Name: Spektroskopia absorpcji atomowej do pomiaru wewnątrzkomórkowych rezerwuarów w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Poznaj spektroskopię absorpcji atomowej do pomiaru cynku w komórkach ssaków. Ta metoda umożliwia analizę homeostazy metali w różnych frakcjach podkomórkowych z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Nagrodę Naukowców ds. Różnorodności Wydziału od Szkoły Medycznej Uniwersytetu Massachusetts dla T.P.-B. N.N.-T. jest wspierany przez SEP-CONACYT, grant 279879. J.G.N jest wspierany przez National Science Foundation Grant DBI 0959476. Autorzy są wdzięczni dr Darylowi A. Bosco za dostarczenie linii komórkowej N2A oraz Danielli Cangussu za jej wsparcie techniczne.

1. Hodowla komórek ssaków
<ol>
	<li>Uwagi ogólne
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z technikami aseptycznymi dla hodowli komórek ssaków, które zostały wcześniej przejrzane38.</li>
		<li>Utrzymuj wszystkie linie komórkowe w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C. Warunki hodowli komórkowej różnią się w zależności od typu komórki. Ważne jest, aby utrzymać odpowiednie warunki hodowli dla każdej użytej linii komórkowej, ponieważ zmiany w tych procedurach doprowadzą do nieprawidłowych fenotypów i niepowodzenia hodowli komórkowej.</li>
		<li>Upewnij się, że jesteś zaznajomiony z interesującą Cię linią komórkową i postępuj zgodnie z protokołami dostarczonymi dla każdego typu komórki wybranego do określonych eksperymentów (patrz kilka przykładów poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogólna procedura trypsynizacji i przechodzenia przez przylegające komórki
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z płytki hodowlanej przez aspirację.</li>
		<li>Delikatnie umyj komórki za pomocą PBS bez wapnia i magnezu (5 ml na 10cm2 powierzchni hodowli). Dodaj roztwór myjący z boku płytki, aby uniknąć oderwania monowarstwy komórek; Zakręć płytką, aby zmaksymalizować pokrycie roztworu. W przypadku komórek nabłonkowych konieczne jest inkubowanie komórek przez 10 do 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C w PBS, aby ułatwić dysocjację komórek w kolejnych etapach.</li>
		<li>Usunąć roztwór myjący przez aspirację.</li>
		<li>Dodać wystarczającą ilość odczynnika dysocjacyjnego (0,25% trypsyny) do płytki (około 0,7 ml na 10 cm2). Delikatnie zakręć płytką, aby uzyskać pełne pokrycie monowarstwy komórek.</li>
		<li>Inkubuj kulturę w temperaturze pokojowej przez 2 do 5 minut. Rzeczywisty czas inkubacji różni się w zależności od użytej linii komórkowej, w przypadku komórek nabłonkowych zaleca się inkubację przez 10 do 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem oderwania komórek.</li>
		<li>Gdy większość komórek odłączy się, odzyskaj zawiesinę komórek w 5 ml wstępnie podgrzanego posiewu lub pożywki wzrostowej (poniżej znajduje się kilka przykładów). Mechanicznie dysocjuj grudki komórek, kilkakrotnie pipetując monowarstwę komórki.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować je przy 1 000 x g przez 2 do 5 minut. Szybkość i czas wirowania różnią się w zależności od typu komórki. Usuń pożywkę przez delikatne zasysanie, uważając, aby nie dotknąć osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy w 5 do 10 ml odpowiedniej, wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej i usunąć próbkę do policzenia za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
		<li>Wykorzystaj odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej, aby wysiać zalecaną gęstość dla każdej konkretnej linii komórkowej (poniżej znajduje się kilka przykładów). Uzupełnić odpowiednią ilością pożywki hodowlanej w zależności od wielkości naczynia hodowlanego i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pierwotne mioblasty pochodzące z mysich komórek satelitarnych
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem przygotuj płytki pokryte kolagenem do pierwotnego wzrostu mioblastów. Roztwór zawierający 0,02% kolagenu i 0,05 M kwasu octowego w wodzie dejonizowanej musi być sterylizowany przez filtrację za pomocą sterylnego urządzenia filtrującego 0,22 μm. Inkubować płytki hodowlane z roztworem kolagenu przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Następnego dnia odessać roztwór kolagenu, pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu w sterylnej szafce i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Minimalne objętości kolagenu to: dla 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 ml; 10 cm = 5 ml.</li>
		<li>Wysiewaj pierwotne mioblasty w 1 x 104 komórki/cm2 w 55 cm2 płytki hodowlane pokryte kolagenem. Pożywką proliferacyjną jest pożywka hodowlana Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 zawierająca 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 25 ng/ml rekombinowanego podstawowego fibroblastycznego czynnika wzrostu (FGF) i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. 
		UWAGA: Komórki proliferacyjne i wyjściowe powinny być utrzymywane poniżej 50% zręby. Kontakt z komórkami indukuje zaangażowanie komórek w różnicowanie miogeniczne i upośledza zdolności wzrostu hodowli.</li>
		<li>Aby różnicować pierwotne mioblasty, pozwól komórkom osiągnąć 80% do 100% zbieżności, co zwykle następuje po 48 godzinach posiewu. Następnie zmień na pożywki różnicujące (DMEM, 2% surowica końska, 1% insulina, transferyna, suplement selenu A i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny). Odświeżaj podłoże codziennie aż do zbiorów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mysi neuroblastoma (N2A)
	<ol>
		<li>Płytki N2A komórki o gęstości 2 x 104 komórki/cm2 w pożywce wzrostowej, zawierającej mieszaninę pożywki o obniżonej surowicy/DMEM zawierającej wysoką glukozę i L-glutaminę (1:1, v:v), suplement 10% FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. Utrzymuj kulturę zapasów poniżej 50% konfluencji.</li>
		<li>Indukuj różnicowanie komórek N2A, gdy zbieg osiągnie 25% do 40%. Zmienić na pożywkę różnicującą zawierającą mieszaninę pożywki o zmniejszonej surowicy/DMEM, 1% FBS i 20 μM kwasu retinowego przez 7 do 10 dni. Odświeżaj pożywkę co drugi dzień, aż do zbioru komórek. 
		UWAGA: W miarę różnicowania się komórek N2A niektóre komórki stają się okrągłe, łatwo się odklejają i mogą ulegać apoptozie. Zachowaj ostrożność podczas zasysania i dodawania pożywki hodowlanej do płytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3T3 L1 mysie preadipocyty
	<ol>
		<li>Utrzymuj mysie komórki 3T3 / L1 w DMEM o wysokim poziomie glukozy, uzupełnione 10% FBS i 100 U / ml penicyliny / streptomycyny. Proces adipogenny jest zależny od zbiegania się komórek; Dlatego nie pozwól, aby kultura podstawowa rosła powyżej 50% konfluencji, ponieważ wyższa konfluencja upośledza zdolność komórek do różnicowania.</li>
		<li>Umieść komórki w odległości 2 x 104 komórek/cm2. Przy tej gęstości komórki osiągną konfluencję w ciągu 3 dni.</li>
		<li>Indukuj różnicowanie adipogenne dwa dni po osiągnięciu przez komórki 100% zbieżności. Pożywka indukcyjna składa się z DMEM zawierającego 10% FBS, 10 μg/ml insuliny, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyksantyny, 1 μM deksametazonu i 10 μM troglitazonu.</li>
		<li>Po 48 godzinach inkubacji wymienić pożywkę indukcyjną na pożywkę różnicującą (DMEM zawierający 10% FBS i 5 μg/ml insuliny). Odświeżaj podłoże co drugi dzień, aż do zbiorów. Reprezentatywne próbki o pełnym zróżnicowaniu są zwykle pobierane między 7 a 10 dniem po indukcji adipogennej. 
		UWAGA: W miarę postępu adipogenezy komórki stają się okrągłe i mają tendencję do łatwego odklejania się. Zachowaj ostrożność podczas zasysania i dodawania pożywki hodowlanej do płytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogniwa MCF10A
	<ol>
		<li>Płytki komórek MCF10A w DMEM/F12 (1:1, v:v), uzupełnione 5% FBS, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 0,5 μg/ml hydrokortyzonu, 10 μg/ml insuliny i 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF). Zalecana gęstość wysiewu to 1 x 105 komórek/cm2. W tych warunkach komórki osiągną 100% konfluencję w ciągu 4 dni. Odświeżaj podłoże co 2 do 3 dni aż do zbiorów. 
		UWAGA: Ogniwa MCF10A są trudne do odłączenia. Zaleca się inkubację komórek przez 10 do 15 minut w temperaturze 37 °C w PBS wolnym od wapnia z 0,5 mM EDTA przed trypsynizacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki nerkowe psów Madin-Darby (MDCK)
	<ol>
		<li>Płytki komórki MDCK w DMEM uzupełnione 10% FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. Zalecana gęstość wysiewu to 1 x 105 komórek/cm2, gdzie komórki osiągną 100% zbieżność w ciągu 3 dni. Odświeżaj podłoże co 2 dni aż do zbiorów. 
		UWAGA: Ogniwa MDCK są trudne do odłączenia. Zaleca się inkubację komórek przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C w PBS wolnym od wapnia i magnezu przed trypsynizacją. Aby zapobiec zbrylaniu się komórek, nie należy mieszać płytek poprzez uderzanie lub potrząsanie kolbą w oczekiwaniu na oderwanie się komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki do hodowli komórek ssaków do AAS: frakcjonowanie całych komórek i subkomórkowych
<ol>
	<li>Hoduj interesujące komórki na 55 cm2 płytkach. Użycie mniejszych płytek hodowlanych może prowadzić do uzyskania próbek, w których poziom metali mieści się w granicach wykrywalności GF-AAS.</li>
	<li>Ekstrakt z całych komórek
	<ol>
		<li>Zassać pożywkę hodowlaną za pomocą pułapki próżniowej. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie ślady nośnika. Przepłucz komórki z żądanych punktów czasowych lub warunków hodowli trzykrotnie lodowatym PBS wolnym od wapnia i magnezu.</li>
		<li>Natychmiast zeskrobać komórki z płytki za pomocą nowego plastikowego skrobaka do komórek w 1 ml PBS wolnego od wapnia i magnezu. Przenieść próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 2 minuty przy 2 000 x g i odessać supernatant. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Przechowywać próbki granulek w temperaturze -20 °C lub przejść do kroku 2.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Frakcjonowanie subkomórkowe
	<ol>
		<li>Zassać pożywkę hodowlaną za pomocą pułapki próżniowej. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie ślady nośnika. Przepłucz komórki z żądanych punktów czasowych lub warunków hodowli trzykrotnie lodowatym PBS wolnym od wapnia i magnezu. Zeskrob komórki z płytki za pomocą 1 ml lodowatego PBS wolnego od wapnia i magnezu.</li>
		<li>Przenieść próbki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie. Wirować przez 10 s przy 10 000 x g. Kontynuować szybką izolację jąder, jeśli pożądana jest analiza metali frakcji cytoplazmatycznych i jądrowych. Ta procedura zminimalizuje potencjalną utratę metali w wyniku ekstrakcji komórek39,40.</li>
		<li>Usunąć supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 μl lodowatego PBS wolnego od wapnia i magnezu, zawierającego 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), niejonowego detergentu. Przenieść 100 μl do nowej probówki do mikrowirówki i traktować ją jako próbkę całej komórki. Podwielokrotność ta stanowi 25 % próby.</li>
		<li>Wyizolować jądra, pipetując zawiesinę komórek 5 do 10 razy na lodzie za pomocą końcówki do mikropipety P1000. Izolacja jąder komórek nabłonkowych wymaga stężenia 0,5 % NP-40. Osiągnij dysocjację komórek, przepuszczając zawiesinę komórkową przez igłę 26 3/4 G 10 do 15 razy, a następnie 10 do 15 przejść przez igłę 30 1/2 G. 
		UWAGA: Sprawdź integralność jąder za pomocą mikroskopii świetlnej przy użyciu obiektywu 40x.</li>
		<li>Pozostałą zawiesinę lizatu komórkowego (300 μl) odwirować przez 10 s przy 10 000 x g. Supernatant będzie zawierał frakcję cytozolową. Przenieść 300 μl do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Przepłukać osad zawierający frakcję jądrową w 500 μl PBS wolnym od wapnia i magnezu, zawierającym 0,1% NP-40, a następnie odwirować przez 10 s przy 10 000 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający jądra w 100 μl tego samego roztworu. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddać komórki lizie przez trzy cykle sonikacji (30 s wł./30 s wyłącz., przy 50 kHz, 200 W) przez 5 min. Określić ilościowo całkowitą zawartość białka w próbce za pomocą Bradford41.</li>
	<li>Przeprowadzić kontrolę jakości czystości frakcji metodą western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla frakcji jądrowej (histony, remodelery chromatyny, białka macierzy jądrowej) lub cytozolowej (β-tubulina, β-aktyna) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Nie używaj sonikatorów z metalową końcówką. Mogą one zanieczyścić próbkę metalami.</li>
</ol>
3. Analiza zawartości Zn w całych komórkach i subkomórkowych frakcjach kultur komórkowych ssaków za pomocą atomowej spektroskopii absorbancji
<ol>
	<li>Próbki kultur komórkowych (całe komórki lub frakcje jądrowe) należy mineralizować przez trawienie kwasowe przy użyciu równej objętości stężonego HNO3 klasy metali śladowych (UWAGA) przez 1 godzinę w temperaturze 80 °C, a następnie przez noc w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, dodając 30% objętości reakcyjnejH2O2. Doprowadzić objętość próbki do 500 μl za pomocą 18 MΩ oczyszczonej wody. 
	UWAGA: Obchodzenie się z HNO3 powinno odbywać się w okularach ochronnych przed chemikaliami, osłonie twarzy chroniącej przed rozpryskami, rękawicach i zatwierdzonej masce oddechowej, jeśli odpowiednia wentylacja (okap wyciągowy) nie jest dostępna. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przygotować roztwory wzorcowe i próbki doświadczalne do pomiarów Zn za pomocą AAS wyposażonego w piec grafitowy.
	<ol>
		<li>Użyć 2% (v/v) roztworu HNO3 w wodzie dejonizowanej, pochodzącego z tej samej partii, która jest używana do krzywej wzorcowej, co roztwór ślepej próby do kalibracji w całym tekście. Stosować wzorce czystości analitycznej rozcieńczone w wodzie oczyszczonej o mocy 18 MΩ.</li>
		<li>Przygotować wzorzec 1,000 ppb Zn z dostępnego w handlu roztworu podstawowego Zn 1,000 ppm z 2% (v/v) roztworem HNO3 w wodzie dejonizowanej. Przygotować robocze roztwory wzorcowe ze wzorca 100 ppb, rozcieńczając je do 5, 8, 10, 15, 20 i 25 ppb bezpośrednio 2% (v/v) roztworem HNO3 w wodzie dejonizowanej. Przygotować wzorce Zn i ślepą próbę z modyfikatorem matrycy 0,1% (1 g/l) Mg(NO3)2. 
		UWAGA: LOD Zn wynosi 0,01 ppb (μg/L). Zwiększając stężenie wzorców, granicę liniowości Zn wyznaczono na 20 ppb (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Pomiar wzorca i próbek w tych samych zoptymalizowanych warunkach: natężenie przepływu przy wprowadzaniu 250 ml/min, temperatura wtrysku 20 °C i temperatura GF 1 800 °C. 
		UWAGA: Temperatura GF została zwiększona do 2450 °C dla etapów czyszczenia, przed wstrzyknięciem nowej próbki lub wzorca.</li>
		<li>Zoptymalizuj lampę (C-HCL) do prądu 20 A, długości fali 213,9 nm i szczeliny 0,7 nm.</li>
		<li>Zmierzyć zmineralizowane próbki za pomocą krzywej wzorcowej Zn w celu określenia zawartości metalu. Ponieważ mierzone są małe objętości, próbki mogą odparować, jeśli pomiary trwają długo. Dlatego zaleca się dodawanie wody do próbek. Rozcieńczyć próbki oczyszczoną wodą o mocy 18 MΩ poddaną działaniu 0,01% HNO3 (czystości analitycznej), jeżeli uzyskane dane wykraczają poza granicę oznaczalności. 
		UWAGA: Zazwyczaj próbki rozcieńcza się do objętości 500 μl i umieszcza w automatycznym podajniku próbek AAS, który ma być mierzony zaraz po ustaleniu krzywej wzorcowej. Wymagana objętość powinna zostać określona przez użytkownika i powinna uwzględniać końcowe obliczenia stężeń. Zaleca się zakończenie oznaczania Zn za pomocą AAS całego eksperymentu za jednym razem. Wstrzymanie pomiarów może prowadzić do dużych różnic eksperymentalnych i niespójności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przelicz pomiary ppb na molowość uzyskaną z Zn mierzoną za pomocą AAS. Weźmy pod uwagę masę Zn (65,39 amu). Podziel ilość ppb uzyskaną przez AAS przez 63 390 000. W komórkach stężenia Zn wahają się od jednostek pmol do μmol.
	<ol>
		<li>Podzielić stężenie Zn (pmol lub μmol) przez początkową masę białka w próbce oznaczoną przez Bradforda (etap 2.4). W obliczeniach tych zostanie obliczona ilość metalu (pmol lub μmol Zn) zawartego w przypadającej na mg białka w próbce. 
		UWAGA: Ważne jest, aby wziąć pod uwagę współczynniki rozcieńczenia stosowane podczas oznaczania metali.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Spektroskopia absorpcji atomowej jest bardzo czułą metodą oznaczania ilościowego Zn w próbkach biologicznych o małej objętości/masie. Opisana optymalizacja pomiaru Zn sprawia, że zastosowanie tej metody jest proste i gwarantuje idealne warunki analityczne. Tutaj, za pomocą GF-AAS, określiliśmy stężenie Zn w całych komórkach oraz we frakcjach cytozolowych i jądrowych z różnych linii komórkowych. Wyniki pokazują, że technika ta jest porównywalna z technikami uzyskiwanymi za pomocą sond fluorescencyjnych i ICP-MS. Na przykł...

Metale przejściowe i ciężkie, takie jak Zn, Cu, Mn i Fe, występują naturalnie w środowisku zarówno w składnikach odżywczych w żywności, jak i w zanieczyszczeniach. Wszystkie żywe organizmy potrzebują różnych ilości tych mikroelementów; Jednak narażenie na wysokie poziomy jest szkodliwe dla organizmów. Pozyskiwanie metali odbywa się głównie poprzez dietę, ale metale mogą być również wdychane lub wchłaniane przez skórę1,2,3,4,5. Należy zauważyć, że obecność metali w cząsteczkach atmosferycznych wzrasta i w dużej mierze wiąże się z zagrożeniami dla zdrowia. Ze względu na działalność antropogeniczną w pyłach atmosferycznych, wodzie deszczowej i gleb><><ie wykryto podwyższony poziom metali ciężkich, takich jak Ag, As, Cd, Cr, Hg, Ni, Fe i Pb. Metale te mają potencjał, aby konkurować z niezbędnymi fizjologicznymi pierwiastkami śladowymi, w szczególności Zn i Fe, i wywołują efekty toksyczne poprzez inaktywację podstawowych enzymów procesów biologicznych.
Pierwiastek śladowy Zn jest redoks neutralny i zachowuje się jak kwas Lewisa w reakcjach biologicznych, co czyni go podstawowym kofaktorem niezbędnym do fałdowania białek i aktywności katalitycznej w ponad 10% białek ssaków8,9,10; w związku z tym jest niezbędny dla różnych funkcji fizjologicznych8,11. Jednak, podobnie jak w przypadku wielu pierwiastków śladowych, istnieje delikatna równowaga między tymi metalami, które ułatwiają normalne funkcje fizjologiczne i powodują toksyczność. U ssaków niedobory Zn prowadzą do niedokrwistości, opóźnienia wzrostu, hipogonadyzmu, nieprawidłowości skórnych, biegunki, łysienia, zaburzeń smaku, przewlekłych stanów zapalnych oraz upośledzenia funkcji immunologicznych i neurologicznych11,12,13,14,15,16,17,18. W nadmiarze, Zn jest cytotoksyczny i upośledza wchłanianie innych niezbędnych metali, takich jak miedź19,20,21.
Dodatkowo, niektóre metale, takie jak Cu i Fe, mogą potencjalnie uczestniczyć w szkodliwych reakcjach. Produkcja reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą chemii Fentona może zakłócać składanie białek klastra siarki żelaza i zmieniać metabolizm lipidów22,23,24. Aby zapobiec tym uszkodzeniom, komórki wykorzystują białka opiekuńcze i transportery wiążące metale, aby zapobiec skutkom toksycznym. Niewątpliwie homeostaza metali musi być ściśle kontrolowana, aby zapewnić, że określone typy komórek utrzymują odpowiedni poziom metali. Z tego powodu istnieje znaczna potrzeba udoskonalenia technik dokładnego pomiaru metali śladowych w próbkach biologicznych. W organizmach rozwijających się i dojrzałych istnieje zróżnicowane biologiczne zapotrzebowanie na pierwiastki śladowe na poziomie komórkowym, na różnych etapach rozwoju oraz w warunkach normalnych i patologicznych. Dlatego precyzyjne określenie tkankowych i ogólnoustrojowych poziomów metali jest niezbędne do zrozumienia homeostazy metali w organizmie.
Spektrometria absorpcji atomowej w piecu grafitowym (GF-AAS) jest bardzo czułą techniką stosowaną do małych objętości próbek, dzięki czemu idealnie nadaje się do pomiaru metali przejściowych i ciężkich obecnych w próbkach biologicznych i środowiskowych25,26,27,28. Ponadto, ze względu na wysoką czułość techniki, wykazano, że jest ona odpowiednia do badania właściwości transportu precyzyjnego ATPazy Na+/K+-ATPazy i żołądkowej H+/K+-ATPazy przy użyciu oocytów Xenopus jako systemu modelowego29. W GF-AAS rozpylone pierwiastki w próbce pochłaniają długość fali promieniowania emitowanego przez źródło światła zawierające interesujący nas metal, przy czym pochłonięte promieniowanie jest proporcjonalne do stężenia pierwiastka. Elementarne wzbudzenie elektronowe odbywa się po absorpcji promieniowania ultrafioletowego lub widzialnego w skwantowanym procesie unikalnym dla każdego pierwiastka chemicznego. W procesie jednoelektronowym absorpcja fotonu polega na tym, że elektron przemieszcza się z niższego poziomu energetycznego na wyższy poziom w atomie, a GF-AAS określa ilość fotonów pochłoniętych przez próbkę, która jest proporcjonalna do liczby pierwiastków pochłaniających promieniowanie rozpylonych w rurce grafitowej.
Selektywność tej techniki opiera się na strukturze elektronowej atomów, w której każdy pierwiastek ma określoną linię widmową absorpcji/emisji. W przypadku Zn długość fali absorbancji wynosi 213,9 nm i można ją precyzyjnie odróżnić od innych metali. Ogólnie rzecz biorąc, GF-AAS może być używany do ilościowego oznaczania Zn z odpowiednimi granicami wykrywalności (LOD) oraz wysoką czułością i selektywnością25. Zmiany pochłoniętej długości fali są integrowane i przedstawiane jako szczyty absorpcji energii na określonych i izolowanych długościach fal. Stężenie Zn w danej próbce oblicza się zwykle na podstawie krzywej wzorcowej znanych stężeń zgodnie z prawem Beera-Lamberta, w której absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia Zn w próbce. Jednak zastosowanie równania Beera-Lamberta do analiz GF-AAS również wiąże się z pewnymi komplikacjami. Na przykład różnice w atomizacji i/lub niejednorodne stężenia próbek mogą mieć wpływ na pomiary metalu.
Atomizacja metalu wymagana do analizy pierwiastków śladowych GF AAS składa się z trzech podstawowych kroków. Pierwszym krokiem jest desolwatacja, w której ciekły rozpuszczalnik jest odparowywany; pozostawienie suchych związków po osiągnięciu przez piec temperatury około 100 °C. Następnie związki są odparowywane poprzez podgrzanie ich od 800 do 1 400 °C (w zależności od analizowanego pierwiastka) i stają się gazem. Wreszcie związki w stanie gazowym są rozpylane w temperaturach od 1,500 do 2,500 °C. Jak omówiono powyżej, wzrost stężenia metalu będącego przedmiotem zainteresowania spowoduje proporcjonalny wzrost absorpcji wykrytej przez GF-AAS, jednak piec zmniejsza zakres dynamiczny analizy, który jest roboczym zakresem stężeń, które można określić za pomocą przyrządu. W związku z tym technika ta wymaga niskich stężeń i starannego wyznaczenia zakresu dynamicznego metody poprzez wyznaczenie LOD i granicy liniowości (LOL) prawa Beera-Lamberta. LOD jest minimalną ilością wymaganą do wykrycia substancji, zdefiniowaną jako trzykrotność odchylenia standardowego Zn w matrycy. LOL to maksymalne stężenie, które można wykryć za pomocą prawa Beera-Lamberta.
W tej pracy opisujemy standardową metodę analizy poziomów Zn w ekstraktach z całych komórek, frakcjach cytoplazmatycznych i jądrowych oraz w proliferujących i różnicujących się hodowanych komórkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Dostosowaliśmy protokół szybkiej izolacji jąder do różnych systemów komórkowych, aby zapobiec utracie metalu podczas przygotowywania próbki. Wykorzystane modele komórkowe to pierwotne mioblasty pochodzące z mysich komórek satelitarnych, mysie komórki nerwiaka zarodkowego (N2A lub Neuro2A), mysie adipocyty 3T3 L1, ludzka nienowotworowa linia komórek nabłonka piersi (MCF10A) oraz nabłonkowe komórki nerki psów Madin-Darby (MDCK). Komórki te zostały stworzone z różnych linii i są dobrymi modelami do badania specyficznych dla danej linii zmian poziomów metali in vitro.
Pierwotne mioblasty pochodzące z mysich komórek satelitarnych stanowią dobrze dopasowany model in vitro do badania różnicowania mięśni szkieletowych. Proliferacja tych komórek jest szybka, gdy są hodowane w warunkach wysokiej surowicy. Różnicowanie w linię mięśniową jest następnie indukowane przez warunki niskiej surowicy30. Linia komórkowa nerwiaka zarodkowego myszy (N2A) została wyprowadzona z grzebienia nerwowego myszy. Komórki te prezentują morfologię neuronalnych i ameboidalnych komórek macierzystych. Po bodźcu różnicującym komórki N2A wykazują kilka właściwości neuronów, takich jak neurofilamenty. Komórki N2A są używane do badania choroby Alzheimera, przerostu neurytów i neurotoksyczności31,32,33. Mysia linia komórkowa preadipocytów 3T3-L1 jest powszechnie stosowana do badania zmian metabolicznych i fizjologicznych związanych z adipogenezą. Komórki te mają morfologię podobną do fibroblastów, ale po pobudzeniu do różnicowania wykazują aktywację enzymatyczną związaną z syntezą lipidów i akumulacją trójglicerydów. Można to zaobserwować jako zmiany morfologiczne powodujące powstawanie cytoplazmatycznych kropelek lipidów34,35. MCF10A to nienowotworowa linia komórek nabłonka sutka pochodząca od kobiety przed menopauzą z chorobą torbielowatą sutka36. Jest szeroko stosowany w badaniach biochemicznych, molekularnych i komórkowych związanych z karcynogenezą sutka, takich jak proliferacja, migracja komórek i inwazja. Linia komórek nabłonkowych nerki psów Madin-Darby (MDCK) jest szeroko wykorzystywana do badania właściwości i zdarzeń molekularnych związanych z ustaleniem fenotypu nabłonkowego. Po osiągnięciu konfluencji, komórki te stają się spolaryzowane i tworzą zrosty komórka-komórka, cechy charakterystyczne tkanek nabłonkowych ssaków37.
Aby przetestować zdolność AAS do pomiaru poziomu Zn w komórkach ssaków, przeanalizowaliśmy całe i subkomórkowe frakcje (cytozol i jądro) tych pięciu linii komórkowych. Pomiary AAS wykazały różne stężenia Zn w tych typach komórek. Stężenia były niższe w proliferujących i różnicujących się pierwotnych mioblastach (od 4 do 7 nmol/mg białka) i wyższe w czterech ustalonych liniach komórkowych (w zakresie od 20 do 40 nmol/mg białka). Niewielki, nieistotny wzrost poziomu Zn wykryto w różnicowaniu pierwotnych mioblastów i komórek nerwiaka zarodkowego w porównaniu z komórkami proliferującymi. Odwrotny efekt wykryto w zróżnicowanych adipocytach. Jednak proliferujące komórki 3T3-L1 wykazywały wyższe stężenia metalu w porównaniu z komórkami zróżnicowanymi. Co ważne, w tych trzech liniach komórkowych frakcjonowanie subkomórkowe wykazało, że Zn jest różnie rozmieszczony w cytozolu i jądrze w zależności od stanu metabolicznego tych komórek. Na przykład w proliferujących mioblastach, komórkach N2A i preadipocytach 3T3-L1 większość metalu jest zlokalizowana w jądrze. Po indukcji różnicowania za pomocą określonych zabiegów komórkowych, Zn lokalizował się w cytozolu w tych trzech typach komórek. Co ciekawe, obie nabłonkowe linie komórkowe wykazywały wyższe poziomy Zn podczas proliferacji w porównaniu do osiągania konfluencji, w której utworzyła się charakterystyczna ciasna monowarstwa. W proliferujących komórkach nabłonkowych linia komórkowa sutka MCF10A miała równy rozkład Zn między cytozolem a jądrem, podczas gdy w linii komórkowej pochodzącej z nerki większość metalu znajdowała się w jądrze. W tych dwóch typach komórek, gdy komórki osiągnęły zbieg, Zn był głównie zlokalizowany w cytozolu. Wyniki te pokazują, że GF-AAS jest bardzo czułą i dokładną techniką przeprowadzania analizy pierwiastkowej w próbkach o niskiej wydajności. GF-AAS w połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i może być przystosowany do badania poziomów pierwiastków śladowych w różnych liniach komórkowych i tkankach.

<table><tbody><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1005706</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty Brg1 (G7)</td><td>Santa Cruz biotechnologies</td><td>sc-17796</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty b-tubuliny (BT7R)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA5-16308</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>Biorad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (DMEM)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana mieszanka pożywki Eagle's Eagle's (DMEM/F12)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastyczny czynnik wzrostu-zasadowy (FGF) (AA 10-155)</td><td>TermoFischer-Gibco</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (H2O2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen-A</td><td>ThermoFischer</td><td>51300044</td><td></td></tr><tr><td>Kwas azotowy (HNO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85125</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM (Zredukowane podłoże w surowicy)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>PureCol (kolagen)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retionowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1187</td><td></td></tr><tr><td>Troglitazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>648469-M</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Czysty (Zn) Czysty jednoelementowy wzorzec, 1 000 &mikro; g / ml, 2% HNO3</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300168</td><td></td></tr><tr><td>Established Cell Lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T3-L1</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>CL-173</td><td></td></tr><tr><td>MCDK</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>CRL-10317</td><td></td></tr><tr><td>N2A</td><td>American Opis Kolekcja kultur</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Atomic Absortion</td><td>PerkinElmer</td><td>Aanalyst 800</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagnode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr></tbody></table>

spektroskopia absorpcji atomowej do pomiaru wewnątrzkomórkowych rezerwuarów w komórkach ssaków

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Metale przejściowe są niezbędnymi mikroelementami dla organizmów, ale mogą być toksyczne dla komórek w wysokich stężeniach, konkurując z fizjologicznymi metalami w białkach i generując stres redoks. Stany patologiczne, które prowadzą do zubożenia lub akumulacji metalu, są czynnikami sprawczymi różnych chorób człowieka. Niektóre przykłady obejmują niedokrwistość, enteropatię akrodermitis oraz choroby Wilsona i Menkesa. Dlatego ważne jest, aby móc mierzyć poziomy i transport metali przejściowych w próbkach biologicznych z dużą czułością i dokładnością, aby ułatwić badania nad tym, w jaki sposób pierwiastki te przyczyniają się do normalnych funkcji fizjologicznych i toksyczności. Na przykład (Zn) jest kofaktorem w wielu białkach ssaków, uczestniczy w zdarzeniach sygnalizacyjnych i jest wtórnym przekaźnikiem w komórkach. W nadmiarze Zn jest toksyczny i może hamować wchłanianie innych metali, podczas gdy w niedoborze może prowadzić do różnych potencjalnie śmiertelnych stanów.

Spektroskopia absorpcji atomowej w piecu grafitowym (GF-AAS) zapewnia bardzo czułą i skuteczną metodę oznaczania stężeń Zn i innych metali przejściowych w różnych próbkach biologicznych. Atomizacja elektrotermiczna za pomocą GF-AAS określa ilościowo metale poprzez rozpylanie małych objętości próbek w celu późniejszej selektywnej analizy absorpcyjnej przy użyciu długości fali wzbudzenia pierwiastka będącego przedmiotem zainteresowania. W granicach liniowości prawa Beera-Lamberta absorbancja światła przez metal jest wprost proporcjonalna do stężenia analitu. W porównaniu z innymi metodami oznaczania zawartości Zn, GF-AAS wykrywa zarówno wolny, jak i skompleksowany Zn w białkach i ewentualnie w małych cząsteczkach wewnątrzkomórkowych z wysoką czułością w małych objętościach próbek. Co więcej, GF-AAS jest również łatwiej dostępny niż spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) lub fluorescencja rentgenowska oparta na synchrotronie. W metodzie tej opisano systematyczne przygotowanie próbek różnych hodowanych linii komórkowych do analiz w GF-AAS. Różnice w tym pierwiastku śladowym porównano zarówno w lizatach całych komórek, jak i we frakcjach subkomórkowych komórek proliferujących i zróżnicowanych jako dowód zasady.

Przetestowano zdolność GF-AAS do wykrywania śladowych poziomów Zn w komórkach ssaków (Rysunek 1). W tym celu hodowano pierwotne mioblasty pochodzące z komórek satelitarnych myszy oraz ustalone linie komórkowe N2A (pochodzące z neuroblastoma), 3T3 L1 (adipocyty), MCF10A (nabłonek piersi) i komórki MDCK (nabłonek nerki psa). Najpierw wyizolowano frakcje całokomórkowe, cytozolowe i jądrowe wszystkich tych typów komórek, a następnie oceniono czystość frakcji za p...

Hodowlane pierwotne lub ustalone linie komórkowe są powszechnie używane do rozwiązywania podstawowych problemów biologicznych i mechanistycznych jako wstępne podejście przed użyciem modeli zwierzęcych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przygotować ekstrakty z całych komórek i frakcje subkomórkowe do badań (Zn) i innych pierwiastków śladowych za pomocą atomowej spektroskopii absorbancji.

Spektroskopia absorpcji atomowej do pomiaru wewnątrzkomórkowych rezerwuarów w komórkach ssaków

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Rola metali przejściowych w rozwoju ssaków jest w dużej mierze niedoceniana. Pojawiające się dowody wskazują, że homeostaza metali nadal się zmienia w zależności od etapu rozwoju komórek i tkanek. Co więcej, specyficzne miejsca przeznaczenia komórkowe metali również różnią się pod względem różnorodności i oczywiście trudno jest określić ich lokalizację.Do tej pory opracowano różne techniki analityczne do ilościowego oznaczania metali, ale większość z nich jest droga lub niedostępna. Intensywne badania koncentrują się na poprawie oznaczania metali w bardziej dostępny i efektywny sposób. Atomowa spektroskopia absorpcyjna w piecu grafitowym, GF-AAS, ma dwie główne zalety.Zapewnia niskie granice wykrywalności, co pozwala na dokładną analizę śladowych ilości. Jest to również technika, która nie wymaga dużych objętości próbki, do przeprowadzenia analizy zwykle wystarczają mikrolitry roztworu. Połączenie tych dwóch zalet sprawia, że GF-AAS idealnie nadaje się do analizy pierwiastków śladowych w próbkach o małej objętości.Kilka stanów patologicznych u ludzi jest związanych z nierównowagą metali. Niektóre przykłady to niedokrwistość, acrodermatitis enteropathica oraz choroby Wilsona i Menkesa. Dlatego ważne jest opracowanie wydajnych i wiarygodnych metod pomiaru poziomów metali przejściowych w próbkach biologicznych z wysoką czułością i dokładnością.GF-AAS jest doskonałym przykładem technologii, która ułatwia oznaczanie dowolnego metalu w normalnych warunkach fizjologicznych oraz w przypadkach patogennych. Metoda jest bardzo wszechstronna. Może być stosowany do wielu systemów, a wiele elementów może być analizowanych za pomocą GF-AAS.Wyzwaniem jest ustalenie granicy wykrywalności metody w rzeczywistości, upewniając się, że próbki mieszczą się w tym limicie. Biorąc pod uwagę fakt, że objętość próbek jest niewielka, nie ma zbyt wiele miejsca na testy, dlatego od samego początku należy dokładnie zbadać dane. Po pierwszej analizie próbek musimy ustalić, jaki jest współczynnik rozcieńczenia potrzebny do doprowadzenia próbek do limitów wymaganych do oznaczania ilościowego.Upewnij się, że jesteś w stanie prawidłowo frakcjonować jądra przed udaniem się do AAS. Western blot jest zawsze dobrą walidacją przed analizą spektroskopową. Podczas gdy GF-AAS wymaga małych objętości, pule wewnątrzkomórkowe są już w małych ilościach.To daje niewiele miejsca na testy. Pierwsze pomiary muszą być dokładnie wykonane i zbadane, aby można było zminimalizować obróbkę próbki do zaledwie jednego współczynnika rozcieńczenia. Na początek hoduj interesujące Cię komórki na płytkach o powierzchni 55 centymetrów kwadratowych.Użyj pułapki próżniowej, aby zassać pożywkę hodowlaną. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie ślady nośnika. Użyj lodowatego PBS wolnego od wapnia i magnezu, aby trzykrotnie przepłukać komórki z pożądanych punktów czasowych lub warunków hodowli.Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do płytki i zeskrob komórki z płytki. Przenieś zawiesiny komórek do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i trzymaj ją na lodzie. Wirować przez 10 sekund w temperaturze 10 000 razy G i usunąć supernatant przez aspirację.Jeśli pożądana jest analiza metali frakcji cytoplazmatycznych i jądrowych, ponownie zawieś osad komórek w 400 mikrolitrach lodowatego PBS zawierającego 0,1% NP-40, niejonowy detergent. Przenieś 100 mikrolitrów do nowej probówki mikrowirówkowej jako próbkę całej komórki i przechowuj ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby wyizolować jądra, użyj końcówki do mikropipet P1000, aby pipetować zawiesinę komórek o objętości 400 mikrolitrów w górę i w dół od pięciu do 10 razy na lodzie.Następnie wyekstrahuj pięć mikrolitrów zawiesiny komórek i przenieś ją do szkiełka mikroskopowego. Umieść pięć mikrolitrów pod mikroskopem świetlnym za pomocą 40-krotnego obiektywu, aby zweryfikować integralność jąder. Odwirować pozostałą zawiesinę lizatu komórkowego o objętości 395 mikrolitrów przez 10 sekund po 10 000 razy G. Przenieść supernatant zawierający frakcję cytozolową do nowej probówki do mikrowirówki.Następnie dodać 500 mikrolitrów PBS zawierającego 0,1% NP-40, aby przepłukać osad frakcją jądrową i odwirować przez 10 sekund przy 10 000 razy G. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający jądra w 100 mikrolitrach tego samego roztworu. Aby poddać lizie komórki, należy użyć Bioruptora do sonikacji całej komórki i jąder zawierających roztwór trzy razy, każdy przez pięć minut. Przystąp do przeprowadzenia kontroli jakości czystości frakcji za pomocą western blot, stosując przeciwciała specyficzne dla frakcji jądrowej lub cytozolowej.Najpierw dodaj równą objętość stężonego kwasu azotowego klasy metalu śladowego do całej komórki, frakcji cytoplazmatycznych i jądrowych zawierających 100, 500 i 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej w 1,5 mililitrowych probówkach do mikrowirówek i umieść je w bloku termicznym w temperaturze 80 stopni Celsjusza w celu mineralizacji kultury komórkowej przez godzinę. Następnie wyjmij rurki z bloku termicznego i umieść je na stojaku, aby kontynuować trawienie kwasem przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Zatrzymaj reakcję, dodając 30% objętości próbki nadtlenku wodoru.Doprowadzić objętość próbki do 500 mikrolitrów za pomocą oczyszczonej wody o stężeniu 18 megaomów. Następnie w 15-mililitrowej probówce Falcon rozcieńczyć wzorcowy tlenek azotu klasy analitycznej w oczyszczonej wodzie o stężeniu 18 megaomów, aby przygotować dwuprocentowy objętościowo roztwór kwasu azotowego jako roztwór ślepy podczas kalibracji. Następnie użyj dwuprocentowego roztworu kwasu azotowego, aby rozcieńczyć dostępny w handlu roztwór podstawowy o stężeniu 1000 ppm o stężeniu 1000 części na miliard.Przygotować robocze roztwory wzorcowe z roztworu wzorcowego o stężeniu 1 000 części na milion, roztworu o stężeniu 1 000 części na miliard, a następnie rozcieńczyć je do 5, 8, 10, 15, 20 i 25 ppb bezpośrednio roztworem kwasu azotowego o stężeniu 2 % objętościowym. Umieść jeden mililitr 0,1% modyfikatora matrycy azotanu magnezu w polipropylenowych kubkach na próbki, a następnie załaduj kubki do karuzeli automatycznego podajnika próbek. Zaprogramuj spektrometr absorpcji atomowej tak, aby automatycznie dodawał pięć mikrolitrów modyfikatora matrycy do wzorców i ślepej próby.Ustaw ten sam zoptymalizowany warunek na spektrometrze absorpcji atomowej dla roztworów wzorcowych i próbek, z natężeniem przepływu wprowadzania na poziomie 250 mililitrów na minutę, temperaturą wtrysku 20 stopni Celsjusza i temperaturą pieca grafitowego osiągającą 1 800 stopni Celsjusza w czteroetapowych procesach. Wszystkie wzorce i próbki z jednego eksperymentu powinny być mierzone w tym samym czasie, aby uniknąć błędów spowodowanych różnicami w kalibracji lub parowaniem. Zoptymalizuj lampę C-HCL do prądu 20 amperów, długości fali 213,9 nanometra i szczeliny 0,7 nanometra.Pipetować próbki w polipropylenowych kubkach na próbki i umieszczać je w karuzeli automatycznego podajnika próbek. Dolna granica wykrywalności wynosi 0,01 części na miliard. Zwiększając stężenie wzorców, górną granicę wykrywalności określa się na 20 części na miliard.Po uzyskaniu krzywej wzorcowej zmierz zmineralizowane próbki w celu określenia zawartości metalu. Jeżeli uzyskane dane wykraczają poza granicę wykrywalności, należy rozcieńczyć próbki oczyszczoną wodą o stężeniu 18 megaomów potraktowaną 0,1% kwasem azotowym o czystości analitycznej. W tym protokole szybkiej izolacji jąder reprezentatywna plama zachodnia od różnicowania mioblastów pierwotnych świadczy o czystości frakcji subkomórkowych.Enzym remodelujący chromatynę Brg1 został użyty do identyfikacji frakcji jądrowej, a tubulina została użyta do identyfikacji frakcji cytozolowej. Rysunek ten przedstawia reprezentatywne mikrofotografie świetlne dla proliferujących i zróżnicowanych lub zlewających się monowarstw każdego typu komórek oraz odpowiadającą im zawartość w ekstraktach z całych komórek, frakcjach cytozolowych i jądrowych. Wszystkie linie komórkowe analizowane w tym badaniu wykazały stężenia w zakresie nanomolowym.Zróżnicowane pierwotne miorurki wykazywały wyższy poziom niż komórki proliferujące. Podobną subkomórkową dystrybucję wykryto w linii komórkowej N2A pochodzącej z nerwiaka zarodkowego. Z drugiej strony, ustalona linia komórkowa 3T3-L1 wykazywała wyższy poziom, gdy preadipocyty proliferowały niż wtedy, gdy były indukowane lub różnicowane.Komórki MCF10A wykazały równy poziom między frakcją cytozolową i jądrową w proliferujących komórkach. Gdy komórki MCF10A osiągną konfluencję, wykryto 40% spadek poziomu w całej komórce i stwierdzono, że metal jest najbardziej skoncentrowany we frakcji cytozolowej. Spektrometria absorpcji atomowej w piecu grafitowym jest bardzo czułą techniką pomiaru metali przejściowych i ciężkich w próbkach biologicznych i środowiskowych.Należy zachować szczególną ostrożność i czystość podczas przygotowywania frakcji subkomórkowych, ponieważ minimalne zanieczyszczenie prawdopodobnie zakłóci analizę ze względu na czułość sprzętu. Biorąc pod uwagę małe objętości i śladowe poziomy metali w każdym eksperymencie, trudno jest wymyślić lepszą i dokładniejszą technikę pomiaru niż GF-AAS. Nie ma obecnie technik, które mogłyby zapewnić limity wykrywalności i wymaganą małą objętość przy stosunkowo niskich kosztach GF-AAS.Atomowa spektrometria absorpcyjna w piecu grafitowym jest dokładna, czuła, opłacalna i dostępna. Ta technika analityczna będzie nadal ulepszana wraz z rozwojem technologii wykrywania pierwiastków. Przyszłe zastosowania do wykrywania i innych metali za pomocą GF-AAS będą obejmować narządy, tkanki uzyskane z modeli zwierzęcych oraz biopsje od pacjentów z chorobą związaną z ogólnoustrojowymi zaburzeniami równowagi metali.Kwas azotowy jest niezwykle kwasem, który może bardzo szybko spowodować poważne oparzenia chemiczne. Ta substancja chemiczna może również gwałtownie reagować z niektórymi związkami, takimi jak proszki metaliczne. Ze względu na zagrożenie stwarzane przez kwas azotowy ważne jest, aby podejmować ścisłe środki bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z kwasem azotowym.Podczas pracy z kwasem azotowym zdecydowanie zalecamy noszenie chemicznych okularów ochronnych, osłony twarzy chroniącej przed rozpryskami, rękawic i zatwierdzonego systemu oddychania parowego, jeśli wentylacja nie jest odpowiednia.

atomic-absorbance-spectroscopy-to-measure-intracellular-zinc-pools

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Prezentujemy technikę pomiaru z dużą precyzją proporcji izotopów w narządach myszy.

Precyzyjne pomiary izotopowe stosowane do narządów myszy

Przedstawiono protokół ekstrakcji białka opiekuńczego z peryplazmatycznego metalu przejściowego w kontekście jego natywnych partnerów wiążących, oraz biofizyczną charakterystykę zawartości jego substratu za pomocą fluorescencji rentgenowskiej i wychwytu radiometalu.

Niezbędny wychwyt metali przez bakterie Gram-ujemne: fluorescencja rentgenowska, radioizotopy i frakcjonowanie komórek

Ten artykuł szczegółowo wyjaśnia systematyczne podejście do oceny dostępności mikrominerałów w łososiu atlantyckim. Metodologia obejmuje narzędzia i modele o rosnącej złożoności biologicznej: (1) analizę specjacji chemicznej, (2) rozpuszczalność in vitro, (3) badania absorpcji w liniach komórkowych oraz (4) badania in vivo na rybach.

Ocena dostępności minerałów w paszach dla ryb przy użyciu metod uzupełniających zademonstrowanych na przykładzie w łososiu atlantyckim

Ten protokół opisuje konfigurację bioreaktora NMR w celu utrzymania żywotności zamkniętych komórek ludzkich przez okres do 72 godzin, po czym następuje czasowo-rozdzielcza akwizycja i analiza danych NMR w komórce. Metodologia ta jest stosowana do monitorowania wewnątrzkomórkowych oddziaływań białko-ligand w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego NMR w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o dużej gęstości komórek

Transport okazał się trudny do zmierzenia ze względu na słabe związki przyczynowo-skutkowe z funkcją białka i niską rozdzielczość czasową. Protokół ten opisuje metodę monitorowania, z wysoką rozdzielczością czasową, ekstruzji Zn2 + z żywych komórek przy użyciu wrażliwego barwnika fluorescencyjnego Zn2 +, zapewniając w ten sposób bezpośredni pomiar wypływu Zn2 +.

Charakterystyka transporterów u ssaków za pomocą testu transportu in vitro

Poniższe badanie ocenia profil toksykologiczny wybranego szkieletu metaloorganicznego za pomocą wykrywania impedancji ogniwa elektrycznego i substratu (ECIS), techniki badań przesiewowych w czasie rzeczywistym o wysokiej przepustowości.

Elektryczne wykrywanie podłoża komórkowego do oceny profili toksykologicznych struktury metaloorganicznej w czasie rzeczywistym

Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie pożywek o ograniczonym poziomie Zn2++, naczyń wzrostowych i kultur nasion do produkcji rybosomów z ograniczoną ilością Zn2+ w prątkach. Ślady Zn2+ prowadzą do wzrostu ograniczającego wzrost Zn2+ i opisujemy cechy morfogenne wykorzystywane jako bioindykatory do weryfikacji ograniczenia Zn2+ in vitro w modelowej bakterii Mycobacterium smegmatis i ludzkim patogenie M. tuberculosis.

Wykorzystanie Mycobacterium smegmatis jako biowskaźnika warunków wzrostu prątków ograniczonych oznaczeniem

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Poznaj spektroskopię absorpcji atomowej do pomiaru cynku w komórkach ssaków. Ta metoda umożliwia analizę homeostazy metali w różnych frakcjach podkomórkowych z wysoką czułością.

Spektroskopia absorpcji atomowej do pomiaru wewnątrzkomórkowych rezerwuarów w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów