CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej
June 20th, 2019
Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.
Bezpieczne i skuteczne dostarczanie elementów Cas9 do komórek ma kluczowe znaczenie dla terapii opartych na edycji genów. Protokoły, które tutaj pokazujemy, prezentują nowatorskie podejście w tym kierunku. Protokół wykorzystuje nową metodę elektroporacji zwaną elektroporacją rurową.
Prowadzi to do wysokich wskaźników przeżycia komórek, a także wskaźników edycji genów. Metoda elektroporacji rurkowej jest wolna od wirusów, leków i wzbogacania reporterowego. Są one preferowane w zastosowaniach klinicznych, a więc w terapiach opartych na edycji genów.
Metoda ma uniwersalne zastosowanie do wielu typów komórek. Na przykład ludzkie komórki krwiotwórcze, pierwotne limfocyty T i inne komórki można edytować za pomocą naszej metody. Ta metoda elektroporacji rurkowej wykorzystuje cienką rurkę.
Jeśli używasz go po raz pierwszy, możesz wypróbować GFP z ekspresją plazmidowego DNA. Procedurę zademonstruje Linyuan Ma, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pozyskać ludzkie iPSC z American Type Culture Collection.
Hodowla iPSC na sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej z pożywką do hodowli komórkowych bez podawania w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy. Dwie godziny przed transfekcją potraktuj iPSC 10 mikromolową cewką zwijaną związaną z Rho zawierającą inhibitor kinazy białkowej Y-27632. Podczas transfekcji należy dysocjować iPSC z roztworem odłączającym komórki do pojedynczych komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Następnie policz liczbę komórek. Aby ustalić hodowlę komórek fibroblastów królika, należy wykonać biopsję skóry ucha z czubka ucha królika. Dwukrotnie przepłukać tkankę DPBS zawierającym 5% penicyliny-streptomycyny.
Przenieś wypłukaną tkankę ucha do nowego sześciocentymetrowego naczynia do hodowli tkanek i pokrój tkankę na małe kawałki, każdy o wymiarach około jeden na jeden milimetr. Dodaj kilka kropli FBS, aby zapobiec wysuszeniu tkanki. Następnie rozprowadź rozdrobnioną tkankę w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowych i dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do pięciu dni. Trzy do pięciu dni po posiewie użyj trypsyny-EDTA, aby trawić komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie policz liczbę komórek. Po zaprojektowaniu i zsyntetyzowaniu gRNA i oligonukleotydów donorowych, należy przygotować komórki zgodnie z wcześniejszym opisem.
Ponownie zawiesić od 20 do 30 000 ogniw w 20 mikrolitrach buforu do elektroporacji. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. W przypadku transfekcji Cas9 RNP należy wstępnie wymieszać dwa mikrogramy białka Cas9 NLS z 0,67 mikrograma gRNA w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut.
Delikatnie wymieszaj utworzony kompleks RNP z dwoma mikrogramami ssODN z komórkami. Za pomocą uniwersalnych końcówek do pipet z zestawu do elektroporacji przenieś mieszaninę komórek do rurki do elektroporacji o pojemności 20 mikrolitrów. Umieść rurkę do elektroporacji w szczelinie elektroporatora i naciśnij go, aby zakończyć.
Pomyślny cykl elektroporacji jest sygnalizowany raportem impulsów na ekranie wyświetlacza elektroporatora. Po elektroporacji przenieś ludzkie komórki iPS na jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki zawierającej Y-27632, jak opisano wcześniej. Następnie umieść zawieszone komórki w jednym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli komórek.
Kontynuuj hodowlę płytki, pamiętając o codziennej zmianie pożywki hodowlanej. Y-27632 usuwa się z pożywki hodowlanej iPSC dla ludzi 24 godziny po elektroporacji. 72 godziny po elektroporacji zbierz komórki.
W przypadku komórek fibroblastów królika użyj trypsyny-EDTA do trawienia komórek z płytki hodowlanej. W przypadku ludzkich iPSC należy użyć roztworu do odrywania komórek, aby strawić komórki z płytek hodowlanych. Krótko odwirować próbki z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut i ponownie zawiesić komórki za pomocą 350 mililitrów buforu do lizy.
Inkubować przez noc w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Następnego dnia ekstrahuj genomowe DNA za pomocą fenolu-chloroformu przy użyciu standardowych procedur. Amplifikuj od 100 do 200 par zasad fragmentów DNA z żeli za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu lub bezpośrednio z produktów PCR za pomocą mini zestawu PCR SV.
Aby określić skuteczność edycji genów za pomocą sekwencjonowania kolonii bakteryjnych, należy użyć zestawu do klonowania TOPO-TA do ligacji oczyszczonych produktów PCR do wektora PCR4-TOPO. Losowo wybieraj klony bakteryjne i sekwencjonuj wstawki za pomocą uniwersalnego startera sekwencjonowania dostarczonego przez zestaw do klonowania TOPO-TA. Aby określić wydajność edycji genów poprzez głębokie sekwencjonowanie, należy wysłać wcześniej uzyskane oczyszczone produkty PCR do sekwencjonowania amplikonów CRISPR w rdzeniu sekwencjonowania DNA.
W tym badaniu metoda elektroporacji rurkowej jest skutecznie stosowana do dostarczania CRISPR/Cas9 RNP i ssODN do komórek króliczych i ludzkich, co prowadzi do solidnej, precyzyjnej edycji genów. Po pierwsze, mutacje C231Y i Q235X są wytwarzane w genie IL2RG, a mutacja R150G jest wytwarzana w genie SPR w komórkach fibroblastów królika. Przedstawiono tutaj konkretne projekty sgRNA i szybkości edycji genów określone przez klonowanie bakteryjnej TA.
Locus IL2RG C231, spośród 28 zsekwencjonowanych klonów, jeden jest nosicielem dokładnej mutacji C231Y, cztery są nosicielami mutacji insercji lub delecji, a pozostałe 23 są typu dzikiego. W locus IL2RG Q235, z 27 zsekwencjonowanych klonów, dwa są nosicielami dokładnej mutacji Q235X, trzy są nosicielami mutacji indel, a pozostałe są typu dzikiego. W locus SPG R150, z 20 zsekwencjonowanych klonów, pięć jest nosicielami precyzyjnej mutacji genu R150, 10 jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe są typu dzikiego.
Elektroporacja rurkowa jest następnie wykorzystywana do dostarczania Cas9 RNP i ssODN do ludzkich iPSC i docelowych klinicznie istotnych loci w genach EGFR, Mybpc3 i HBB. W locus EGFR 15,68% alleli jest nosicielami mutacji punktowych, 22,75% jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe 61,57% to mutacje typu dzikiego. W locus Mybpc3 37,92% jest nosicielami precyzyjnej delecji TGAA z czterema parami zasad, 2,24% jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe 59,84% jest typu dzikiego.
W locus HBB 11,5% jest nosicielami mutacji E6V, 35,4% jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe 65% jest typu dzikiego. Cas9 RNP jest preferowaną formą Cas9 ze względu na jego mniejszy rozmiar w porównaniu z plazmidowym DNA. Elektroporacja lampowa jest skuteczną metodą dostarczania Cas9 RNP.
Jesteśmy szczególnie zainteresowani wykorzystaniem elektroporacji lampowej Cas9 RNP w pierwotnych ogniwach T do zastosowań CAR T.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej. Ta nowatorska metoda poprawia przeżywalność komórek i wskaźniki edycji genów, będąc wolna od wirusów i leków.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Edycja genów
- Technologia CRISPR/Cas9
- Biologia komórki
Tło
- Efektywne dostarczanie elementów Cas9 jest kluczowe dla edycji genów.
- Elektroporacja rurkowa to nowa metoda, która poprawia efektywność dostarczania.
- Metoda jest stosowana do różnych typów komórek, w tym ludzkich iPSC i fibroblastów królików.
- Wysokie wskaźniki przeżywalności i efektywności edycji genów są niezbędne dla zastosowań klinicznych.
Cel badania
- Aby zademonstrować nowatorską metodę elektroporacji rurkowej do edycji genów.
- Aby osiągnąć wysokie wskaźniki edycji w komórkach ssaków.
- Aby dostarczyć protokół, który jest wolny od interwencji wirusowych i leków.
Zastosowanie metod
- Przygotowanie kultur ludzkich iPSC i fibroblastów królików.
- Transfekcja za pomocą Cas9 RNP i donorowych oligonukleotydów.
- Elektroporacja przy użyciu specyficznej metody rurkowej.
- Ocena efektywności edycji genów poprzez sekwencjonowanie.
Główne wyniki
- Skuteczna dostawa komponentów CRISPR/Cas9 do różnych typów komórek.
- Wysokie wskaźniki precyzyjnej edycji genów w docelowych lokusach.
- Wykazane mutacje w genach IL2RG i SPR w fibroblastach królików.
- Efektywność edycji w ludzkich iPSC na klinicznie istotnych lokusach.
Wnioski
- Elektroporacja rurkowa jest skuteczną metodą edycji genów.
- Metoda pozwala na wysokie wskaźniki przeżywalności komórek i edycji.
- Jest odpowiednia do zastosowań klinicznych ze względu na swoją efektywność i bezpieczeństwo.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient and safe delivery of CRISPR/Cas9 components is a critical bottleneck in therapeutic gene editing development. Tube electroporation enables high-precision editing in clinically relevant human iPSCs and primary cells without viral vectors or drug-based transfection reagents, reducing immunogenicity risks and supporting scalable, GMP-compatible workflows. This approach directly addresses the need for mechanistic de-risking in early-stage genome editing programs by providing quantitative, reproducible editing outcomes across disease-relevant loci.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of disease-associated mutations in IL2RG, SPR, EGFR, Mybpc3, and HBB genes to confirm pathogenic mechanisms.
- Operational Value: Supports rapid generation of isogenic cell lines for target de-risking and pathway interrogation in rabbit fibroblasts and human iPSCs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantifiable precise editing rates (3.57%-37.92%) via bacterial TA cloning and deep sequencing, enabling dose-response and condition comparison.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible editing outcomes across cell types, supporting assay readiness for CRISPR-based screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates clinically relevant disease models (e.g., HBB E6V for sickle cell, EGFR mutations) for preclinical efficacy and safety testing.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation using the same editing method, reducing variability in translational handoff.
Pipeline & Workflow Integration
Tube electroporation fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling precise genome editing for target validation, assay development, and disease model generation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through precise introduction of disease-causing mutations to clarify gene function and pathway involvement.
- Screening: Delivers quantitative editing readouts that allow comparison of gRNA efficacy, donor template design, and electroporation conditions.
- Analytics: Provides measurable outputs (precise mutation rates, indel frequencies) via sequencing to inform go/no-go decisions in target validation.
- Translational Research: Generates isogenic human iPSC models with clinically relevant mutations for preclinical mechanistic and toxicity studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, non-viral editing platform applicable across multiple cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High precision editing reduces mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening.
- Operational Value: Virus- and drug-free delivery improves scalability, reduces regulatory burden, and supports consistent manufacturing.
- Strategic Value: Enables data-driven target prioritization by linking editing efficiency to phenotypic outcomes.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement of genome editing programs through validated, reproducible disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, iPSC handling, and electroporation optimization.
- Dependent on access to tube electroporation systems and compatible buffers.
- Necessitates standardized gRNA and ssODN design and validation protocols.
- Requires sequencing capacity (clonal or deep sequencing) for editing efficiency assessment.
- Performance may vary across primary cell types, necessitating pilot optimization.
