CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Bezpieczne i skuteczne dostarczanie elementów Cas9 do komórek ma kluczowe znaczenie dla terapii opartych na edycji genów. Protokoły, które tutaj pokazujemy, prezentują nowatorskie podejście w tym kierunku. Protokół wykorzystuje nową metodę elektroporacji zwaną elektroporacją rurową.

Prowadzi to do wysokich wskaźników przeżycia komórek, a także wskaźników edycji genów. Metoda elektroporacji rurkowej jest wolna od wirusów, leków i wzbogacania reporterowego. Są one preferowane w zastosowaniach klinicznych, a więc w terapiach opartych na edycji genów.

Metoda ma uniwersalne zastosowanie do wielu typów komórek. Na przykład ludzkie komórki krwiotwórcze, pierwotne limfocyty T i inne komórki można edytować za pomocą naszej metody. Ta metoda elektroporacji rurkowej wykorzystuje cienką rurkę.

Jeśli używasz go po raz pierwszy, możesz wypróbować GFP z ekspresją plazmidowego DNA. Procedurę zademonstruje Linyuan Ma, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pozyskać ludzkie iPSC z American Type Culture Collection.

Hodowla iPSC na sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej z pożywką do hodowli komórkowych bez podawania w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy. Dwie godziny przed transfekcją potraktuj iPSC 10 mikromolową cewką zwijaną związaną z Rho zawierającą inhibitor kinazy białkowej Y-27632. Podczas transfekcji należy dysocjować iPSC z roztworem odłączającym komórki do pojedynczych komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie policz liczbę komórek. Aby ustalić hodowlę komórek fibroblastów królika, należy wykonać biopsję skóry ucha z czubka ucha królika. Dwukrotnie przepłukać tkankę DPBS zawierającym 5% penicyliny-streptomycyny.

Przenieś wypłukaną tkankę ucha do nowego sześciocentymetrowego naczynia do hodowli tkanek i pokrój tkankę na małe kawałki, każdy o wymiarach około jeden na jeden milimetr. Dodaj kilka kropli FBS, aby zapobiec wysuszeniu tkanki. Następnie rozprowadź rozdrobnioną tkankę w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowych i dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do pięciu dni. Trzy do pięciu dni po posiewie użyj trypsyny-EDTA, aby trawić komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie policz liczbę komórek. Po zaprojektowaniu i zsyntetyzowaniu gRNA i oligonukleotydów donorowych, należy przygotować komórki zgodnie z wcześniejszym opisem.

Ponownie zawiesić od 20 do 30 000 ogniw w 20 mikrolitrach buforu do elektroporacji. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. W przypadku transfekcji Cas9 RNP należy wstępnie wymieszać dwa mikrogramy białka Cas9 NLS z 0,67 mikrograma gRNA w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut.

Delikatnie wymieszaj utworzony kompleks RNP z dwoma mikrogramami ssODN z komórkami. Za pomocą uniwersalnych końcówek do pipet z zestawu do elektroporacji przenieś mieszaninę komórek do rurki do elektroporacji o pojemności 20 mikrolitrów. Umieść rurkę do elektroporacji w szczelinie elektroporatora i naciśnij go, aby zakończyć.

Pomyślny cykl elektroporacji jest sygnalizowany raportem impulsów na ekranie wyświetlacza elektroporatora. Po elektroporacji przenieś ludzkie komórki iPS na jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki zawierającej Y-27632, jak opisano wcześniej. Następnie umieść zawieszone komórki w jednym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli komórek.

Kontynuuj hodowlę płytki, pamiętając o codziennej zmianie pożywki hodowlanej. Y-27632 usuwa się z pożywki hodowlanej iPSC dla ludzi 24 godziny po elektroporacji. 72 godziny po elektroporacji zbierz komórki.

W przypadku komórek fibroblastów królika użyj trypsyny-EDTA do trawienia komórek z płytki hodowlanej. W przypadku ludzkich iPSC należy użyć roztworu do odrywania komórek, aby strawić komórki z płytek hodowlanych. Krótko odwirować próbki z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut i ponownie zawiesić komórki za pomocą 350 mililitrów buforu do lizy.

Inkubować przez noc w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Następnego dnia ekstrahuj genomowe DNA za pomocą fenolu-chloroformu przy użyciu standardowych procedur. Amplifikuj od 100 do 200 par zasad fragmentów DNA z żeli za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu lub bezpośrednio z produktów PCR za pomocą mini zestawu PCR SV.

Aby określić skuteczność edycji genów za pomocą sekwencjonowania kolonii bakteryjnych, należy użyć zestawu do klonowania TOPO-TA do ligacji oczyszczonych produktów PCR do wektora PCR4-TOPO. Losowo wybieraj klony bakteryjne i sekwencjonuj wstawki za pomocą uniwersalnego startera sekwencjonowania dostarczonego przez zestaw do klonowania TOPO-TA. Aby określić wydajność edycji genów poprzez głębokie sekwencjonowanie, należy wysłać wcześniej uzyskane oczyszczone produkty PCR do sekwencjonowania amplikonów CRISPR w rdzeniu sekwencjonowania DNA.

W tym badaniu metoda elektroporacji rurkowej jest skutecznie stosowana do dostarczania CRISPR/Cas9 RNP i ssODN do komórek króliczych i ludzkich, co prowadzi do solidnej, precyzyjnej edycji genów. Po pierwsze, mutacje C231Y i Q235X są wytwarzane w genie IL2RG, a mutacja R150G jest wytwarzana w genie SPR w komórkach fibroblastów królika. Przedstawiono tutaj konkretne projekty sgRNA i szybkości edycji genów określone przez klonowanie bakteryjnej TA.

Locus IL2RG C231, spośród 28 zsekwencjonowanych klonów, jeden jest nosicielem dokładnej mutacji C231Y, cztery są nosicielami mutacji insercji lub delecji, a pozostałe 23 są typu dzikiego. W locus IL2RG Q235, z 27 zsekwencjonowanych klonów, dwa są nosicielami dokładnej mutacji Q235X, trzy są nosicielami mutacji indel, a pozostałe są typu dzikiego. W locus SPG R150, z 20 zsekwencjonowanych klonów, pięć jest nosicielami precyzyjnej mutacji genu R150, 10 jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe są typu dzikiego.

Elektroporacja rurkowa jest następnie wykorzystywana do dostarczania Cas9 RNP i ssODN do ludzkich iPSC i docelowych klinicznie istotnych loci w genach EGFR, Mybpc3 i HBB. W locus EGFR 15,68% alleli jest nosicielami mutacji punktowych, 22,75% jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe 61,57% to mutacje typu dzikiego. W locus Mybpc3 37,92% jest nosicielami precyzyjnej delecji TGAA z czterema parami zasad, 2,24% jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe 59,84% jest typu dzikiego.

W locus HBB 11,5% jest nosicielami mutacji E6V, 35,4% jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe 65% jest typu dzikiego. Cas9 RNP jest preferowaną formą Cas9 ze względu na jego mniejszy rozmiar w porównaniu z plazmidowym DNA. Elektroporacja lampowa jest skuteczną metodą dostarczania Cas9 RNP.

Jesteśmy szczególnie zainteresowani wykorzystaniem elektroporacji lampowej Cas9 RNP w pierwotnych ogniwach T do zastosowań CAR T.