Name: Rozmrażanie, hodowla i kriokonserwacja linii komórkowych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Naucz się protokołów rozmrażania, hodowli i kriokonserwacji linii komórkowych Drosophila. Standardowe metody zapewniają wysoką żywotność komórek i powtarzalność wyników w badaniach biomedycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy National Institutes of Health (Nagroda NIH P40OD010949) oraz społeczności naukowej za wykorzystanie różnych zasobów DNA/wektorów/komórek D. melanogaster nadzorowanych przez DGRC.

1. Rozmrażanie i rewitalizowanie zamrożonych linii komórkowych Drosophila
<ol>
	<li>Wysterylizuj kaptur, przecierając powierzchnię roboczą 70% etanolem. Dozować 5 ml odpowiedniej pożywki (Tabela 1) do kolby T o średnicy25 cm (T-25).</li>
	<li>Usunąć kriofial/ampułkę z płynuN2 lub suchego lodu. Przetrzyj kriowial 70% etanolem, ostrożnie poluzuj i rozszczelnij ampułkę.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura pobrać 1 ml pożywki o temperaturze pokojowej (RT) z kolby T-25. Powoli dodawaj pożywkę do kriowialu i delikatnie mieszaj, aby rozmrozić zamrożone komórki, upewniając się, że zawiesina komórek nie przeleje się.</li>
	<li>Przenieść całą objętość zawiesiny rozmrożonych komórek z ampułki do kolby T-25. Powtórz tę czynność, aby upewnić się, że zawiesina komórek została całkowicie przeniesiona.</li>
	<li>Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 25 °C, pozwalając komórkom osiąść i przylegać przez co najmniej 2 godziny. Zbadać komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek osiadła na powierzchni wzrostu. Delikatnie usuń stare podłoże i zastąp je 5 ml świeżym. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze.</li>
	<li>Następnego dnia delikatnie usuń stare podłoże i zastąp je 5 ml świeżym. Przywróć kulturę do inkubatora.</li>
</ol>
2. Rozmrażanie i rewitalizacja zamrożonych linii komórkowych Drosophila (alternatywnie)
<ol>
	<li>W sterylnym kapturze rozmrozić komórki, ponownie zawieszając zamrożone osady z 1 ml pożywki RT. Przenieść całą rozmrożoną zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Osadzać komórki przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml świeżej pożywki.</li>
	<li>Przenieść całą objętość zawiesiny komórkowej do kolby T-25 i inkubować kulturę w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>1 do 2 godzin później zbadaj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek osiadła na rosnącej powierzchni. Następnego dnia zastąp starą pożywkę 5 ml świeżej pożywki i włóż kulturę z powrotem do inkubatora.</li>
</ol>
3. Hodowla komórek póładherentnych hodowanych na 100 mm płytkach hodowlanych
<ol>
	<li>Wysterylizuj kaptur, wycierając go 70% etanolem. Do kaptura należy włożyć sterylne materiały do subkulturacji, w tym butelki z pożywką, pipety, przyrząd do pipet i płytki hodowlane.</li>
	<li>Zbadaj morfologię i zbieg kultury pod mikroskopem. Szukaj wyraźnych oznak skażenia mikroorganizmami w kulturze. Określ, czy komórki są gotowe do pasażu, w oparciu o charakterystykę hodowli: gęstość komórek i czas podwojenia, w tym ostatni raz, kiedy były subhodowane.</li>
	<li>Jeśli kultura wydaje się wysoce zlewająca (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), określ gęstość komórek. W sterylnym kapturze usuń komórki z powierzchni wzrostu, odpipetowując do 10 ml pożywki z płytki i dozując ją na komórki. Powtórz kilka razy, uważając, aby nie tworzyć piany, aż powierzchnia do uprawy stanie się czysta. Określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika cząstek (sekcja 5, <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Subkultura komórek, jeśli gęstość komórek wynosi od 5 x 106 do 1 x 107 komórek/ml. 
	nuta: Nie należy subkulturować linii komórkowych Drosophila do gęstości komórek poniżej 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórkową odpowiednio, używając odpowiedniej pożywki, do końcowego stężenia wysiewu co najmniej 1 x 106 komórek/ml.
	<ol>
		<li>W przypadku rutynowego pasażowania i konserwacji należy dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do wcześniej określonej objętości pożywki na nowej płytce hodowlanej, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek wysiewu.</li>
		<li>W celu zwiększenia skali hodowli należy przenieść całą zawiesinę komórek do dużej kolby. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do pożądanej gęstości komórek odpowiednią objętością pożywki. Rozprowadzić równe objętości rozcieńczonej zawiesiny komórkowej na nowe płytki. Ta metoda minimalizuje różnice w gęstości komórek między płytkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryj i oznacz płytki inicjałami operatora, datą, stosunkiem podziału, gęstością komórek wysiewu, identyfikatorem linii komórkowej, pożywką, numerem pasażu i wszelkimi dodatkami pożywki, takimi jak antybiotyki.</li>
	<li>Umieść płytki w plastikowym pojemniku i włóż pudełko z powrotem do inkubatora. 
	UWAGA: W tabeli 3 wymieniono naczynia hodowlane powszechnie używane do hodowli linii komórkowych Drosophila i związane z nimi objętości robocze.</li>
</ol>
4. Przemieszczanie przylegających komórek hodowanych na 100 mm płytkach hodowlanych
<ol>
	<li>Przenieść całe podłoże z płytki do nowej sterylnej kolby. Zapisz nośnik.</li>
	<li>Opłucz komórki, powoli dodając do płytki 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Delikatnie obracaj, aby upewnić się, że roztwór trypsyny pokrywa całą powierzchnię wzrostu. Wyrzuć roztwór trypsyny.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do płytki. Inkubować płytkę w temperaturze 25 °C między 3-10 minutami, monitorując widoczne oznaki odklejania się warstwy komórkowej i zsuwania się z powierzchni wzrostu.</li>
	<li>Dodaj 9 ml zapisanej pożywki do płytki, aby zatrzymać aktywność trypsyny. Wymieszaj zawiesinę komórkową, aby zdysocjować grudki komórek. Gdy wszystkie komórki zostaną usunięte, powierzchnia do uprawy będzie czysta. 
	nuta: Stosowanie enzymów trawiennych, takich jak trypsyna, pomaga w przechodzeniu silnie przylegających linii komórkowych. Trypsyna jest mieszaniną proteaz często pochodzących z trzustki świni i jest dostępna w handlu w różnych stopniach czystości.</li>
</ol>
5. Ręczne liczenie komórek za pomocą suwaka do liczenia komórek Neubauera
<ol>
	<li>Przygotuj szkiełko hemocytometryczne i szkiełko nakrywkowe, przecierając powierzchnię 70% alkoholem.</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę komórek i dozuj 15 μl zawiesiny komórek do rowkowanej krawędzi hemocytometru (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A), aby wypełnić pierwszą komorę hemocytometru. Napełnij drugą komorę hemocytometru. Zawiesina komórek zostanie wciągnięta do komory zliczającej przez działanie kapilarne.</li>
	<li>Używając obiektywu mikroskopowego 10x, policz komórki w obszarze 1 mm2 w środku siatki ograniczonej równoległymi liniami (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C, D). Aby uniknąć zduplikowanego zliczania, należy policzyć komórki, które nakładają się na górną i lewą granicę, ale nie komórki, które przecinają prawą i dolną granicę kwadratów o wielkości 200μm2. Policz od 100 do 200 komórek. Powtórz liczenie z drugą komorą.</li>
	<li>Oblicz średnią z dwóch zliczeń i określ gęstość komórek zgodnie z następującym wzorem: Gęstość komórek (komórki/ml) = średnia liczba komórek (n1 + n2/2) x 104, 
	nuta: Żywotność komórek jest wyrażona jako procent żywotnych komórek w stosunku do wszystkich komórek. Aby określić żywotność komórek, wymieszaj zawiesinę komórek z równą objętością roztworu błękitu trypanowego (0,4%) przed ręcznym lub automatycznym liczeniem komórek. Żywe komórki nie przyjmą barwnika, podczas gdy martwe komórki zostaną zabarwione na niebiesko.</li>
</ol>
6. Kriokonserwacja linii komórkowych Drosophila
<ol>
	<li>Sprawdź kulturę pod kątem zdrowej morfologii, wzrostu i braku zanieczyszczeń. Zbieraj kultury od środkowej do późnej fazy wzrostu (krok 3.3 lub sekcja 4). W przypadku wielu linii komórkowych Drosophila jest to w przybliżeniu od 4 x 106 komórek/ml do 8 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Przenieść całą zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w objętości pożywki do zamrażania (Tabela 4), co spowoduje uzyskanie końcowej gęstości komórek co najmniej 4 x 107 komórek/ml.</li>
	<li>Dodawać kroplami odpowiednią ilość krioprotektantu dimetylosulfotlenku (DMSO) do zawiesiny komórkowej tak, aby końcowe stężenie DMSO wynosiło 10%. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową.</li>
	<li>Ostrożnie dozować 0,5 ml zawiesiny komórkowej do porcji wstępnie znakowanych kriowialiów (~2 x 107 komórek/fiolkę). Umieść ampułki w pojemniku do zamrażania wypełnionym izopropanolem (<klasa silna = "xfig">Rysunek 4A). Przenieść pojemnik do zamrażania do zamrażarki o temperaturze -80 °C na noc, aby temperatura kriowiali powoli spadała (-1 °C/min) do temperatury zamrażarki.</li>
	<li>Wyjmij zamrożone kriowiale i szybko przymocuj je do trzciny (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). Włóż laski zawierające kriowiale do kanistra (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C). Alternatywnie, umieść zamrożone kriowiale w wstępnie schłodzonym pudełku do zamrażania (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D). Przechowywać zamrożone kriowiale w fazie ciekłej zamrażarek N2 (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 4E,F). 
	nuta: W przypadku stosowania pożywek zamrażających zawierających DMSO, opóźnienie do 30 minut w temperaturze pokojowej nie jest szkodliwe dla komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Baum, B., Cherbas, L. Drosophila: Methods and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaum%2C+B+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Dahmann, C. 420, Humana Press. Ch. 25 391-424 (2008).</li>
<li>Cherbas, L., Gong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell lines.</a> Methods. 68 (1), 74-81 (2014).</li>
<li>Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+and+working+with+Drosophila+cell+cultures%3A+Current+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339(2018).</li>
<li>Franz, A., Brunner, E., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genome-modified+Drosophila+cell+lines+using+SwAP%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP.</a> Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).</li>
<li>Housden, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+drug+targets+for+tuberous+sclerosis+complex+by+synthetic+screens+combining+CRISPR-based+knockouts+with+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi.</a> Science Signaling. 8 (393), r9(2015).</li>
<li>Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Toolbox+for+Genome+Editing+in+Cultured+Drosophila+melanogaster+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells.</a> G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).</li>
<li>Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+CRISPR-Cas9+system+for+genome+editing+in+cultured+Drosophila+ovarian+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells.</a> Methods. 126, 186-192 (2017).</li>
<li>Echalier, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEchalier%2C+G+%22Drosophila+Cells+in+Culture%22">Drosophila Cells in Culture</a>. , Academic Press. (1997).</li>
<li>Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEchalier%2C+G+%22Drosophila+cells+in+culture.+2nd+edition%22">Drosophila cells in culture. 2nd edition</a>. , Elsevier. (2017).</li>
<li>Cherbas, L., Cherbas, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCherbas%2C+L+%22Drosophila%3A+A+practical+approach%22">Drosophila: A practical approach</a>. Roberts, D. B. 10, 2nd, Oxford University Press. 319-346 (1998).</li>
<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryollgy+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).</li>
<li>Echalier, G., Ohanessian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolement%2C+en+cultures+in+vitro%2C+de+lignees+cellulaires+diploides+de+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+de+l%27Acad%C3%A9mie+des+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster.</a> Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).</li>
<li>Ui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+established+cell+lines+from+Drosophila+larval+CNS+express+neural+specific+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+%E2%88%92+Animal%22%5BJournal%5D)">Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology − Animal. 30A (4), 209-216 (1994).</li>
<li>Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+from+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).</li>
<li>Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+and+differentiation+in+vitro+of+leg+and+wing+imaginal+disc+cells+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster.</a> Development. 102, 805-814 (1988).</li>
<li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+circuit+for+piwi+by+the+large+Maf+gene+traffic+jam+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila.</a> Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).</li>
<li>Simcox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genetic+method+for+establishing+Drosophila+cell+lines+unlocks+the+potential+to+create+lines+of+specific+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes.</a> PLoS Genetics. 4 (8), e1000142(2008).</li>
<li>Sumiyoshi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+l%283%29mbt+leads+to+acquisition+of+the+ping-pong+cycle+in+Drosophila+ovarian+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells.</a> Genes & Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).</li>
<li>Dequeant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+progenitor+cell+signatures+by+time-series+synexpression+analysis+during+Drosophila+embryonic+cell+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).</li>
<li>Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mycoplasma+in+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mycoplasma in cell cultures.</a> Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).</li>
<li>Shields, G., Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+medium+for+culture+of+Drosophila+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Information+Service%22%5BJournal%5D)">Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells.</a> Drosophila Information Service. 52, 161(1977).</li>
<li>Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells+%3A+a+manual+of+basic+technique+and+specialized+applications.+Seventh+edition.+edn%22">Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn</a>. , Wiley Blackwell. (2016).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+copy+number+evolution+in+Drosophila+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA copy number evolution in Drosophila cell lines.</a> Genome Biology. 15 (8), R70(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowle komórek Drosophila są podstawowymi odczynnikami do wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na komórkach. Ich zastosowanie uzupełnia również badania genetyczne in vivo, zapewniając jednorodną populację komórek nadających się do biochemii, szybkiego testowania konstruktów transgenicznych przed wstrzyknięciem do much, biologii komórki, mikroskopii, a ostatnio manipulacji genetycznych komórek somatycznych poprzez edycję genomu 1,2,3,8,9,10.
Żywotność i regeneracja zamrożonych komórek Drosophila jest wrażliwa na drastyczne wahania nawet w niskich temperaturach. DGRC przechowuje zamrożone linie komórkowe w fazie ciekłej N2 (-196 °C) i transportuje je w suchym lodzie (-78,5 °C). Zamrożonych ampułek, które były transportowane w suchym lodzie, nie należy przenosić z powrotem do cieczyN2 lub zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania. Zamiast tego zamrożone komórki powinny zostać rozmrożone, ponownie zasiane w wysokiej gęstości komórek tak szybko, jak to możliwe po przybyciu (sekcja 1 protokołu) i hodowane zgodnie z ich przeznaczeniem (sekcja 3 protokołu). Jeśli linie komórkowe nie zostaną natychmiast wykorzystane do eksperymentów, linie komórkowe powinny zostać poddane krioprezerwacji (sekcja 6 protokołu) do czasu, aż będą gotowe do użycia.
Niektóre linie komórkowe, takie jak linie ML-BG2-c2 i Ras, potrzebują kilku dni, aby dojść do siebie po skutkach ożywienia ze stanu kriokonserwacji. Znaczna ilość szczątków komórkowych towarzyszy tym liniom komórkowym w ciągu pierwszych kilku dni po rozmrożeniu. Pozostawione w spokoju komórki zregenerują się i będą się namnażać. Wiele linii komórkowych Drosophila w DGRC zostało przystosowanych do wzrostu w pożywkach opartych na M322. W przypadku linii komórkowych, które powoli regenerują się po skutkach rozmrażania, przydatne może być użycie kondycjonowanych pożywek. Kondycjonowane pożywki prawdopodobnie zawierają czynniki wzrostu wydzielane przez komórki do pożywki, które mogą sprzyjać regeneracji i proliferacji komórek po rozmrożeniu.
Linie komórkowe na ogół podążają za stereotypową krzywą wzrostu składającą się z fazy opóźnienia, fazy wykładniczej, fazy plateau i fazy degradacji. Wiele linii komórkowych Drosophila namnaża się w logarytmicznej fazie wzrostu, gdy są hodowane w gęstości między 1 x 106 a 1 x 107 komórek/ml w temperaturze 25 °C. Istotne jest, aby linie komórkowe były pasażowane w taki sposób, aby zawsze znajdowały się w fazie wzrostu wykładniczego.
Zbieżność kultury, wyrażona w procentach, opisuje powierzchnię wzrostu pokrytą przez komórki. Zbieg komórek dla linii komórkowej zależy od jej kształtu i wielkości komórki. Odrębne linie komórkowe mają różną morfologię i właściwości przylegania. W rezultacie, różne linie komórkowe w przybliżeniu podobnej konfluencji mogą mieć znacznie różną gęstość komórek (ryc. 1). Zbieg kultur może nie być idealnym wskaźnikiem pasażowania kultur komórkowych Drosophila, ponieważ linie komórkowe Drosophila nadal się namnażają, gromadząc się jedna na drugiej jako ogniska lub w zawiesinie, nawet po pokryciu powierzchni wzrostu (ryc. 1). Jednak użytkownicy doświadczeni z określonymi liniami komórkowymi mogą często używać konfluencji jako szybkiego wizualnego przewodnika po tym, kiedy należy przeprowadzić subkulturę.
Chociaż możliwe jest hodowanie linii Drosophila w temperaturze otoczenia w temperaturze pokojowej w zakresie 19-25 °C, nie jest to zalecane, ponieważ wahania temperatury otoczenia mogą wpływać na tempo proliferacji. Zaleca się stosowanie dedykowanego inkubatora o temperaturze 25 °C. Inkubator do hodowli komórek Drosophila nie musi ułatwiać wymiany gazowej CO2 , ponieważ pożywki do hodowli komórkowych Drosophila nie wykorzystują CO2 do buforowania. Wilgotność wewnątrz inkubatora do hodowli linii komórkowych jest ważnym czynnikiem, którego nie należy przeoczyć podczas hodowli komórek na płytkach. W zależności od rodzaju inkubatora i środowiska pracy może być konieczne umieszczenie w nim zlewki ze sterylną wodą. Aby zminimalizować parowanie pożywki, należy używać zamkniętej kolby T lub przechowywać płytki hodowlane w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku wewnątrz inkubatora.
Ważne jest, aby opracować harmonogram subhodowli linii komórkowych Drosophila . Aby oszacować tempo wzrostu i monitorować spójność, wygodnie jest subkulturować w równych proporcjach geometrycznych (stosunek podziału 1:2, 1:4, 1:8). Na przykład 10 ml zlewającej się płytki komórek Kc167 o wymiarach 8 x 106 komórek/ml można podzielić w stosunku 1:8, aby uzyskać gęstość wysiewu 1 x 106 komórek/ml (1,25 ml zawiesiny komórkowej rozcieńczonej w 8,75 ml świeżej pożywki). Oczekuje się, że w ciągu 72 godzin kultury Kc167 rozmnożą się do gęstości 8 x 106 komórek/ml, biorąc pod uwagę czas podwojenia wynoszący 24 godziny. W związku z tym współczynnik podziału jest określany tak, aby ułatwić wygodną rutynę subhodowli do dwóch razy w tygodniu, zapewniając, że komórki są zawsze hodowane w ich wykładniczej fazie wzrostu. Pozwala to na regularny harmonogram subkulturacji komórek, dzięki czemu czas do zbiegu nie jest ani za krótki, ani za długi. Jeśli czas do konfluencji jest zbyt krótki, komórki są hodowane przy niższej gęstości komórek (wyższy współczynnik podziału). Podobnie, jeśli czas do osiągnięcia konfluencji jest zbyt długi, komórki są hodowane w subkulturze przy większej gęstości komórek (niższy współczynnik podziału). Ważne jest, aby pamiętać, że większość linii komórkowych Drosophila jest bardzo wrażliwa na niską gęstość komórek (<1 x 105 komórek/ml), w której komórki prawie się nie namnażają i mogą ostatecznie umrzeć.
Linie komórkowe Drosophila różnią się charakterystyką wzrostu i morfologią. W rezultacie, linie komórkowe o różnych właściwościach mogą wymagać innego traktowania. Większość linii komórkowych Drosophila jest częściowo przylegająca. Przy mniejszej gęstości komórek silniej przylegają do powierzchni wzrostu, a gdy kultura staje się zlewana, komórki stają się mniej przylegające i łatwo się odłączają. Ta stopniowa zmiana przylegania komórek ułatwia łatwą hodowlę najczęściej stosowanych linii komórkowych Drosophila (linie Schneidera, Kc, dysk imaginalny i linie OUN), ponieważ pozwala operatorowi po prostu dozować pożywkę na monowarstwę komórki, aby usunąć je z powierzchni wzrostu, gdy hodowla jest gęsta. W przypadku linii, które przylegają do powierzchni, takich jak żeńska osłonka somatyczna macierzysta/jajnikowa (fGS/OSS) i linie Ras, konieczne jest inkubowanie komórek w trypsynie przez krótki czas, aby pomóc w oderwaniu komórek od powierzchni wzrostu.
Dodatki do pożywek dla większości linii komórkowych Drosophila obejmują płodową surowicę cielęcą (FCS). Insulina i ekstrakt z dorosłej muchy (FEX) są wymagane dla niektórych określonych linii. FEX zawiera niezdefiniowane składniki niezbędne do wzrostu określonych linii krążka międzykręgowego larwalnego i linii komórkowych dorosłego jajnika. DGRC przygotowuje i udostępnia dorosłe FEX pochodzące od 1-tygodniowych much Oregon-R-modENCODE (RRID: BDSC_25211) w podwielokrotnościach 2,5 ml i 10 ml. DGRC udostępnia również instrukcje dotyczące przygotowania FEX na małą skalę na swojej stronie internetowej <https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf>. Przygotowanie FEX jest jednak czasochłonne i wymaga dużej ilości dorosłych much.
Kriokonserwacja linii komórkowych Drosophila oszczędza czas i odczynniki do konserwacji linii komórkowych, które nie są w bezpośrednim użyciu. Kriokonserwację uzyskuje się poprzez powolne zamrażanie komórek (-1 °C/min) do -80 °C w pożywce zawierającej DMSO, środek krioprotekcyjny. Powolny etap chłodzenia ma kluczowe znaczenie dla udanej kriokonserwacji. W zamrażarce o temperaturze -80 °C ampułka komórek jest schładzana z prędkością -1 °C/min po umieszczeniu w pojemniku do zamrażania wypełnionym izopropanolem. Począwszy od temperatury otoczenia 25 °C, potrzeba do 2 godzin, aby temperatura w ampułkach osiągnęła -80 °C. Zaleca się pozostawienie ampułek do zamrożenia na noc.
Zamrożone ampułki muszą być następnie szybko przeniesione do ciekłej fazy azotu w celu przedłużonego przechowywania. W temperaturze otoczenia kriowial szybko się nagrzeje do około 10 °C/min, a żywotność będzie zagrożona przy temperaturze powyżej -50 °C23. Aby transfer był szybki, należy obchodzić się z ampułkami w małych partiach, aby zminimalizować narażenie na temperaturę otoczenia. Alternatywnie, umieścić zamrożone kriowiale na suchym lodzie, przygotowując się do ich przeniesienia do cieczy N2. Jeżeli ciekły azot nie jest dostępny, komórki można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C, przy czym istnieje ryzyko znacznego pogorszenia stanu w miarę upływu czasu.
Gęstość komórek ma kluczowe znaczenie dla udanej kriokonserwacji i późniejszego odrodzenia linii komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, nowe linie komórkowe powinny być zamrażane, aby stworzyć początkowe zamrożenie (1-3 ampułki), gdy tylko nadmiar komórek stanie się dostępny. Po stabilnej hodowli linii komórkowej należy utworzyć zamrożony zapas 10-20 ampułek. Stado to jest następnie rozmrażane w celu sprawdzenia jego regeneracji i żywotności po zamrożeniu, po czym rozmnaża się je w celach doświadczalnych lub w celu wymiany stada, gdy liczba zamrożonych ampułek spadnie poniżej pięciu. Wreszcie, ważne jest, aby potwierdzić, że rozmrożone komórki zachowują cechy swojego stada rodzicielskiego, ponieważ wiadomo, że linie komórkowe ewoluują 3,24.
Podsumowując, w tym artykule przedstawiono podstawy pracy z hodowlami komórek Drosophila , dostarczając podstawowych informacji na temat różnych linii, najlepszych praktyk i protokołów audiowizualnych dotyczących podstawowej obsługi linii komórkowych Drosophila . Ten dostępny zasób ma na celu bezproblemowe ułatwienie wprowadzenia do pracy z hodowanymi komórkami Drosophila i uzupełnienie istniejących przewodników szkoleniowych w każdym laboratorium badawczym.

Wykorzystanie komórek hodowanych przez Drosophila uzupełnia analizę genetyczną much in vivo i służy jako podstawowe narzędzie do rozwiązywania wielu podstawowych pytań biologicznych1,2,3. Linie komórkowe Drosophila oferują unikalne, jednorodne populacje komórek pochodzących z różnych źródeł tkankowych o różnym pochodzeniu genetycznym. Linie komórkowe nadają się do wielu zastosowań, w tym do transgenicznej ekspresji genów, genomiki, transkryptomiki, proteomiki, metabolomiki, wysokoprzepustowych badań przesiewowych interferencji RNA (RNAi), biologii komórki i mikroskopii. Co ważne, zastosowanie hodowli komórek Drosophila ułatwia scharakteryzowanie natychmiastowych reakcji czasowych na znane bodźce. Co więcej, hodowla komórek Drosophila jest podatna na edycję genomu CRISPR-Cas9, dzięki czemu stosunkowo łatwo jest tworzyć nowe linie komórkowe z określonymi modyfikacjami genomu4,5,6,7.
Centrum Zasobów Genomiki Drosophila (DGRC) służy jako repozytorium i centrum dystrybucji dla linii komórkowych Drosophila. Jednym z celów DGRC jest pomoc członkom społeczności naukowej w korzystaniu z zasobów hodowli komórek Drosophila. W artykule przedstawiono podstawowe protokoły postępowania z liniami komórkowymi Drosophila. Uzupełnia istniejące zasoby, aby pomóc naukowcom oswoić się z hodowlami komórek Drosophila i osiągnąć pewien poziom niezależności w swoich eksperymentach1,2,8,9,10.
Najczęściej używanymi liniami komórkowymi Drosophila są: Linie Schneidera11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake imaginal disc and central nervous system (CNS) lines13,14, Milner laboratory imaginal disc lines15, dorosłe linie komórkowe jajników16,17, oraz linie Ras18 (Tabela 1). Linie Schneidera i Kc167 są ogólnymi, uniwersalnymi liniami komórkowymi do stosowania w biochemii, rekombinowanej ekspresji genów transgenicznych i odwrotnych badaniach genetycznych. Linie laboratoryjne Mitsubishi/Miyake (ML) wywodzą się albo z dysków wyobrażonych larw, albo z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i były przydatne w badaniach związanych z neurowydzielaniem, regulacją transkrypcji i przetwarzaniem RNA. Linie dysków Milnera (CME) były ważne dla badania transdukcji sygnału. Linie komórkowe fGS/OSS pochodzące ze zmutowanych dorosłych jajników pozostają ważnymi odczynnikami do badania wpływu niekodującej biologii małego RNA na utrzymanie i różnicowanie komórek rozrodczych17,19. Wreszcie, linie Ras są wyjątkowe, ponieważ są to linie komórkowe pochodzące z zarodków ektopowo wyrażających onkogen Ras. Mają one sygnaturę transkrypcyjną komórek prekursorowych mięśni i wyrażają aktywną maszynerię piRNA20. Ostatnie artykuły przeglądowe i rozdziały książek omawiają zastosowania tych popularnych linii komórkowych z większą ilością szczegółów2,3,9.
Wszystkie te linie komórkowe mogą być subhodowane i zamrażane. Istnieją niewielkie, ale ważne wymagania dotyczące tego, jak każda linia komórkowa jest utrzymywana i przygotowywana do krioprezerwacji. Na przykład odrębne linie komórkowe wymagają różnych pożywek i suplementów (Tabela 1). Linie różnią się również właściwościami przylegania do powierzchni, morfologią (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2), genotypem i czasem podwojenia (Tabela 2). Przedstawiamy podstawowe protokoły i podkreślamy unikalne różnice w obsłudze różnych szeroko stosowanych linii komórkowych Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych 100 mm Corning</td><td>&nbsp;</td><td>430167</td><td>Termos</td></tr><tr><td>25 cm2 Kolba T</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik do przechowywania ciekłego azotu 35HC</td><td>Taylor-Wharton</td><td>35HCB-11M</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td> do kriokonserwacji <td>BIO-RAD</td><td>TC20</td><td>Liczenie</td></tr><tr><td>Bactopepton</td><td>BD BioSciences</td><td>211677</td><td>Dodatki do pożywki</td></tr><tr><td>Szkiełka do liczenia</td><td>BIO-RAD</td><td>145-0011</td><td>Liczenie</td></tr><tr><td>Cryovial 1 mL</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>123263</td><td>Kriokonserwacja</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5879</td><td>Zamrażarka do krioprezerwacji</td></tr><tr><td></td><td>Nalgene</td><td>5029-0909</td><td>Pojemnik</td></tr><tr><td>do zamrażania</td> kriokonserwacji <td>Fisher Scientific</td><td>15-350-50</td> Hematocytometr <td>do krioprezerwacji</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>#0267110</td><td>Liczenie</td></tr><tr><td>ludzkiej insuliny</td><td>Millipore Sigma</td><td>I9278</td><td>Dodatki do pożywki</td></tr><tr><td>Hyclone CCM3 Media</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30061.03</td><td>Średni</td></tr><tr><td>hyklon Płodowa surowica bydlęca</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30070.03</td><td>Dodatki podłoża</td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy sól potasowa monohydrat</td><td>Millipore Sigma</td><td>G1149</td><td>Średnie dodatki</td></tr><tr><td>L-Glutation zredukowany</td><td>Millipore Sigma</td><td>G6013</td><td>Dodatki do pożywki</td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu</td><td>Millipore Sigma</td><td>237205</td><td>Dodatki</td></tr><tr><td>do podłoża Select Ekstrakt drożdżowy&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>Sigma Y1000</td><td>Medium dodatki</td></tr><tr><td>Shields i Sang's M3 Insect medium</td><td>Millipore Sigma</td><td>S8398</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Trpsin-EDTA (0,05 %), czerwień fenolowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td>Kultura</td></tr><tr><td>Trypanu Niebieskiego (0,4%)</td><td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td>Liczenie</td></tr></tbody></table>

rozmrażanie, hodowla i kriokonserwacja linii komórkowych drosophila

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Obecnie istnieje ponad 160 różnych linii komórkowych Drosophila dystrybuowanych przez Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). Oczekuje się, że dzięki inżynierii genomu liczba nowych linii komórkowych wzrośnie. DGRC ma na celu zapoznanie naukowców z wykorzystaniem linii komórkowych Drosophila jako narzędzia eksperymentalnego uzupełniającego i napędzającego ich program badawczy. Podano procedury pracy z różnymi liniami komórkowymi Drosophila o różnych cechach, w tym protokoły rozmrażania, hodowli i kriokonserwacji linii komórkowych. Co ważne, publikacja ta przedstawia najlepsze praktyki wymagane do pracy z liniami komórkowymi Drosophila w celu zminimalizowania ryzyka zanieczyszczeń mikroorganizmami przypadkowymi lub innymi liniami komórkowymi. Naukowcy, którzy zapoznają się z tymi procedurami, będą mogli zagłębić się w wiele zastosowań wykorzystujących komórki hodowane przez Drosophila, w tym biochemię, biologię komórki i genomikę funkcjonalną.

Linie komórkowe Drosophila są ważnymi odczynnikami zarówno dla badań podstawowych, jak i biomedycznych. Ten artykuł zawiera protokoły rozmrażania, subhodowli i kriokonserwacji powszechnie stosowanych linii komórkowych Drosophila, aby pomóc naukowcom w włączeniu tych odczynników do ich badań.

Rozmrażanie, hodowla i kriokonserwacja linii komórkowych Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Protokoły te pomogą każdemu badaczowi w wykorzystaniu linii komórkowych Drosophila do napędzania lub uzupełniania swojego programu badawczego. Większość, jeśli nie wszystkie hodowle komórek Drosophila ożywiają się, rozmnażają i dobrze konserwują, jeśli są obsługiwane zgodnie z tymi wytycznymi. Po przetarciu powierzchni roboczej okapu z przepływem laminarnym 70% etanolem, należy dozować pięć mililitrów odpowiedniego medium do kolby T o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych.Przetrzyj pojemnik zamrożonej linii komórkowej 70% etanolem i ostrożnie poluzuj i rozszczelnij pokrywkę. Za pomocą pipety Pasteura przenieś jeden mililitr pożywki o temperaturze pokojowej z kolby do kriofiolki i delikatnie wymieszaj, aby rozmrozić zamrożone komórki. Uważając, aby zawiesina komórek nie przelała się, przenieść całą objętość rozmrożonej zawiesiny komórek do kolby i przepłukać kriofiolkę świeżym podłożem.Pozostawić komórki na dnie kolby na co najmniej dwie godziny w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza. Nie należy zwracać zamrożonych komórek, które zostały zapakowane do podróży, z powrotem do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na dłuższy czas lub do ciekłego azotu. Zamiast tego rozmrozić komórki JAK NAJSZYBCIEJ.Po potwierdzeniu przyłączenia pod mikroskopem świetlnym, delikatnie zastąpić supernatant pięcioma mililitrami świeżej pożywki przed powrotem kolby do inkubatora. Alternatywnie, po rozmrożeniu, przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżej pożywki przed wysiewem do kolby T-25, jak właśnie pokazano. Aby ustalić, czy komórki są gotowe do pasażowania, zbadaj morfologię i zbieg kultury pod mikroskopem.Biorąc pod uwagę gęstość komórek i czas podwajania, ostatni raz komórki były hodowane i wszelkie oznaki zanieczyszczenia mikroorganizmami w hodowli. Jeśli kultura wydaje się silnie zlewająca, użyj dziesięciu mililitrów supernatantu hodowlanego, aby delikatnie usunąć komórki z dna płytki hodowlanej i określić gęstość komórek, licząc liczbę żywotnych komórek w powstałej zawiesinie pojedynczej komórki. Hoduj komórki w subkulturze, jeśli gęstość komórek wynosi od pięciu do dziesięciu razy dziesięć do szóstych komórek na mililitr w odpowiednim podłożu.Dodaj co najmniej jeden razy dziesięć do szóstego stężenia komórek na mililitr na nowej płytce hodowlanej, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek wysiewu. Następnie przykryj i oznacz płytki inicjałami operatora, datą, stosunkiem podziału, gęstością komórek wysiewu, identyfikatorem linii komórkowej, pożywką, numerem pasażu i wszelkimi dodatkami pożywki, takimi jak antybiotyki, i umieść płytki w plastikowym pojemniku w celu ich dalszej inkubacji w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza. Aby usunąć przylegające komórki z 100-milimetrowego dna naczynia hodowlanego, najpierw przenieś cały supernatant do sterylnej kolby i przepłucz komórki powolnym dodatkiem jednego mililitra 0,05% trypsyny EDTA.Delikatnie zamieszaj, aby upewnić się, że roztwór trypsyny pokrywa całą powierzchnię wzrostu przed wyrzuceniem roztworu. Następnie delikatnie dodaj jeden do dwóch mililitrów świeżej 0,05% trypsyny EDTA na płytkę i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza na trzy do dziesięciu minut. Gdy można zaobserwować, jak warstwa komórkowa odrywa się i zsuwa z powierzchni wzrostu, zatrzymaj aktywność trypsyny poprzez dodanie dziewięciu mililitrów zapisanego supernatantu i dokładnie wymieszaj zawiesinę komórkową, aby zdysocjować grudki komórek.Kiedy wszystkie komórki zostaną usunięte, powierzchnia wzrostu będzie czysta. Aby ręcznie policzyć komórki za pomocą szkiełka do liczenia komórek Neubauera, najpierw przetrzyj powierzchnię szkiełka hemocytometrycznego i szkiełka nakrywkowego 70% alkoholem. Po wymieszaniu dodaj 15 mikrolitrów komórek do każdej rowkowanej krawędzi hemocytometru, aby wypełnić obie komory.Zawiesina komórek zostanie wciągnięta do komory zliczającej przez działanie kapilarne. Za pomocą obiektywu mikroskopowego o powiększeniu 10x policz od 100 do 200 komórek w obszarze o powierzchni jednego milimetra kwadratowego pośrodku siatki ograniczonej równoległymi liniami. Następnie powtórz liczenie z drugą komorą i użyj średniej z dwóch zliczeń, aby określić gęstość komórek zgodnie ze wzorem.W celu kriokonserwacji linii komórkowej Drosophila ponownie zawiesić osad komórkowy w objętości pożywki do zamrażania, co spowoduje końcową gęstość komórek co najmniej cztery razy dziesięć do siódmych komórek na mililitr. Dodaj odpowiednią objętość krioprotektoru, dimetylosulfotlenku lub DMSO, do zawiesiny komórek kroplami, tak aby końcowe stężenie DMSO wynosiło 10% i delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową. Następnie ostrożnie dodać 0,5 mililitra porcji zawiesiny komórkowej do wstępnie oznakowanych kriofiolek i umieścić kriofiolki w pojemniku do zamrażania wypełnionym izopropanolem.Następnie przenieś pojemnik do zamrażania do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na noc, aby temperatura kriofiolek powoli spadała do temperatury zamrażarki. Następnie szybko przenieś kriofiolki do trzciny w celu umieszczenia w kanistrze z ciekłym azotem. Alternatywnie, przenieść zamrożone kriofiolki do wstępnie schłodzonego zamrażalnika i przechowywać zamrożone kriofiolki w fazie ciekłej zamrażarki azotowej.Zbieg linii komórkowej można określić za pomocą mikroskopu świetlnego. Szybko rosnące linie komórkowe, które wcześnie osiągają zbieg, muszą być regularnie przeczesywane, nawet dwa razy w tygodniu. W przeciwieństwie do tego, wolno rosnące komórki mogą być pasażowane co najmniej raz na dwa tygodnie lub dłużej, chociaż komórki te muszą być karmione świeżą pożywką co tydzień.Linie komórkowe pochodzące z różnych źródeł tkankowych różnią się morfologią, właściwościami przylegania, wymaganiami dotyczącymi pożywek i czasem podwajania. W przypadku eksperymentów ilościowych niezbędne jest zliczanie komórek. Komórki można policzyć za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika cząstek.Konfluencja komórek jest wizualnym przewodnikiem po tym, kiedy należy dokonać subkultury dla doświadczonego operatora. Jednak zliczanie komórek prowadzi do przewidywalnego harmonogramu hodowli i ułatwia wykrywanie anomalii wzrostu. Zachowaj ostrożność i używaj odpowiedniego sprzętu ochronnego podczas pracy z ciekłym azotem.

thawing-culturing-and-cryopreserving-drosophila-cell-lines

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy film demonstruje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila w stadium środkowej gastruli. Widoki żywych kultur przedstawiają komórki 1 godzinę po wysianiu oraz zróżnicowane neurony po 2 dniach wzrostu w zdefiniowanym medium opartym na wodorowęglanach. Neurony te są elektrycznie pobudliwe i tworzą połączenia synaptyczne.

Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium środkowej gastruli

Hodowlane komórki ssaków są szeroko wykorzystywane w badaniach z zakresu biologii komórki. Niniejszy film opisuje podstawowe umiejętności niezbędne do zamrażania i przechowywania komórek oraz sposób regeneracji zamrożonych zapasów.

Mrożenie, rozmrażanie i pakowanie komórek do transportu

Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila. Zdolność do przeprowadzania skutecznej perturbacji RNAi, wraz z innymi molekularnymi, biochemicznymi i obrazowymi metodami analizy komórek, pozwoli na rozstrzygnięcie wielu kwestii badawczych w pierwotnych komórkach Drosophila.

Podstawowe hodowle komórkowe z embrionów Drosophila w stadium gastruli

Opisujemy tutaj procedury ekstrakcji i oczyszczania mRNA i metabolitów z głów Drosophila. Stosujemy te techniki, aby lepiej zrozumieć perturbacje komórkowe leżące u podstaw degeneracji neuronów. Metodologie te można łatwo skalować i dostosowywać do innych projektów "omicznych".

Oczyszczanie transkryptów i metabolitów z głów Drosophila

Techniki rekombinacji homologicznej znacznie rozwijają genetykę Drosophila, umożliwiając tworzenie molekularnie precyzyjnych mutacji.  Niedawne zastosowanie rekombinacji pozwala na manipulowanie dużymi fragmentami DNA i przekształcanie ich w Drosophila6. Przedstawione tutaj metody łączą te techniki w celu szybkiego generowania dużych wektorów rekombinacji homologicznej.

Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila

Komórki S2 Drosophila i hodowane neurony są świetnymi systemami do obrazowania transportu organelli napędzanych motorycznie in vivo. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły hodowli obu typów komórek, ich obrazowania i analizy transportu.

Transport organelli w hodowanych komórkach Drosophila: linia komórkowa S2 i neurony pierwotne.

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Tutaj opisujemy test kurczliwości z użyciem komórek Drosophila S2R+. Zastosowanie egzogennego liganda, gastrulacji fałdowej (Mgła), prowadzi do aktywacji szlaku sygnałowego Mgły i kurczliwości komórek. Test ten można wykorzystać do zbadania regulacji białek kurczliwości komórkowej w szlaku sygnałowym mgły.

Test komórkowy do badania kurczliwości miozyny II niezwiązanej z mięśniami za pośrednictwem szlaku sygnałowego zagiętego gastrulacji w komórkach S2R + Drosophila

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Wysoce pożądana jest długoterminowa metoda konserwacji szczepów Drosophila jako alternatywa dla częstego przenoszenia dorosłych much do fiolek ze świeżą żywnością. Protokół ten opisuje kriokonserwację pierwotnych komórek rozrodczych Drosophila i odrodzenie szczepu poprzez ich przeszczepienie do agametycznych zarodków gospodarza.

Kriokonserwacja pierwotnych komórek rozrodczych i ożywienie szczepów Drosophila

Linie komórkowe są przydatne w badaniach nad organizmami wewnątrzkomórkowymi, które nie mogą być hodowane poza komórkami gospodarza. Chociaż linie zakażone Wolbachią umożliwiły wiele odkryć, niejednorodność w obrębie tych linii może prowadzić do zmiennych wyników eksperymentalnych. Przedstawiamy protokół generowania klonów jednokomórkowych i ciągłych hodowli z komórek JW18 zakażonych Wolbachią.

Generacja kultur monoklonalnych z linii komórkowej Drosophila melanogaster JW18 zakażonej Wolbachią

Naucz się protokołów rozmrażania, hodowli i kriokonserwacji linii komórkowych Drosophila. Standardowe metody zapewniają wysoką żywotność komórek i powtarzalność wyników w badaniach biomedycznych.

Rozmrażanie, hodowla i kriokonserwacja linii komórkowych Drosophila

Przeglądaj więcej filmów