Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Metoda ta pomoże zrozumieć i zastosować techniki laboratoryjne niezbędne do identyfikacji aktywności dwóch mikroRNA w komórkach raka płuc in vitro. Rak płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami na całym świecie. W tym miejscu przedstawiamy techniki obejmujące zarówno podstawowe metodologie laboratoryjne, jak i bardziej złożone protokoły, takie jak analiza ekspresji genów i mikroRNA białka przeciwciała, stosowane w szczególności do identyfikacji efektu działania mikroRNA.

Poniższe metody pomogą nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące wpływu dwóch mikroRNA, mikroRNA 143 i mikroRNA 506, na regulację cyklu komórkowego w komórkach raka płuc. Przedstawiamy różne techniki laboratoryjne, takie jak transfekcja komórek, ekstrakcja RNA, ilościowy PCR w czasie rzeczywistym i analiza mikroRNA. Mamy nadzieję, że nasza prezentacja przyczyni się do pomyślnego zakończenia tych analiz.

Po pierwsze, umieść hodowane komórki w odpowiedniej kolbie wystarczającej do ekstrakcji RNA i białka, aby przeprowadzić ekspresję genów za pomocą qPCR lub analizy mikromacierzy. Następnie inkubuj przez noc z pożywką uzupełnioną 10% FBS i 1% penicyliny streptomycyny. Następnego dnia przygotuj próbkę mikroRNA do transfekcji, rozcieńczając mikroRNA 143 i mikroRNA 506 w pożywkach o stężeniu 100 nanomolowych każdy.

Wyjąć kolbę z inkubatora i usunąć pożywkę. Umyć 1x PBS. Wszystkie niepoddane działaniu substancji kontrole będą zawierały tylko niekompletne pożywki z komórkami.

Inkubować komórki z pożywką do transfekcji przez sześć godzin w inkubatorze. Po sześciu godzinach wyjmij pożywkę i zastąp ją czterema mililitrami świeżej, kompletnej pożywki. Zbierz komórki po 24 godzinach i 48 godzinach przez trypsynizację.

Następnie przemyć dwukrotnie 1x PBS w każdej probówce i usunąć supernatant. Aby przeprowadzić ekstrakcję RNA w późniejszym czasie, należy zamrozić komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ekstrakcję RNA przeprowadzono przy użyciu zestawu RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Najpierw wyjmij rurki z minus 80 stopni Celsjusza i pozostaw do rozmrożenia. Dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy i pipetuj w górę iw dół, aby przerwać błonę komórkową. Dodaj równą objętość 100-procentowego ultraczystego etanolu.

Następnie dobrze wymieszaj i umieść w oddzielnej kolumnie. Odwirować i usunąć przepływ. Dodaj 400 mikrolitrów płukania i buforu oraz odwirować, aby usunąć bufor.

Dodać 5 mikrolitrów DNAzy 1 z 75 mikrolitrami buforu do wytrawiania VNA do każdej próbki i inkubować przez 15 minut. Następnie przemyj próbkę 400 mikrolitrowym buforem przygotowawczym RNA. Następnie przemyć dwukrotnie buforem do płukania RNA.

Teraz dodaj wodę wolną od nukleaz do kolumny, odwiruj, a następnie zbierz RNA. Zmierz stężenie RNA. Na tym etapie można wysłać dwa mikrogramy próbki RNA do sekwencjonowania RNA.

Przygotuj cDNA zgodnie z protokołem opisanym w części tekstowej, używając termocyklera. Przygotuj roztwory starterów do przodu i do tyłu z wodą wolną od DNAzy RNAzy do stężenia 10 mikromolowych. Przygotować mieszankę wzorcową dla każdego genu, który ma zostać wykryty, w zależności od liczby próbek.

Dla każdej próbki cDNA ilość reakcji jest zgodna z tabelą opisaną w tekście. Umieść każdą próbkę w odpowiednich dołkach. W przypadku qPCR zawsze dobrze jest przygotować dokument Excel z układem płytek 96-dołkowych, aby śledzić próbki.

Dla każdej próbki i analizowanego genu przeprowadź ich reakcję w trzech egzemplarzach lub przynajmniej duplikatach. Uszczelnij plastikową płytkę przezroczystym, optycznie przezroczystym plastikowym uszczelniaczem. Unikaj dotykania palcami cienkiej, plastikowej warstwy, ponieważ może to spowodować fałszywy sygnał.

Szybko obróć płytkę, aby wymieszać wszystkie odczynniki z dnem ich dołków. Następnie uruchom płytkę z próbką za pomocą ilościowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym. Uzyskaj wartości CT wygenerowane przez maszynę qPCR i przeanalizuj pod kątem względnej ekspresji genów.

Transfekcja komórek zgodnie z opisem we wcześniejszej części tego filmu. Zbierz komórki z każdej próbki w oddzielnych, 15-mililitrowych sterylnych probówkach do trypsynizacji. Następnie przemyj komórki dwukrotnie 1x PBS, wirując w 751G przez pięć minut, a następnie usuń supernatant.

Ponownie zawieś i rozbij paletę, dodając 200 mikrolitrów lodowatego 1x PBS przez pipetę. Dodaj dwa mililitry 70-procentowego lodowatego etanolu, kroplami do probówki, delikatnie obracając probówkę, aby utrwalić komórki. Inkubuj probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej i umieść je w czterech stopniach Celsjusza na godzinę.

Wyjmij probówki z czterech stopni Celsjusza i odwiruj. Dodać 2 ml lodowatego PBS i odwirować, a następnie usunąć supernatant przez odwirowanie. Dodać 500 mikrolitrów 1x PBS zawierającego jodek propidyny i rybonukleazę A o stężeniu odpowiednio 50 i 200 mikrogramów na mililitr w każdej próbce i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Przenieś próbki do odpowiednich probówek, chroniąc je przed światłem, i uruchom cytometr przepływowy. Eksperyment ten ma na celu zidentyfikowanie wszystkich białek szlaku cyklu komórkowego zmienionych przez leczenie mikroRNA. Pobrać próbki białka zgodnie z procedurą opisaną w rozdziale dotyczącym transfekcji i oznaczyć ilościowo za pomocą testu BCA.

Wyjmij szkiełka z minus czterech stopni Celsjusza na godzinę przed eksperymentem, aby doprowadzić do temperatury pokojowej i usunąć wilgoć. Weź 70 mikrogramów próbek białka i przygotuj preparaty podstawowe zgodnie z instrukcjami producenta, które są również opisane krok po kroku w części tekstowej. W tym miejscu należy zauważyć, że prawidłowe mycie szkiełek ultraczystą wodą dejonizowaną jest kolejnym ważnym krokiem, ponieważ pomoże to zmniejszyć tło slajdów.

Ponadto w tym eksperymencie bardzo ważne jest, aby nie wysuszać szkiełek z próbkami aż do ostatniego etapu. Na koniec zeskanuj slajd za pomocą mikromacierzy i przeanalizuj dane. Przeprowadzono analizę qPCR próbek poddanych działaniu mikroRNA w celu określenia ekspresji genów CDK1, CDK4 i CDK6.

Geny te regulują cykl komórkowy komórek normalnych i nowotworowych i zostały ukierunkowane na hamowanie progresji guza. Dane wykazały efekt regulacyjny tych genów w dół spowodowany leczeniem mikroRNA 143 i 506. Dane dotyczące rozkładu cyklu komórkowego z cytometrii przepływowej wykazały wzrost populacji w fazie G0 i G1 oraz spadek populacji w fazie S spowodowany efektem skojarzonego traktowania mikroRNA 143 i 506.

Specyficzna analiza mikromacierzy cyklu komórkowego wykryła zmiany ekspresji białek w około 60 genach. Przedstawiona mapa cieplna wskazała na regulację w dół na poziomie białek wielu genów niezbędnych do progresji cyklu komórkowego i proliferacji, takich jak CDK2, Helen 1 i 3, RE2F1. W przeciwieństwie do tego, białka powszechnie rozpoznawane przez ich narastające działanie hamujące były regulowane w górę.

Chociaż wyniki są półilościowe i wymagana jest dalsza analiza, analiza mikromacierzy zapewnia szybki przegląd aktywności szlaku. Wierzymy, że po obejrzeniu tego filmu będziesz w stanie przeprowadzić podstawowe, jak również złożone eksperymenty laboratoryjne, które pomogą Ci w identyfikacji aktywności mikroRNA w komórkach.