Name: Nielosowy mysi model do farmakologicznej reaktywacji Mecp2 na nieaktywnym chromosomie X (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metodę generowania mysiego modelu z nieaktywnym chromosomem X Mecp2 i oceny farmakologicznej reaktywacji in vivo. Technika ta umożliwia badanie terapii zespołu Retta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Antonio Bedalovowi za dostarczenie odczynników; Rdzeń histologii tkanek Uniwersytetu Wirginii do kriosekcji; Rdzeń cytometrii przepływowej Uniwersytetu Wirginii do analizy cytometrii przepływowej; Christianowi Blue i Saloniemu Singhowi za pomoc techniczną w genotypowaniu. Praca ta została wsparta grantem badawczym Double Hoo dla Z.Z. oraz nagrodą programu pilotażowego przyznaną przez University of Virginia-Virginia Tech Seed Fund Award oraz nagrodą Hartwell Foundation Individual Biomedical Research Award dla S.B.

Praca z udziałem myszy została zatwierdzona przez University of Virginia Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC; #4112).
1. Wygeneruj nielosowy model myszy XCI z genetycznie oznaczonym Mecp2 na Xi
UWAGA: Szczepy myszy użyte w badaniu były następujące: Mecp2-Gfp/Mecp2-Gfp (Mecp2tm3.1Bird, Tabela materiałów) i Xist/ΔXist (B6; 129-Xist<tm5Sado>; dostarczone przez Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle). Strategie hodowlane między odpowiednimi szczepami zostały zaprojektowane tak, aby rozszerzyć kolonie myszy dla każdego szczepu.
<ol>
	<li>Przeprowadzić genotypowanie PCR na wszystkich szczepach myszy i odpowiednich potomkach uzyskanych po hodowli przy użyciu starterów specyficznych dla genów wymienionych w tabeli 1.</li>
</ol>
2. Zaprojektuj strategię hodowli myszy, aby wygenerować XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-gfp
<ol>
	<li>Stwórz parę lęgową, trzymając razem samca Mecp2-Gfp/Y i samicę XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 (12 godzin/12 godzin: cykl jasny / ciemny) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Najlepiej ustawić co najmniej 5 par lęgowych na raz, używając żywotnych i płodnych myszy. Po urodzeniu ciężarnej samicy pozwól jej wychować swój pierwszy miot z samcem. 
	nuta: Ponieważ ojcowski nokaut Xist upośledza wdrukowane XCI, kompensację dawki i szlaki różnicowania17, użycie myszy XistΔ-Mecp2/Y w hodowli nie pozwoli na wyprodukowanie samic szczeniąt o wymaganym genotypie.</li>
	<li>Po odsadzeniu miotu w 21 dniu po urodzeniu (P21), zidentyfikuj i oznacz młode samice XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp za pomocą testu genotypowania opartego na PCR (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	nuta: Jeśli chodzi o liczbę zwierząt potrzebnych w grupie, dla wyników przedstawionych poniżej, stworzono 5 par hodowlanych, które wygenerowały około 10 samic myszy XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp.</li>
	<li>We wszystkich proponowanych eksperymentach należy używać żeńskich modeli mysich. 
	nuta: Płeć jest ważną zmienną biologiczną w badaniach XCI, a model męski nie uwzględnia mylących skutków losowego XCI.</li>
	<li>Aby zachować spójność we wszystkich badaniach na zwierzętach i wykluczyć wszelkie skutki wieku zwierząt, wykonaj wszystkie eksperymenty na 5-8-tygodniowych samicach myszy XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp.</li>
</ol>
3. Izoluj samice XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp Mysie fibroblasty embrionalne (MEF)
<ol>
	<li>Ustaw krycie czasowe między samcem Mecp2-Gfp/Y a samicą XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2. Ustaw co najmniej 3-4 klatki godowe, aby zwiększyć prawdopodobieństwo zajścia w ciążę.</li>
	<li>Po potwierdzeniu czopa pochwowego rano po kryciu, oddziel samicę i ten dzień uważa się za dzień embrionalny 0,5 (E0,5). Monitoruj przyrost masy ciała potencjalnej ciężarnej samicy i sprawdź wzrokowo brzuch myszy, aby potwierdzić ciążę. Na E14.5−15.5 poddać eutanazji ciężarne samice myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Pod laminarnym kapturem przetrzyj brzuch ciężarnej samicy 70% etanolem. Za pomocą sterylnych nożyczek przeprowadź sekcję jamy brzusznej i usuń rogi macicy zawierające zarodki. Za pomocą kleszczy delikatnie wyjmij zarodki, odcinając pozostałą tkankę brzuszną (zwykle oczekuje się 6-12 zarodków).</li>
	<li>Umieścić rogi macicy zawierające zarodki w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 10 mm. Za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy wykonaj nacięcie wzdłuż rogów macicy, aby wyizolować poszczególne woreczki z zarodkiem. Ostrożnie umieść rogi macicy zawierające resztę zarodków w 30 ml sterylnego roztworu soli Hanksa (HBSS) na lodzie.</li>
	<li>Delikatnie rozetnij worek i odizoluj zarodek za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy. Usuń łożysko, przecinając pępowinę.</li>
	<li>Odetnij głowę zarodkowi. 
	nuta: Podczas gdy reszta tkanki embrionalnej będzie dalej przetwarzana, tkanka z głowy zarodka zostanie wykorzystana do wyizolowania DNA do genotypowania.</li>
	<li>Otwórz brzuch, przecinając linię środkową zarodka za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy. Usuń narządy trzewne, takie jak serce, wątroba i płuca.</li>
	<li>Pozostałą tkankę zarodkową przenieść na sterylną płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm i pokroić na małe kawałki za pomocą nożyczek lub żyletki. Aby rozbić grudki komórek, dodaj 3 ml trypsyny-EDTA (0,05%) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę-EDTA, dodając 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 10 μg/ml penicyliny/streptomycyny (pióro/paciorkowca) do płytki i dysocjuj tkankę przez powtarzalne pipetowanie (około 20-30 razy).</li>
	<li>Odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawieś osad komórkowy w 4 ml DMEM z 10% FBS i 10 μg/ml długopisu/paciorkowca. Umieścić komórki na naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm i wyhodować komórki w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 .</li>
	<li>Wykonaj kroki 3.5−3.10 dla każdego zarodka.</li>
	<li>Hodowle MEF uzyskane w kroku 3.11 przez co najmniej 3-4 dni. 
	nuta: Na tym etapie MEF-y mogą być również kriokonserwowane do przyszłych eksperymentów.</li>
	<li>W celu określenia płci i genotypu każdego zarodka należy przeprowadzić genotypowanie PCR przy użyciu DNA wyizolowanego z głów zarodków przy użyciu starterów i warunków PCR wymienionych w tabeli 1.</li>
</ol>
4. Potwierdź brak ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) w mózgu myszy XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp za pomocą testu opartego na sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją
<ol>
	<li>Za pomocą nożyczek oddziel korę mózgową od reszty półkul mózgowych i umieść w 1 ml lodowatego buforu do izolacji jąder (NIM) zawierającego 250 mM sacharozy, 25 mM chlorku potasu (KCl), 5 mM chlorku magnezu (MgCl2), 10 mM Tris-Cl, uzupełnionego 2% paraformaldehydem (PFA) i 0,1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym (Tabela materiałów).</li>
	<li>Homogenizować za pomocą homogenizatora ze szkła lodowatego.</li>
	<li>Odwirować homogenizowaną tkankę w temperaturze 600 x g, 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml 25% jodiksanolu w roztworze NIM.</li>
	<li>Dodać 1 ml 29% lodiksanolu w roztworze NIM do probówki ultrawirówki o pojemności 4 ml (przechowywać na lodzie do momentu, aż próbki będą gotowe) i ostrożnie ułożyć warstwę 1 ml próbki (w 25% lodiksanolu).</li>
	<li>Wirować w temperaturze 9 000 x g, 4 °C przez 10 minut w ultrawirówce.</li>
	<li>Odessać supernatant i zawiesić osad w 500 μl buforu do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS] uzupełniona 1 mM EDTA, 0,05% azydkiem sodu i 2% albuminą surowicy bydlęcej [BSA]). 
	nuta: Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C lub do 1 tygodnia.</li>
	<li>Dodać 5 μl 7-amino-aktynomycyny D (7-AAD; 50 mg/ml) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby wybarwić DNA.</li>
	<li>Analizuj próbki pod kątem sygnału 7-AAD i białka zielonej fluorescencji (GFP) za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
5. Określ wykonalność modelu myszy XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp dla reaktywacji Xi
<ol>
	<li>Nasiona 1 x 105 komórek/ml żeńskie XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp MEFs, MEFy Mecp2/Mecp2-Gfp i Xist-Mecp2/Y otrzymane w kroku 3.12 w formacie 6-dołkowym i na szkiełkach komorowych, w DMEM z 10% FBS i 10 μg/ml długopisu/paciorkowca, w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2, 
	UWAGA: MEF Mecp2/Mecp2-Gfp i Xist-Mecp2/Y są używane jako kontrole pozytywne i negatywne w eksperymentach.</li>
	<li>Po 24 godzinach dodać świeżą pożywkę do komórek. W przypadku XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp MEFów dodać pożywkę uzupełnioną inhibitorami XCIFs (np. 0,5 μM LDN193189 i 2,5 μM GSK650394) lub sam nośnik. Pożywkę uzupełnioną nowym inhibitorem lub samym nośnikiem należy wymieniać co 2 dni. W przypadku MEFów Mecp2/Mecp2-Gfp i Xist-Mecp2/Y dodawaj świeże podłoże co 2 dni.</li>
	<li>Po 1 tygodniu leczenia inhibitorem należy pobrać MEF-y do izolacji RNA (płytka 6-dołkowa) lub utrwalić komórki do immunofluorescencji (szkiełka komorowe). Stosować MEF wyizolowane z zarodków Mecp2/Mecp2-Gfp jako zarodki dodatnie i zarodki Xist-Mecp2/Y jako kontrolę ujemną.
	<ol>
		<li>W celu izolacji RNA należy wyizolować całkowity RNA za pomocą odczynnika do ekstrakcji RNA na bazie tiocyjanianu guanidyny i dokonać odwrotnej transkrypcji przy użyciu odwrotnej transkryptazy. Zmierz ekspresję Mecp2-Gfp za pomocą ilościowej odwrotnej transkryptazy-PCR (qRT-PCR) przy użyciu Mecp2-WT i Mecp2-GFP oraz starterów wymienionych w Tabeli 1, jak opisano wcześniej12.</li>
		<li>W przypadku immunofluorescencji należy zabarwić MEF pierwszorzędowym przeciwciałem anty-GFP (1:100), jak opisano wcześniej12,16. Zmierz intensywność GFP za pomocą ilościowej immunofluorescencji w MEF XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp, jak opisano wcześniej18.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Zademonstruj farmakologiczną reaktywację Xi w mózgu mysiego modelu XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp 
<ol>
	<li>Przygotuj leki i kontrolę pojazdu.
	<ol>
		<li>Przygotować świeży, sterylny roztwór podłoża (0,9% NaCl, 0,5% metylocelulozy, 4,5% dimetylosulfotlenku [DMSO]) do wstrzykiwań do mózgu.</li>
		<li>Przygotować inhibitory chemiczne, w tym 1,5 mM LDN193189 (małocząsteczkowy inhibitor ACVR1) i 1,6 mM GSK650394 (małocząsteczkowy inhibitor SGK1, efektor PDPK1) ponownie zawieszone w podnośniku (0,9% NaCl, 0,5% metylocelulozy, 4,5% DMSO) lub sam nośnik. Całkowita objętość wstrzykniętych inhibitorów chemicznych lub nośnika wynosi 10 μl na dawkę na zwierzę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zwierzę do wstrzyknięć do mózgu.
	<ol>
		<li>Przygotuj obszar operacyjny, przecierając ławkę i poduszkę grzewczą środkiem dezynfekującym (10% roztwór podchlorynu sodu).</li>
		<li>Znieczulić 4-tygodniową mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym mieszaniny ketaminy/ksylazyny w dawce odpowiednio 140 mg/kg i 10 mg/kg. Użyj odruchu wycofania pedału, aby określić poziom znieczulenia.</li>
		<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy po indukcji znieczulenia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
		<li>Zgolić sierść od szyi do czubka głowy myszy.</li>
		<li>Ustaw mysz na platformie stereotaktycznej, zaczepiając siekacze myszy o belkę zgryzową ogranicznika pyska i dokręcając zacisk nosowy nad pyskiem, upewniając się, że głowa myszy znajduje się na płaskiej płaszczyźnie.</li>
		<li>W razie potrzeby dostosuj wysokość nauszników, aby dotrzeć do ogonowej części przewodu słuchowego, zabezpieczając je tak, aby głowa myszy znajdowała się w płaszczyźnie poziomej i była unieruchomiona przy dotknięciu palcem.</li>
		<li>Zdezynfekuj głowę myszy naprzemiennymi chusteczkami z miejscowym środkiem antyseptycznym, takim jak powidon-jod i 70% etanol.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podawać leki.
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj poziome nacięcie o długości 0,75 cm w środkowej części skóry głowy.</li>
		<li>Za pomocą zadzioru 0,45 mm wywierć dwa symetryczne otwory nad prawą i lewą półkulą korową (2 mm od szwu strzałkowego i 2 mm od szwu lambdoidalnego, mniej więcej pośrodku kości ciemieniowej).</li>
		<li>Mocno przymocuj strzykawkę o pojemności 10 μl do platformy stereotaktycznej.</li>
		<li>Wymieszać roztwór chemicznych inhibitorów i pobrać 10 μl roztworu do strzykawki. Należy unikać umieszczania pęcherzyków powietrza w strzykawce.</li>
		<li>Wsunąć igłę strzykawki do otworu w zadziorach, utrzymując igłę prostopadle (90°) do czaszki. Gdy igła przechodzi przez czaszkę, wyzeruj współrzędne na stereotaktycznym wyświetlaczu cyfrowym, a następnie przesuwaj końcówkę igły, aż osiągnie głębokość 2,5 mm.</li>
		<li>Wyciągnąć igłę 0,5 mm na głębokość 2 mm.</li>
		<li>Powoli wstrzyknąć 10 μl roztworu (~1 min). Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę w mózgu na ~1 minutę, a następnie wyjąć igłę.</li>
		<li>Powtórzyć wstrzyknięcie dla drugiej półkuli (kontrola tylko pojazd).</li>
		<li>Za pomocą szwów lub "kleju do skóry" zamknij skórę myszy (jeśli rana jest > 0,5 cm, należy użyć zarówno szwów, jak i "kleju do skóry").</li>
		<li>Poluzuj nauszniki i wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego.</li>
		<li>Podać leki przeciwbólowe (buprenorfina SR 0,5 mg/kg IP) i umieścić mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C, aż zwierzę odzyska przytomność.</li>
		<li>Gdy mysz będzie czujna i zareaguje, przenieś zwierzę z powrotem do jego pierwotnej klatki.</li>
		<li>Powtarzaj procedurę co 2 dni przez 20 dni. Wielokrotne wiercenie obszaru nie jest wymagane w przypadku kolejnych iniekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizoluj mózg myszy.
	<ol>
		<li>Po zakończeniu schematu dawkowania należy poddać mysz eutanazji w komorze CO2 .</li>
		<li>Unieruchamij mysz na powierzchni za pomocą igieł.</li>
		<li>Wykonaj boczne nacięcie przez powłokę i ścianę brzucha tuż pod klatką piersiową za pomocą nożyczek i kleszczy. Ostrożnie oddziel wątrobę od przepony.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek przetnij przeponę i kontynuuj cięcie na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie na tylnym końcu lewej komory.</li>
		<li>Natychmiast należy rozpocząć wstrzykiwanie do prawej komory serca ~15 ml PBS w ciągu ~2 min. Zmiana koloru wątroby z czerwonego na bladoróżowy wskazuje na dobrą perfuzję.</li>
		<li>Wstrzyknąć do prawej komory serca myszy ~10 ml 4% paraformaldehydu w PBS przez ~2 min.</li>
		<li>Odetnij głowę myszy i użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.</li>
		<li>Umieść jedną końcówkę nożyczek w otworze wielkim i naciąć bocznie w czaszce w kierunku oka. Powtórz dla drugiej strony. Staraj się, aby koniec nożyczek był jak najbardziej powierzchowny, aby uniknąć uszkodzenia mózgu.</li>
		<li>Użyj nożyczek, aby wyciąć obszar między oczami i nad nosem myszy.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie oderwać kości czaszki od półkul mózgowych.</li>
		<li>Podnieś mózg szpatułką i użyj nożyczek, aby ostrożnie wyciąć włókna nerwowe czaszki, które mocują go do czaszki.</li>
		<li>Umieść mózg na plastikowym naczyniu, wytnij móżdżek i opuszki węchowe, a następnie umieść mózg w 15 ml probówce wypełnionej 4% PFA to PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriosekcja mózgu myszy.
	<ol>
		<li>Napraw mózg w 4% paraformaldehydzie w PBS w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Przepłukać mózg PBS w temperaturze 4 °C co najmniej 3 razy przez 5 minut każdy.</li>
		<li>Oznacz jednorazowe formy do kriokonserwacji tkanek.</li>
		<li>Wytnij przednią część mózgu za pomocą nożyczek i kleszczy (zacznij robić skrawki ~5 mm z miejsc wstrzyknięcia).</li>
		<li>Przenieś mózg do kriomoldu z przodu mózgu skierowanym w dół, aby uzyskać przekroje koronalne. Zanurz mózg zawierający formę w związku o optymalnej temperaturze skrawania (OCT).</li>
		<li>Wlej ciekły azot do plastikowej szalki Petriego o średnicy 10 mm i umieść mózg w krioformie w azocie. 
		nuta: Ważne jest, aby ustawić tkankę zgodnie z opisem w kroku 6.5.5, aby pokierować sekcją mózgu.</li>
		<li>Gdy OCT stanie się jednolicie biały, umieść zamrożony mózg w zamrażarce o temperaturze -80 °C w celu przechowywania.</li>
		<li>Zrównoważyć mózg do -20 °C przez co najmniej 30 minut przed sekcją za pomocą kriostatu i kriosekcji (5−6 μm grubości) mózgu, montując 2−3 sekcje na szkiełku. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ reaktywację Xi przy użyciu podejścia opartego na immunofluorescencji.
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem procedury barwienia należy wysuszyć skrawki mózgu przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zanurzyć szkiełka w roztworze do pobierania antygenu (0,1 M kwasu cytrynowego, 0,1 M zasady Tris, pH = 6,0) na bloku grzewczym o temperaturze 100 °C na 5 minut.</li>
		<li>Myj szkiełka 4x z 1x PBS przez 5 minut każda w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zanurzyć szkiełka w roztworze blokującym (0,1 M NH<s>4</s>Cl/PBS/0,2% żelatyny/0,05% niejonowego środka powierzchniowo czynnego) na 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Myj szkiełka 3x buforem do płukania (PBS/0,2% żelatyny) w temperaturze pokojowej przez 5 min każde.</li>
		<li>Wybarwić skrawki mózgu przeciwciałami anty-GFP-AlexaFluor647 (1:100) i anty-MAP2 (1:1000) w pożywce inkubacyjnej (PBS/0,2% żelatyny/1% BSA) i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Zbierz przeciwciała pierwotne (można je ponownie użyć). Myć szkiełka 4x z buforem do płukania przez łącznie 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować skrawki mózgu z kozim przeciwciałem drugorzędowym znakowanym izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (1:1,000) w pożywce inkubacyjnej i inkubować 1-2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Myć szkiełka 4x z buforem do płukania przez łącznie 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieścić kroplę podłoża mocującego z 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 50 mm, a następnie odwrócić szkiełko nakrywkowe na szkiełko podstawowe, pokrywając wszystkie skrawki tkanki.</li>
		<li>Obraz pod mikroskopem i dostosuj obrazy pod kątem kontrastu i jasności. Uchwyć obrazy i określ ilościowo liczbę komórek GFP-dodatnich zarówno dla półkul mózgowych myszy XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp leczonych lekiem, jak i poddanych działaniu nośnika.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nucleic+Acid+Research+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li>
<li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin%3A+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+Development%22%5BJournal%5D)">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li>
<li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li>
<li>Pontier, D. B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xist+regulation+and+function+explored%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Xist regulation and function explored.</a> Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).</li>
<li>Barnes, C., Kanhere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-Protein+Interactions+Through+In+Vitro+RNA+Pull-Down+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li>
<li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li>
<li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Curren+Biology%22%5BJournal%5D)">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383(2016).</li>
<li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li>
<li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+E+anchors+Xist+RNA+to+the+inactive+X+chromosomal+compartment+through+CDKN1A-interacting+protein+%28CIZ1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1).</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).</li>
<li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Development%22%5BJournal%5D)">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li>
<li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome%3A+random+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li>
<li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2%2C+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li>
<li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Natlional+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li>
<li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li>
<li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li>
<li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wcześniej zidentyfikowano XCIF, które są selektywnie wymagane do wyciszania genów sprzężonych z Xi w komórkach żeńskichssaków12. Następnie zoptymalizowaliśmy silne inhibitory małocząsteczkowe pod kątem XCIF, takich jak ACVR1 i efektory PDPK1, które skutecznie reaktywują Mecp2 sprzężony z Xi w liniach komórkowych fibroblastów myszy, neuronach korowych myszy i ludzkiej linii komórkowej fibroblastów pochodzącej od pacjenta z RTT. Wyniki te sugerują, że reaktywacja Xi jest prawdopodobnym pode...

Inaktywacja chromosomu X (XCI) to proces kompensacji dawkowania, który równoważy ekspresję genów sprzężonych z chromosomem X poprzez wyciszenie jednej kopii chromosomu X u kobiet1. W rezultacie nieaktywny chromosom X (Xi) kumuluje charakterystyczne cechy heterochromatyny, w tym metylację DNA i hamujące modyfikacje histonów, takie jak trimetylacja histonu H3-lizyny 27 (H3K27me3) i ubikwitynacja histonu H2A (H2Aub)2. Głównym regulatorem wyciszania chromosomu X jest region centrum inaktywacji chromosomu X (Xic), około 100−500 kb, który kontroluje liczenie i parowanie chromosomów X, losowy wybór chromosomu X do inaktywacji oraz inicjację i rozprzestrzenianie się wyciszania wzdłuż chromosomu X3. Proces inaktywacji chromosomu X jest inicjowany przez nieaktywny specyficzny transkrypt X (Xist), który powleka Xi w cis, aby pośredniczyć w wyciszaniu całego chromosomu i przebudowie trójwymiarowej struktury chromosomu X4. Ostatnio kilka proteomicznych i genetycznych badań przesiewowych zidentyfikowało dodatkowe regulatory XCI, takie jak białka oddziałujące z Xist5,6,7,8,9,10,11,12. Na przykład poprzednie badanie wykorzystujące bezstronne badanie przesiewowe interferencji RNA całego genomu zidentyfikowało 13 transakcyjnych czynników XCI (XCIFs)12. Mechanicznie, XCIF-y regulują ekspresję Xist, a zatem zakłócenie funkcji XCIFs powoduje wadliwe XCI12. Ostatnie postępy w tej dziedzinie dostarczyły ważnych informacji na temat maszynerii molekularnej, która jest niezbędna do zainicjowania i utrzymania XCI.
Identyfikacja regulatorów XCI i zrozumienie ich mechanizmu w XCI jest bezpośrednio związane z chorobami ludzkimi sprzężonymi z chromosomem X, takimi jak zespół Retta (RTT)13,14. RTT jest rzadkim zaburzeniem neurorozwojowym spowodowanym heterozygotyczną mutacją w białku wiążącym metylo-CpG 2 sprzężonym z chromosomem X (MECP2), które dotyka głównie dziewcząt15. Ponieważ MECP2 znajduje się na chromosomie X, dziewczęta RTT są heterozygotyczne pod względem niedoboru MECP2 z ~50% komórek wykazujących ekspresję typu dzikiego i ~50% eksprymujących zmutowany MECP2. Warto zauważyć, że zmutowane komórki RTT zawierają uśpioną, ale dziką kopię Mecp2 na Xi, stanowiąc źródło funkcjonalnego genu, który w przypadku reaktywacji może potencjalnie złagodzić objawy choroby. Oprócz RTT istnieje kilka innych chorób u ludzi sprzężonych z chromosomem X, w przypadku których reaktywacja Xi stanowi potencjalne podejście terapeutyczne, takich jak zespół DDX3X.
Hamowanie XCIFs, kinazy białkowej zależnej od 3-fosfoinozytydu-1 (PDPK1) i receptora aktywiny A typu 1 (ACVR1), zarówno przez krótkie RNA spinki do włosów (shRNA), jak i inhibitory małocząsteczkowe, reaktywuje geny sprzężone z Xi12. Farmakologiczną reaktywację genów sprzężonych z Xi obserwuje się w różnych modelach ex vivo, które obejmują linie komórkowe fibroblastów myszy, dorosłe neurony korowe myszy, fibroblasty embrionalne myszy i linie komórkowe fibroblastów pochodzące od pacjenta RTT12. Nie wiadomo jednak, czy farmakologiczna reaktywacja genów sprzężonych z Xi jest możliwa in vivo. Jednym z czynników ograniczających jest brak skutecznych modeli zwierzęcych do dokładnego pomiaru ekspresji genów z reaktywowanego Xi. W tym celu wygenerowano mysi model XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp, który przenosi genetycznie znakowany Mecp2 na Xi we wszystkich komórkach z powodu heterozygotycznej delecji w Xist na matczynym chromosomie X16. Korzystając z tego modelu, ekspresję Mecp2 z Xi określono ilościowo po leczeniu inhibitorami XCIFs w mózgu żywych myszy. W tym miejscu opisano generowanie mysiego modelu XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp oraz metodologię ilościowego oznaczania reaktywacji Xi w neuronach korowych przy użyciu testów opartych na immunofluorescencji.

<table><tbody><tr><td>MICE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mecp2tm3.1Bird</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>#014610</td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-Xist (tm5Sado)</td><td>dostarczone przez Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ODCZYNNIKI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm szkiełko nakrywkowe</td><td>FISHERfinest (Fisher Scientific)</td><td>125488</td><td></td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>Medline Industries</td><td>NPMJD50LZ</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane 60 mm</td><td>CellStar</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD </td><td>BioLegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A661-3</td><td></td></tr><tr><td>anty-GFP-AlexaFluor647</td><td>Invitrogen</td><td>A-31852</td><td></td></tr><tr><td>anty-MAP2</td><td>Aves Labs</td><td>MAP</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Promega</td><td>R396D</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina SR</td><td>Zoopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwas cytrynowy </td><td>Sigma</td><td>C-1857</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>VWR Life Science</td><td>89510-198</td><td></td></tr><tr><td>żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka</td><td>podstawowe Fisherbrand</td><td>22-034-486</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało wtórne anty-kurczak znakowane FITC </td><td>Aves</td><td>Labs F-1005</td><td></td></tr><tr><td>GSK650394</td><td>ApexBio</td><td>B1051</td><td></td></tr><tr><td>hamilton 10&mu; l strzykawka </td><td>Hamilton Sigma-Aldrich</td><td>28615-U</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Ketaset</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td></td></tr><tr><td>Duże/zakrzywione nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14519-14</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Cayman Chemicals</td><td>11802</td><td></td></tr><tr><td>lodixanol</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>1343517</tr><tr><td>chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Fisher Chemical</td><td>M35-212</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma</td><td>M0262-100G</td><td></td></tr><tr><td>podłoże montażowe z DAPI </td><td>Vectashield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka igły, 26 GA x 1,25"</td><td></td>Maść okulistyczna <td>PrecisionGlide</td> 305111 <td></td></tr><tr><td> </td><td>Refresh Lacri-Lube</td><td>93468</td><td></td></tr><tr><td>optymalna temperatura skrawania (O.C.T.) </td><td>Mieszanka</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>ThermoFisher<td>PCR</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (Pen/Strep)</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanem pH 7,4 (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-103-CM</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Ostrza</td><td></td> skalpela Fisher Scientific P330-500 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka szklana lub plastikowa taca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>klej do skóry / klej tkankowy</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>azydek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>standardowe kleszcze do hemostatu</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta standardowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do prostych tęczówek</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioreagents Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA </td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDC: 59399-111-50</td><td></td></tr><tr><td>WYPOSAŻENIE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop komórkowy Zeiss AxioObserver </td><td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>Frez 0,45 mm IDEAL</td><td>MicroDrill</td><td>67-1000</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScalibur</td><td></td><td></td><td></td></tr> homogenizator <tr><td></td> szkła wirówkowego <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Leica 3050S kriostat </td><td></td><td></td><td></td>badawczy</tr> <tr><td>platforma </td><td></td><td></td><td></td>stereotaktyczna</tr> <tr><td>termocykler</td><td></td><td></td><td></td>Ultrawirówka</tr><tr><td>Timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter Optima L-100 XP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna (37 &ordm; C)</td> <td>Fisher Scientific Isotemp 2239</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nielosowy mysi model do farmakologicznej reaktywacji mecp2 na nieaktywnym chromosomie x

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Inaktywacja chromosomu X (XCI) to losowe wyciszenie jednego chromosomu X u kobiet w celu osiągnięcia równowagi dawkowania genów między płciami. W rezultacie wszystkie samice są heterozygotyczne pod względem ekspresji genów sprzężonych z chromosomem X. Jednym z kluczowych regulatorów XCI jest Xist, który jest niezbędny do inicjacji i utrzymania XCI. Wcześniejsze badania zidentyfikowały 13 czynników inaktywacji chromosomu X (XCIF) działających w trans za pomocą wielkoskalowego genetycznego badania przesiewowego pod kątem utraty funkcji. Hamowanie XCIF, takich jak ACVR1 i PDPK1, za pomocą krótkiego RNA lub inhibitorów małocząsteczkowych, reaktywuje geny związane z chromosomem X w hodowanych komórkach. Jednak wykonalność i tolerancja reaktywacji nieaktywnego chromosomu X in vivo pozostaje do ustalenia. W tym celu wygenerowano mysi model XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp z nielosowym XCI z powodu delecji Xist na jednym chromosomie X. Korzystając z tego modelu, określono ilościowo zakres nieaktywnej reaktywacji chromosomu X w mózgu myszy po leczeniu inhibitorami XCIF. Niedawno opublikowane wyniki pokazują po raz pierwszy, że farmakologiczne hamowanie XCIF-ów reaktywuje Mecp2 z nieaktywnego chromosomu X w neuronach korowych żywego mózgu myszy.

Aby wykazać wykonalność zastosowania modelu mysiego XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp w badaniach nad reaktywacją Xi, przetestowano reaktywację związanego z Xi genu Mecp2-Gfp za pomocą inhibitora XCIF w embrionalnych fibroblastach mysich (MEF). Samicze MEF wyizolowano z embrionów XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp w 15,5 dniu rozwoju, zgodnie z opisem w sekcji 3 (Rysunek 1A). Genotypy samiczych MEF XistΔ:Mecp2/Xist:Mecp2-Gfp potwierdzono za pomocą PCR...

Tutaj opisujemy protokół generowania realnego modelu samicy mysiej z nielosową inaktywacją chromosomu X, tzn. chromosom X odziedziczony po matce jest nieaktywny w 100% komórek. Opisujemy również protokół testowania wykonalności, tolerancji i bezpieczeństwa farmakologicznej reaktywacji nieaktywnego chromosomu X in vivo.

Nielosowy mysi model do farmakologicznej reaktywacji Mecp2 na nieaktywnym chromosomie X

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Protokół ten może być wykorzystany do wygenerowania nielosowego modelu myszy do testowania i ilościowego określania reaktywacji nieaktywnego chromosomu Mecp2 sprzężonego z chromosomem X w mózgu żywej myszy. Model ten można łatwo zmodyfikować w celu zbadania reaktywacji Xi w innych modelach chorób sprzężonych z chromosomem X, takich jak zespół DDX3X. Jestem stażystą podoktorskim w laboratorium Sanchity Bhatnagara i będę demonstrować procedurę z Zeming Zhengiem.Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy na platformie stereotaktycznej z siekaczami zaczepionymi w pręt gryzący ogranicznika pyska. Dokręć nos clamp, trzymając głowę myszy na poziomej płaszczyźnie. Dostosuj wysokość nauszników, aby dotrzeć do ogonowej części kanału słuchowego, aby utrzymać głowę unieruchomioną.Następnie zdezynfekuj głowę naprzemiennymi chusteczkami z miejscowym środkiem antyseptycznym i 70% etanolem. Gdy mysz będzie gotowa, użyj sterylnego skalpela, aby wykonać 0,75 centymetra poziomego nacięcia w środkowej części skóry głowy. Użyj zadzioru o średnicy 0,45 milimetra, aby wywiercić dwa symetryczne otwory nad prawą i lewą półkulą korową, dwa milimetry od szwu strzałkowego i szwu lambdoidalnego w przybliżeniu pośrodku kości ciemieniowej.Mocno przymocuj strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów do platformy stereotaktycznej i załaduj 10 mikrolitrów świeżo przygotowanego inhibitora chemicznego do strzykawki. Wsuń igłę do pierwszego otworu w zadziorach, trzymając igłę prostopadle do czaszki. Gdy igła przejdzie przez czaszkę, wyzeruj współrzędne na stereotaktycznym wyświetlaczu cyfrowym i przesuwaj końcówkę igły, aż osiągnie głębokość 2,5 milimetra.Wycofać igłę na głębokość 0,5 milimetra na głębokość dwóch milimetrów i powoli wstrzykiwać całą objętość roztworu o objętości 10 mikrolitrów w ciągu jednej minuty. Po dostarczeniu całego inhibitora, należy pozostawić igłę w mózgu na kolejną minutę przed wyjęciem igły. Powtórzyć wstrzyknięcie do drugiego otworu z zadziorami, używając pojazdu tylko jako kontroli i zamknąć skórę nad nacięciem.Następnie przenieś mysz z aparatu stereotaktycznego na poduszkę grzewczą o temperaturze 37 stopni Celsjusza z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Pod koniec schematu dawkowania należy zabezpieczyć mysz na podkładce preparcyjnej. Użyj nożyczek i kleszczy, aby wykonać boczne nacięcie przez powłokę i ścianę brzucha tuż pod klatką piersiową.Ostrożnie oddziel wątrobę od przepony i przetnij przeponę na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie na tylnym końcu lewej komory i natychmiast wstrzyknij do prawej komory serca około 15 mililitrów PBS w ciągu dwóch minut. Udana perfuzja spowoduje zmianę koloru wątroby z czerwonego na bladoróżowy.Po dostarczeniu całego PBS, należy wykonać perfuzję serca za pomocą około 10 mililitrów 4% paraformaldehydu w PBS w ciągu dwóch minut. Po zebraniu głowy użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę. Umieść jedną końcówkę nożyczek w otworze wielkim, aby ułatwić utworzenie bocznego nacięcia w czaszce w kierunku oka.Wykonaj podobne nacięcie po drugiej stronie czaszki, utrzymując koniec nożyczek tak powierzchownie, jak to możliwe, i przetnij obszar czaszki między oczami i nad nosem myszy. Użyj kleszczy, aby delikatnie oderwać kości czaszki od półkul mózgu i użyj szpatułki, aby podnieść mózg. Ostrożnie wypreparuj włókna nerwowe czaszki, które mocują mózg do czaszki i umieść mózg w plastikowym naczyniu.Następnie wytnij móżdżek i opuszki węchowe. Aby uzyskać skrawki tkanki mózgowej, najpierw umieść mózg w 15-mililitrowej probówce wypełnionej 4% paraformaldehydem w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka płucz tkankę mózgową co najmniej trzy razy przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w świeżym PBS na pranie.Po ostatnim praniu usuń przód każdej półkuli nożyczkami i kleszczami i umieść próbki w oznaczonych krioforemkach przodem do dołu. Zanurz każdą tkankę w podłożu o optymalnej temperaturze cięcia przed zatrzaskowym zamrożeniem próbek w ciekłym azocie na 10-milimetrowej plastikowej szalce Petriego do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby określić reaktywację Xi, zanurz od pięciu do sześciu mikrometrowych skrawków tkanki mózgowej w roztworze do pobierania antygenu na pięć minut w bloku grzewczym o temperaturze 100 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji umyć szkiełka czterema pięciominutowymi płukaniami w temperaturze pokojowej świeżym PBS na przemycie przed zanurzeniem szkiełek w roztworze blokującym. Po 20 minutach w temperaturze pokojowej umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w buforze do świeżego mycia na pranie. Wybarwić próbki tkanek odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Zobrazuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym, dostosowując kontrast i jasność, aby umożliwić ilościowe określenie liczby komórek GFP dodatnich zarówno dla półkul mózgowych myszy leczonych lekiem, jak i nośnikiem. Aby zademonstrować wykonalność nielosowego modelu myszy inaktywacji chromosomu X do badań nad reaktywacją nieaktywnego chromosomu X, genotypy żeńskich transgenicznych fibroblastów zarodkowych myszy potwierdzono za pomocą genotypowania PCR i cytometrii przepływowej. Jak oceniono za pomocą PCR, ekspresja genu MECP2 białka wiążącego metylenowe CPG znakowane GFP lub MECP2 została reaktywowana przez lek, ale nie przez leczenie nośnikiem.Nielosowe fibroblasty embrionalne myszy z inaktywacją chromosomu X również wykazywały ekspresję jądrowego GFP po leczeniu lekiem, ale nie nośnikiem, wykazując, że inhibitory czynnika inaktywacji chromosomu X reaktywują inaktywowany MECP2 sprzężony z chromosomem X w mysich fibroblastach embrionalnych. Leczenie farmakologiczne reaktywuje inaktywowany chromosom X MECP2-GFP w około 30% komórek w półkulach mózgowych podawanych lekami, podczas gdy w półkulach z podparciem nie wykrywa się reaktywacji. Białko związane z mikrotubulami, dwa neurony dodatnie są również GFP dodatnie w półkulach leczonych lekiem, co wskazuje na inaktywowaną ekspresję MECP2-GFP chromosomu X.Schemat leczenia będzie zależał od celu i skuteczności inhibitorów małocząsteczkowych, dlatego przed testami in vivo należy zoptymalizować dawkę i leczenie in vitro. Nielosowy model myszy może być wykorzystany do testowania różnych leków pojedynczo lub w połączeniu. W rzeczywistości my i inni zidentyfikowaliśmy kilka czynników inaktywacji chromosomu X dających się ulegać farmakologicznemu.

a-non-random-mouse-model-for-pharmacological-reactivation-mecp2-on

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala na wykrywanie kwasów nukleinowych w ich naturalnym środowisku w komórkach. Opisujemy tutaj protokół połączonego, jednoczesnego wykrywania RNA i DNA za pomocą FISH, który może być wykorzystany do badania inaktywacji chromosomu X w embrionalnych komórkach macierzystych myszy.

Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Ten artykuł opisuje, jak wstrzyknąć wektory wirusowe do kory czołowej myszy w celu przetestowania testów behawioralnych, które wymagają tworzenia heteromerycznego GPCR.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem HSV konstruktów chimerycznych w celu zbadania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Informujemy o małym RNA spinki do włosów (shRNA) i protokole sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji regulatorów inaktywacji chromosomu X w linii komórkowej myszy z genami oporności na lucyferazy świetlika i higromycynę połączonymi z genem białka wiążącego metylo CpG 2 (MeCP2) na nieaktywnym chromosomie X.

Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Test immunologiczny elektrochemiluminescencji (ECLIA) to nowatorskie podejście do ilościowego wykrywania endogennych i egzogennie stosowanych wariantów białka MeCP2, które daje wysoce ilościowe, dokładne i powtarzalne pomiary z niskim błędem wewnątrz- i międzytestowym w szerokim zakresie roboczym. W tym miejscu opisano protokół dla MeCP2-ECLIA w formacie 96-dołkowym.

Test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka MeCP2

Modele gryzoni są cennymi narzędziami do badania podstawowych zachowań związanych z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD). W tym artykule wyjaśniamy dwa testy behawioralne do modelowania podstawowych cech ASD u myszy: samopielęgnację, który ocenia powtarzające się zachowanie, oraz trzykomorowy test interakcji społecznych, który dokumentuje upośledzenia społeczne.

Strategie oceny zachowań podobnych do autystycznych u myszy

Poznaj metodę generowania mysiego modelu z nieaktywnym chromosomem X Mecp2 i oceny farmakologicznej reaktywacji in vivo. Technika ta umożliwia badanie terapii zespołu Retta.

Nielosowy mysi model do farmakologicznej reaktywacji Mecp2 na nieaktywnym chromosomie X

Przeglądaj więcej filmów