm), szerokość pasma (minimum 16 nm, nominalne FWHM 20 nm), współczynnik załamania światła (1,88)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-402/16</td><td>Środkowy zakres długości fali (360-400 nm), Szerokość pasma (minimum 16 nm, nominalne FWHM 20 nm), Współczynnik załamania światła (1,8)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-449/15</td><td>Środkowy zakres długości fali (400-448,8 nm), szerokość pasma (minimum 15 nm, nominalne FWHM 20 nm), współczynnik załamania światła (1,8)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-501/15</td><td>Środkowy zakres długości fali (448,8-501,5 nm), szerokość pasma (minimum 15 nm, nominalne FWHM 20 nm), współczynnik załamania światła (1,84)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-561/14</td><td>Środkowy zakres długości fali (501,5-561 nm), szerokość pasma (minimalna 14 nm, nominalna FWHM 20 nm), współczynnik załamania światła (1,83)</td></tr><tr><td>Kostka filtra fluorescencyjnego Dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Semrock Inc.</td><td>FF495-Di03</td><td>Rozdziela światło wzbudzenia i emisji przy 495 nm (>98% odbicia w zakresie 350-488 nm, >93% transmisji w zakresie 502-950 nm), Efektywny indeks filtra (1,78)</td></tr><tr><td>Filtr fluorescencyjny Cube Longpass Filter</td><td>Semrock Inc.</td><td>FF01 496/LP-25</td><td>Umożliwia przepuszczanie światła dłuższego niż 496 nm ( >93% średnia transmisja w zakresie 503,2-1100 nm), współczynnik załamania światła (1,86)Sonda</td></tr> <tr><td>GCaMP</td><td>Addgene</td><td>G-CaMP3; Plazmid #22692</td><td>Genetycznie kodowany wskaźnik wapnia o pojedynczej długości fali GCaMP2</td></tr><tr><td>Integrujący Sphere</td><td>Ocean Optics</td><td>FOIS-1</td><td>Używany do dokładnego pomiaru oświetlenia szerokokątnego</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000</td><td>Mikroskopy odwrócone umożliwiają bezpośrednie wzbudzenie próbki bez konieczności penetrowania warstw mediów i/lub tkanki.</td></tr><tr><td>Mitotracker Green FM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M7514</td><td>Etykiety mitochondria</td></tr><tr><td>Lampa kalibracyjna śledzona przez NIST</td> Ocean <td>Optics</td><td>LS-1-CAL-INT</td><td>Lampa o znanym widmie do stosowania jako standardowa</td></tr><tr><td>fluoresceina identyfikowalna przez NIST</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific F36915</td><td>Do weryfikacji odpowiedniej odpowiedzi spektralnej systemu</td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Etykiety jądra komórkowe</td></tr><tr><td>Obiektyw (10X)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo &lambda; 10X/0.45 &infin;/0.17 MRD00105</td><td>Przydatne przy dużych polach widzenia</td></tr><tr><td>Obiektyw (20x)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo &lambda; 20X/0.75 &infin;/0.17 MRD00205</td><td>Najczęściej używany do próbek tkanek</td></tr><tr><td>Obiektyw (60X)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &infin;/0.15-0.18 WD 0.27</td><td>Najczęściej używany do próbek komórek</td></tr><tr><td>Aparat fotograficzny sCMOS</td><td>Fotometria</td><td>Prime 95B (Rev A8-062802018)</td><td>Do pozyskiwania obrazów cyfrowych o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Spektrometr</td><td>Ocean Optics</td><td>QE65000</td><td>Służy do pomiaru wydajności spektralnej układu spektralnego skanowania wzbudzenia</td></tr><tr><td>Przestrajalny zmieniacz filtrów</td><td>Instrument Sutter</td><td>Lambda VF-5</td><td>Zmotoryzowana jednostka do automatycznego strojenia filtra wzbudzenia/ przełączająca</td></tr><tr><td>ksenonowa lampa łukowa</td><td>Sunoptic Technologies</td><td>Titan 300HP Lightsource</td><td>Źródło światła o stosunkowo jednolitej mocy spektralnej</td></tr></tbody></table>

mikroskopia obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia w celu skutecznego rozróżniania sygnałów fluorescencyjnych

Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

Kilka technik polega na wykrywaniu sygnałów fluorescencyjnych w celu identyfikacji lub badania zjawisk lub wyjaśnienia funkcji. Separacja tych sygnałów fluorescencyjnych okazała się kłopotliwa do czasu pojawienia się obrazowania hiperspektralnego, w którym źródła fluorescencji mogą być oddzielone od siebie, a także od sygnałów tła i autofluorescencji (biorąc pod uwagę wiedzę o ich sygnaturach widmowych). Jednak tradycyjne, emisyjne obrazowanie hiperspektralne cierpi z powodu powolnych czasów akwizycji i niskich stosunków sygnału do szumu ze względu na niezbędne filtrowanie zarówno światła wzbudzonego, jak i emisyjnego. Wcześniej wykazano, że obrazowanie hiperspektralne ze skanowaniem wzbudzenia skraca niezbędny czas akwizycji, jednocześnie zwiększając stosunek sygnału do szumu pozyskanych danych. Korzystając z komercyjnie dostępnego sprzętu, protokół ten opisuje, jak zmontować, skalibrować i używać systemu mikroskopii obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia do separacji sygnałów z kilku źródeł fluorescencji w jednej próbce. Chociaż technika ta ma szerokie zastosowanie w obrazowaniu mikroskopowym komórek i tkanek, może być również przydatna w każdym rodzaju eksperymentu wykorzystującego fluorescencję, w którym możliwa jest zmiana długości fal wzbudzenia, w tym między innymi: obrazowanie chemiczne, zastosowania środowiskowe, pielęgnacja oczu, nauka o żywności, nauki sądowe, nauki medyczne i mineralogia.

Kilka kluczowych etapów niniejszego protokołu jest niezbędnych, aby zapewnić gromadzenie danych, które są zarówno dokładne, jak i wolne od artefaktów obrazowania oraz widmowych. Pominięcie tych kroków może doprowadzić do uzyskania danych, które wydają się istotne, lecz nie mogą zostać zweryfikowane ani odtworzone przy użyciu żadnego innego systemu obrazowania spektralnego, co w efekcie unieważnia wszelkie wnioski wyciągnięte na podstawie tych danych. Najważniejszym z tych etapów jest praw...

Obrazowanie spektralne stało się niezawodnym rozwiązaniem do identyfikacji i separacji wielu sygnałów fluorescencyjnych w jednej próbce i może łatwo odróżnić interesujące sygnały od tła lub autofluorescencji. Obrazowanie hiperspektralne ze skanowaniem wzbudzenia ulepsza tę technikę, skracając niezbędny czas akwizycji obrazu przy jednoczesnym zwiększeniu stosunku sygnału do szumu.

Mikroskopia obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia w celu skutecznego rozróżniania sygnałów fluorescencyjnych

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ opisuje metodę, która może być użyta do rozdzielenia kilku sygnałów fluorescencyjnych w jednej próbce. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, wzbudzenie i skanowanie może zwiększyć szybkość eksperymentu i poprawić czułość danych. Dzięki zastosowaniu różnych źródeł oświetlenia, takich jak laser superkontinuum, metoda ta może być stosowana w systemach wirującego dysku lub laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.Podczas wykonywania skanów wzbudzenia, mikroskopii obrazowania spektralnego, ważne jest, aby sprawdzić, czy pik wzbudzenia każdej etykiety fluorescencyjnej występuje na innej długości fali. Aby rozpocząć, ustaw odwrócony mikroskop fluorescencyjny i kamerę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie załaduj próbkę na stolik.Z menu rozwijanego w oknie głównym mikromenedżera wybierz 475 nanometrów do początkowego przeglądania próbki. Następnie kliknij dwukrotnie pole obok ekspozycji i wprowadź 100, aby ustawić czas ekspozycji na 100 milisekund. Na koniec kliknij przycisk na żywo, aby wyświetlić przykład.Teraz kliknij Auto. Przycisk automatycznego zakresu widzenia intensywności, aby przenieść minimalne i maksymalne wartości do znaczących, wizualnych zakresów. Następnie użyj pokręteł ostrości mikroskopu, aby ustawić ostrość próbki.Po ustawieniu ostrości dostosuj położenie próbki tak, aby jej krawędź znajdowała się w środku pola widzenia. Następnie dostosuj ostrość. Próbka jest ostra, gdy elementy krawędzi obrazu wydają się ostre.Teraz otwórz narzędzie do akwizycji wielowymiarowej. W menu kliknij przycisk ładowania i wybierz wstępnie ustawione ustawienie zawierające odpowiedni zakres długości fal do akwizycji spektralnej. Po potwierdzeniu ustawień akwizycji przejdź do pustego obszaru próbki i kliknij przycisk uzyskaj, aby zebrać stos obrazów spektralnych zawierający tło i szum, który można później odjąć.Następnie poruszaj się po próbce, aby znaleźć najjaśniejsze obszary. Próbki mogą mieć intensywniejszą fluorescencję z dala od krawędzi próbki. Po zlokalizowaniu najjaśniejszego obszaru zrób pojedynczy stos obrazów.Załaduj uzyskany obraz do obrazu J i użyj funkcji pomiaru obrazu J, aby potwierdzić, że żadne długości fal nie zawierają prześwietlonych pikseli. Jeśli konieczne jest skrócenie czasu naświetlania z powodu prześwietlenia, obraz tła należy również wykonać ponownie z nowym czasem naświetlania. Jeśli okaże się, że którykolwiek z obrazów zawiera górny limit wykrywalności kamery, dostosuj czas ekspozycji skanowania spektralnego, aby upewnić się, że maksymalny sygnał w całym zakresie widmowym nie przekracza zakresu dynamicznego kamery.Po ustaleniu odpowiedniego czasu naświetlania, umieścić nieoznakowaną próbkę na stoliku. Uzyskaj dane obrazu spektralnego z nieznakowanej próbki, aby określić, czy pod spodem znajduje się autofluorescencja. Następnie umieść pojedynczą próbkę na stoliku.Uzyskaj dane obrazu spektralnego z każdej z pojedynczo znakowanych próbek, aby użyć ich jako kontroli spektralnej w celu zbudowania biblioteki spektralnej. Wykonaj skanowanie dla każdej próbki kontrolnej przy użyciu identycznego zakresu długości fali, czasu ekspozycji i ustawień kamery. Następnie umieść szkiełko zawierające próbkę doświadczalną pod mikroskopem.Wybierz pole widzenia, które ma odpowiednio oznaczone komórki i uzyskaj dane obrazu spektralnego z próbki, korzystając z określonych ustawień akwizycji. Koryguj obrazy do płaskiej odpowiedzi spektralnej, odejmując widmo tła od przykładowego obrazu i mnożąc obraz przez współczynnik korekcji. W tym przypadku skrypt MATLAB służy do szybkiego przetwarzania obrazów.Następnie wygeneruj bibliotekę spektralną. Aby uzyskać najlepsze wyniki, znormalizuj każdy element końcowy do pasma długości fali o największym natężeniu, określając, które pasmo długości fali ma największą wartość i dzieląc pomiar w każdym paśmie długości fali przez tę wartość maksymalną. Następnie zapisz dane spektralne jako plik dat.Po zakończeniu rozmieszaj dane obrazu spektralnego. Krok rozmieszania spowoduje wygenerowanie obrazu obfitości dla każdej etykiety fluorescencyjnej, gdzie obfitość to ilość względnego sygnału fluorescencyjnego na obrazie z prospektywnej etykiety. Następnie otwórz każdy niezmieszany obraz, aby wizualnie sprawdzić rozkład czystych składników.Porównaj skalę obrazu błędu z rozmiarem obrazów niezmieszanych. Jeśli wielkość obrazu błędu jest podobna do obrazów niezmieszanych obfitości, sygnały w danych obrazu widmowego mogą nie być dokładnie uwzględnione. Na koniec sprawdź, czy nie ma niezidentyfikowanych szczątkowych struktur, porównując obraz błędu z niezmieszanymi obrazami.Przy prawidłowym przeprowadzeniu procesu rozmieszania spektralnego umożliwia rozdzielenie stosu obrazów spektralnych na odpowiednie wkłady z każdej etykiety fluorescencyjnej. Tutaj niemieszany zestaw obrazów spektralnych z indywidualnymi obrazami podkreślającymi autofluorescencję komórek mięśni gładkich dróg oddechowych, sondę GCaMP i znacznik mitochondrialny. Istnieje wysoki błąd związany z obszarami jądrowymi i okołojądrowymi komórek, co wskazuje, że zmierzone widma tych regionów nie są dobrze uwzględnione w widmach w bibliotece spektralnej.Czyste widma zebrane ze znakowanych komórek, które są również autofluorescencyjne, prawdopodobnie zanieczyszczą profil widmowy czystego składnika. Tutaj można zobaczyć różnicę między niemieszaniem z czystymi widmami zanieczyszczonymi autofluorescencją, a skorygowanymi czystymi widmami po odjęciu skalowanym. Właściwa akwizycja danych jest niezbędna podczas obrazowania wrażliwych próbek, ponieważ mogą one przetrwać tylko jedną sesję obrazowania, w przeciwieństwie do tła i kontroli, które mogą zostać ponownie zobrazowane.Upewnij się, że odpowiedni sprzęt i ustawienia akwizycji są w jak największym stopniu określone. W kolejnym kroku filmy utworzone na podstawie danych poklatkowych uzyskanych za pomocą tego systemu mogą być wykorzystane do śledzenia źródeł fluorescencyjnych w dyskretnych lokalizacjach w czasie, takich jak lokalizacja sygnału drugiego komunikatora. Zachowaj ostrożność podczas korzystania z silnych źródeł światła, aby uniknąć ekspozycji oczu.Pamiętaj również, aby nosić odpowiednie rękawice podczas pracy z etykietami biologicznymi.

excitation-scanning-hyperspectral-imaging-microscopy-to-efficiently

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania luminescencyjnych danych obrazowania hiperspektralnego oraz do analizy cech anizotropii optycznej monokryształów na bazie lantanowców za pomocą Systemu Obrazowania Hiperspektralnego.

Obrazowanie hiperspektralne jako narzędzie do badania anizotropii optycznej w monokryształach molekularnych na bazie lantanowców

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Multimodalny, szybki system obrazowania hiperspektralnego został opracowany w celu uzyskania szerokopasmowych obrazów generowania oscylacyjnej sumy częstotliwości (VSFG), wraz z modalnościami obrazowania jasnego pola i generacji drugiej harmonicznej (SHG). Ze względu na to, że częstotliwość podczerwieni rezonansuje z drganiami molekularnymi, ujawnia się mikroskopijna wiedza o morfologii strukturalnej i mezoskopowej próbek dopuszczonych do symetrii.

Multimodalne nieliniowe hiperspektralne obrazowanie chemiczne przy użyciu mikroskopii generacji drgań i częstotliwości ze skanowaniem liniowym

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Wielokompartmentowy dynamiczny fantom jest używany do symulacji niektórych interesujących biologicznych badań metabolicznych przy użyciu hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego.

Wykorzystanie wielokompartmentowego dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu do badań hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego

Poznaj metodę obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia do rozdzielania wielu sygnałów fluorescencyjnych w jednej próbce. Technika ta zwiększa szybkość eksperymentów i poprawia czułość danych w porównaniu do tradycyjnych metod mikroskopii fluorescencyjnej.

Mikroskopia obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem wzbudzenia w celu skutecznego rozróżniania sygnałów fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów