Name: CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj precyzyjną edycję genów CRISPR/Cas9 za pomocą elektroporacji rurkowej w komórkach ssaków. Ta metoda zapewnia wysoką przeżywalność komórek i efektywność edycji bez użycia wirusów i leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R21OD023194 do JX). W pracach wykorzystano usługi podstawowe wspierane przez Centrum Zaawansowanych Modeli Nauk Translacyjnych i Terapii (CAMTraST) w Centrum Medycznym Uniwersytetu Michigan.

Wszystkie procedury dotyczące utrzymania, opieki i użytkowania zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Zdobądź ludzkie iPSC (ACS-1030) z American Type Culture Collection (ATCC). Hodowla iPScs na sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej z pożywką do hodowli komórkowych bez podawania (patrz tabela materiałów) w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2 w temperaturze 37 °C) zgodnie z instrukcjami dostawcy.
	<ol>
		<li>Na 2 godziny przed transfekcją należy potraktować iPSC inhibitorem Y27632 Y27632 związanym z Rho, zwiniętym zwojem zawierającym kinazę białkową (ROCK) (którego zastosowanie zmniejsza apoptozę zdysocjowanych ludzkich hiPSC oraz zwiększa przeżywalność i skuteczność klonowania hiPSC bez wpływu na ich pluripotencję).</li>
		<li>Podczas transfekcji należy rozdzielić iPSC z roztworem oddzielającym komórki (patrz tabela materiałów) na pojedyncze komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Policz liczbę komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij hodowlę komórek fibroblastów królika, używając podstawowej hodowli biopsji tkanki skóry ucha królika, jak opisano wcześniej10.
	<ol>
		<li>Biopsję skóry ucha o wymiarach 0,5 cm x 0,5 cm uzyskuje się z czubka ucha królika. Zgolić włosy z tkanki ucha.</li>
		<li>Przepłukać 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco z 5% penicyliną-streptomycyną. Przenieś tkankę ucha do nowego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 6 cm, a następnie pokrój tkankę na małe kawałki (~1,0 mm x 1,0 mm). Dodaj kilka kropli płodowej surowicy bydlęcej, aby zapobiec wysychaniu tkanki.</li>
		<li>Rozprowadź rozdrobnioną tkankę w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowych, a następnie dodaj 10 ml pożywki hodowlanej. Komórki fibroblastów królika są hodowane w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą. Umieścić naczynie do hodowli tkankowych w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2 w temperaturze 37 °C).</li>
		<li>Trzy do pięciu dni po posianiu użyj trypsyny-EDTA do trawienia komórek w temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Policz liczbę komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Projektowanie i synteza gRNA i oligonukleotydów donorowych
<ol>
	<li>Dla każdego genu zaprojektuj RNA przewodnika na podstawie sekwencji docelowego locus za pomocą narzędzia online (na przykład <http://crispor.tefor.net/>).</li>
	<li>Wklej interesującą Cię sekwencję DNA.</li>
	<li>Wybierz genom i motyw przylegający do protospaceru (PAM). Możliwe sekwencje przewodnikowe w wejściowych sekwencjach DNA zostaną wyświetlone na stronie wyjściowej. Zaleca się wybór gRNA o wyższej przewidywanej wydajności i niższym potencjale poza celem.</li>
	<li>Zsyntetyzuj DNA przez komercyjnego dostawcę do transkrypcji gRNA. Wykonać transkrypcję gRNA in vitro za pomocą zestawu do syntezy gRNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Oczyść gRNA za pomocą mikrokolumny do oczyszczania RNA zawartej w zestawie do syntezy gRNA. Zmierz stężenie, a następnie przechowuj gRNA w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zaprojektuj szablon dawcy ssODN dla każdego miejsca mutacji. Numery ssODN mogą być syntetyzowane przez dostawców komercyjnych, takich jak IDT. Ogólnie rzecz biorąc, każdy ssODN ma długość 120-160 nukleotydów (nt), składających się z 60-80 nt w lewym ramieniu homologii i 60-80 nt w prawym ramieniu homologii. Aby zapobiec ponownemu przecięciu edytowanego DNA, w miarę możliwości należy wprowadzić cichą mutację w PAM w ssODN. Miejsce cięcia CRISPR powinno znajdować się jak najbliżej zamierzonej zmiany genomowej.</li>
</ol>
3. Elektroporacja rurowa Cas9 RNP i ssODN
<ol>
	<li>Przygotować komórki zgodnie z opisem w sekcji 1.</li>
	<li>Zawiesić 2-3 x 105 ogniw w 20 μl buforu do elektroporacji. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>W przypadku transfekcji Cas9 RNP należy wymieszać 2 μg białka Cas9-NLS z 0,67 μg gRNA w temperaturze pokojowej (RT) przez 10-15 min. Następnie delikatnie wymieszaj utworzony kompleks RNP wraz z 2 μg ssODN z komórkami.</li>
	<li>Przenieś mieszaninę komórek do probówki do elektroporacji o pojemności 20 μl za pomocą uniwersalnych końcówek do pipet dostarczonych z zestawem do elektroporacji probówki. Aby uzyskać lepszą elektroporację, staraj się unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas przenoszenia.</li>
	<li>Umieść rurkę do elektroporacji w szczelinie elektroporatora i naciśnij "Go", aby zakończyć. Postępuj zgodnie z sugerowanymi przez producenta parametrami dla każdego typu ogniwa. Na przykład w przypadku ludzkich komórek iPS i fibroblastów króliczych ustawione napięcie wynosi 420 V, a czas impulsu wynosi 30 ms. Pomyślny cykl elektroporacji jest sygnalizowany raportem impulsów na ekranie wyświetlacza elektroporatora.</li>
	<li>Po elektroporacji przenieś ludzkie komórki iPS do 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki zawierającej Y-27632 opisanej w części dotyczącej hodowli komórkowej. W przypadku komórek fibroblastów królika przenieś je do DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą.</li>
	<li>Umieść zawieszone komórki w jednym dołku na 12-dołkowej płytce do hodowli komórek.</li>
	<li>Codziennie zmieniaj pożywkę hodowlaną. Y-27632 usuwa się z pożywki hodowlanej iPSC dla ludzi 24 godziny po elektroporacji.</li>
</ol>
4. Analiza zdarzeń edycji genów
<ol>
	<li>Zbierz ogniwa 72 godziny po elektroporacji. Trawić komórki z płytki hodowlanej przy użyciu trypsyny-EDTA w przypadku komórek fibroblastów królika lub roztworu do odrywania komórek w przypadku ludzkich iPSC. Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki za pomocą 350 ml buforu do lizy (1 M Tris HCl, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA; pH 8,0, 10% SDS, dodać 20 μl 20 mg/ml proteinazy K na 1 ml buforu do lizy), a następnie inkubować w temperaturze 55 °C przez noc.</li>
	<li>Ekstrakcja genomowego DNA za pomocą chloroformu fenolowego przy użyciu standardowych procedur.</li>
	<li>Amplifikuj fragmenty DNA o długości 100-200 pz zawierające region docelowy za pomocą polimerazy DNA o wysokiej wierności, a następnie oczyść fragmenty DNA z żeli za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu lub bezpośrednio z produktów PCR za pomocą minizestawu PCR SV.</li>
	<li>Aby określić skuteczność edycji genów za pomocą sekwencjonowania kolonii bakteryjnych, należy poddać ligazie oczyszczone produkty PCR do wektora pCR4-TOPO za pomocą zestawu do klonowania TOPO TA. Losowo wybierz klony bakterii, a następnie zsekwencjonuj wstawki za pomocą uniwersalnego startera sekwencjonowania dostarczonego przez zestaw do klonowania TOPO TA.</li>
	<li>Aby określić wydajność edycji genów za pomocą głębokiego sekwencjonowania, wyślij oczyszczone produkty PCR (~100-200 pz) z kroku 4.3 do sekwencjonowania amplikonów CRISPR w rdzeniu sekwencjonowania DNA.</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Cytosolic+Delivery+of+CRISPR%2FCas9-Ribonucleoprotein+for+Efficient+Gene+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing.</a> ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).</li>
<li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li>
<li>Miller, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Viral+CRISPR%2FCas+Gene+Editing+In+Vitro+and+In+Vivo+Enabled+by+Synthetic+Nanoparticle+Co-Delivery+of+Cas9+mRNA+and+sgRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).</li>
<li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Administration+of+CRISPR%2FCas9+Lipid+Nanoparticles+Achieves+Robust+and+Persistent+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li>
<li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-targeted+delivery+of+CRISPR%2FCas9+by+aptamer-functionalized+lipopolymer+for+therapeutic+genome+editing+of+VEGFA+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma.</a> Biomaterials. 147, 68-85 (2017).</li>
<li>Luo, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-Specific+in+Vivo+Gene+Editing+Using+Cationic+Lipid-Assisted+Polymeric+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles.</a> ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).</li>
<li>Wang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+editing+via+CRISPR%2FCas9+delivery+by+membrane-disruptive+and+endosomolytic+helical+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+homology-directed+gene+editing+by+CRISPR%2FCas9+in+human+stem+and+primary+cells+using+tube+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11649(2018).</li>
<li>Du, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effect+of+young+oocytes+for+rabbit+somatic+cell+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer.</a> Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).</li>
<li>Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllenspach%2C+E+%22GeneReviews%28R%29%22">GeneReviews(R)</a>. Adam, M. P., et al. , (1993).</li>
<li>Friedman, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriedman%2C+J+%22GeneReviews%28R%29%22">GeneReviews(R)</a>. Adam, M. P., et al. , (1993).</li>
<li>Hidaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+T790M+mutations+are+present+on+the+same+EGFR+allele+as+activating+mutations+in+patients+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+a+pathogenic+gene+mutation+in+human+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos.</a> Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).</li>
<li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+Pneumocystis+Infections+in+the+Lungs+of+Gene-Knockout+Rabbits+with+Severe+Combined+Immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency.</a> Frontiers in Immunology. 9, 429(2018).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+immunodeficient+rabbits+by+multiplex+embryo+transfer+and+multiplex+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12202(2017).</li>
</ol>

J. C. pracuje w firmie Celetrix LLC, producencie elektroporatorów lampowych. L. M., L. J., J. S., D. Y., J. Z., Y. E. C. i J. X. nie deklarują braku sprzecznych interesów.

Metoda elektroporacji lampowej okazała się skuteczna w dostarczaniu CRISPR/Cas9 RNP i ssODN do komórek króliczych i ludzkich, co doprowadziło do solidnej, precyzyjnej edycji genów (PGE). Podstawową różnicą między TE a innymi konwencjonalnymi urządzeniami do elektroporacji jest zastosowanie rurki, w której dwie elektrody znajdują się na górze i na dole rurki, a próbka jest ładowana w całości, a następnie zamykana po elektroporacji (rysunek 1). Natomiast w konwencjonalnej kuwecie elektrody znajdują się po bokach, a próbka nie jest w pełni uszczelniona podczas elektroporacji. Ta nowa konstrukcja zmniejsza wytwarzanie pęcherzyków powietrza i ściska rozmiar pęcherzyków powietrza, co w konsekwencji poprawia równomierny rozkład napięcia elektrycznego, a w rezultacie prowadzi do zmniejszenia śmierci komórek i wysokiej wydajności transfekcji9. W niniejszej pracy osiągnięto wysokie wskaźniki PGE (15%-37%) ukierunkowane na geny EGFR, Mybpc3 i HBB w ludzkich iPSC. Wyniki te są zgodne z wcześniejszym raportem, w którym wysokie wskaźniki PGE osiągnięto w ludzkich komórkach macierzystych9.
Mutacje powodujące chorobę były celem w genach IL2RG i SPR w komórkach królika. Ostatnio króliki z nokautem IL2RG zostały wyprodukowane jako modele dla ludzkiego ciężkiego złożonego niedoboru odporności sprzężonego z chromosomem X (SCID-X1)16,17. Niniejsza praca pokazuje, że mutacje IL2RG u pacjentów (np. C231Y i Q235X) mogą być skutecznie generowane w komórkach królika, co demonstruje możliwość tworzenia modeli królików SCID-X1 zawierających mutacje pacjenta. Wykazano również, że mutacje SPR R150G mogą być skutecznie tworzone w komórkach króliczych. Mutacja ta powoduje deficyty motoryczne i poznawcze u dzieci12. Te modele królików z mutacjami IL2RG i SPR, po wygenerowaniu, mogą służyć jako cenne modele przedkliniczne do badań translacyjnych. Mogą być również wykorzystane do opracowania terapii opartych na edycji genów dla tych chorób monogenowych.
Jednym z problemów związanych z aplikacjami do edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 są zdarzenia edycji poza celem. Wskaźniki indel przeanalizowano w przewidywanych górnych miejscach poza celem dla sgRNA użytych w tym badaniu (Tabela S1), przy użyciu metod opisanych wcześniej9. W sumie przeanalizowano siedem potencjalnych loci górnych poza celem dla sg-rb-IL2RG-01, pięć dla sg-rb-SPR, siedem dla sg-hEGFR, pięć dla sg-hMybpc3 i siedem dla sg-hHBB), przy użyciu starterów wymienionych w tabeli S2. W testach T7E1 nie ujawniono żadnych niedocelowych indeli (Figura S1), co wskazuje na minimalne ryzyko niedocelowej edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu tych sgRNA. Wskazuje to również, że sama metoda elektroporacji lampy nie powoduje ani nie zwiększa zmian poza celem. Niemniej jednak należy dołożyć starań, aby ograniczyć lub wyeliminować niechciane edycje niezgodne z celem. Sekwencjonowanie całego genomu może być konieczne w celu wykluczenia takich zdarzeń w przypadku komórek, które są przeznaczone do zastosowań klinicznych.
Na poziomie technicznym następujące czynniki są uważane za kluczowe dla osiągnięcia wydajnej, precyzyjnej edycji genomu za pomocą elektroporacji probówkowej CRISPR/Cas9 RNP. Po pierwsze, zaleca się wybór wydajnego sgRNA o przewidywanym niskim potencjale off-target. Ważne jest, aby zweryfikować wydajność indel wybranego sgRNA przed użyciem go do zastosowań PEG. Nierzadko zdarza się, że oprogramowanie przewidywane dobre sgRNA zawodzi na etapie walidacji.
Po drugie, aby osiągnąć wysokie PGE, zaleca się indukowanie mutacji PAM u dawcy ssODN, gdy tylko jest to możliwe. Uzasadnieniem jest to, że w ten sposób zapobiega się ponownemu cięciu CRISPR/Cas9 po integracji szablonu dawcy. W niektórych przypadkach PGE sama wprowadza mutacje PAM. W innych przypadkach możliwe jest wprowadzenie cichych mutacji do sekwencji PAM. W przypadku, gdy mutacja PAM nie jest możliwa, zaleca się próbę włączenia kilku cichych mutacji do dawcy, które odpowiadają sekwencji sgRNA.
Po trzecie, szczególnie istotne dla TE, ważne jest, aby unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas przenoszenia komórek i mieszaniny RNP do rurki do elektroporacji. Chociaż konstrukcja rurki TE już minimalizuje tworzenie się pęcherzyków powietrza, ostrożne obchodzenie się z nią jeszcze bardziej ograniczy, a może nawet całkowicie pozwoli uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Przewodnik rozwiązywania częstych problemów, które można napotkać podczas stosowania elektroporacji lampowej do precyzyjnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9, znajduje się w tabeli 2.
Podsumowując, wykazano tutaj, że elektroporacja lampowa jest skutecznym sposobem dostarczania CRISPR/Cas9 RNP i ssODN do komórek ssaków w celu osiągnięcia wysokich wskaźników PGE. Ta nowa technika transfekcji TE i jej solidne, precyzyjne tempo edycji genów może ułatwić rozwój aplikacji do edycji genów.

CRISPR/Cas9 jest najczęściej używaną programowalną nukleazą do edycji genów. Działa poprzez rozpoznawanie za pośrednictwem pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) zarówno sekwencji docelowych, jak i sąsiedniej sekwencji motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) w genomie. Nukleaza Cas9 generuje dwuniciowe pęknięcie DNA (DSB) zlokalizowane trzy nukleotydy przed sekwencją PAM1. DSB są naprawiane albo przez podatne na błędy ścieżki niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR). Aby osiągnąć precyzyjną edycję genów za pośrednictwem szlaku HDR, matryce dawców są często dostarczane w formacie plazmidowego DNA (pDNA) lub jednoniciowego oligodeoksynukleotydu (ssODN).
CRISPR/Cas9 i sgRNA mogą być dostarczane do komórek w trzech formatach: kompleks rybonukleoproteinowy (RNP) białka Cas9 i gRNA2,3; Cas9 mRNA i sgRNA4,5; lub plazmidowe DNA (pDNA), które zawiera niezbędne promotory, sterowane sgRNA i region kodujący Cas96,7,8. Wiele grup wykazało, że gdy CRISPR/Cas9 jest dostarczany jako RNP, wydajność edycji genów często przewyższa te osiągane w formatach pDNA lub mRNA, co można przypisać znacznie mniejszemu rozmiarowi RNP w porównaniu z kwasami nukleinowymi9. Co więcej, wykazano wcześniej, że nowatorska maszyna do elektroporacji lampowej (TE) jest szczególnie skuteczna w zastosowaniach związanych z edycją genów w kilku typach komórek9.
W niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku protokół wykorzystania TE do dostarczania CRISPR/Cas9 RNP do komórek ssaków różnych gatunków w kilku klinicznie istotnych loci. Ta nowatorska technika transfekcji TE i zjawisko wysokiego współczynnika HDR mogą znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach biomedycznych.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>792</td><td>Roztwór do odłączania komórek dla ludzkich komórek iPSC, po raz pierwszy użyty w kroku 1.1.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Nukleaza Cas9 3NLS</td><td>IDT</td><td>1074182</td><td>białko Cas9, po raz pierwszy użyte w kroku 3.3.&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965092</td><td>Do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyty w kroku 1.2.3.&nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>1708075</td><td>Do przygotowania hodowli komórkowej, po raz pierwszy użyty w kroku 1.2.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Lonza</td><td>51201</td><td>Do wytwarzania buforu do lizy, po raz pierwszy użyty w kroku 4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor do elektroporacji</td><td>Celetrix</td><td>13&ndash; 0104</td><td>Bufor do elektroporacji, po raz pierwszy użyty w kroku 3.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurki do elektroporacji</td><td>Celetrix</td><td>20 &mu; L: 12&ndash; 0107; 120 &mu; L: 12&ndash; 0104</td><td>Rurka do elektroporacji, po raz pierwszy użyta w kroku 3.4.&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Celetrix</td><td>CTX-1500A LE</td><td>Maszyna do elektroporacji rurkowej, po raz pierwszy użyta w kroku 3.5</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td>Do hodowli komórkowej, po raz pierwszy użyta w kroku 1.2.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Forma CO2 Inkubatory</td><td>Thermo Fisher</td><td>Model 370</td><td>Do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyty w kroku 1.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28115</td><td>Do oczyszczania żelu, po raz pierwszy użyty w kroku 4.3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ludzkie&nbsp; indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>ACS-1030</td><td>Ludzkie iPSC, po raz pierwszy użyte w kroku 1.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Sztuczna matryca zewnątrzkomórkowa; do wstępnego powlekania płytki do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyta w kroku 1.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>mTeSR 1 średni&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Bezkarmowe podłoże do hodowli komórkowych dla ludzkich iPSC, po raz pierwszy użyte w kroku 1.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR SV mini</td><td>GeneAll</td><td>103-102</td><td>Do oczyszczania produktu PCR, po raz pierwszy użyty w kroku 4.3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td>Do przygotowania hodowli komórkowej, po raz pierwszy użyty w kroku 1.2.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform fenolowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>15593031</td><td>Do ekstrakcji DNA, po raz pierwszy użyty w kroku 4.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Precyzyjny zestaw do syntezy gRNA</td><td>Invitrogen</td><td>A29377</td><td>Do generowania gRNA o pełnej długości (przewodnika RNA), po raz pierwszy użyty w kroku 2.4.&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór proteinazy K</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2548</td><td>Do ekstrakcji DNA, po raz pierwszy użyty w kroku 4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>Q5 polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0491</td><td>Do amplifikacji PCR, po raz pierwszy użyta w kroku 4.3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Do wytwarzania buforu do lizy, po raz pierwszy użyty w kroku 4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania TA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>K457502</td><td>Do sekwencjonowania klonów TA, po raz pierwszy użyty w kroku 4.4.&nbsp;</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych (10 cm)</td><td>FALCON</td><td>353003</td><td>Do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyte w kroku 1.2.3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowej (12 dołków)</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td>Do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyte w kroku 3.7.&nbsp;</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych (6 cm)</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td>Do hodowli komórkowych, po raz pierwszy użyte w kroku 1.2.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1757-500</td><td>Do wytwarzania buforu do lizy, po raz pierwszy użyty w kroku 4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td>Do trawienia komórek, po raz pierwszy użyty w kroku 1.2. 4.</td></tr> <tr><td>Uniwersalne końcówki do pipet&nbsp;</td><td>Celetrix</td><td>14-0101</td><td>Do elektroporacji, po raz pierwszy użyty w kroku 3.4.&nbsp;</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>LC Labs</td><td>Y-5301</td><td>Hibotor apoptozy, po raz pierwszy użyty w kroku 1.1.1.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Nukleazy edytujące geny, reprezentowane przez białko 9 (Cas9) związane z CRISPR, stają się głównymi narzędziami w badaniach biomedycznych. Pomyślne dostarczenie elementów CRISPR/Cas9 do komórek docelowych przez transfekcję jest warunkiem wstępnym skutecznej edycji genów. Protokół ten pokazuje, że dostarczanie rybonukleoproteiny (RNP) CRISPR/Cas9 za pośrednictwem elektroporacji lampowej (TE) za pośrednictwem elektroporacji (RNP) wraz z jednoniciowymi matrycami dawcy oligodeoksynukleotydu (ssODN) do różnych typów komórek ssaków, prowadzi do solidnych, precyzyjnych zdarzeń edycji genów. Po pierwsze, TE zastosowano do dostarczania CRISPR/Cas9 RNP i ssODN w celu wywołania mutacji powodujących chorobę w genie podjednostki gamma receptora interleukiny 2 (IL2RG) i genie reduktazy sepiapteryny (SPR) w komórkach fibroblastów królika. Osiągnięto dokładne wskaźniki mutacji wynoszące 3,57%-20%, jak określono za pomocą sekwencjonowania klonowania bakteryjnego TA. Ta sama strategia została następnie zastosowana w ludzkich iPSC na kilku klinicznie istotnych genach, w tym receptorze naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), białku C wiążącym miozynę, sercowym (Mybpc3) i podjednostce hemoglobiny beta (HBB). Konsekwentnie, bardzo precyzyjnie osiągano wskaźniki mutacji (11,65%-37,92%), jak określono za pomocą głębokiego sekwencjonowania (DeepSeq). Niniejsza praca pokazuje, że elektroporacja lampowa CRISPR/Cas9 RNP stanowi skuteczny protokół transfekcji do edycji genów w komórkach ssaków.

TE Cas9 RNP i ssODN do komórek fibroblastów królika
Ogólny proces dostarczania Cas9 RNP do komórek ssaków za pośrednictwem TE jest zilustrowany w Rysunek 1. Po pierwsze, mutacje C231Y i Q235X zostały wytworzone w genie IL2RG, a mutacja R150G została wytworzona w genie SPR w komórkach fibroblastów królika. Wiadomo, że mutacje powodujące utratę funkcji w genach IL2RG i SPR powodują odpowiednio pierwotny niedobór odporności11 oraz deficyty motoryczne i poznawcze12.
Konkretne projekty sgRNA są zilustrowane w Rysunek 2A. Startery stosowane do amplifikacji docelowych regionów są wymienione w Tabeli 3. Sekwencje ssODN przedstawiono w tabeli 1. Tempo edycji genów określono za pomocą klonowania bakteryjnego TA (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). W locus IL2RG C231, spośród 28 zsekwencjonowanych klonów, jeden (3,57%) był nosicielem dokładnej mutacji C231Y, cztery (14,28%) miały mutacje insercji lub delecji (indel), a pozostałe 23 (82%) były typu dzikiego. W locus IL2RG Q235, z 27 klonów, które zostały zsekwencjonowane, dwa (7,41%) były nosicielami dokładnej mutacji Q235X, trzy były nosicielami mutacji indel (11,11%), a pozostałe były typu dzikiego. W locus SPG R150, z 20 zsekwencjonowanych klonów, pięć (25%) było nosicielami dokładnej mutacji R150G, 10 (50%) było nosicielami mutacji indel, a pozostałe były typu dzikiego.</silna>
TE Cas9 RNP i ssODN do ludzkich iPSC
TE został następnie wykorzystany do dostarczenia Cas9 RNP i ssODN do ludzkich iPSC i celowania w klinicznie istotne loci w genach EGFR, Mybpc3 i HBB. Mutacje punktowe w regionie proksymalnym EGFR T790 nadają oporność na inhibitory kinazy tyrozynowej EGFR u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) z mutacjami aktywującymi EGFR13. Mutacja przesunięcia ramki odczytu w eksonie 16 w Mybpc3 jest związana z kardiomiopatią przerostową14. Mutacja punktowa E6V w genie HBB prowadzi do niedokrwistości sierpowatokrwinkowej15.
Konkretne projekty sgRNA są zilustrowane w Rysunek 3A. Startery stosowane do amplifikacji docelowych regionów są wymienione w Tabeli 3. Sekwencje ssODN przedstawiono w tabeli 1. Tempo edycji genów zostało określone przez DeepSeq (<silna klasa="xfig"> Rysunek 3B). W locus EGFR 15,68% alleli zawierało dokładne mutacje punktowe (6 315 odczytów), 22,75% było nosicielami mutacji indel (9 162 odczytów), a pozostałe 61,57% było typu dzikiego (24 797 odczytów). W locus Mybpc3 37,92% było nosicielami dokładnej delecji 4-bp TGAA (11 654 odczytów), 2,24% było nosicielami mutacji indel (410 odczytów), a pozostałe 59,84% było typu dzikiego (18 692 odczytów). W locus HBB 11,65% było nosicielami dokładnej mutacji E6V (6 565 odczytów), 23,35% było nosicielami mutacji indel (13 163 odczytów), a pozostałe 65% było typu dzikiego (36 644 odczytów).</silna>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig1.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 1: Schemat blokowy elektroporacji rurki Cas9 RNP.</silna>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Edycja genów komórek fibroblastów królika. (A) Ilustracja sekwencji docelowych. W polach zaznaczono docelowe loci. Podkreślone litery odpowiadają sekwencjom gRNA. Czerwone litery oznaczają sekwencje PAM. (B) Wyniki klonowania TA zdarzeń edycji genów. Ramki wskazują precyzyjnie zmutowane loci. Pokazana sekwencja indel jest reprezentatywna tylko dla jednego typu allelu. Inne sekwencje indel nie są pokazane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Edycja genów ludzkich iPSC. (A) Ilustracja sekwencji docelowych. W polach zaznaczono docelowe loci. Podkreślone litery odpowiadają sekwencji gRNA. Czerwone litery oznaczają sekwencje PAM. (B) Wyniki Deepseq zdarzeń edycji genów. Ramki wskazują precyzyjnie zmutowane loci. Czerwone litery oznaczają ciche mutacje, które zostały wprowadzone w szablonach dawcy. Pokazana sekwencja indel jest reprezentatywna tylko dla jednego typu allelu. Inne sekwencje indel nie są pokazane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Locus </td>
			<td colspan="8" rowspan="2">Sekwencja oligo 
			 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mutacja ukierunkowana)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Królik IL2RG (C231Y)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTATGGATGGGCTCAGCATTGGAGT 
			GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Królik IL2RG (Q235X)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGGGCTTAGCATTGGAGT 
			GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Królik SPR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">gacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtggaacatctcgtgctgtgccctgcctgcagccctcagcccttcaagggctggg 
			Biblioteka CGCTGTAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Czynnik chłodniczy R150G)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ludzki EGFR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">ACGTGATGGAGCGTGGACAACCCCCACGTGCCTGCTGCTGCCTCTCTCACCTCTCCAACTGATTACCCCC 
			AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAAGACAATATTGGCTCCCCCAGTACAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Mutacje punktowe bliskie T790)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ludzki Mybpc3</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGAGGACCAGCTGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT&lt;„br /&gt;
			GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(delecja 4 pz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ludzki HBB </td>
			<td colspan="8" rowspan="2">TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAACCTCAAACCATCAACCTCAAACCATGCATGACTCCTGTGGGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC 
			CTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E6V)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencje ssODNs. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>krok</td>
			<td>problem</td>
			<td>Możliwe przyczyny</td>
			<td>Rozwiązania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1</td>
			<td>Niska stopa indel</td>
			<td>Zła konstrukcja przewodnika RNA, zapasy przewodnika RNA &gt;6 miesięcy, niskie stężenie przewodnikowego RNA</td>
			<td>Przeprojektuj przewodnik RNA, wyprodukuj/zamów nowy przewodnik RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.3</td>
			<td>Niska sprawność PGE</td>
			<td>zły projekt DNA dawcy, niska wydajność przewodnika RNA, niewłaściwa ilość DNA dawcy lub niska jakość DNA</td>
			<td>Zwiększ długość ramienia homologii, wprowadź mutację PAM, wprowadź ciche mutacje do DNA dawcy, użyj bardziej wydajnego przewodnika RNA, zoptymalizuj stosunek białka Cas9 do prowadzącego RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.4</td>
			<td>Nieudana transfekcja</td>
			<td>Pęcherzyki powietrza powstające podczas przenoszenia mieszaniny ogniwo-bufor do rurki do elektroporacji, nieprawidłowe ustawienie napięcia/czasu trwania</td>
			<td>Staraj się unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza, dostosuj napięcie/ustawienie czasu trwania.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.6</td>
			<td>niska żywotność ogniw po elektroporacji</td>
			<td>Niska przeżywalność pojedynczego człowieka ipsc</td>
			<td>Dodaj inhibitor ROCK po elektroporacji, zwiększ liczbę komórek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1</td>
			<td>Nieudany PCR</td>
			<td>Wysoka zawartość GC lub powtarzająca się sekwencja</td>
			<td>Zoptymalizuj stan PCR, dodaj DMSO do systemu PCR.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Poradniki rozwiązywania częstych problemów. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa podkładu</td>
			<td>kolejność</td>
			<td>nuta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał Rb-IL2RG-F</td>
			<td>CATGACAGTGACAGGGTCCC powiedział:</td>
			<td rowspan="2">Do amplifikacji fragmentu DNA IL2RG królika</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rb-IL2RG-R</td>
			<td>TGCCAGAGACACAAGCGAAC</td> powiedział:
		</tr>
		<tr>
			<td>Rb-SPR-F</td>
			<td>GTACTTTGGAGGGACAGAGG</td> powiedział:
			<td rowspan="2">Do amplifikacji fragmentu DNA SPR królika</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RB-SPR-R</td>
			<td>CTCAGCACCCTGACACTGGG powiedział: CTCAGCACCCTGACACTGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-EGFR-F</td>
			<td>TGATGGCCAGCGTGGACAAC powiedział: TGATGGAGCGTGGACAAC</td> powiedział:
			<td rowspan="2">Do amplifikacji fragmentu ludzkiego DNA EGFR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-EGFR-R</td>
			<td>ACCAGTTGAGCAGGTACTGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-Mybpc3-F</td>
			<td>ATGCCCCGTGCTTCTGGAAC powiedział</td>:
			<td rowspan="2">Do amplifikacji ludzkiego fragmentu DNA Mybpc3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-Mybpc3-R</td>
			<td>TCAGGGGAGCCAACCCTCAT powiedział:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-HBB-F</td>
			<td>TAACCTTGATACCAACCTGC powiedział:</td>
			<td rowspan="2">Do amplifikacji ludzkiego fragmentu DNA HBB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-HBB-R</td>
			<td>CATTTGCTTCTGACACAACT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Podkłady użyte w kroku 4.3.

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Bezpieczne i skuteczne dostarczanie elementów Cas9 do komórek ma kluczowe znaczenie dla terapii opartych na edycji genów. Protokoły, które tutaj pokazujemy, prezentują nowatorskie podejście w tym kierunku. Protokół wykorzystuje nową metodę elektroporacji zwaną elektroporacją rurową.Prowadzi to do wysokich wskaźników przeżycia komórek, a także wskaźników edycji genów. Metoda elektroporacji rurkowej jest wolna od wirusów, leków i wzbogacania reporterowego. Są one preferowane w zastosowaniach klinicznych, a więc w terapiach opartych na edycji genów.Metoda ma uniwersalne zastosowanie do wielu typów komórek. Na przykład ludzkie komórki krwiotwórcze, pierwotne limfocyty T i inne komórki można edytować za pomocą naszej metody. Ta metoda elektroporacji rurkowej wykorzystuje cienką rurkę.Jeśli używasz go po raz pierwszy, możesz wypróbować GFP z ekspresją plazmidowego DNA. Procedurę zademonstruje Linyuan Ma, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pozyskać ludzkie iPSC z American Type Culture Collection.Hodowla iPSC na sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej z pożywką do hodowli komórkowych bez podawania w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, postępując zgodnie z instrukcjami dostawcy. Dwie godziny przed transfekcją potraktuj iPSC 10 mikromolową cewką zwijaną związaną z Rho zawierającą inhibitor kinazy białkowej Y-27632. Podczas transfekcji należy dysocjować iPSC z roztworem odłączającym komórki do pojedynczych komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie policz liczbę komórek. Aby ustalić hodowlę komórek fibroblastów królika, należy wykonać biopsję skóry ucha z czubka ucha królika. Dwukrotnie przepłukać tkankę DPBS zawierającym 5% penicyliny-streptomycyny.Przenieś wypłukaną tkankę ucha do nowego sześciocentymetrowego naczynia do hodowli tkanek i pokrój tkankę na małe kawałki, każdy o wymiarach około jeden na jeden milimetr. Dodaj kilka kropli FBS, aby zapobiec wysuszeniu tkanki. Następnie rozprowadź rozdrobnioną tkankę w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowych i dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do pięciu dni. Trzy do pięciu dni po posiewie użyj trypsyny-EDTA, aby trawić komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie policz liczbę komórek. Po zaprojektowaniu i zsyntetyzowaniu gRNA i oligonukleotydów donorowych, należy przygotować komórki zgodnie z wcześniejszym opisem.Ponownie zawiesić od 20 do 30 000 ogniw w 20 mikrolitrach buforu do elektroporacji. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. W przypadku transfekcji Cas9 RNP należy wstępnie wymieszać dwa mikrogramy białka Cas9 NLS z 0,67 mikrograma gRNA w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut.Delikatnie wymieszaj utworzony kompleks RNP z dwoma mikrogramami ssODN z komórkami. Za pomocą uniwersalnych końcówek do pipet z zestawu do elektroporacji przenieś mieszaninę komórek do rurki do elektroporacji o pojemności 20 mikrolitrów. Umieść rurkę do elektroporacji w szczelinie elektroporatora i naciśnij go, aby zakończyć.Pomyślny cykl elektroporacji jest sygnalizowany raportem impulsów na ekranie wyświetlacza elektroporatora. Po elektroporacji przenieś ludzkie komórki iPS na jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki zawierającej Y-27632, jak opisano wcześniej. Następnie umieść zawieszone komórki w jednym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli komórek.Kontynuuj hodowlę płytki, pamiętając o codziennej zmianie pożywki hodowlanej. Y-27632 usuwa się z pożywki hodowlanej iPSC dla ludzi 24 godziny po elektroporacji. 72 godziny po elektroporacji zbierz komórki.W przypadku komórek fibroblastów królika użyj trypsyny-EDTA do trawienia komórek z płytki hodowlanej. W przypadku ludzkich iPSC należy użyć roztworu do odrywania komórek, aby strawić komórki z płytek hodowlanych. Krótko odwirować próbki z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut i ponownie zawiesić komórki za pomocą 350 mililitrów buforu do lizy.Inkubować przez noc w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Następnego dnia ekstrahuj genomowe DNA za pomocą fenolu-chloroformu przy użyciu standardowych procedur. Amplifikuj od 100 do 200 par zasad fragmentów DNA z żeli za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu lub bezpośrednio z produktów PCR za pomocą mini zestawu PCR SV.Aby określić skuteczność edycji genów za pomocą sekwencjonowania kolonii bakteryjnych, należy użyć zestawu do klonowania TOPO-TA do ligacji oczyszczonych produktów PCR do wektora PCR4-TOPO. Losowo wybieraj klony bakteryjne i sekwencjonuj wstawki za pomocą uniwersalnego startera sekwencjonowania dostarczonego przez zestaw do klonowania TOPO-TA. Aby określić wydajność edycji genów poprzez głębokie sekwencjonowanie, należy wysłać wcześniej uzyskane oczyszczone produkty PCR do sekwencjonowania amplikonów CRISPR w rdzeniu sekwencjonowania DNA.W tym badaniu metoda elektroporacji rurkowej jest skutecznie stosowana do dostarczania CRISPR/Cas9 RNP i ssODN do komórek króliczych i ludzkich, co prowadzi do solidnej, precyzyjnej edycji genów. Po pierwsze, mutacje C231Y i Q235X są wytwarzane w genie IL2RG, a mutacja R150G jest wytwarzana w genie SPR w komórkach fibroblastów królika. Przedstawiono tutaj konkretne projekty sgRNA i szybkości edycji genów określone przez klonowanie bakteryjnej TA.Locus IL2RG C231, spośród 28 zsekwencjonowanych klonów, jeden jest nosicielem dokładnej mutacji C231Y, cztery są nosicielami mutacji insercji lub delecji, a pozostałe 23 są typu dzikiego. W locus IL2RG Q235, z 27 zsekwencjonowanych klonów, dwa są nosicielami dokładnej mutacji Q235X, trzy są nosicielami mutacji indel, a pozostałe są typu dzikiego. W locus SPG R150, z 20 zsekwencjonowanych klonów, pięć jest nosicielami precyzyjnej mutacji genu R150, 10 jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe są typu dzikiego.Elektroporacja rurkowa jest następnie wykorzystywana do dostarczania Cas9 RNP i ssODN do ludzkich iPSC i docelowych klinicznie istotnych loci w genach EGFR, Mybpc3 i HBB. W locus EGFR 15,68% alleli jest nosicielami mutacji punktowych, 22,75% jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe 61,57% to mutacje typu dzikiego. W locus Mybpc3 37,92% jest nosicielami precyzyjnej delecji TGAA z czterema parami zasad, 2,24% jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe 59,84% jest typu dzikiego.W locus HBB 11,5% jest nosicielami mutacji E6V, 35,4% jest nosicielami mutacji indel, a pozostałe 65% jest typu dzikiego. Cas9 RNP jest preferowaną formą Cas9 ze względu na jego mniejszy rozmiar w porównaniu z plazmidowym DNA. Elektroporacja lampowa jest skuteczną metodą dostarczania Cas9 RNP.Jesteśmy szczególnie zainteresowani wykorzystaniem elektroporacji lampowej Cas9 RNP w pierwotnych ogniwach T do zastosowań CAR T.

crisprcas9-ribonucleoprotein-mediated-precise-gene-editing-tube

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film demonstruje test do edycji genów w ludzkich limfocytach T przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Mieszanina pierwotnych limfocytów T CD4 + i CD8 + jest połączona z kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9, ukierunkowanym na określone geny w celu nokautu. Po elektroporacji sgRNA kieruje Cas9 do docelowej sekwencji DNA, tworząc precyzyjne cięcia. Cięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczny mechanizm łączenia końców komórki, co prowadzi do nokautu genu.

Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

Ten film demonstruje technikę genetycznej modyfikacji komórek NK za pośrednictwem rybonukleoproteiny Cas9. Rybonukleoproteina Cas9, składająca się z endonukleazy Cas9 związanej z przewodnikiem RNA (gRNA) utworzonego przez parowanie zasad CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującego crRNA (tracrRNA), jest wprowadzana do pierwotnych komórek NK za pomocą elektroporacji. Rybonukleoproteina atakuje i rozszczepia DNA gospodarza w miejscu docelowym, prowadząc do nokautu genu poprzez modyfikację genu...

Technika edycji genów w komórkach NK przy użyciu CRISPR Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Tutaj opisujemy narzędzie do edycji genomu oparte na czasowej i warunkowej stabilizacji zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego, krótkiego białka 9 (Cas9) związanego z powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) pod małą cząsteczką Shield-1. Metoda może być stosowana w przypadku hodowanych komórek i modeli zwierzęcych.

Nowy zestaw narzędzi do oceny funkcji genów za pomocą warunkowej stabilizacji Cas9

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj precyzyjną edycję genów CRISPR/Cas9 za pomocą elektroporacji rurkowej w komórkach ssaków. Ta metoda zapewnia wysoką przeżywalność komórek i efektywność edycji bez użycia wirusów i leków.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Przeglądaj więcej filmów