Nielosowy mysi model do farmakologicznej reaktywacji Mecp2 na nieaktywnym chromosomie X

Protokół ten może być wykorzystany do wygenerowania nielosowego modelu myszy do testowania i ilościowego określania reaktywacji nieaktywnego chromosomu Mecp2 sprzężonego z chromosomem X w mózgu żywej myszy. Model ten można łatwo zmodyfikować w celu zbadania reaktywacji Xi w innych modelach chorób sprzężonych z chromosomem X, takich jak zespół DDX3X. Jestem stażystą podoktorskim w laboratorium Sanchity Bhatnagara i będę demonstrować procedurę z Zeming Zhengiem.

Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy na platformie stereotaktycznej z siekaczami zaczepionymi w pręt gryzący ogranicznika pyska. Dokręć nos clamp, trzymając głowę myszy na poziomej płaszczyźnie. Dostosuj wysokość nauszników, aby dotrzeć do ogonowej części kanału słuchowego, aby utrzymać głowę unieruchomioną.

Następnie zdezynfekuj głowę naprzemiennymi chusteczkami z miejscowym środkiem antyseptycznym i 70% etanolem. Gdy mysz będzie gotowa, użyj sterylnego skalpela, aby wykonać 0,75 centymetra poziomego nacięcia w środkowej części skóry głowy. Użyj zadzioru o średnicy 0,45 milimetra, aby wywiercić dwa symetryczne otwory nad prawą i lewą półkulą korową, dwa milimetry od szwu strzałkowego i szwu lambdoidalnego w przybliżeniu pośrodku kości ciemieniowej.

Mocno przymocuj strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów do platformy stereotaktycznej i załaduj 10 mikrolitrów świeżo przygotowanego inhibitora chemicznego do strzykawki. Wsuń igłę do pierwszego otworu w zadziorach, trzymając igłę prostopadle do czaszki. Gdy igła przejdzie przez czaszkę, wyzeruj współrzędne na stereotaktycznym wyświetlaczu cyfrowym i przesuwaj końcówkę igły, aż osiągnie głębokość 2,5 milimetra.

Wycofać igłę na głębokość 0,5 milimetra na głębokość dwóch milimetrów i powoli wstrzykiwać całą objętość roztworu o objętości 10 mikrolitrów w ciągu jednej minuty. Po dostarczeniu całego inhibitora, należy pozostawić igłę w mózgu na kolejną minutę przed wyjęciem igły. Powtórzyć wstrzyknięcie do drugiego otworu z zadziorami, używając pojazdu tylko jako kontroli i zamknąć skórę nad nacięciem.

Następnie przenieś mysz z aparatu stereotaktycznego na poduszkę grzewczą o temperaturze 37 stopni Celsjusza z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Pod koniec schematu dawkowania należy zabezpieczyć mysz na podkładce preparcyjnej. Użyj nożyczek i kleszczy, aby wykonać boczne nacięcie przez powłokę i ścianę brzucha tuż pod klatką piersiową.

Ostrożnie oddziel wątrobę od przepony i przetnij przeponę na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie na tylnym końcu lewej komory i natychmiast wstrzyknij do prawej komory serca około 15 mililitrów PBS w ciągu dwóch minut. Udana perfuzja spowoduje zmianę koloru wątroby z czerwonego na bladoróżowy.

Po dostarczeniu całego PBS, należy wykonać perfuzję serca za pomocą około 10 mililitrów 4% paraformaldehydu w PBS w ciągu dwóch minut. Po zebraniu głowy użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę. Umieść jedną końcówkę nożyczek w otworze wielkim, aby ułatwić utworzenie bocznego nacięcia w czaszce w kierunku oka.

Wykonaj podobne nacięcie po drugiej stronie czaszki, utrzymując koniec nożyczek tak powierzchownie, jak to możliwe, i przetnij obszar czaszki między oczami i nad nosem myszy. Użyj kleszczy, aby delikatnie oderwać kości czaszki od półkul mózgu i użyj szpatułki, aby podnieść mózg. Ostrożnie wypreparuj włókna nerwowe czaszki, które mocują mózg do czaszki i umieść mózg w plastikowym naczyniu.

Następnie wytnij móżdżek i opuszki węchowe. Aby uzyskać skrawki tkanki mózgowej, najpierw umieść mózg w 15-mililitrowej probówce wypełnionej 4% paraformaldehydem w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka płucz tkankę mózgową co najmniej trzy razy przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w świeżym PBS na pranie.

Po ostatnim praniu usuń przód każdej półkuli nożyczkami i kleszczami i umieść próbki w oznaczonych krioforemkach przodem do dołu. Zanurz każdą tkankę w podłożu o optymalnej temperaturze cięcia przed zatrzaskowym zamrożeniem próbek w ciekłym azocie na 10-milimetrowej plastikowej szalce Petriego do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby określić reaktywację Xi, zanurz od pięciu do sześciu mikrometrowych skrawków tkanki mózgowej w roztworze do pobierania antygenu na pięć minut w bloku grzewczym o temperaturze 100 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji umyć szkiełka czterema pięciominutowymi płukaniami w temperaturze pokojowej świeżym PBS na przemycie przed zanurzeniem szkiełek w roztworze blokującym. Po 20 minutach w temperaturze pokojowej umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w buforze do świeżego mycia na pranie. Wybarwić próbki tkanek odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Zobrazuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym, dostosowując kontrast i jasność, aby umożliwić ilościowe określenie liczby komórek GFP dodatnich zarówno dla półkul mózgowych myszy leczonych lekiem, jak i nośnikiem. Aby zademonstrować wykonalność nielosowego modelu myszy inaktywacji chromosomu X do badań nad reaktywacją nieaktywnego chromosomu X, genotypy żeńskich transgenicznych fibroblastów zarodkowych myszy potwierdzono za pomocą genotypowania PCR i cytometrii przepływowej. Jak oceniono za pomocą PCR, ekspresja genu MECP2 białka wiążącego metylenowe CPG znakowane GFP lub MECP2 została reaktywowana przez lek, ale nie przez leczenie nośnikiem.

Nielosowe fibroblasty embrionalne myszy z inaktywacją chromosomu X również wykazywały ekspresję jądrowego GFP po leczeniu lekiem, ale nie nośnikiem, wykazując, że inhibitory czynnika inaktywacji chromosomu X reaktywują inaktywowany MECP2 sprzężony z chromosomem X w mysich fibroblastach embrionalnych. Leczenie farmakologiczne reaktywuje inaktywowany chromosom X MECP2-GFP w około 30% komórek w półkulach mózgowych podawanych lekami, podczas gdy w półkulach z podparciem nie wykrywa się reaktywacji. Białko związane z mikrotubulami, dwa neurony dodatnie są również GFP dodatnie w półkulach leczonych lekiem, co wskazuje na inaktywowaną ekspresję MECP2-GFP chromosomu X.

Schemat leczenia będzie zależał od celu i skuteczności inhibitorów małocząsteczkowych, dlatego przed testami in vivo należy zoptymalizować dawkę i leczenie in vitro. Nielosowy model myszy może być wykorzystany do testowania różnych leków pojedynczo lub w połączeniu. W rzeczywistości my i inni zidentyfikowaliśmy kilka czynników inaktywacji chromosomu X dających się ulegać farmakologicznemu.