Name: Szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Naucz się szybkiej metody hodowli pierwotnych melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy. Technika ta umożliwia badania biologii komórek skóry, gojenia ran i melanoma bez konieczności separacji naskórka i skóry właściwej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Fundacji Damona Runyona (Nagroda za Innowacyjność #38-16 dla C.E.B.) i Pelotonii (B.M.M.) za wsparcie finansowe. Jesteśmy wdzięczni C. Hainesowi i C. Wormsbaecherowi, którzy udzielili komentarzy w celu ulepszenia tekstu rękopisu. Prace te skorzystały ze wspólnych zasobów cytometrii analitycznej Ohio State Comprehensive Cancer Center, które są wspierane przez NIH P30 CA016058.

Uzyskaj zgodę od swojej instytucjonalnej komisji etyki zwierząt przed rozpoczęciem tego lub jakiegokolwiek innego badania z udziałem zwierząt. Eksperymenty przeprowadzone w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio (IACUC, protokół #2012A00000134).
1. Przygotowanie protokołu
UWAGA: Poniższe instrukcje przygotowania odczynników są odpowiednie dla generacji 9 cm2 kultur melanocytów i fibroblastów z jednej myszy. Zapoznaj się z przewodnikiem przygotowania odczynnika w Tabeli 1, aby uzyskać informacje na temat izolacji na większą skalę.
<ol>
	<li>Przygotuj 1,5 ml roztworu kolagenu zawierającego 50 μg/ml kolagenu w 0,1 M lodowatym kwasie octowym.</li>
	<li>W komorze z przepływem laminarnym pokryj jedną studzienkę 6-dołkowego naczynia do hodowli komórkowych roztworem kolagenu o stężeniu 8 μg/cm2 (1,44 ml). Upewnij się, że studzienka jest całkowicie pokryta roztworem kolagenu. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 3 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc. Przed użyciem należy dwukrotnie dobrze przemyć pokrytą kolagenem 1,35 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (150 μl PBS na 1 cm2).</li>
	<li>Zamontuj rozdrabniacz do tkanek w komorze z przepływem laminarnym, ostrożnie umieszczając tarczę do cięcia na platformie rozdrabniacza tkanek i mocując sterylne ostrze do ruchomego ramienia.</li>
	<li>Przygotuj 3 ml 1x roztworu antybiotyku/antybiotyku, rozcieńczając 100x roztwór podstawowy antybiotyku/antybiotyku w sterylnym PBS.</li>
	<li>Przygotuj 3 ml świeżego buforu do trawienia skóry zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% roztworu penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 10 mg/ml kolagenazy typu I, 0,25% trypsyny wieprzowej i 0,02 mg/ml dezoksyrybonukleazy I w RPMI 1640.</li>
	<li>Przygotuj 6 ml świeżej pożywki melanocytowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 7% surowicy końskiej, 1% roztworu penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 0,5 mM cyklicznego AMP di-butyrylu (dbcAMP), 20 nM 13-octanu tetradekanoiloforbolu (TPA) i 200 pM toksyny (CT) w pożywce F-12 Ham's Media. 
	nuta: Stężone roztwory podstawowe dbcAMP, TPA i CT mogą być sporządzane, porcjowane i przechowywane przez >1 rok w temperaturze -80 °C. Pożywki bazowe pozbawione tych składników można przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj 4 ml pożywki Fibroblasts zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Medium. Nośnik ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Przygotuj 40 ml 4% roztworu paraformaldehydu, rozcieńczając 16% paraformaldehydu w PBS. Nadmiar należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc lub w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.</li>
	<li>Przygotować 1% roztwór podstawowy saponin, mieszając 0,5 g saponiny w 50 ml PBS w temperaturze 37 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia saponiny. Wysterylizuj roztwór do długotrwałego przechowywania za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml wyposażonej w filtr PES 0,2 μm. Otrzymany roztwór podstawowy saponin można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.</li>
	<li>Przygotować 200 μl 0,1% roztworu saponiny na mysz, rozcieńczając 1% roztwór podstawowy saponin w PBS zawierającym 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Przygotować 1 ml roztworu żywotności, rozcieńczając 1 μl dającego się utrwalić barwnika żywotności w 1 ml PBS.</li>
</ol>
2. Izolacja melanocytów i fibroblastów
<ol>
	<li>Eutanazja od 0 do 4 dniowych szczeniąt płci męskiej i/lub żeńskiej C57Bl/6J przez dekapitację i usunięcie kończyn z uśpionych myszy za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>W komorze z przepływem laminarnym krótko zwiń pień każdej myszy na sterylnej szalce Petriego zawierającej 70% etanolu. Wyjmij pień z etanolu i umieść go na pustej, sterylnej szalce Petriego.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych, wysterylizowanych w 70% etanolu, wykonaj nacięcie w skórze po brzusznej stronie tułowia, zaczynając od szyi do ogona. Oderwij skórę od tułowia myszy za pomocą sterylnych kleszczy.</li>
	<li>Umieść skórę właściwą stroną do dołu w 6-dołkowym naczyniu zawierającym 3 ml 1x antybiotyku/roztworu przeciwgrzybiczego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty.</li>
	<li>Włącz rozdrabniacz tkanek z następującymi ustawieniami: Grubość plastra: 1 μm; Siła ostrza: ~60% maksimum; Prędkość: ~50% maksimum.</li>
	<li>Przenieś skórę stroną właściwą do dołu do sterylnego krążka do rozdrabniania tkanek i przepuść skórę całkowicie przez aktywowany rozdrabniacz tkanek 3 razy.</li>
	<li>Przenieś homogenizowaną skórę do sterylnej, stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml buforu do trawienia skóry. Wymieszaj otrzymaną zawiesinę, pipetując w górę i w dół 10-15 razy za pomocą mikropipety P1000.</li>
	<li>Zakryj stożkową probówkę i inkubuj próbkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut, odwracając probówkę co 3-5 minut.</li>
	<li>Komórki w skórze otoczkować homogenacyjnie, odwirowując stożkową rurkę w obracającym się wirniku kubełkowym o sile 750 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety P1000 powoli i całkowicie usuń bufor do trawienia skóry, uważając, aby nie naruszyć granulki. 
	nuta: Na tym etapie można zachować część całej skóry i wykorzystać ją jako kontrolę dla Kroku 3: Potwierdzenie Czystości Komórkowej. Przecedzić te komórki przez sitko o średnicy 70 μm, a następnie rozpocząć od kroku 3.5 w celu dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Dokładnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki z melanocytami, pipetując w górę i w dół 15-20 razy za pomocą mikropipety P1000. Dodaj otrzymany roztwór komórkowy kroplami do niepowlekanego dołka 6-dołkowego naczynia zawierającego 1 ml pożywki melanocytowej.</li>
	<li>Umieścić posiany homogenat skóry w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Pozostawić kultury do inkubacji przez 40 min. 
	nuta: W tym czasie niektóre fibroblasty w homogenacie skóry będą przylegać do niepowlekanego naczynia, podczas gdy melanocyty i keratynocyty pozostaną w zawiesinie.</li>
	<li>Przenieść supernatant hodowli z niepowlekanego naczynia do jednego dołka wstępnie umytego, pokrytego kolagenem naczynia 6-dołkowego. Dodać G418 do pożywki tak, aby końcowe stężenie wynosiło 100 ng/ml.</li>
	<li>Dodaj 2 ml pożywki Fibroblast do jednego dołka niepowlekanego naczynia, które teraz zawiera przylegające fibroblasty.</li>
	<li>Inkubować obie kultury przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Oddzielnie odessać pożywkę i wszelkie zanieczyszczenia z każdej kultury, 16-24 godziny po posiewaniu. Umyj każde naczynie dwukrotnie 1 ml sterylnego PBS, a następnie dodaj 2 ml świeżej pożywki melanocytowej plus 100 ng/ml G418 do kultury melanocytów i 2 ml świeżej pożywki Fibroblastów do kultury fibroblastów.</li>
	<li>Po potraktowaniu kultur melanocytów G418 przez 48 godzin, przemyj komórki dwukrotnie 1 ml sterylnego PBS i dodaj do kultury 2 ml świeżej pożywki melanocytowej bez G418. 
	nuta: Ponieważ fibroblasty w kulturze melanocytów nadal obumierają po leczeniu G418, umyj naczynie sterylnym PBS, aby usunąć martwe komórki i dodaj świeże podłoże melanocytowe. Kultury melanocytów i fibroblastów powinny być pasażowane, gdy osiągną 70-80% zbiegalności.</li>
</ol>
3. Potwierdzenie czystości komórkowej
<ol>
	<li>Odessać pożywkę z każdej kultury i ostrożnie umyć każde naczynie 1 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Dodać 0,7 ml 0,25% trypsyny do każdej kultury i inkubować kultury w trypsynie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 minutę.</li>
	<li>Usunąć komórki, pipetując trypsynę do dna naczynia za pomocą mikropipety P1000.</li>
	<li>Dodać 0,7 ml odpowiedniej pożywki do każdej trypsynizowanej kultury i przenieść roztwór komórkowy do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie przy 750 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą mikropipety P1000. 
	nuta: Kroki 3.1-3.5 można zastosować do pasażowania kultur melanocytów i fibroblastów. Otrzymany osad należy ponownie zawiesić w odpowiednim podłożu i umieścić w nowym, niepowlekanym (fibroblasty) lub wstępnie umytym, pokrytym kolagenem (melanocyty) naczyniu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Zlicz i przenieś 0,5 miliona komórek do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Powtórz krok 3.5, a następnie ponownie zawieś komórki w 100 μl roztworu żywotności. Inkubować zawiesinę komórkową przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.5-3.6 dwukrotnie.</li>
	<li>Powtórz krok 3.5, a następnie utrwal komórki, ponownie zawieszając osad w 100 μl lodowatego 4% roztworu paraformaldehydu. Inkubować zawiesinę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Powtórz krok 3,5 dwukrotnie, za każdym razem ponownie zawieszając osad w 0,5 ml 3% BSA w 1x PBS.</li>
	<li>Powtórz krok 3.5, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 100 μl 0,1% roztworu saponiny. Inkubować zawiesinę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Powtórz krok 3.5, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 100 μl 0,1% roztworu saponiny zawierającego 0,5 μg króliczego przeciwciała anty-gp100, 0,5 μg króliczego przeciwciała przeciwko białku swoistemu dla fibroblastów 1 (FSP1) i 0,025 μg mysiego przeciwciała anty-cytokeratyny 14 (K14). Inkubować zawiesinę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. 
	nuta: Podczas gdy przeciwciało K14 zostało zakupione wstępnie skoniugowane z Alexa Fluor 647, przeciwciała gp100 i FSP1 zostały skoniugowane odpowiednio z CF 555 i CF 488. Na tym etapie należy również rozpocząć barwienie populacji kontrolnych. Populacje komórek kontrolnych należy wyizolować z hodowli i przetworzyć w sposób opisany w krokach 3.5-3.12.</li>
	<li>Powtórz krok 3.11 dwukrotnie, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała.</li>
	<li>Powtórz krok 3.5, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 200-400 μl 3% BSA w 1x PBS.</li>
	<li>Przepuścić roztwór komórkowy przez sitko o wielkości 40 μm do probówki okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 5 ml i przeanalizować odkształcone komórki za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Rittie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+skin+repair+in+humans+and+other+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communucation+and+Signal%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals.</a> Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).</li>
<li>Romanovsky, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+temperature%3A+its+role+in+thermoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Skin temperature: its role in thermoregulation.</a> Acta Physiologica (Oxf). 210 (3), 498-507 (2014).</li>
<li>Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+as+the+site+of+vitamin+D+synthesis+and+target+tissue+for+1%2C25-dihydroxyvitamin+D3.+Use+of+calcitriol+%281%2C25-dihydroxyvitamin+D3%29+for+treatment+of+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis.</a> Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+factors+that+regulate+skin+pigmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Physiological factors that regulate skin pigmentation.</a> Biofactors. 35 (2), 193-199 (2009).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocytes+and+their+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Melanocytes and their diseases.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (5), (2014).</li>
<li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li>
<li>Thody, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheomelanin+as+well+as+eumelanin+is+present+in+human+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).</li>
<li>Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MC1R%3A+Front+and+Center+in+the+Bright+Side+of+Dark+Eumelanin+and+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).</li>
<li>Barsh, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+controls+variation+in+human+skin+color%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">What controls variation in human skin color.</a> PLoS biology. 1 (1), 27(2003).</li>
<li>Abdel-Malek, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+melanocortin-1+receptor+is+a+key+regulator+of+human+cutaneous+pigmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation.</a> Pigment Cell Research. 13, Suppl 8 156-162 (2000).</li>
<li>Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oculocutaneous+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Oculocutaneous albinism.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 2, 43(2007).</li>
<li>Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+Pathology+of+Melasma+and+Its+Clinical+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).</li>
<li>D'Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+radiation+and+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">UV radiation and the skin.</a> International Journal of Molecular Science. 14 (6), 12222-12248 (2013).</li>
<li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).</li>
<li>Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+fibrosis%3A+novel+roles+and+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 123(2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li>
<li>Dickson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+that+express+hTERT+and+also+bypass+a+p16%28INK4a%29-enforced+mechanism+that+limits+life+span+become+immortal+yet+retain+normal+growth+and+differentiation+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Hodowla in vitro pierwotnych melanocytów i fibroblastów doprowadziła do znacznego postępu w naszym zrozumieniu biologii i chorób skóry. Protokół ten ulepsza wcześniejsze metody izolacji melanocytów, skracając czas i wiedzę techniczną potrzebną do wygenerowania spójnych kultur melanocytów, umożliwiając jednocześnie jednoczesną izolację fibroblastów skóry. Nowatorskim, oszczędzającym czas elementem tej procedury jest to, że skóra właściwa i naskórek nie muszą być rozdzielane. Zamiast tego komórki skóry są izolowane przy uż...

Skóra ssaków to wielowarstwowy organ, który chroni ciało przed obcymi patogenami i promieniowaniem ultrafioletowym (UVR). Skóra odgrywa również kluczową rolę w procesach homeostatycznych, takich jak gojenie się ran, regulacja temperatury i produkcja witaminy D1,2,3. Skóra ssaków składa się z trzech głównych typów komórek: melanocytów, fibroblastów i keratynocytów. Te typy komórek zasiedlają różne warstwy skóry, z keratynocytami tworzącymi naskórek, fibroblastami znajdującymi się w skórze właściwej i melanocytami zlokalizowanymi w połączeniu naskórkowo-skórnym i mieszkach włosowych4. W tym miejscu szczegółowo opisujemy prostą procedurę, która umożliwia jednoczesne generowanie pierwotnych kultur melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy.
Melanocyty to komórki produkujące pigment, które znajdują się w wielu miejscach w ludzkim ciele, w tym w naskórku podstawnym, tęczówce, ślimaku, mózgu i mieszkach włosowych5. Podstawową funkcją melanocytów jest generowanie i wydzielanie pęcherzyków zawierających melaninę zwanych melanosomami5,6. Melanosomy zawierają dwie główne klasy melaniny: brązową/czarną eumelaninę i żółtą/czerwoną feomelaninę6,7. Procesy biochemiczne zachodzące w melanocytach regulują względną obfitość każdego gatunku melaniny i pomagają określić kolor włosów, skóry i oczu8,9. Melanina służy również do pochłaniania promieniowania UVR i ochrony tkanek wystawionych na działanie promieni słonecznych przed mutagenezą10.
dysfunkcja melanocytów może powodować defekty pigmentowe i zwiększać podatność na raka skóry. Na przykład przebarwione plamy skórne charakterystyczne dla melasmy są wynikiem ogniskowej nadprodukcji melaniny, podczas gdy mutacje genetyczne linii zarodkowej, które upośledzają geny zaangażowane w syntezę melaniny, prowadzą do albinizmu11,12. Dogłębna wiedza z zakresu biologii melanocytów jest niezbędna do opracowania strategii, które skorygują takie defekty pigmentowe i ostatecznie poprawią dobrostan psychospołeczny osób dotkniętych tymi chorobami. Deficyty w produkcji melaniny i/lub preferencyjnej syntezie feomelaniny są również związane ze zwiększonym ryzykiem raka skóry10. Uważa się, że ryzyko to wynika ze zmniejszonej ochrony przed promieniowaniem UVR6,13. Tak więc metody zwiększające lub przywracające produkcję eumelaniny w melanocytach mogą zmniejszyć częstość występowania raka skóry w tych populacjach.
Fionchymalne fibroblasty tworzą tkankę łączną i wsparcie strukturalne dla wszystkich organów ciała, w tym warstwy skórnej skóry14. Wydalanie białek, takich jak kolagen, elastyna, laminina i fibronektyna, umożliwia fibroblastom tworzenie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), która jest niezbędna dla integralności tkanki1,14. Fibroblasty odgrywają również istotną rolę w procesach takich jak gojenie się ran, stany zapalne, angiogeneza oraz powstawanie/progresja raka1,15,16.
Podobnie jak w przypadku melanocytów, defekty w aktywacji i funkcji fibroblastów mogą sprzyjać powstawaniu nowotworów i chorobom. Na przykład niewłaściwa aktywacja fibroblastów często prowadzi do powstania zwłóknienia, wynikającego ze zwiększonego odkładania się nadmiaru składników ECM w otaczającej tkance. Ponieważ fibroblasty utrzymują znaczną część integralności strukturalnej organizmu, zwłóknienie sprzyja chorobom, które wpływają na wiele tkanek i narządów, w tym idiopatycznemu zwłóknieniu płuc, twardzinie układowemu, marskości wątroby i zwłóknieniu serca15. Fibroblasty odgrywają również kluczową rolę w raku16. Fibroblasty związane z rakiem (CAF) są najliczniejszymi komórkami niezłośliwymi w mikrośrodowisku wielu nowotworów. Wykazano, że CAF promują proliferację, progresję i oporność terapeutyczną guza poprzez modulowanie sztywności tkanek, lokalnej produkcji cytokin i funkcji immunologicznej16.
Pierwotne hodowle komórkowe dostarczają badaczom genetycznie łatwych modeli do identyfikacji i łagodzenia wad melanocytów i fibroblastów, które prowadzą do choroby. Jednak obecne metody zakładania kultur melanocytów są czasochłonne i trudne technicznie. Konieczność trypsynizacji i delikatnego oddzielenia naskórka od skóry właściwej przyczynia się do zmienności plonów doświadczalnych i utrudnia przeprowadzanie eksperymentów na dużą skalę. Co więcej, obecnie w tej dziedzinie brakuje protokołów jednoczesnego izolowania melanocytów i fibroblastów z całej skóry.
Opracowaliśmy metodę pozwalającą na zmniejszenie liczby etapów przetwarzania, zmienności i czasu potrzebnego do stworzenia kultur melanocytów i fibroblastów z tej samej próbki całej skóry. Stosując metodę mechanicznej homogenizacji, po której następuje krótkie trawienie, nasza strategia znacznie skraca czas potrzebny do wyizolowania pierwotnych melanocytów, umożliwiając jednocześnie jednoczesną izolację fibroblastów. Zwiększona szybkość, wydajność i spójność tego protokołu, w połączeniu z możliwością izolowania melanocytów od myszy w wieku 0-4 dni, zapewnia naukowcom elastyczność w przeprowadzaniu szerszego wachlarza eksperymentów niż było to wcześniej możliwe.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; m PES sterylny filtr strzykawkowy</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>10 cm naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>40 & mikro; m sitko do komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówki okrągłodenne z polistyrenu</td><td>Fisher Scientific 352008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL0516</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; Filtr siatkowy do komórek m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>CF 488A Zestaw do znakowania przeciwciał Mix-n-Stain</td><td>Biotium</td><td>92273</td><td></td></tr><tr><td>CF 555 Zestaw do znakowania przeciwciał Mix-n-Stain</td><td>Biotium</td><td>92274</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen ze szczurzego ogona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Worthington Biochemicals</td><td>LS004156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Roztwór penicyliny/streptomycyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>30-002-CL</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało cytokeratyny 14 Alexa Fluor 647</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34403AF647</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I</td><td>Worthington Biochemicals</td><td>LS002058</td><td></td></tr><tr><td>cykliczny di-butyryl AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td><td>Thermo Fisher</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>22032601</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Przeciwciało Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>FSP1/S100A4</td><td>Millipore Sigma</td><td>07-2274</td><td></td></tr><tr><td>G418 Dwusiarczek</td><td>P212121</td><td>LGB-418-1</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>VWR</td><td>VWRV0714</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Fisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003402</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek McIlwain</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko czerniakowi gp100</td><td>Abcam</td><td>ab137078</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka odżywcza F-12 Ham's Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6760</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-mirystynian 13-octan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldehyd</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna wieprzowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85450C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7900</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze do rozdrabniania tkanek</td><td>Ted Pella</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz do tkanek Plastikowy dysk</td><td>Ted Pella</td><td>10180-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>VWR</td><td>VWRL0154-0100</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Defekty w funkcjonowaniu fibroblastów lub melanocytów są związane z chorobami skóry, w tym słabą funkcją bariery, wadliwym gojeniem się ran, defektami pigmentacji i rakiem. Kluczowe znaczenie dla zrozumienia i poprawy stanu zdrowia tych chorób mają eksperymenty na pierwotnych hodowlach fibroblastów i melanocytów. Niemniej jednak obecne protokoły izolacji melanocytów wymagają, aby warstwy naskórka i skóry właściwej zostały trypsynizowane i ręcznie oddzielone. Proces ten jest czasochłonny, trudny technicznie i przyczynia się do niespójnych plonów. Co więcej, metody jednoczesnego generowania czystych kultur fibroblastów z tej samej próbki tkanki nie są łatwo dostępne. Tutaj opisujemy ulepszony protokół izolowania melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy w dniach poporodowych 0-4. W tym protokole cała skóra jest mechanicznie homogenizowana za pomocą rozdrabniacza do tkanek, a następnie krótko trawiona kolagenazą i trypsyną. Populacje komórek są następnie izolowane poprzez selektywne posiewanie, a następnie traktowanie G418. Ta procedura zapewnia stałą wydajność melanocytów i fibroblastów od jednej myszy w mniej niż 90 minut. Protokół ten jest również łatwo skalowalny, co pozwala naukowcom przetwarzać duże kohorty zwierząt bez znacznego wydłużenia czasu pracy. Za pomocą oceny cytometrii przepływowej pokazujemy, że kultury założone przy użyciu tego protokołu są wysoce wzbogacone o melanocyty lub fibroblasty.

Samce i samice myszy C57Bl/6J zostały uśmiercone w dniach postnatalnych 0-4, a skórę tułowia poddano dysocjacji mechanicznej zgodnie z powyższym opisem. Po posiekaniu skóra utworzyła lepką zawiesinę, w której nie było widocznych oznak struktury tkankowej. Wirowanie tej zawiesiny doprowadziło do powstania dużego osadu komórkowego na dnie probówki stożkowej oraz warstwy tkanki tłuszczowej pływającej na powierzchni naddatku. Warstwę tłuszczową usunięto wraz z naddatkiem, a pozostały osad komórkowy resuspensowano i przeniesi...

Ten protokół przedstawia szybką metodę jednoczesnego generowania kultur melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy w wieku 0-4 dni. Te pierwotne kultury mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania różnych fizjologicznie istotnych procesów, w tym biologii komórek skóry, pigmentacji, gojenia się ran i czerniaka.

Szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Niniejszy protokół opisuje szybką i prostą metodę generowania pierwotnych kultur melanocytów i fibroblastów z myszy. Ponieważ technika ta nie wymaga oddzielania naskórka od skóry właściwej, może być ona wykonywana szybko i powtarzalnie przy minimalnym przeszkoleniu. Metodę tę można wykorzystać do badania biologii skórnych melanocytów i fibroblastów.Badania na tych kulturach mogą dostarczyć istotnych informacji w kontekście nowotworów, gojenia ran oraz wad pigmentacji. Przed rozpoczęciem należy przygotować wszystkie niezbędne odczynniki i sprawdzić temperaturę kąpieli wodnej. W przypadku planowanego przetworzenia wielu próbek należy zapoznać się z przewodnikiem skalowania odczynników w Tabeli 1.Procedurę tę zaprezentuje Brandon Murphy, doktorant z mojego laboratorium. W komorze z laminarnym przepływem powietrza krótko przemyj tułów każdego uśpionego myszy, tocząc go w sterylnej płytce Petri zawierającej 70% etanol. Wyjmij mysz z etanolu i umieść ją w pustej sterylnej płytce Petri.Następnie wysterylizuj nożyczki chirurgiczne w 70% ethanolu. Użyj tych nożyczek, aby wykonać nacięcie skóry na stronie brzusznej tułowia, zaczynając od szyi i kontynuując w kierunku ogona. Za pomocą steryln

rapid-generation-of-primary-murine-melanocyte-and-fibroblast-cultures

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje protokół izolacji i hodowli pierwotnych kultur fibroblastów z tkanki skóry oraz płuc dzikich gryzoni.

Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów dorosłych gryzoni

W niniejszym protokole zidentyfikowaliśmy nową populację komórek melanocytopodobnych (znanych również jako melanocyty serca) w sercach myszy i ludzi, które przyczyniają się do wyzwalania arytmii przedsionkowej u...

Izolowanie pierwotnych komórek melanocytopodobnych z serca myszy

Ten film opisuje szybką metodę jednoczesnego izolowania i hodowli melanocytów i fibroblastów ze skóry pourodzeniowego szczeniaka myszy. Komórki te mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania biologii komórek skóry, gojenia się ran i czerniaka.

Szybka hodowla pierwotnych mysich melanocytów i fibroblastów: Izolowanie melanocytów i fibroblastów z próbki całej mysiej skóry

Opisujemy sekcję i hodowlę ex vivo skóry embrionalnej myszy. System hodowli utrzymuje granicę faz powietrze-ciecz na powierzchni tkanki i umożliwia obrazowanie pod mikroskopem odwróconym. Melanoblasty, składnik rozwijającej się skóry, są znakowane fluorescencyjnie, co pozwala na obserwację ich zachowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Hodowla skóry embrionalnej myszy i obrazowanie na żywo migracji melanoblastów

Opisujemy prostą i szybką eksperymentalną procedurę generowania pierwotnych fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Procedura nie wymaga specjalnego szkolenia zwierząt i może być stosowana do generowania kultur fibroblastów z uszu przechowywanych w RT przez okres do 10 dni.

Generowanie pierwotnych kultur fibroblastów z tkanek uszu i ogona myszy

Ta praca opisuje protokół różnicowania in vitro do produkcji pigmentowanych, dojrzałych melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą grzebienia nerwowego i etapu pośredniego melanoblastu przy użyciu 25-dniowego protokołu bez karmienia.

Bezkarmowe pozyskiwanie melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół generowania 3D organotypowego modelu skóry czerniaka sferoidalnego, który podsumowuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządu/guza in vivo, ale jednocześnie uwzględnia systematyczną interwencję eksperymentalną.

Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Powstaje nowy trójwymiarowy model sferoidalny oparty na heterotypowym oddziaływaniu komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu. Tutaj prezentujemy kokulturę komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną w celu wizualizacji powstawania sferoid. Ten trójwymiarowy model stanowi istotną platformę do badania interakcji między guzem a zrębem i testowania terapii przeciwnowotworowych.

Nowatorski, modulowany fibroblastami zrębu model sferoidalny 3D guza do badania interakcji guz-zręb i odkrywania leków

Ten artykuł informuje, że dodanie Y-27632 do podłoża TIVA może znacznie zwiększyć wydajność melanocytów z tkanek skóry dorosłych.

Y-27632 Wzbogaca wydajność ludzkich melanocytów z tkanek skóry dorosłych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system bezpośredniego przeprogramowania melanocytów oraz wysoce wydajny, skoncentrowany system pakowania wirusów, który zapewnia płynne bezpośrednie przeprogramowanie.

Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

Naucz się szybkiej metody hodowli pierwotnych melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy. Technika ta umożliwia badania biologii komórek skóry, gojenia ran i melanoma bez konieczności separacji naskórka i skóry właściwej.

Szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów

Przeglądaj więcej filmów