Name: Bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniego podania dooskrzelowego do płuc myszy, umożliwiającą selektywną aplikację czynników do jednego płuca lub symetryczne rozłożenie w obu płucach. Technika ta poprawia dokładność badań nad chorobami płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez NHLBI grant HL125371 dla E.P.S. oraz przez DOD (CDMRP) grant W81XWH-17-1-0051 dla Y.Y.

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wszystkie procedury opisane poniżej (sekcje 4-7) zostały zoptymalizowane przy użyciu zarówno samców, jak i samic myszy C57BL/6. Podejście to zostało zweryfikowane na myszach o masie ciała od 19 do 40 g.
1. Stworzenie platformy do administrowania IB
<ol>
	<li>Zegnij podpórkę od pierwotnego kąta 90° między skrzydłem podstawowym a skrzydłem stojącym do 70° (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Wywierć otwór w środkowej górnej części stojącego skrzydła metalowej podpórki do książek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Wywierć otwór o identycznym rozmiarze w odpowiednim miejscu plastikowej deski. Wywierć dwa mniejsze otwory dolnie i bocznie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Ułóż jedwabny szew w proporcji 4:0 pomiędzy tymi małymi otworami w plastikowej desce (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Umieść taśmę rzepową na krawędzi plastikowej tablicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Przymocuj plastikową tablicę do metalowej podpórki za pomocą (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Upewnij się, że nakrętka śrubowa jest wystarczająco dokręcona, aby utrzymać deskę na miejscu, umożliwiając jednocześnie regulację kąta, jeśli to konieczne.</li>
	<li>Upewnij się, że plastikowa tablica obraca się zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, poruszając się swobodnie. 
	UWAGA: Ruch w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara jest reprezentowany w tym raporcie jako obrót o (+) stopień, a ruch w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara jest reprezentowany jako obrót o (-) stopień.</li>
	<li>Za pomocą kątomierza ustaw plastikową tablicę pod kątem +30°, +86°, -30° i -74° i zaznacz je odpowiednio na podpórce.</li>
</ol>
2. Stworzenie rozszerzonych cewników do podawania IB
<ol>
	<li>Wykonaj cięcie pod kątem prostym ostrym ostrzem na końcówce oryginalnego cewnika 22 G (25 mm, patrz Tabela materiałów) (Rysunek 3, krok 1a).</li>
	<li>Skos (~50°–60°) końcówki drugiego oryginalnego cewnika (25 mm) z ostrzem, a następnie odciąć pod kątem prostym od piasty (Rysunek 3, krok 1b).</li>
	<li>Przyklej dwa cewniki na ich końcach pod kątem nieco mniejszym niż 180° (Ryc. 3, krok 2).</li>
	<li>Stępić skośną końcówkę przez stopienie za pomocą kauteryzacji w niskiej temperaturze (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wypoleruj przedłużony cewnik papierem ściernym o rozmiarze "0" na klejonym obszarze i skośnej końcówce przedłużonego cewnika (Rysunek 3, krok 3).</li>
	<li>Zaznacz na przedłużonym cewniku różne kolory w odległości 25 mm, 30 mm i 35 mm (Rysunek 3, krok 3).</li>
	<li>Wskaż skośną stronę przedłużonego cewnika, oznaczając jego piastę markerem.</li>
	<li>Przepłukać przedłużony cewnik wodą demineralizowaną, a następnie przepłukać wnętrze cewnika 70% etanolem. Wysuszyć cewnik na powietrzu.</li>
	<li>Sterylizuj światłem UV przez 10 minut przed użyciem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do zabiegu
<ol>
	<li>Wszystkie podawane środki należy umieścić w biologicznym kapturze bezpieczeństwa w sterylnej technice.</li>
	<li>Oczyść miejsce pracy 70% etanolem.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem.</li>
	<li>Przymocuj podstawę platformy roboczej do stołu bezpośrednio przed badaczem, przymocowując zaciski C do podstawowego skrzydła podpórki do książek.</li>
	<li>Wygeneruj kilka prowizorycznych spirometrów, czyli urządzeń, które pozwolą na wykrycie pływowego przepływu powietrza u myszy. Krótko mówiąc, umieść 60 μl wysterylizowanej soli fizjologicznej w strzykawce o pojemności 1 ml (bez tłoka) z końcówką ładującą żel. 
	UWAGA: Zdeponowana kropla soli fizjologicznej zasłania beczkę i porusza się w górę i w dół, gdy jest wystawiona na wentylację pływową3.</li>
	<li>Luźno przymocuj piastę przedłużonego cewnika 22 G do prowizorycznego spirometru.</li>
	<li>Umieść każdy ze szklanych zakraplaczy po obu stronach platformy, aby ułatwić dostęp.</li>
	<li>Podłączyć komorę indukcyjną izofluranu do aparatu do znieczulania gryzoni (patrz tabela materiałów) w komorze bezpieczeństwa biologicznego zgodnej z izofluranem.</li>
</ol>
4. Nieoperacyjne podejście do intubacji IT
<ol>
	<li>Znieczulić mysz C57BL/6 (samiec lub samica, 8–10 tygodni, ~25 g) tlenem (2 l/min) i 5% izofluranem (patrz tabela materiałów) w komorze indukcyjnej przez 4 minuty.</li>
	<li>Odessać czynnik doświadczalny, który ma być dostarczony (np. niebieski barwnik Evansa lub dekstran FITC, jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 4) do dwóch pipet, a następnie umieścić je po obu stronach platformy podczas sedacji.</li>
	<li>Upewnij się, że częstość oddechów wynosi około 24–30 oddechów/min przed wyjęciem myszy z komory indukcyjnej znieczulenia. 
	UWAGA: Znieczulenie izofluranem trwa zazwyczaj 4 minuty, co jest wystarczające dla wszystkich zabiegów IB. Jeśli operator nie jest biegły w tej technice, ketamina/ksylazyna (80 mg/kg i 10 mg/kg dootrzewnowo, patrz tabela materiałów) może być użyta do bardziej długotrwałego znieczulenia.</li>
	<li>Zawieś mysz za siekacze na udrapowanej linii szwu w pozycji leżącej. Zabezpiecz mysz dwoma lub trzema kawałkami haczyka i luźno owiń taśmę, unikając ograniczenia wentylacji.</li>
	<li>Włącz oświetlacz światłowodowy LED (patrz Tabela materiałów, <silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Ustaw operatora za platformą (grzbietem do myszy).</li>
	<li>Ustaw gęsią szyję oświetlacza tak, aby oświetlał obszar krtani przez skórę. Odległość między myszą a źródłem światła wynosi 2–3 cm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca/łapy przed wykonaniem wszystkich poniższych procedur.</li>
	<li>Przytrzymaj sterylne kleszcze dominującą ręką, a następnie wyciągnij język z jamy ustnej za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przytrzymaj sterylny depresor ręką niedominującą, a następnie spłaszcz nasadę języka za pomocą depresora, aby szeroko odsłonić część ustno-gardłową. Kleszcze można następnie zwolnić, uwalniając dominującą rękę.</li>
	<li>Użyj dominującej ręki, aby zaintubować przedłużony cewnik do tchawicy przez jamę ustną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Potwierdź umieszczenie, obserwując, czy bańka w strzykawce porusza się w górę i w dół z każdym oddechem.</li>
	<li>Dodatkowe szczegóły dotyczące intubacji IT zostały opublikowane wcześniej3. Całkowity czas zabiegu, bez znieczulenia, trwa 10–15 s dla dobrze wyszkolonego operatora.</li>
</ol>
5. Nieoperacyjna intubacja IB i metody porodu
<ol>
	<li>Podejście IB do selektywnej kaniulacji płatowej dystalnego prawego płuca
	<ol>
		<li>Po wykonaniu kaniulacji IT (krok 4.11) obróć plastikową płytkę o +30° (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4A).</li>
		<li>Przytrzymaj piastę cewnika i prowadź go w sposób naturalny równolegle do linii środkowej myszy, rozciągając go na głębokość zależną od masy, jak opisano w tabeli 1. 
		UWAGA: Należy zwrócić uwagę na opór na tych głębokościach. W tym momencie mysz stanie się lekko tachypneiczna, jak wyjaśniono w reprezentatywnych wynikach. Dla doświadczonego operatora około 90% prób pomyślnie kaniuluje prawe płuco (z odnotowanym przyspieszonym oddechem).</li>
		<li>Dostarczyć 20 μl 0,3% niebieskiego barwnika Evansa (EBD, patrz tabela materiałów) za pomocą końcówki ładującej żel.</li>
		<li>Dozuj 1–2 porcje (po 0,1 ml każdy) powietrza za pomocą szklanego zakraplacza. 
		UWAGA: Zapewnia to usunięcie resztkowego roztworu EBD (lub środków eksperymentalnych) z wnętrza cewnika.</li>
		<li>Wyjmij cewnik, a następnie utrzymaj pozycję myszy przez 30 sekund.</li>
		<li>Połóż zwierzę na ocieplającym kocu, aż odzyska przytomność. Rekonwalescencja trwa zazwyczaj w ciągu 2 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podejście IB do selektywnej segmentowej kaniulacji dystalnego lewego płuca
	<ol>
		<li>Po wykonaniu kaniulacji IT (krok 4.11) obróć plastikową płytkę o -74° (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
		<li>Przytrzymaj piastę cewnika i delikatnie dociśnij, aby wsunąć cewnik do lewego oskrzela głównego pnia, jednocześnie wywierając umiarkowany nacisk zarówno w dół (90°), jak i w kierunku podnóżka. Na głębokościach podanych w tabeli 1 operator powinien zwrócić uwagę na opór, gdy dolne segmenty lewego płuca są zaangażowane. Jeśli wystąpi przyspieszony oddech, wycofaj cewnik do pozycji 20–25 mm i spróbuj ponownie.</li>
		<li>Po kaniulacji lewych dolnych segmentów płuc wymagana jest zmiana położenia, aby umożliwić grawitacyjne wspomaganie podawania środka. Obróć plastikową tablicę o -30° (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4B).</li>
		<li>Dostarcz 40 μl 0,3% EBD za pomocą końcówki ładującej żel. 
		UWAGA: Możliwe jest dostarczenie większej objętości środka, ponieważ lewe płuco ma tylko jeden płat</li>.
		<li>Dozować 1–2 porcje (0,1–0,3 ml każdy) powietrza za pomocą szklanych zakraplaczy. 
		UWAGA: Zapewnia to usunięcie wszelkich pozostałości EBD (lub środków eksperymentalnych) z wnętrza cewnika.</li>
		<li>Wyjmij cewnik, a następnie utrzymaj pozycję myszy przez 30 sekund.</li>
		<li>Połóż zwierzę na ocieplającym kocu, aż odzyska przytomność. Rekonwalescencja trwa zazwyczaj w ciągu 2 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosowanie podawania IB w celu umożliwienia podania środka do całego płuca lewego lub prawego 
	UWAGA: Jeśli operator stara się dostarczyć środki nie do określonego płata prawego płuca lub lewego segmentu płuca, ale raczej do całego płuca (prawego lub lewego płuca), cewnik należy lekko wycofać do odpowiednich oskrzeli pniowych, jak poniżej.
	<ol>
		<li>Prawe podanie całego płuca
		<ol>
			<li>Po kroku 4.11 obróć plastikową tablicę o +30° (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
			<li>Przytrzymaj piastę cewnika i prowadź go w sposób naturalny równolegle do linii środkowej myszy, docierając do głębokości niezbędnej do prawostronnej kaniulacji dystalnego płata (Tabela 1).</li>
			<li>Potwierdź pojawienie się objawu przyspieszonego oddechu.</li>
			<li>Obróć mysz o -74°, aby włączyć wspomaganie grawitacyjne dla dostarczania agenta (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 5B).</li>
			<li>Wycofać cewnik do pozycji odpowiadającej startowi prawego oskrzela głównego (Tabela 1). Upewnij się, że skos cewnika jest skierowany w dół (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B).</li>
			<li>Dostarczyć 30 μl 0,3% EBD za pomocą końcówki ładującej żel do prawego płuca.</li>
			<li>Dozuj 1–2 porcje (po 0,1–0,3 ml każdy) powietrza za pomocą szklanego zakraplacza.</li>
			<li>Wyjmij cewnik, a następnie utrzymaj pozycję myszy przez 30 s. Połóż zwierzę na kocu rozgrzewającym, aż odzyska przytomność. Rekonwalescencja trwa zazwyczaj w ciągu 2 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podanie całego lewego płuca
		<ol>
			<li>Po kroku 4.11 obróć plastikową tablicę o -74° (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A). Alternatywnie, po kroku 5.3.1.8 może nastąpić rotacja poprzez wycofanie cewnika do tchawicy, co umożliwia obustronne podanie IB.</li>
			<li>Przytrzymaj piastę cewnika i delikatnie dociśnij, aby wsunąć cewnik do lewego cewnika głównego mostka, jednocześnie wywierając umiarkowany nacisk zarówno w dół (90°), jak i w kierunku podnóżka. Głębokość intubacji jest określona w tabeli 1.</li>
			<li>Potwierdź brak objawu przyspieszonego oddechu.</li>
			<li>Obróć mysz o +86°, aby umożliwić grawitacyjną pomoc w podawaniu środka.</li>
			<li>Wycofaj cewnik do lewego oskrzela głównego pnia (te same odległości, co prawe płuco są wystarczające, Tabela 1) i obróć skos cewnika skierowany w dół (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B).</li>
			<li>Dostarczyć 30 μl 0,3% EBD za pomocą końcówki ładującej żel do lewego płuca.</li>
			<li>Dozuj 1–2 porcje (po 0,1–0,3 ml każdy) powietrza za pomocą szklanego zakraplacza.</li>
			<li>Wyjmij cewnik, a następnie utrzymaj pozycję myszy przez 30 s. Połóż zwierzę na kocu rozgrzewającym, aż odzyska przytomność. Rekonwalescencja trwa zazwyczaj w ciągu 2 minut.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Zastosowanie sekwencyjnych metod kaniulacji IB w celu dostarczenia dostosowanych do dawki objętości środka do każdego płuca
<ol>
	<li>Grupa administracyjna IT
	<ol>
		<li>Wykonaj kaniulację IT zgodnie z opisem w krokach 4.1–4.11.</li>
		<li>Dostarczyć 60 μl 0,05% dekstranu FITC (patrz Tabela Materiałów) za pomocą końcówki do ładowania żelem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
		<li>Dozuj 1–2 porcje (po 0,1–0,3 ml każdy) powietrza za pomocą szklanych zakraplaczy.</li>
		<li>Utrzymuj pozycję przez 60 s i pozwól na odzyskanie myszy, jak opisano powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Symetryczne obustronne podawanie IB
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 5.3.1.1–5.3.1.8 (prawe płuco) i 5.3.2.1–5.3.2.8 (lewe płuco).</li>
		<li>Podawać równe objętości (30 μl) 0,05% dekstranu FITC (lub środka eksperymentalnego) do każdej strony płuca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podawanie obustronnego IB w zależności od dawki
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 5.3.1.1–5.3.1.8 (prawe płuco) i kroki 5.3.2.1–5.3.2.8 (lewe płuco).</li>
		<li>Większą objętość (40 μl) 0,05% dekstranu FITC należy podać do większego prawego płuca, a mniejszą objętość (20 μl) 0,05% dekstranu FITC do mniejszego lewego płuca. Zamiast dekstranu FITC można podać środek eksperymentalny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Stosowanie IB dostosowanego do dawki w celu poprawy symetrii uszkodzenia płuc wywołanego pojedynczą dawką bleomycyny (BLM)
<ol>
	<li>Grupy administracyjne BLM
	<ol>
		<li>Grupa podawania IB-BLM dostosowana do dawki (1,2 mg/kg, patrz tabela materiałów): myszom dostarczono 60 μl (odpowiednio 20 μl dla lewego płuca i 40 μl dla prawego płuca) roztworu BLM (n = 5). Osoby z grupy kontrolnej (n = 5) otrzymały podobne ilości soli fizjologicznej. 
		UWAGA: Patrz kroki 5.3.1 i 5.3.2.</li>
		<li>Grupa administracji IT: 60 μl rozwiązania BLM dostarczono do myszy z technikami administrowania IT. 
		UWAGA: Patrz kroki 6.1.1–6.1.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar czynności płuc
	<ol>
		<li>W 21 dniu po BLM lub soli fizjologicznej znieczulij myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym (IP) ketaminy (160 mg / kg) i ksylazyny (32 mg / kg).</li>
		<li>Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia przez uszczypnięcie łapy/palca u nogi należy wykonać tracheostomię za pomocą kaniuli 18 G (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Podłącz myszy do respiratora i zmierz mechanikę oddychania zgodnie z wcześniejszym opisem4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie i przetwarzanie tkanki płucnej
	<ol>
		<li>Po pomiarze mechaniki płuc poddaj znieczulone myszy eutanazji przez nakłucie serca.</li>
		<li>Otwórz ścianę klatki piersiowej i wywołaj obustronną odmę opłucnową.</li>
		<li>Napompuj płuca 1% niskotopliwą agarozą (40 °C)5 w PBS pod stałym ciśnieniem (42 cm H2O).</li>
		<li>Wytnij cztery do pięciu kawałków płuca wzdłuż długiej osi poprzecznie, utrwal w 10% formalinie i zanurz w parafinie.</li>
		<li>Wytnij odcinki 5 μm i zabarwij trichromem Massona, aby uwidocznić osadzanie kolagenu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8 Opieka pozabiegowa
<ol>
	<li>Pod koniec procedur przetrwania należy położyć zwierzę na kocu rozgrzewającym, aż odzyska przytomność. Rekonwalescencja trwa zazwyczaj w ciągu 2 minut.</li>
</ol>

<ol><li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of Applied Physiology. 106 (3), 984-987 (2009).</li>
<li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotracheal+intubation+in+mice+via+direct+laryngoscopy+using+an+otoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li>
<li>Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Method+for+Rapid+Intubation+of+the+Trachea+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53771(2016).</li>
<li>McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> Journal of Visualized Experiments. (75), e50172(2013).</li>
<li>Halbower, A. C., Mason, R. J., Abman, S. H., Tuder, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+infiltration+improves+morphology+of+cryostat+sections+of+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Agarose infiltration improves morphology of cryostat sections of lung.</a> Laboratory Investigation. 71 (1), 149-153 (1994).</li>
<li>Thrall, R. S., McCormick, J. R., Jack, R. M., McReynolds, R. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis+in+the+rat%3A+inhibition+by+indomethacin%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rat: inhibition by indomethacin.</a> American Journal of Pathology. 95 (1), 117-130 (1979).</li>
<li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), L379-L399 (2008).</li>
<li>Del Sorbo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratracheal+Administration+of+Small+Interfering+RNA+Targeting+Fas+Reduces+Lung+Ischemia-Reperfusion+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Criticial+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury.</a> Criticial Care Medicine. 44 (8), e604-e613 (2016).</li>
<li>McLemore, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+intrapulmonary+model+for+orthotopic+propagation+of+human+lung+cancers+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice.</a> Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).</li>
<li>Vertrees, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+to+murine+orthotopic+xenotransplanted+lung+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Surgery%22%5BJournal%5D)">Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model.</a> Journal of Investigative Surgery. 13 (6), 349-358 (2000).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Uszkodzenie płuc zostało klasycznie zamodelowane u gryzoni przy użyciu informatycznego podawania szkodliwych czynników, takich jak BLM6. Taka administracja IT prowadzi jednak jedynie do niejednolitych uszkodzeń, co odzwierciedla niecelowy charakter dostarczania do płuc przy tym podejściu7. Te ograniczenia w modelowaniu uszkodzenia płuc są pouczającymi wyzwaniami, przed którymi staje się próba informatycznego dostarczania nieszkodliwych środków eksperymentalnych, takich jak ...

Bezpośrednie podawanie eksperymentalnych środków do płuc myszom pozwala na badanie reakcji immunologicznych płuc, ostrego uszkodzenia płuc i zwłóknienia płuc. Bezpośrednie podanie do płuc jest zwykle wykonywane poprzez wkraplanie dotchawicze (IT), jak opisano wcześniej1,2,3. Podejście to jest jednak nieselektywne, wpływając na oba płuca w sposób nieukierunkowany i często asymetryczny. Eksperymentalne modelowanie uszkodzenia płuc może przynieść korzyści dzięki możliwości selektywnego celowania w jedno określone płuco, co pozwala na wykorzystanie płuca przeciwległego jako kontroli. I odwrotnie, dokładne modelowanie rozlanych chorób płuc u ludzi przynosi korzyści dzięki symetrycznemu rozmieszczeniu czynników eksperymentalnych do obustronnego miąższu płuc.
Ogólnym celem tego raportu jest opisanie metody selektywnego dostarczania eksperymentalnych środków do lewego lub prawego płuca myszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). To podejście do podawania dooskrzelowego (IB) pozwala na jednostronne leczenie płuc myszy i może być łatwo dostosowane, aby zapewnić równe dostarczanie środka do obustronnych oskrzeli pniowych. Stosując podawanie IB do dostarczania większych dawek środków eksperymentalnych do większego prawego płuca i mniejszych objętości do mniejszego lewego płuca (tj. podawanie IB dostosowane do dawki), wykazano w tym raporcie poprawę jednorodności dostarczania do płuc środków eksperymentalnych, optymalizując model rozlanego uszkodzenia płuc u myszy. W związku z tym raport ten może mieć wartość dla badaczy dążących do jednostronnego podawania środków eksperymentalnych myszom lub poprawy symetrii osadzania się leku w obu płucach.

<table><tbody><tr><td>Osłonięty cewnik dożylny 22 G</td><td>BD</td><td>381423</td><td></td></tr><tr><td>Bleomycin</td><td>Enzo nauki przyrodnicze</td><td>BML-AP302-0010</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowa mini maszyna do znieczulania gryzoni&nbsp;</td><td>DRE Veterinary</td><td>9280</td><td></td></tr><tr><td>Evans niebieski barwnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD150</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LED-30W Światłowód Podwójny oświetlacz mikroskopu na gęsiej szyi</td><td>AmScope</td><td>LED-30W</td><td></td></tr><tr><td>Kauteryzacja niskotemperaturowa z cienką końcówką&nbsp;</td><td>Igła Bovie</td><td>AA02</td><td></td></tr><tr><td>Precisionglide, 18G x 1"</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Końcówka skośna, długość 12 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>AKORN</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Zatamine</td><td>VetOne</td><td>NDC 13985-702-10&nbsp;</td><td>Ketamina</td></tr></tbody></table>

bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy

Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung

Dotchawicze (IT) podawanie eksperymentalnych środków jest podstawową techniką w mysich modelach rozlanych chorób płuc, takich jak zwłóknienie płuc wywołane bleomycyną. Jednak dystrybucja środków podawanych dotchawiczo do dystalnego płuca myszy jest często asymetryczna, a stężenie miąższu w płucach jest zwiększone w mniejszym (ale równie dostępnym) lewym płucu myszy. W tym raporcie opisano nową substancję wewnątrzoskrzelową (IB) podejście do kaniulacji lewego i/lub prawego płuca żywych myszy bez operacji. Wykazano również, w jaki sposób podejście to może być wykorzystane do selektywnego podawania środków do jednego płuca lub dostosowane (poprzez dostarczanie IB dostosowane do dawki) w celu poprawy symetrii lewo-prawo dostarczania do płuc czynników eksperymentalnych, poprawiając w ten sposób modele rozlanej choroby płuc, takiej jak zwłóknienie płuc wywołane bleomycyną.

Selektywna intubacja oskrzelowa (IB) celuje w konkretne płaty (płuca prawe) lub segmenty podstawne (płuco lewe).
Podanie EBD drogą IB do prawego płuca przeprowadzono zgodnie z opisem w sekcji 5.1. Po zakończeniu eksperymentu myszom podano śmiertelną dawkę ketaminy/ksylazyny drogą doszpikową, a następnie pobrano płuca w celu zademonstrowania rozmieszczenia EBD (Rysunek 4A, po prawej)...

Dotchawicze (IT) podawanie eksperymentalnych środków myszom często powoduje asymetryczne dostarczanie do dystalnych płuc. W tym raporcie opisujemy bezpośrednie podejście dooskrzelowe (IB) do kanniulacji każdego płuca u żywych myszy bez operacji. To podejście może być stosowane do selektywnego podawania środków do jednego płuca lub może być dostosowane do poprawy symetrycznego dostarczania środka do obu płuc.

Bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced ...

Aby modelować chorobę płuc u myszy, środki eksperymentalne są często podawane przez wstrzyknięcie dotchawicze. Podejście to nie może jednak selektywnie celować w jedno płuco, a dystrybucja może być asymetryczna między płucami. Poprzez kaniulację pojedynczego płuca u znieczulonej myszy, możemy jednostronnie podać środki eksperymentalne.Po modyfikacji podejście to może być stosowane obustronnie, poprawiając symetrię osadzania w obu płucach. Przygotowanie cewnika, w tym polerowanie, lekkie kątowanie i etykietowanie, jest kluczowym elementem sukcesu. Oczywiście konieczne jest również ćwiczenie tej techniki.Procedurę zademonstruje Sumei Liao, profesjonalna asystentka naukowa z mojego laboratorium. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca, zawiesić znieczuloną, ośmio- do 10-tygodniową mysz C57-Black/6 z siekaczy na udrapowanej linii szwów w pozycji leżącej. Luźno zabezpiecz mysz dwoma lub trzema kawałkami haczyka i owiń taśmę, unikając ograniczenia wentylacji, i włącz oświetlacz światłowodowy z diodą elektroluminescencyjną.Ustaw operatora za platformą, grzbietem do myszy. Ustaw oświetlacz na gęsiej szyi w odległości od dwóch do trzech centymetrów od myszy, tak aby oświetlał obszar krtani przez skórę. Za pomocą sterylnych kleszczy w dominującej ręce wyciągnij język z jamy ustnej.Użyj ręki niedominującej i sterylnego depresora, aby spłaszczyć nasadę języka, aby szeroko odsłonić część ustno-gardłową. Po zwolnieniu kleszczy użyj dominującej ręki, aby zaintubować przedłużony cewnik do tchawicy przez jamę ustną. Potwierdzić umieszczenie, obserwując, czy pęcherzyk w strzykawce porusza się w górę i w dół przy każdym oddechu.W przypadku selektywnej kaniulacji płatowej dystalnego prawego płuca, po intubacji dotchawiczej, obróć plastikową płytkę o 30 stopni i poprowadź piastę cewnika równolegle do linii środkowej myszy na odpowiednią głębokość opartą na wadze, jak wskazano w tabeli. Za pomocą końcówki ładującej żel wprowadź 20 mikrolitrów 0,3% niebieskiego barwnika Evansa do cewnika, a następnie od jednej do dwóch 100-mikrolitrowych porcji powietrza szklanym zakraplaczem. Następnie wyjmij cewnik i utrzymuj mysz w tej pozycji przez 30 sekund przed umieszczeniem zwierzęcia na kocu rozgrzewającym, z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia.W przypadku selektywnej kaniulacji płatowej dystalnego lewego płuca, po intubacji dotchawiczej, obróć plastikową płytkę o minus 74 stopnie i delikatnie wsuń cewnik do lewego oskrzela głównego pnia, wywierając niewielki nacisk 90 stopni w dół i w kierunku podpórki książki. Po kaniulacji lewych dolnych segmentów płuc obróć plastikową płytkę o minus 30 stopni i podaj 40 mikrolitrów 0,3% niebieskiego barwnika Evansa za pomocą końcówki ładującej żel. Następnie podaj jedną do dwóch porcji powietrza o pojemności od 100 do 300 mikrolitrów przez szklany zakraplacz i wyjmij cewnik, aby umożliwić myszy powrót do zdrowia, jak pokazano.W przypadku podania prawego całego płuca, po intubacji dotchawiczej, obróć plastikową płytkę o 30 stopni i poprowadź cewnik równolegle do linii środkowej myszy, sięgając do głębokości niezbędnej do prawostronnej kaniulacji dystalnej płata. Potwierdź pojawienie się objawu przyspieszonego oddechu i obróć mysz o minus 74 stopnie, aby umożliwić wspomaganie grawitacyjne dostarczania środka. Wycofać cewnik do pozycji odpowiadającej startowi prawego oskrzela głównego i upewnić się, że skos cewnika jest skierowany w dół.Dostarczyć 30 mikrolitrów 0,3% niebieskiego barwnika Evansa do prawego płuca, a następnie od jednego do dwóch podwielokrotności powietrza o pojemności od 100 do 300 mikrolitrów. Następnie wyjmij cewnik i pozwól myszy dojść do siebie. W przypadku podania całego lewego płuca, po kaniulacji dotchawiczej, obróć plastikową płytkę o minus 74 stopnie i delikatnie wsuń cewnik do lewego oskrzela głównego pnia, wywierając umiarkowany nacisk zarówno pod kątem 90 stopni w dół, jak i w kierunku podnóżka.Potwierdź brak objawu przyspieszonego oddechu i obróć mysz o 86 stopni, aby umożliwić pomoc grawitacyjną w podawaniu środka. Wycofaj cewnik do lewego oskrzela głównego pnia i obróć skos cewnika tak, aby był skierowany w dół. Dostarczyć 30 mikrolitrów 0,3% niebieskiego barwnika Evansa za pomocą końcówki ładującej żel do lewego płuca, a następnie od jednej do dwóch porcji powietrza o pojemności od 100 do 300 mikrolitrów.Następnie należy wycofać cewnik, aby umożliwić myszowi powrót do zdrowia, jak pokazano. Obustronne podawanie FITC-dekstranu zarówno dotchawiczo, jak i symetrycznie dooskrzelowym prowadzi do asymetrycznej fluorescencji FITC w miąższu płuc z większymi względnymi stężeniami obserwowanymi w lewym płucu. Sugeruje to, że asymetryczne dostarczanie do płuc środków eksperymentalnych po podaniu dotchawiczym nie jest konsekwencją asymetrycznego podawania tych środków do każdego oskrzela pnia głównego, ale że równe dostarczanie do pnia głównego jest rozcieńczane przez różnice w masie i masie płuc.Podanie dooskrzelowe dostosowane do dawki poprawia symetrię podawania środka miąższowego do płuc. Jednak pomimo tej korekty nadal obserwuje się utrzymującą się heterogeniczność w obrębie różnych płatów prawego płuca. 21 dni po zwłóknieniowym uszkodzeniu płuc wywołanym przez bleomycynę dotchawiczą stan zapalny obserwuje się głównie w lewym płucu, z mniejszym uszkodzeniem zauważalnym w prawym płucu.I odwrotnie, dooskrzelowe podawanie bleomycyny dooskrzelowej po dostosowaniu dawki powoduje nieznacznie zmniejszone uszkodzenie lewego płuca i zwiększone uszkodzenie prawego płuca, przy czym największe uszkodzenie jest widoczne w środkowym i górnym płacie. Podczas całego podawania do płuc nie należy zapominać o wyjęciu cewnika i skierowaniu skosu cewnika do dołu.

direct-intrabronchial-administration-to-improve-selective-agent

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Instylacje wewnątrzkrtaniowe pozwalają na dostarczanie substancji bezpośrednio do płuc. Procedura ta umożliwia wprowadzenie instylatu do dystalnych obszarów płuc, dlatego jest często stosowana w badaniach nad pęcherzykami pęcherzykowymi. Przedstawiamy szczegółowy protokół dla zwierząt przeżywalnych dotyczący wykonywania instylacji wewnątrzkrtaniowych u myszy.

Bezpośrednia instylacja substancji rozpuszczonych do tchawicy myszy w celu podania do płuc

Prezentujemy metodę niechirurgicznego podawania materiałów testowych do płuc znieczulonych myszy poprzez tchawicę. Metoda ta umożliwia ekspozycję płuc na patogeny bakteryjne i wirusowe, cytokiny, przeciwciała, koraliki, związki chemiczne lub barwniki. Ponadto opisujemy proces pobierania i przygotowania płuc oraz drenujących je węzłów chłonnych (LDLNs) do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Niesurgicalna instylacja endotrachealna u myszy z analizą płuc oraz drenujących płuca węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej

Opracowaliśmy nową metodę chirurgiczną podawania czynników bioaktywnych drogą wewnątrz tchawiczną do płodu myszy. Ta droga podania jest bardziej efektywna w celowaniu w płuca płodu myszy niż powszechnie stosowane wstrzyknięcia do jamniówki. Procedura ta nie była dotychczas opisana w modelu mysim.

Nowatorskie podejście chirurgiczne do wewnątrztrachealnego podawania substancji bioaktywnych w płodowym modelu mysim

Ten film opisuje podejście dooskrzelowe polegające na selektywnym podawaniu eksperymentalnego środka do dystalnego prawego i lewego płuca. W przedstawionym protokole będziemy podawać bleomycynę dooskrzelowo myszy, aby uzyskać lepszy model zwłóknienia płuc.

Podawanie dooskrzelowe: technika selektywnego podawania eksperymentalnego środka do płuc myszy

Ten film pokazuje proces powstawania infekcji płuc u immunokompetentnego modelu gryzoni poprzez intubację i instalację zawiesin bakteryjnych w płatach płuc. Model ten umożliwia badania skuteczności przeciwbakteryjnej u zwierząt immunokompetentnych.

Wkraplanie dooskrzelowe Streptococcus pneumoniae w immunokompetentnych modelach gryzoni

Użycie modelu, który naśladuje stan chorób płuc u ludzi, jest kluczowe dla badania patofizjologii i/lub etiologii danej choroby oraz dla opracowania interwencji terapeutycznej. W artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę intubacji dotchawiczej, która może bezpośrednio dostarczać materiały egzogenne do płuc myszy.

Nieinwazyjna intubacja dotchawicza w celu zbadania patologii i fizjologii płuc myszy

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Intubacja-intubacja dotchawicza (IMIT) jest doskonałą, nieinwazyjną metodą badania chorób układu oddechowego, jak również metodą wkraplania odczynników terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Jest to szybka i wysoce powtarzalna metoda, która nadaje się do badań przedklinicznych.

Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Ten artykuł przedstawia szybką i prostą metodę podawania bleomycyny bezpośrednio do tchawicy myszy poprzez intubację. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna, łatwa do opanowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani długiego czasu rekonwalescencji.

Ulepszona metoda szybkiej intubacji tchawicy u myszy

Terapia komórkowa oferuje obiecujące leczenie dla pacjentów z przewlekłą chorobą płuc poprzez zastosowanie komórek progenitorowych do naprawy uszkodzonych tkanek i poprawy funkcji płuc. Ponieważ obrazowanie odgrywa kluczową rolę w śledzeniu integracji komórek, opisujemy tutaj śledzenie in vivo terapii komórkowej dla przewlekłej choroby płuc w modelu mysim z wykorzystaniem obrazowania cząstek magnetycznych.

Zobrazenie in vivo sterydowane obrazem śledzenia przeszczepowanych komórek macierzystych nabłonka odległych płuc w przypadku zwłóknienia płuc przy użyciu obrazowania z zastosowaniem cząstek magnetycznych

Przedstawiamy protokół modelowania włóknienia płuc u myszy z wykorzystaniem aerozozolizowanej bleomycyny podanej przez tchawicę. Ta zoptymalizowana metoda umożliwia jednolite, ilościowe i precyzyjne podanie bez nacięcia chirurgicznego, zwiększając powtarzalność i wiarygodność włóknienia wywołanego bleomycyną.

Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc

Poznaj metodę bezpośredniego podania dooskrzelowego do płuc myszy, umożliwiającą selektywną aplikację czynników do jednego płuca lub symetryczne rozłożenie w obu płucach. Technika ta poprawia dokładność badań nad chorobami płuc.

Bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy

Przeglądaj więcej filmów