Name: Test kolorymetryczny aktywności syntazy cytrynianu u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Poznaj metodę kolorymetrycznego pomiaru aktywności syntazy cytrynianu w homogenatach tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten pozwala szybko ocenić masę mitochondriów bez ich izolacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31401013 i 31471010), Komisji Nauki i Technologii Gminy Szanghaj, Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) oraz Fundacji Nauk Przyrodniczych w Szanghaju (19ZR1446400).

1. Kolorymetryczny pomiar aktywności syntazy cytrynianowej u D. melanogaster16
<ol>
	<li>Zebrać dziesięć dorosłych much dla każdej próbki. Zebrać co najmniej trzy powtórzenia próbek dla każdego genotypu.</li>
	<li>Przygotuj 500 µL lodowatego buforu do ekstrakcji zawierającego 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA oraz 0,1% triton X-10 w probówce 1,5 ml dla każdej próbki.</li>
	<li>Uśpić dorosłe muchy za pomocą CO22 na podkładce do anestezji i wyizoluj pożądane tkanki. Aby wyizolować klatki piersiowe dorosłych much, należy na przykład unieruchomić klatki piersiowe much pęsetą, a następnie oddzielić odwłoki much, przecinając je wzdłuż granicy klatki piersiowej i odwłoka za pomocą nożyczek. Klatki piersiowe much należy zebrać do oznaczenia aktywności syntazy cytrynianowej w mięśniach. 
	UWAGA: Na tym etapie należy określić masę świeżą tkanki, jeśli jest ona wykorzystywana do normalizacji aktywności syntazy cytrynianowej.</li>
	<li>Przenieś 10 odwłoków dorosłych much do 100 µL buforu ekstrakcyjnego schłodzonego do temperatury 0°C i homogenizuj za pomocą tłuczka na lodzie. Aby próbki pozostały schłodzone, homogenizuj je przez 5–10 s na lodzie, następnie pozostaw na lodzie na 5 s i powtarzaj tę czynność, aż wszystkie tkanki w probówce zostaną całkowicie zhomogenizowane. 
	UWAGA: Proszkę zaklejonej probówki, a następnie sprawdzić homogenaty, aby upewnić się, że nie zawierają one skrzepów i że tkanki w probówce zostały całkowicie zhomogenizowane. Wszystkie etapy obróbki próbek należy przeprowadzać w warunkach chłodzenia na lodzie.</li>
	<li>Pobierz 10 µL każdą zhomogenizowanych próbek do nowej probówki w celu oznaczenia zawartości białka. Próbki przeznaczone do pomiaru białka należy przechowywać na lodzie. 
	UWAGA: Próbki białek można zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy. Stężenia białek służą jako wewnętrzny parametr do normalizacji aktywności syntazy cytrynianowej.</li>
	<li>Dodaj 400 µL lodowatego buforu ekstrakcyjnego do każdej pozostałej próbki, tak aby uzyskać całkowitą objętość wynoszącą 500 µLWymieszać dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół co najmniej 5 razy, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. Do każdej reakcji dodać 1 µL rozcieńczonego lizatu komórkowego do 150 µL świeżo przygotowanego roztworu reakcyjnego (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetylu CoA, 1 mM kwasu szczawiowego). Wymieszać dokładnie i niezwłocznie, delikatnie pipetując, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Pomiar absorbancji przeprowadzać przy 412 nm co 10–30 s przez 4 min w 25 °C przy użyciu czytnika płytek umożliwiającego pomiar absorbancji przy 412 nm w odstępach czasowych wynoszących co najmniej 10 s. 
	UWAGA: Przed pipetowaniem innego odczynnika należy zmienić końcówkę i unikać tworzenia pęcherzyków powietrza w dołkach. Niecałkowite wymieszanie odczynników może prowadzić do zmienności pomiarów. Analizę aktywności syntazy cytrynianowej należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej niezwłocznie po pobraniu próbek, ponieważ analiza ta służy do ilościowego oznaczenia nienaruszonej masy mitochondriów. Bufor reakcyjny należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i nie należy go przechowywać.</li>
	<li>Nanieś dane jako gęstość optyczną (OD) lub absorbancję (abs) (oś Y) w funkcji czasu (w minutach) (oś X). Następnie oblicz nachylenie dla liniowego fragmentu krzywej, w którym szybkość reakcji jest 
	 
	<img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq1.jpg" alt="Wzór na szybkość zmiany gęstości optycznej, ΔOD/ΔT, stosowany w analizie absorpcyjnej i badaniach spektroskopowych." data-altupdatedat="1788282455000"> 
	 
	Podziel uzyskaną wartość przez stężenie białka w próbce, aby znormalizować aktywność syntazy cytrynianowej. Aktywność syntazy cytrynianowej oblicza się według wzoru 
	 
	<img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq2.jpg" alt="Wzór na aktywność syntazy cytrynianowej, szybkość reakcji/białko, równanie kinetyki enzymatycznej." data-altupdatedat="1788282455000"> 
	 
	UWAGA: Stężenie białka w próbce można zmierzyć za pomocą zestawu do oznaczania stężenia białek.</li>
</ol>

<ol><li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells%3A+The+Discerning+Killers%21%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!</a> Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).</li>
<li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li>
<li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals%3A+Untangling+the+knot%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li>
<li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction%2C+oxidative+stress%2C+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death & Disease. 5, e984(2014).</li>
<li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li>
<li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrate+synthase%3A+structure%2C+control%2C+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li>
<li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
<li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel%2FdPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).</li>
<li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spargel%2FdPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li>
<li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1%2FSpargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li>
<li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li>
<li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster%3A+oxidative+stress%2C+mitochondrial+activity%2C+and+survivorship%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Badania metaboliczne z wykorzystaniem Drosophila jako modelu muszą uwzględniać tło genetyczne, dietę i utrzymanie stada muszek18. Aby uniknąć wpływu różnych środowisk genetycznych na pomiar aktywności syntazy cytrynianu, różne szczepy Drosophila powinny być krzyżowane wstecznie ze szczepem kontrolnym przez 10 pokoleń. Tło genetyczne wszystkich szczepów Drosophila użytych w naszych eksperymentach to w1118, więc użyliśmy w1118 jako k...

Mitochondria są najbardziej znane jako organelle wytwarzające energię w większości organizmów eukariotycznych, które wytwarzają walutę energetyczną, ATP, poprzez cykl kwasów trikarboksylowych (tj. cykl Krebsa) i fosforylację oksydacyjną. Stwierdzono również, że mitochondria odgrywają ważną rolę w wielu innych procesach fizjologicznych, takich jak regulacja apoptozy1, Ca2+ homeostaza2,3, generacja reaktywnych form utleniania (ROS)4, oraz retikulum endoplazmatyczne (ER)-odpowiedź na stres5. Dysfunkcja mitochondriów może wpływać na każdy narząd w ciele w każdym wieku i jest główną przyczyną chorób metabolicznych, związanych ze starzeniem się6 i neurodegeneracyjnych7. Nienaruszone mitochondria są mechanistycznie związane z funkcją mitochondriów. Tak więc właściwa kwantyfikacja nienaruszonej masy mitochondrialnej jest bardzo ważna dla oceny funkcji mitochondriów8. Syntaza cytrynianu, enzym ograniczający szybkość w pierwszym etapie cyklu kwasów trikarboksylowych9, jest zlokalizowana w macierzy mitochondrialnej w komórkach eukariotycznych, a zatem może być stosowana jako ilościowy marker obecności nienaruszonej masy mitochondrialnej9,10. Aktywność syntazy cytrynianu może być również stosowana jako czynnik normalizujący dla nienaruszonych białek mitochondrialnych11,12.
Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, jest doskonałym modelowym systemem do badania funkcji mitochondriów, ponieważ wiele cząsteczek i szlaków, które odgrywają kluczową rolę w mitochondriach, jest ewolucyjnie zachowanych od Drosophila do człowieka13,14,15. W tym miejscu przedstawiamy protokół szybkiej i prostej metody pomiaru aktywności syntazy cytrynianu za pomocą testu kolorymetrycznego w homogenatach tkanek Drosophila16 w formacie płytki 96-dołkowej. W teście aktywności syntazy cytrynianu syntaza cytrynianu w homogenacie tkankowym Drosophila katalizuje reakcję szczawiooctanu z acetylokoenzymem A (acetylo-CoA) w celu wytworzenia cytrynianu CoA-SH i H+. CoA-SH następnie reaguje z 5,5'-ditiobis-(kwasem 2-nitrobenzoesowym) (DTNB), tworząc barwny produkt, 2-nitro-5-tiobenzoesan (TNB), który można łatwo zmierzyć spektrofotometrycznie przy 412 nm. Aktywność syntazy cytrynianu może być odzwierciedlona w szybkości produkcji koloru.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowy (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900477</td><td></td></tr><tr><td>2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol (zasada TRIZMA))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900483</td><td></td></tr><tr><td>Acetylo-CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2181</td><td></td></tr><tr><td>Kwas ditio-bis-nitrobenzoesowy (DTNB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>szczawiooctan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek do pelletu</td><td>Sangon</td><td>F619072</td><td></td></tr><tr><td>Silnik do peletów</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y10</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>BioTek</td><td>Eon</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białka BCA</td><td>Beyotime</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>WPI</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon</td><td>A110694-0100</td><td></td></tr></tbody></table>

test kolorymetryczny aktywności syntazy cytrynianu u drosophila melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondria odgrywają najważniejszą rolę w metabolizmie komórkowym, wytwarzając ATP poprzez fosforylację oksydacyjną i regulując różnorodne procesy fizjologiczne. Dysfunkcja mitochondriów jest główną przyczyną wielu chorób metabolicznych i neurodegeneracyjnych. Nienaruszone mitochondria mają kluczowe znaczenie dla ich prawidłowego funkcjonowania. Enzym syntaza cytrynianu jest zlokalizowany w macierzy mitochondrialnej, a zatem może być stosowany jako ilościowy marker enzymatyczny nienaruszonej masy mitochondrialnej. Biorąc pod uwagę, że wiele cząsteczek i szlaków, które pełnią ważne funkcje w mitochondriach, jest wysoce konserwatywnych między ludźmi a Drosophila, oraz że w Drosophila dostępny jest szereg potężnych narzędzi genetycznych, Drosophila służy jako dobry system modelowy do badania funkcji mitochondriów. W tym miejscu przedstawiamy protokół szybkiego i prostego pomiaru aktywności syntazy cytrynianu w homogenacie tkankowym od dorosłych much bez izolowania mitochondriów. Protokół ten nadaje się również do pomiaru aktywności syntazy cytrynianu w larwach, hodowanych komórkach i tkankach ssaków.

Rycina 1 przedstawia przykład krzywych kinetycznych wchłaniania OD przy 412 nm w czasie, uzyskanych za pomocą kolorymetrycznego testu aktywności cytrynianowej syntezy w homogenatach tkanki tułowia Drosophila o różnych genotypach. Wiadomo, że PGC-1α jest głównym regulatorem biogenezy mitochondriów. PGC-1α jest funkcjonalnie zachowany między Drosophila a człowiekiem. Drosophila RNF34 (dRNF34) jest ligazą ubiquitynową typu E3 dla D...

Przedstawiamy protokół kolorymetrycznego testu aktywności syntazy cytrynianu do ilościowego oznaczania nienaruszonej masy mitochondrialnej w homogenatach tkanek Drosophila.

Test kolorymetryczny aktywności syntazy cytrynianu u Drosophila melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Drosophila służy jako dobry system modelowy do badania funkcji mitochondriów. W tym miejscu przedstawiamy protokół pomiaru aktywności syntazy cytrynianu w homogenacie tkankowym dorosłych muszek. Protokół ten nie wymaga izolacji mitochondriów.Jest szybki i prosty i nadaje się do pomiaru aktywności syntazy cytrynianu w larwach, hodowanych komórkach i tkankach ssaków. Zacznij od zebrania dorosłych much dla każdej próbki, upewniając się, że zebrałeś co najmniej trzy próbki dla każdego genotypu. Przygotuj 500 mikrolitrów lodowatego buforu ekstrakcyjnego z 20 milimolowymi HEPES, jednym milimolowym EDTA i 0,1% trytonem X-100 w 1,5-mililitrowej probówce dla każdej próbki.Znieczulij dorosłe muchy dwutlenkiem węgla na podkładce anestezjologicznej. Aby odizolować klatkę piersiową, przymocuj je za pomocą kleszczy i odizoluj odwłoki much, przecinając wzdłuż granicy klatki piersiowej i brzucha nożyczkami. Zebrać klatki piersiowe much do testu aktywności syntazy cytrynianu.Natychmiast przenieś 10 dorosłych much tułowia do 100 mikrolitrów lodowatego buforu ekstrakcyjnego i homogenizuj je tłuczkiem na lodzie. Utrzymuj próbki w niskiej temperaturze, homogenizując je przez pięć do 10 sekund na lodzie, pozostawiając je na lodzie przez pięć sekund, a następnie powtarzaj, aż wszystkie tkanki zostaną całkowicie zhomogenizowane. Porcję 10 mikrolitrów każdej homogenizowanej próbki do nowej probówki w celu pomiaru zawartości białka, utrzymując te probówki również na lodzie.Dodaj 400 mikrolitrów lodowatego buforu ekstrakcyjnego do każdej pozostałej próbki, aby uzyskać łączną objętość 500 mikrolitrów i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Do każdej reakcji dodać jeden mikrolitr rozcieńczonego lizatu komórkowego do 150 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu reakcyjnego. Dokładnie wymieszaj, delikatnie pipetując, upewniając się, że nie tworzy się pęcherzyków, a następnie użyj czytnika płytek, aby zmierzyć absorbancję przy 412 nanometrach co 10 do 30 sekund przez cztery minuty w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Wykreśl dane jako absorbancję w czasie, a następnie oblicz nachylenie liniowej części krzywej. Na koniec podziel szybkość reakcji lub nachylenie przez stężenie białka próbki, aby znormalizować aktywność syntazy cytrynianu. Postawiono hipotezę, że knockdown dRNF34 w mięśniu Drosophila zwiększy aktywność mitochondrialnej syntazy cytrynianu, podczas gdy knockdown dPGC-1 odwróci ten wzrost.Początkową liniową szybkość enzymatyczną ustalono dla każdego testu; Nachylenia linii trendu reprezentują maksymalne szybkości reakcji, które są równoważne maksymalnej aktywności syntazy cytrynianu różnych genotypów. Maksymalną aktywność syntazy cytrynianu obliczono na podstawie krzywych kinetycznych i znormalizowano stężeniem białka. Wyniki wykazały, że aktywność syntazy w tułowiu muchy rzeczywiście wzrosła wraz ze specyficznym dla mięśni knockdownem dRNF34, a wzrost został odwrócony przez specyficzny dla mięśni knockdown dPGC-1.Podczas homogenizacji próbki ważne jest, aby przechylić probówkę i sprawdzić homogenat, aby upewnić się, że nie ma skrzepów i że tkanki w probówce są całkowicie homogenizowane. Po pobraniu próbki wszystkie zabiegi należy wykonać na lodzie. Test aktywności syntazy cytrynianu służy do ilościowego określania nienaruszonej masy mitochondrialnej.Właściwa kwantyfikacja nienaruszonej masy mitochondrialnej jest bardzo ważna dla oceny funkcji mitochondriów.

a-colorimetric-assay-citrate-synthase-activity-drosophila

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Ten film opisuje test kolorymetryczny do pomiaru aktywności syntazy cytrynianu mitochondrialnego obecnego w homogenacie tkankowym Drosophila.

Test aktywności syntazy cytrynianu: Test kolorymetryczny do pomiaru aktywności syntazy cytazy mitochondrialnej w homogenacie tkanki Drosophila

Wprowadzenie małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka Drosophila daje ogromne możliwości do charakteryzowania aktywności biologicznej nowych związków, leków i toksyn, a także do badania podstawowych ścieżek rozwojowych. Opisane tu metody nakreślają kroki, które pokonują naturalne bariery dla tego podejścia, rozszerzając użyteczność modelu zarodka Drosophila.

Metoda przenikania zarodków Drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru utleniania paliwa u Drosophila melanogaster, w której muchom podawane są śladowe ilości specyficznych, znakowanych radioaktywnie substratów metabolicznych. Wydychany znakowany radioizotopowo CO2 powstający w wyniku utleniania paliwa jest zbierany i mierzony.

Pomiar produkcji dwutlenku węgla z substratów znakowanych radioaktywnie u Drosophila melanogaster

Test CApillary FEeder (CAFE) jest prostą, niedrogą i wysoce niezawodną metodą badania mechanizmów leżących u podstaw przyjmowania pokarmu. Stosowany w połączeniu z wysoce wszechstronnym modelem genetycznym Drosophila melanogaster, stanowi potężny środek do uzyskania nowego wglądu w mechanizmy regulacyjne przyjmowania pokarmu.

Test CApillary FEeder mierzy spożycie pokarmu u Drosophila melanogaster

Komórkowy transport jonów często można ocenić poprzez monitorowanie wewnątrzkomórkowego pH (pHi). Genetycznie kodowane wskaźniki pH (GEpHIs) zapewniają optyczną kwantyfikację wewnątrzkomórkowego pH w nienaruszonych komórkach. Protokół ten szczegółowo opisuje ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowego pH za pomocą komórkowego obrazowania na żywo ex vivo kanalików Malpighiego Drosophila melanogaster z pHerry, pseudoratiometrycznym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH.

Optyczna kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pH w nabłonku kanalików Malpighian Drosophila melanogaster z fluorescencyjnym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH

Protokół opisuje prosty test do identyfikacji larw Drosophila melanogaster, które doświadczają niedotlenienia przy normalnym poziomie tlenu w atmosferze. Protokół ten pozwala odróżnić niedotlenione larwy od innych mutantów, które wykazują nakładające się fenotypy, takie jak powolność lub powolny wzrost.

Test kopania/tunelowania w celu wykrycia niedotlenienia u larw Drosophila melanogaster

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Przedstawiamy protokół pomiaru zużycia tlenu i pozakomórkowego zakwaszenia w mózgach larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Analizator metaboliczny jest używany z dostosowanym i zoptymalizowanym protokołem. Ograniczenia mikrotkanek są kluczowym elementem tego protokołu i zostały zaprojektowane i stworzone specjalnie do ich wykorzystania w tej analizie.

Analiza metaboliczna larwalnych i dorosłych mózgów Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Kulometryczna respirometria jest idealna do pomiaru tempa metabolizmu małych organizmów. Po dostosowaniu do Drosophila melanogaster w niniejszym badaniu, zmierzone spożycieO2 mieściło się w zakresie zgłoszonym dla dzikiego typu D. melanogaster w poprzednich badaniach. Konsumpcja O2 na muchę przez mutanty CASK, które są mniejsze i mniej aktywne, była znacznie niższa niż w przypadku typu dzikiego.

Pomiar zużyciaO2 u Drosophila melanogaster za pomocą mikrorespirometrii kulometrycznej

Poznaj metodę kolorymetrycznego pomiaru aktywności syntazy cytrynianu w homogenatach tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten pozwala szybko ocenić masę mitochondriów bez ich izolacji.

Test kolorymetryczny aktywności syntazy cytrynianu u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów