Ustalenie i charakterystyka trzech linii komórkowych PC-9 gruczolakoraka płuc opornych na afatynib opracowanych przy rosnących dawkach afatynibu

Badania nad nowymi mechanizmami oporności nabytej przyczynią się do opracowania skuteczniejszych i bezpieczniejszych strategii terapeutycznych u pacjentów z nowotworami opornymi na czynniki przeciwnowotworowe i resekcyjnymi. Niestety, przypadki, w których oporność na leki nie rozwinęła się, na ogół nie są zgłaszane. Ta metoda stopniowego zwiększania dawki jest uważana za najbardziej niezawodną technikę uzyskiwania komórek o nabytej oporności.

Aby określić odpowiednie stężenie oporności na afatynib, należy wyhodować komórki PC-9 w pożywce wzrostowej w 10-centymetrowym naczyniu poddanym hodowli komórkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Ponownie zawiesić komórki PC-9 w stężeniu cztery razy 10 do czterech komórek na mililitr pożywki wzrostowej i umieścić komórki w 50 mikrolitrach zawiesiny komórek na studzienkę w 96-dołkowej mikropłytce. Po całonocnej inkubacji w inkubatorze kultur komórkowych należy potraktować komórki 50 mikrolitrami roztworu afatynibu na studzienkę, w sześciu powtórzeniach wskazanych stężeń, a po 96-godzinnej inkubacji w inkubatorze do hodowli wybrakowanych dodać 15 mikrolitrów barwnika MTT do każdej studzienki.

Po czterech godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych dodaj 100 mikrolitrów roztworu solubilizacyjnego/zatrzymującego do każdej studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora na noc. Następnego ranka zmierz gęstość optyczną przy 570 nanometrach na czytniku mikropłytek. W przypadku ciągłej ekspozycji na afatynib należy hodować komórki PC-9 w szalkach P-100 zawierających 10 mililitrów pożywki wzrostowej, aż komórki osiągną subkonfluencję.

Przenieś zlewające się kultury do trzech nowych szalek P-100 po dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej na początkową szalkę hodowlaną i zwróć komórki do inkubatora do hodowli komórkowych. Następnego ranka dodaj 0,1 nanomola lub 1/10 połowy maksymalnego stężenia hamującego afatynibu do każdego zestawu trzech szalek hodowlanych. Kiedy komórki leczone afatynibem ulegną subkonfuzji, użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby dokładnie wymieszać kultury i przenieś jeden mililitr komórek z każdej szalki do dziewięciu mililitrów świeżej pożywki w nowych szalkach P-100.

Dodać od 10% do 20% wyższe stężenia afatynibu do nowych kultur, zwiększając stężenie afatynibu poprzez stopniowe zwiększanie dawki za każdym razem, gdy kultury osiągną subkonfluencję w okresie od 10 do 12 miesięcy. Po osiągnięciu stężenia afatynibu wynoszącego jeden mikromol należy przeprowadzić test MTT, jak wykazano, w celu potwierdzenia, że komórki rozwinęły oporność na afatynib. Aby wyznaczyć krzywą wzrostu dla linii komórkowych, należy hodować rodzicielski PC-9 i trzy linie komórkowe oporne na afatynib w pożywce wzrostowej w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny.

Ponownie zawiesić komórki z każdej hodowli w stężeniu pięć razy 10 do jednej trzeciej komórek na mililitr pożywki wzrostowej i umieścić 12 100-mikrolitrowych powtórzeń każdej populacji komórek na studzience w 96-dołkowej mikropłytce. Następnie wykonaj test MTT w dniu zero, pierwszym, drugim, trzecim, piątym i siódmym hodowli, jak pokazano, i wykreśl wyniki za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej. Aby zidentyfikować zmiany w receptorze naskórkowego czynnika wzrostu lub ekspresji genomowego DNA EGFR za pomocą analizy łańcucha polimerazy odwrotnej transkryptazy, należy wyizolować genomowe DNA z hodowli komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania za pomocą zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta.

Zmierzyć stężenie 25-nanogramowych mikrolitrów wyizolowanego genomowego DNA na spektrofotometrze. Następnie amplifikuj 50 nanogramów genomowego DNA za pomocą zielonej mieszanki głównej SYBR i przeanalizuj wyniki za pomocą opartego na fluorescencji systemu wykrywania reakcji łańcuchowej polimerazy odwrotnej transkryptazy. Aby zidentyfikować zmiany w ekspresji genomowego DNA EGFR przez sekwencjonowanie, amplifikuj genomowe DNA za pomocą specyficznych starterów dla eksonów EGFR od 19 do 21.

Następnie oczyść amplifikowane produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta i ułóż sekwencje amplikonów. Aby zidentyfikować zmiany w ekspresji białka receptora naskórkowego czynnika wzrostu za pomocą analizy western blot, należy leczyć komórki afatynibem przez 24 godziny. Po 24 godzinach umyj kultury komórkowe dwa razy pięcioma mililitrami lodowatego PBS na kulturę na pranie.

Lizować komórki w buforze do testów radioimmunoprecypitacyjnych, uzupełnionym koktajlem 1% inhibitora proteazy i koktajlem inhibitorów fosfatazy drugim i trzecim przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zebrać lizaty przez odwirowanie. Użyć testu kwasu bicinchoninowego do określenia stężenia białka w próbkach lizatu.

Dostosuj próbki białka do stężenia 0,5 lub jednego mikrograma na mikrolitr w buforze 4-X próbki i gotuj próbki w temperaturze 96 stopni Celsjusza przez pięć minut. W celu analizy próbek metodą western blot należy zmontować szklane płytki i przekładki oczyszczone etanolem, a następnie obciążyć formę 8% żelem poliakrylamidowym z odpowiednimi suplementami eksperymentalnymi. Podczas polimeryzacji żelu dodaj roztwór żelu do układania w stos do odpowiedniej formy, włóż grzebień i pozwól żelowi do polimeryzacji żelu do układania przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej.

Gdy oba żele ulegną polimeryzacji, umieść je w aparacie do elektroforezy i napełnij zbiornik pracującym buforem. Następnie załaduj jedną objętość od 20 do 30 mikrolitrów każdej próbki białka do każdej studzienki i uruchom żel pod napięciem 180 woltów. Przerwij elektroforezę po około 60 minutach, gdy czoło barwnika wypłynie z żelu, i przemyj żel solą fizjologiczną buforowaną tris, uzupełnioną Tween, przez jedną do dwóch minut.

Przenieś białka na membranę z polifluorku winylidenu przez półsuche blot przez jedną i 1/2 godziny przy stałym prądzie 300 miliamperów. Zatkaj membranę 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku rozcieńczonym solą fizjologiczną buforowaną trisem i roztworem Tween przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przez noc sonduj błonę odpowiednimi przeciwciałami w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego ranka przemyj błony trzema 10-minutowymi płukaniami świeżej soli fizjologicznej buforowanej trisem na jedno pranie, a następnie wystawij membranę na działanie odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego przez jedną do jednej i 1/2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj membranę pięć razy świeżą solą fizjologiczną buforowaną trisem na pranie i wystawij membranę na działanie ulepszonego roztworu chemiluminescencyjnego w celu wizualizacji sygnału za pomocą folii. W tym artykule zilustrowano obserwowany spadek proliferacji komórek macierzystych PC-9 w odpowiedzi na rosnące stężenia afatynibu, co potwierdza, że komórki PC-9 są wrażliwe na ekspozycję na afatynib.

Jednak żadna z trzech linii komórkowych opornych na afatynib nie wykazuje zahamowania proliferacji komórek pod wpływem ekspozycji na afatynib. Linie komórkowe oporne na afatynib wykazują znacznie wolniejsze krzywe wzrostu niż rodzicielskie komórki PC-9. Komórki oporne na afatynib wyrażają znacznie wyższe poziomy genomowego DNA EGFR i ekspresji białka EGFR niż komórki rodzicielskie PC-9.

Sekwencjonowanie EGFR pokazuje, że komórki PC-9 wykazują 15 delecji par zasad w eksonie 19 EGFR i EGFR typu dzikiego w eksonie 20. Jedna i dwie komórki linii komórkowej oporne na afatynib wykazują jednak amplifikację eksonu 19 EGFR typu dzikiego. Komórki linii trzykomórkowej opornej na afatynib zawierają te same 15 delecji par zasad w eksonie 19 EGFR, jak w komórkach PC-9, ale mutację punktową w T790M obserwuje się w eksonie 20 EGFR.

Wzrost komórek może stać się dość powolny, gdy stężenie inhibitora jest bliskie wartości IC-50. Nie rozmawiaj o hodowli, ponieważ komórka będzie się stopniowo rozmnażać. Strategie te zostały opracowane w celu naśladowania warunków, w których u pacjentów z rakiem rozwija się klinicznie istotna oporność, w celu oceny nabytych mechanizmów oporności oraz opracowania bezpiecznych i skutecznych strategii terapeutycznych.