Name: Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Poznaj metody analizy wpływu miR-143 i miR-506 na cykl komórkowy i angiogenezę w komórkach raka płuca. Techniki obejmują transfekcję, ekstrakcję RNA oraz qPCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nie deklaruje się konfliktu interesów.

<ol><li>Schafer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Veternary+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cell cycle: a review.</a> Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).</li>
<li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+regulation+by+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li>
<li>Malumbres, M., Barbacid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle%2C+CDKs+and+cancer%3A+a+changing+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+CDK+inhibitor+dinaciclib+suppresses+neuroblastoma+growth+via+inhibiting+CDK2+and+CDK9+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity.</a> Science Repository. 6, 29090(2016).</li>
<li>Brown, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK1+structures+reveal+conserved+and+unique+features+of+the+essential+cell+cycle+CDK%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK.</a> Nature Communications. 6, 6769(2015).</li>
<li>Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+dependent+kinase+%28CDK%29+inhibitors+as+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).</li>
<li>Shah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Approval%3A+Ribociclib+for+the+Treatment+of+Postmenopausal+Women+with+Hormone+Receptor-Positive%2C+HER2-Negative+Advanced+or+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer.</a> Clinical Cancer Research. , (2018).</li>
<li>Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+targeting+cyclin-dependent+kinases+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+approves+Novartis%27s+CDK4%2F6+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">FDA approves Novartis's CDK4/6 inhibitor.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229(2017).</li>
<li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Approval+of+Palbociclib+in+Combination+with+Fulvestrant+for+the+Treatment+of+Hormone+Receptor-Positive%2C+HER2-Negative+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer.</a> Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).</li>
<li>Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipronged+activity+of+combinatorial+miR-143+and+miR-506+inhibits+Lung+Cancer+cell+cycle+progression+and+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro.</a> Science Repository. 8 (1), 10495(2018).</li>
<li>Inamura, K., Ishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+In+Lung+Cancer%3A+Novel+Biomarkers+and+Potential+Tools+for+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).</li>
<li>Mizuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+expression+signature+of+small+cell+lung+cancer%3A+tumor+suppressors+of+miR-27a-5p+and+miR-34b-3p+and+their+targeted+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes.</a> Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).</li>
<li>Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs+as+oncogenes+and+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">microRNAs as oncogenes and tumor suppressors.</a> Developmental Biology. 302 (1), 1-12 (2007).</li>
<li>Peng, Y., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+MicroRNAs+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">The role of MicroRNAs in human cancer.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004(2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+recurrence+in+early+stage+non-small+cell+lung+cancer+using+computer+extracted+nuclear+features+from+digital+H%26E+images%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images.</a> Science Repository. 7 (1), 13543(2017).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiegel%2C+RL+%22Cancer+Statistics%2C+2017.+CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22">Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians</a>. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
<li>Saxon, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p52+expression+enhances+lung+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">p52 expression enhances lung cancer progression.</a> Science Repository. 8 (1), 6078(2018).</li>
<li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+Analyzer+for+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22ImageJ+User+and+Developer+Conference%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis Analyzer for ImageJ.</a> ImageJ User and Developer Conference. , (2012).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), R25(2010).</li>
<li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312(2014).</li>
<li>Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Anti-Angiogenic+Targets+for+Monoclonal+Antibody+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).</li>
<li>Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Novel+Methods+for+Modulating+Tumor+Blood+Vessels+in+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment.</a> Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).</li>
<li>Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and the cell cycle.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).</li>
<li>Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+for+highly+parallel+detection+and+quantitation+of+specific+proteins+and+antibodies+in+complex+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions.</a> Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).</li>
<li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Currrent+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Overview of protein microarrays.</a> Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).</li>
<li>St-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+of+neonatal+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells.</a> Science Repository. 3, 1860(2013).</li>
</ol>

Autorzy chcieliby podziękować Johnowi Caskeyowi z Uniwersytetu Stanowego Luizjany za jego pomoc w analizie ścieżki danych sekwencjonowania RNA oraz University of Texas Southwestern Medical Center, McDermott Center Next Generation Sequencing Core za przeprowadzenie sekwencjonowania RNA i analizy danych. Badania te były wspierane przez College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe w ramach finansowania start-upu oraz National Institutes of Health (NIH) za pośrednictwem National Institute of General Medical Science Grants 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1.

miRNA mogą działać jako terapie celowane w leczeniu raka, rozpoznając rozregulowanie poziomów ekspresji w chorych i normalnych tkankach. Badanie to miało na celu określenie miRNA, które potencjalnie zatrzymują postęp cyklu komórkowego na wielu etapach. Stwierdzono, że miR-143 i miR-506 zatrzymują cykl komórkowy komórek nowotworowych, a przedstawione protokoły miały na celu zrozumienie aktywności tego skojarzonego leczenia miRNA.
Opisane metodologie zapewniają nadrzędne zrozumienie funkcji miRN...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.

Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

Cykl komórkowy to kombinacja wielu zdarzeń regulacyjnych, które umożliwiają duplikację DNA i proliferację komórek w procesie mitotycznym1. Kinazy zależne od cyklin (CDK) regulują i promują cykl komórkowy2. Wśród nich mitotyczne CDK (CDK1) i międzyfazowe CDK (CDK2, CDK4 i CDK6) odgrywają kluczową rolę w progresji cyklu komórkowego3. Białko siatkówczaka (Rb) jest fosforylowane przez kompleks CDK4/CDK6, aby umożliwić progresję cyklu komórkowego4, a aktywacja CDK1 jest niezbędna do pomyślnego podziału komórki5. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano i oceniono liczne inhibitory CDK w badaniach klinicznych, co wskazuje na potencjał celowania w CDK w leczeniu raka. W rzeczywistości trzy inhibitory CDK zostały ostatnio zatwierdzone do leczenia raka piersi6,7,8,9,10. Tak więc CDK, a w szczególności CDK1 i CDK4/6, są bardzo interesujące w regulacji progresji komórek rakowych.
miRNAs (miR) to małe, niekodujące RNA i posttranskrypcyjne regulatory ekspresji genów, regulujące około 30% wszystkich ludzkich genów11. Ich aktywność opiera się na translacyjnej represji lub degradacji informacyjnych RNA (mRNA)12. Ilustrując ich znaczenie biologiczne, zidentyfikowano ponad 5 000 miRNA, a pojedyncza cząsteczka miRNA może regulować wiele genów11,13. Co ważniejsze, ekspresja miRNA jest związana z różnymi chorobami i statusami chorobowymi, w tym z rakiem13. W rzeczywistości miRNA zostały scharakteryzowane jako onkogenne lub supresory nowotworów, zdolne do promowania lub hamowania rozwoju i progresji guza14,15. Względna ekspresja miRNA w chorych tkankach może regulować postęp choroby; w związku z tym egzogenne dostarczanie miRNA ma potencjał terapeutyczny.
Rak płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem, a ponad 60% wszystkich nowotworów płuc to niedrobnokomórkowe nowotwory płuc16,17, z 5-letnim wskaźnikiem przeżycia mniejszym niż 20%18. Zastosowanie miR-143-3p i miR-506-3p zostało niedawno ocenione pod kątem celowania w cykle komórkowe w komórkach raka płuc11. miR-143 i miR-506 mają sekwencje, które są komplementarne do CDK1 i CDK4 / CDK6, a wpływ tych dwóch miR na komórki A549 przeanalizowano. Szczegóły eksperymentu zostały przedstawione i omówione w niniejszym artykule. Ekspresję genów, progresję cyklu komórkowego i apoptozę oceniano przy użyciu różnych projektów eksperymentalnych i punktów czasowych po transfekcji. Użyliśmy metod ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) wraz z analizą mikromacierzy w celu zmierzenia ekspresji określonych genów, a sekwencjonowanie RNA nowej generacji zostało wykorzystane do określenia globalnej dysregulacji genów11. Ta ostatnia metoda identyfikuje względną obfitość transkryptu każdego genu z wysoką czułością i odtwarzalnością, podczas gdy tysiące genów można przeanalizować z jednej analizy eksperymentalnej. Dodatkowo przeprowadzono analizę apoptotyczną spowodowaną leczeniem miRNA, która została opisana tutaj. Analizę szlaków uzupełniła bioinformatyka. Przedstawiono protokoły wykorzystywane do analizy potencjału terapeutycznego kombinatorycznych miR-143 i miR-506.
Głównym celem tego protokołu jest identyfikacja efektów działania miRNA w komórkach, ze szczególnym uwzględnieniem cyklu komórkowego. Różnorodność prezentowanych tu technik rozciąga się od analizy ekspresji genów przed translacją (przy użyciu qPCR) po skomplikowane i nowatorskie techniki analizy genów na poziomie białka, takie jak analiza mikromacierzy. Mamy nadzieję, że ten raport będzie pomocny dla badaczy zainteresowanych pracą z miRNA. Dodatkowo przedstawiono metodykę analizy cyklu komórkowego metodą cytometrii przepływowej i apoptozy komórek.

<table><tbody><tr><td>-80 stopni Celsjusza; C Zamrażarka</td><td>VWR</td><td>VWR40086A</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>CELLTREAT Scientific&nbsp;</td><td>50-607-511</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki mikrodołkowe&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>A549 Komórki niedrobnokomórkowego raka płuc</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>VWR</td><td>0710-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938c</td><td></td></tr><tr><td>Tłumik Ambion Kontrola negatywna nr 1 siRNA</td><td>Ambion</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania matrycy przeciwciał, 2 reakcje</td><td>Full Moon Bio</td><td>KAS02</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop jasnego pola&nbsp; &nbsp;</td><td>Mikroskoptyka&nbsp;</td><td>IV-900</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop jasnego pola&nbsp; &nbsp;</td>Nowa matryca przeciwciał <td>cyklu komórkowego Star Environment LLC</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>2 slajdy</td><td>Full Moon Bio</td><td>ACC058</td><td></td></tr><tr><td>Cell Logic+ Biosafety Cabinate</td><td>Labconco</td><td>342391100</td><td></td></tr><tr><td>Cellquest Pro</td><td>BD bioscience</td><td>Kroki 5.14; 6.13: Służy do obliczania rozkładu populacji według cyklu komórkowego&nbsp; fazy i dla&nbsp; obliczania rozkładu populacji do analizy apoptoza&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>System czasu rzeczywistego CFX96 Moduł</td><td></td>optyczny <td>BioRad</td><td>CFX96</td></tr><tr><td>System obrazowania dotykowego Chemidoc System obrazowania</td><td></td>dotykowego <td>BioRad</td><td>Chemidoc</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERAcell 150i</td> Cultrex Matryca membrany podstawnej o obniżonym współczynniku <td></td></tr><tr><td>wzrostu</td><td>Trevigen</td><td>3433-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>AmScope&nbsp;</td><td>FMA050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/l glukozy, bez pirogronianu sodu, z L-glutaminą</td><td>VWR</td><td>VWRL0100-0500</td><td></td></tr><tr><td>DNAzyda I</td><td>Zymo Research</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka (EKGS)</td><td>BD Biosciences</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Zestawy do pipet Eppendrof</td><td></td><td>05-403-152</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absolutny (200 dowodów), molekularny Ocena z biologii,&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Alfa acar</td><td>L07462</td><td></td></tr><tr><td>F-12K Mieszanka składników odżywczych (mod. Kaighna) z L-glutaminą, Corning</td><td></td><td>Corning 45000-354</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy FACS</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bydlęca surowica - Premium</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Płód Surowica bydlęca (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Basix ze standardowymi zatrzaskami</td><td>Fisherbrand Basix</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 z płaszczem wodnym Forma Series II</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór heparyny (5000 U / ml)</td><td>Hospira</td><td>NDC#63739-920-11</td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy poziomej</td><td>Stołowy system laboratoryjny</td><td>BT102</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-143-3p miRNA Mimic</td><td>ABM</td><td>MCH01315</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-506-3p miRNA Mimic</td><td>ABM</td><td>MCH02824</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>Indywidualni dawcy</td><td>IRB# A15-3891</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem hyklonu (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Analiza szlaku</td><td>Qiagen</td><td>Wyniki: Używany do analizy</td><td></td>ścieżek bioinformatycznych</tr><tr><td>Invitrogen UltraPure Woda destylowana bez DNazy/RNaz</td><td>Invitrogen</td><td>10-977-015</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamina 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11-668-027</td><td></td></tr><tr><td>Ładowanie barwnika 10X</td><td>nauka warda+</td><td>470024-814</td><td></td></tr><tr><td>Medium M199 (z Earle&prime; s sole, L-glutamina i wodorowęglan sodu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Aparat cyfrowy</td><td>AmScope&nbsp;</td><td>Oprogramowanie MU130</td><td></td></tr><tr><td>Modfit LT</td><td>Verity</td><td>Krok 5.15: Alternatywne oprogramowanie do analizy rozkładu populacji cykli</td><td></td>komórkowych</tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop one C</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna 10/10</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>B21210</td><td></td></tr><tr><td>Zasilanie sybr green master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>MP Biochemicals LLC</td><td>IC19545825</td><td></td></tr><tr><td>Proscanarray HT Skaner mikromatrycowy</td><td>Perkin elmer</td><td>ASCNPHRG. Zastosowaliśmy falę lasera wzbudzającego o długości fali 543 nm.</td><td></td></tr><tr><td>q Optyczna osłona samoprzylepna PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy Quick-RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>Rybonukleaza A z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express</td><td>PerkinElmer</td><td>Krok 7.33: Oprogramowanie do</td><td></td>analizy mikromacierzy</tr><tr><td></td><td>Shaker Thermo Scientific</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe SpectraTube 15ml</td><td>VWR</td><td>470224-998</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe SpectraTube 50ml</td><td>VWR</td><td>470225-004</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TBS, 20x płyn</td><td>VWR</td><td>10791-796</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z kontrolowaną temperaturą&nbsp; matchine</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka z kontrolowaną temperaturą matchine</td><td>Eppendrof</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Termo Scientific BioLite Kolby poddane hodowli komórkowej</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-009</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Test białka BCA</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>PI23225</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce RIPA Bufor</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89900</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Thermo-Fast 96-dołkowe płyty z pełnym fartuchem</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0800WL</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA Thermo Scientific Verso (100 przebiegów)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka DNA Ultra Low Range</td><td>Invitrogen</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa lodówka laboratoryjna VWR z pełnymi drzwiami VWR</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza skojarzonych zabiegów mirna w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

Rak płuc (LC) jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem na całym świecie. Podobnie jak w przypadku innych komórek nowotworowych, podstawową cechą komórek LC jest nieuregulowana proliferacja i podział komórek. Wykazano, że hamowanie proliferacji poprzez zatrzymanie progresji cyklu komórkowego jest obiecującym podejściem do leczenia raka, w tym LC. 
terapia miRNA stała się ważnym regulatorem genów potranskrypcyjnych i jest coraz częściej badana pod kątem zastosowania w leczeniu raka. W ostatnich pracach wykorzystaliśmy dwa miRNA, miR-143 i miR-506, do regulacji progresji cyklu komórkowego. Komórki niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) A549 zostały przetransfekowane, przeanalizowano zmiany ekspresji genów, a ostatecznie przeanalizowano aktywność apoptozy spowodowaną leczeniem. Wykryto regulację w dół kinaz zależnych od cyklin (CDK) (tj. CDK1, CDK4 i CDK6), a cykl komórkowy zatrzymał się na przejściach fazowych G1/S i G2/M. Analiza szlaku wykazała potencjalną aktywność antyangiogenną leczenia, która nadaje temu podejściu wieloaspektową aktywność. W tym miejscu opisano metodologie stosowane do identyfikacji aktywności miRNA w odniesieniu do hamowania cyklu komórkowego, indukcji apoptozy oraz wpływu leczenia na komórki śródbłonka poprzez hamowanie angiogenezy. Oczekuje się, że przedstawione tu metody wesprą przyszłe badania nad terapiami miRNA i ich aktywnością, a reprezentatywne dane posłużą innym badaczom podczas analiz eksperymentalnych.

Analiza ekspresji genów za pomocą RT-qPCR i elektroforezy żelowej
Analiza różnicowej ekspresji genów z wykorzystaniem techniki RT-qPCR wykazała istotną downregulację docelowych genów CDK1, CDK4 oraz CDK6. Wykazano, że CDK1 oraz CDK4/6 odgrywają kluczową rolę odpowiednio w przejściach G2/M i G1/S. Przeprowadzona analiza pozwoliła na bezpośrednie porównanie aktywności poszczególnych miRs oraz aktywności kombinacyj...

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Similar to other cancer cells, a fundamental characteristic of LC cells is ...

Metoda ta pomoże zrozumieć i zastosować techniki laboratoryjne niezbędne do identyfikacji aktywności dwóch mikroRNA w komórkach raka płuc in vitro. Rak płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami na całym świecie. W tym miejscu przedstawiamy techniki obejmujące zarówno podstawowe metodologie laboratoryjne, jak i bardziej złożone protokoły, takie jak analiza ekspresji genów i mikroRNA białka przeciwciała, stosowane w szczególności do identyfikacji efektu działania mikroRNA.Poniższe metody pomogą nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące wpływu dwóch mikroRNA, mikroRNA 143 i mikroRNA 506, na regulację cyklu komórkowego w komórkach raka płuc. Przedstawiamy różne techniki laboratoryjne, takie jak transfekcja komórek, ekstrakcja RNA, ilościowy PCR w czasie rzeczywistym i analiza mikroRNA. Mamy nadzieję, że nasza prezentacja przyczyni się do pomyślnego zakończenia tych analiz.Po pierwsze, umieść hodowane komórki w odpowiedniej kolbie wystarczającej do ekstrakcji RNA i białka, aby przeprowadzić ekspresję genów za pomocą qPCR lub analizy mikromacierzy. Następnie inkubuj przez noc z pożywką uzupełnioną 10% FBS i 1% penicyliny streptomycyny. Następnego dnia przygotuj próbkę mikroRNA do transfekcji, rozcieńczając mikroRNA 143 i mikroRNA 506 w pożywkach o stężeniu 100 nanomolowych każdy.Wyjąć kolbę z inkubatora i usunąć pożywkę. Umyć 1x PBS. Wszystkie niepoddane działaniu substancji kontrole będą zawierały tylko niekompletne pożywki z komórkami.Inkubować komórki z pożywką do transfekcji przez sześć godzin w inkubatorze. Po sześciu godzinach wyjmij pożywkę i zastąp ją czterema mililitrami świeżej, kompletnej pożywki. Zbierz komórki po 24 godzinach i 48 godzinach przez trypsynizację.Następnie przemyć dwukrotnie 1x PBS w każdej probówce i usunąć supernatant. Aby przeprowadzić ekstrakcję RNA w późniejszym czasie, należy zamrozić komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ekstrakcję RNA przeprowadzono przy użyciu zestawu RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.Najpierw wyjmij rurki z minus 80 stopni Celsjusza i pozostaw do rozmrożenia. Dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy i pipetuj w górę iw dół, aby przerwać błonę komórkową. Dodaj równą objętość 100-procentowego ultraczystego etanolu.Następnie dobrze wymieszaj i umieść w oddzielnej kolumnie. Odwirować i usunąć przepływ. Dodaj 400 mikrolitrów płukania i buforu oraz odwirować, aby usunąć bufor.Dodać 5 mikrolitrów DNAzy 1 z 75 mikrolitrami buforu do wytrawiania VNA do każdej próbki i inkubować przez 15 minut. Następnie przemyj próbkę 400 mikrolitrowym buforem przygotowawczym RNA. Następnie przemyć dwukrotnie buforem do płukania RNA.Teraz dodaj wodę wolną od nukleaz do kolumny, odwiruj, a następnie zbierz RNA. Zmierz stężenie RNA. Na tym etapie można wysłać dwa mikrogramy próbki RNA do sekwencjonowania RNA.Przygotuj cDNA zgodnie z protokołem opisanym w części tekstowej, używając termocyklera. Przygotuj roztwory starterów do przodu i do tyłu z wodą wolną od DNAzy RNAzy do stężenia 10 mikromolowych. Przygotować mieszankę wzorcową dla każdego genu, który ma zostać wykryty, w zależności od liczby próbek.Dla każdej próbki cDNA ilość reakcji jest zgodna z tabelą opisaną w tekście. Umieść każdą próbkę w odpowiednich dołkach. W przypadku qPCR zawsze dobrze jest przygotować dokument Excel z układem płytek 96-dołkowych, aby śledzić próbki.Dla każdej próbki i analizowanego genu przeprowadź ich reakcję w trzech egzemplarzach lub przynajmniej duplikatach. Uszczelnij plastikową płytkę przezroczystym, optycznie przezroczystym plastikowym uszczelniaczem. Unikaj dotykania palcami cienkiej, plastikowej warstwy, ponieważ może to spowodować fałszywy sygnał.Szybko obróć płytkę, aby wymieszać wszystkie odczynniki z dnem ich dołków. Następnie uruchom płytkę z próbką za pomocą ilościowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym. Uzyskaj wartości CT wygenerowane przez maszynę qPCR i przeanalizuj pod kątem względnej ekspresji genów.Transfekcja komórek zgodnie z opisem we wcześniejszej części tego filmu. Zbierz komórki z każdej próbki w oddzielnych, 15-mililitrowych sterylnych probówkach do trypsynizacji. Następnie przemyj komórki dwukrotnie 1x PBS, wirując w 751G przez pięć minut, a następnie usuń supernatant.Ponownie zawieś i rozbij paletę, dodając 200 mikrolitrów lodowatego 1x PBS przez pipetę. Dodaj dwa mililitry 70-procentowego lodowatego etanolu, kroplami do probówki, delikatnie obracając probówkę, aby utrwalić komórki. Inkubuj probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej i umieść je w czterech stopniach Celsjusza na godzinę.Wyjmij probówki z czterech stopni Celsjusza i odwiruj. Dodać 2 ml lodowatego PBS i odwirować, a następnie usunąć supernatant przez odwirowanie. Dodać 500 mikrolitrów 1x PBS zawierającego jodek propidyny i rybonukleazę A o stężeniu odpowiednio 50 i 200 mikrogramów na mililitr w każdej próbce i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Przenieś próbki do odpowiednich probówek, chroniąc je przed światłem, i uruchom cytometr przepływowy. Eksperyment ten ma na celu zidentyfikowanie wszystkich białek szlaku cyklu komórkowego zmienionych przez leczenie mikroRNA. Pobrać próbki białka zgodnie z procedurą opisaną w rozdziale dotyczącym transfekcji i oznaczyć ilościowo za pomocą testu BCA.Wyjmij szkiełka z minus czterech stopni Celsjusza na godzinę przed eksperymentem, aby doprowadzić do temperatury pokojowej i usunąć wilgoć. Weź 70 mikrogramów próbek białka i przygotuj preparaty podstawowe zgodnie z instrukcjami producenta, które są również opisane krok po kroku w części tekstowej. W tym miejscu należy zauważyć, że prawidłowe mycie szkiełek ultraczystą wodą dejonizowaną jest kolejnym ważnym krokiem, ponieważ pomoże to zmniejszyć tło slajdów.Ponadto w tym eksperymencie bardzo ważne jest, aby nie wysuszać szkiełek z próbkami aż do ostatniego etapu. Na koniec zeskanuj slajd za pomocą mikromacierzy i przeanalizuj dane. Przeprowadzono analizę qPCR próbek poddanych działaniu mikroRNA w celu określenia ekspresji genów CDK1, CDK4 i CDK6.Geny te regulują cykl komórkowy komórek normalnych i nowotworowych i zostały ukierunkowane na hamowanie progresji guza. Dane wykazały efekt regulacyjny tych genów w dół spowodowany leczeniem mikroRNA 143 i 506. Dane dotyczące rozkładu cyklu komórkowego z cytometrii przepływowej wykazały wzrost populacji w fazie G0 i G1 oraz spadek populacji w fazie S spowodowany efektem skojarzonego traktowania mikroRNA 143 i 506.Specyficzna analiza mikromacierzy cyklu komórkowego wykryła zmiany ekspresji białek w około 60 genach. Przedstawiona mapa cieplna wskazała na regulację w dół na poziomie białek wielu genów niezbędnych do progresji cyklu komórkowego i proliferacji, takich jak CDK2, Helen 1 i 3, RE2F1. W przeciwieństwie do tego, białka powszechnie rozpoznawane przez ich narastające działanie hamujące były regulowane w górę.Chociaż wyniki są półilościowe i wymagana jest dalsza analiza, analiza mikromacierzy zapewnia szybki przegląd aktywności szlaku. Wierzymy, że po obejrzeniu tego filmu będziesz w stanie przeprowadzić podstawowe, jak również złożone eksperymenty laboratoryjne, które pomogą Ci w identyfikacji aktywności mikroRNA w komórkach.

analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

Ten film opisuje protokół ekstrakcji RNA z transfekowanych komórek raka płuc transfekowanych miRNA. Podejście to można wykorzystać do identyfikacji skojarzonej aktywności leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Test ekstrakcji RNA: metoda ekstrakcji RNA z transfekowanych komórek raka płuc miRNA

miRNA lub mikroRNA są kluczowymi regulatorami postępu cyklu komórkowego. Ten film opisuje analizę cyklu komórkowego opartą na cytometrii przepływowej komórek raka płuc transfekowanych miRNA w celu zbadania wpływu miRNA na regulację cyklu komórkowego. Hamowanie proliferacji poprzez zatrzymanie progresji cyklu komórkowego wykazało, że może być obiecującym podejściem do leczenia raka.

Analiza cyklu komórkowego: podejście do badania regulacji cyklu komórkowego komórek raka płuc transfekowanych miRNA

Ten film opisuje technikę badania ekspresji białek w transfekowanych komórkach raka płuc transfekowanych miRNA za pomocą mikromacierzy przeciwciał do pomiaru ekspresji określonych genów. W przedstawionym protokole wykonujemy mikromacierz przeciwciał w celu identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Mikromacierz przeciwciał: technika badania ekspresji białek w komórkach raka płuc leczonych miRNA

Ten film pokazuje dostarczanie in vivo inhibitorów miRNA jako środków terapeutycznych przeciwko wzrostowi guza w ortotopowych modelach mysich. Donowotworowe podawanie syntetycznych inhibitorów miRNA lub antagomiR pozwala im wiązać i hamować endogenne miRNA, powodując w ten sposób regulację mRNA w górę i zahamowanie wzrostu guza.

Modelowanie leczenia wewnątrznowotworowego inhibitorami miRNA: metoda analizy wpływu inhibitorów miRNA na wzrost guza w modelu mysim

Opisano protokół indukcji in vitro przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego (EndMT), który jest przydatny do badania szlaków sygnalizacji komórkowej związanych z EndMT. W tym modelu eksperymentalnym EndMT jest indukowany przez leczenie TGF-β w komórkach śródbłonka MS-1.

Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

Opisany tutaj jest protokół charakteryzujący moduły biologicznie synergicznych miRNA i ich łączenie w krótkie transgeny, co pozwala na jednoczesną nadekspresję dla zastosowań terapii genowej.

Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metody analizy wpływu miR-143 i miR-506 na cykl komórkowy i angiogenezę w komórkach raka płuca. Techniki obejmują transfekcję, ekstrakcję RNA oraz qPCR.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Przeglądaj więcej filmów