Name: Wywoływanie wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę wywoływania wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy. Protokół obejmuje chirurgiczne narażenie miazgi zęba, analizę mikro-CT i histologię, umożliwiając badanie resorpcji kości i odpowiedzi immunologicznej in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Odedowi Heymanowi za pomoc w pozycjonowaniu zwierząt, Raphaelowi Lieberowi za pomoc w analizie mikro-tomografii komputerowej oraz prof. Andiarze De Rossi Daldegan za porady dotyczące przygotowania eksperymentu. Chcielibyśmy również podziękować dr Sidneyowi Cohenowi za krytyczną lekturę i redakcję.
Ta praca była wspierana przez grant z Dr. Izador I. Cabakoff Research Endowment Fund dla MK i IA, oraz stypendium Yitzhak Navon od izraelskiego Ministerstwa Nauki i Technologii dla EG.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Hebrajskiego (Etyka nr. MD-17-15093-5).
1. Znieczulenie i pozycjonowanie zwierząt
<ol>
	<li>Przygotuj sterylne roztwory zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Przygotować 5 ml 7 mg/ml ketaminy i 0,09 mg/ml medetomidyny rozcieńczonych w roztworze buforu fosforanowego (PBS)/soli fizjologicznej. </li>
		<li>Przygotować jałowy roztwór Atipamezolu (0,4 mg/ml) rozcieńczony w PBS/soli fizjologicznej (zaleca się przygotowanie ilości 5 ml).</li>
		<li>Przygotować jałowy roztwór mepiwakainy (7,5 mg/ml) rozcieńczony w PBS/soli fizjologicznej do znieczulenia miejscowego (jedna dostarczona fiolka mepiwakainy wystarcza na zapas 7,2 ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do eksperymentu użyj 6-8 tygodniowych samic myszy C57BL/6. Trzymaj zwierzęta w jednostce wolnej od określonych patogenów (SPF), ze standardową wodą i karmą dostarczaną przez obiekt oraz karmieniem zwierząt ad libitum.</li>
	<li>Zważyć myszy i wstrzyknąć dootrzewnowo (IP) objętość 10 μl na każdy gram wagi. Na przykład dla myszy ważącej 20 gramów 
	wstrzyknąć 200 μl roztworu ketaminy/medetomidyny. Daje to końcowe stężenie (70 mg/kg) ketaminy i (0,9 mg/kg) medetomidyny 
	dla każdego zwierzęcia.</li>
	<li>Aby zapobiec owrzodzeniu oka z powodu suchości podczas zabiegu, należy nałożyć maść do oczu zawierającą Chloramfenikol (5%) na oczy zwierząt w znieczuleniu. Utrzymuj zwierzęta w cieple za pomocą lampy, gdy są znieczulane. Sprawdź głębokość znieczulenia, sprawdzając odruch pedałowania (wykonywanie mocnego szczypania palca).</li>
	<li>Po znieczuleniu myszy należy ustawić mysz leżącą na prawym boku (dla praworęcznego badacza) na powierzchni z ekstrudowanej pianki polistyrenowej o zamkniętych komórkach i przymocować stopy do powierzchni za pomocą taśmy.</li>
	<li>Otwórz usta za pomocą małych gumek wokół siekaczy (1 dla górnych siekaczy i 1 dla dolnych siekaczy) utrzymywanych na miejscu za pomocą długich igieł wbitych w powierzchnię ekstrudowanej pianki polistyrenowej o zamkniętych komórkach.</li>
	<li>Cofnij prawy policzek za pomocą kleszczy przyklejonych do powierzchni. Używaj kleszczy, które są zamknięte w stanie ustalonym.</li>
	<li>Umieść powierzchnię z myszką w wygodnej pozycji roboczej umożliwiającej dostęp do zębów trzonowych żuchwy, przy użyciu odpowiedniego powiększenia (mikroskop dwuokularowy lub mikroskop kliniczny) i światła.</li>
	<li>Cofnij język za pomocą kleszczy lub szpatułki dentystycznej i wstrzyknij znieczulenie miejscowe igłą o rozmiarze 27 w fałd śluzówkowo-policzkowy przylegający do pierwszego zęba trzonowego żuchwy. Wystarczy 25-50 μl. Należy uwidocznić obrzęk tkanki wokół miejsca wstrzyknięcia.</li>
</ol>
2. Ekspozycja na miazgę
<ol>
	<li>Użyj okrągłego frezu dentystycznego 1/4 lub frezu diamentowego tego samego rozmiaru (zalecany jest długi trzpień) z prędkością 800 rund na minutę (obr./min), podłączonego do dowolnego odpowiedniego silnika dentystycznego (na przykład silnika z automatyczną redukcją momentu obrotowego (ATR)).</li>
	<li>Wywierć część okluzyjną pierwszego prawego zęba trzonowego żuchwy, aż rogi miazgi będą widoczne przez zębinę. Użyj krótkich impulsów silnika, aby zapobiec przegrzaniu obszaru.</li>
	<li>Użyj pilnika K lub pilnika H #8 lub #10, aby przekłuć miazgę i włóż pilnik do rogów miazgi (mezjalnej i dystalnej), łamiąc pokrywającą je zębinę. Pilniki są sterylizowane w autoklawie.</li>
	<li>Kontynuuj pracę z pilnikami wewnątrz miazgi tak głęboko, jak to możliwe, jednocześnie poszerzając otwory z pilnikami. Zwykle będzie widoczne krwawienie z miazgi.</li>
	<li>Upewnij się, że zaokrągliłeś ostre krawędzie zęba za pomocą zadzioru i usuń ząb z okluzji, aby zmniejszyć ból podczas eksperymentu. Oczyść zanieczyszczenia podczas zabiegu za pomocą mikroszczoteczki.</li>
	<li>Pozostaw ząb przeciwległy (lewy pierwszy ząb trzonowy żuchwy) jako kontrolę.</li>
</ol>
3. Zakończenie procedury klinicznej
<ol>
	<li>Uwolnić mysz ze stanu fiksacji i wstrzyknąć Atipamezole IP (10 μl na każdy gram masy ciała. Spowoduje to podanie ostatniej dawki (4 mg/kg) atipamezolu.</li>
	<li>Wstrzyknąć buprenorfinę rozcieńczoną w PBS/sól fizjologiczna (0,05 mg/kg) IP (zaleca się przygotowanie ilości 3 ml w dniu zabiegu). Zobacz Dyskusję, aby dowiedzieć się, dlaczego konieczne jest uśmierzanie bólu.</li>
	<li>Upewnij się, że zwierzęta dochodzą do siebie po znieczuleniu przed ich opuszczeniem. Podawaj im miękkie jedzenie, ponieważ mogą nie być w stanie jeść twardych pokarmów z powodu bólu zęba.</li>
</ol>
4. Obserwacja po zabiegu (42 dni)
<ol>
	<li>Przez pierwsze 3 dni po zabiegu należy zważyć zwierzęta i raz dziennie wstrzykiwać buprenorfinę (0,1 mg/kg) IP (zaleca się przygotowanie ilości 6 ml).</li>
	<li>W czasie trwania eksperymentu (42 dni, gdy narasta stan zapalny) monitoruj zwierzęta według wagi i ogólnej oceny behawioralnej 2-3 razy w tygodniu.</li>
	<li>Dostarczyć zwierzętom miękki pokarm w trakcie okresu obserwacji. Zwilż jedzenie wodą i umieść je w szalce Petriego na podłodze klatki.</li>
</ol>
5. Zakończenie i analiza eksperymentu
<ol>
	<li>Po 42 dniach11 obserwacji zakończone, znieczulenie zwierząt IP z ketaminą/ksylazyną w stężeniu 106,25 mg/kg ketaminy i 75 mg/kg ksylazyny (zalecany jest roztwór podstawowy 42,5 mg/ml ketaminy i 1,5 mg/ml ksylazyny w całkowitej objętości 2 ml) i zapobiec zwichnięciu szyjki macicy. 
	UWAGA: Istnieją różne opcje możliwych analiz w celu oceny stanu zapalnego20,21. W tym miejscu zostanie opisana analiza tkanki za pomocą mikrotomografii komputerowej i barwienie histologiczne.</li>
	<li>Po eutanazji użyj nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby wyciąć część szczęki, w tym 3 zęby trzonowe (osobno dla każdej kontroli leczonej i nieleczonej). Za pomocą kleszczy należy odkleić jak najwięcej tkanki miękkiej, pozostawiając na próbce głównie kość i zęby.</li>
	<li>Krótko opłucz tkankę w PBS, a następnie umieść ją w paraformaldehydzie (PFA) 4% (rozcieńczonym w PBS) na 24-48 godzin w celu utrwalenia. 
	UWAGA: Używaj PFA w okapie chemicznym i zgodnie z wytycznymi dotyczącymi karty charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS).</li>
	<li>Po 24-48 godzinach spłucz PBS 3x w celu wypłukania PFA.</li>
	<li>Mikrotomografia komputerowa
	<ol>
		<li>W celu analizy mikro-CT należy pobrać pobrane tkanki (część żuchwy wraz z 3 zębami trzonowymi, o wymiarach około 4 mm x 5 mm x 1 mm) do mikrotomografu komputerowego, umieścić je w probówce o średnicy 12 mm wypełnionej 1,5 ml PBS zorientowanej tak, aby powierzchnie policzkowe lub językowe zęba i korzenia leżały równolegle do dna rurki. Oddziel próbki gąbką i przykryj górną część probówki elastyczną folią.</li>
		<li>Otwórz panel skanowania i wybierz numer pomiaru. Wybierz plik kontrolny o następujących parametrach: energia 70 kV, natężenie 114 μA i rozdzielczość 6 μm3 woksel.</li>
		<li>Kliknij na widok zwiadowcy, a gdy pojawi się obraz, kliknij linię odniesienia i zaznacz obszar próbek do skanowania. Po każdej próbce kliknij przycisk dodaj skanowanie. Po zakończeniu oznaczania próbek przejdź do listy zadań i wybierz pozycję rozpocznij interakcję tasks. 
		UWAGA: Te same próbki można następnie wykorzystać do badania histologicznego. Ważne jest, aby nie wysychały podczas tomografii komputerowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj odpowiedniego programu komputerowego do wyrównania i analizy mikro-CT.
	<ol>
		<li>Otwórz próbkę na płaszczyźnie XY w ocenie mikro-CT. Wybierz trzy punkty na każdej próbce do wyrównania: 
		Zwężenie wierzchołkowe mezjalne — określa początek układu współrzędnych. 
		Część czołowa kanału mezjalnego - wyznacza punkt na osi Z. 
		Dystalne zwężenie wierzchołkowe - określa punkt na płaszczyźnie XZ.</li>
		<li>Użyj narzędzia pomiarowego na lewym panelu i narysuj linię prowadzącą do każdego punktu. Zdefiniuj każdy z trzech punktów za pomocą wartości X, Y i Z, tak jak jest ona wyświetlana w prawym panelu.</li>
		<li>Zdefiniuj obszar zainteresowania w próbce, wybierając zadanie w obszarze oceny μCT i kliknij Ocena 3D. Na ekranie pojawi się prostokąt i okno z wymiarami na oś. Dopasuj wymiary prostokąta, aby dopasować je do obszaru zainteresowania na osi XY, klikając w rogach środkowym przyciskiem myszy. Wybierz wymiary na osi Z, wstawiając pierwszy numer interesującego wycinka w kwadracie Z w obszarze VOI Start, a liczbę wycinków od pierwszego do ostatniego numeru interesującego wycinka w kwadracie Z w obszarze Dim.</li>
		<li>Kliknij aplikacje w menedżerze sesji i wybierz DECterm. Poczekaj kilka sekund, aż otworzy się okno, a następnie wpisz pięć kroków skryptu skośnego opisanych poniżej zgodnie z poniższymi instrukcjami (między wierszami kliknij enter): 
		ipl 
		isq_to_aim 
		AIM1</li> powiedział:
		<li>Skopiuj nazwę isq (pliku zainteresowania): wybierz widoki w obszarze menedżer sesji i kliknij microCTdata. Znajdź plik, nad którym pracujesz, i kliknij go środkowym przyciskiem myszy. Następnie kliknij środkowym przyciskiem myszy z powrotem w oknie DECterm.</li>
		<li>Wprowadź wartości X, Y i Z (ze spacją między nimi), które zostały określone w obszarze VOI podczas wybierania obszaru zainteresowania.</li>
		<li>Wprowadź wartości X, Y i Z (ze spacją między nimi), które zostały określone w trybie dim podczas wybierania obszaru zainteresowania.</li>
		<li>Poczekaj na otrzymanie komunikatu: isq do celowania completed. 
		(krok II - wyrównanie): 
		Wyrównaj Z 
		AIM1 
		cel2</li> powiedział:
		<li>Wprowadź wartości X, Y i Z (ze spacją między nimi), które zostały określone dla początku układu współrzędnych.</li>
		<li>Wprowadź wartości X, Y i Z (ze spacją między nimi), które zostały określone dla punktu na osi z.</li>
		<li>Wprowadź wartości X, Y i Z (ze spacją między nimi), które zostały wyznaczone dla punktu na płaszczyźnie XZ.</li>
		<li>Poczekaj na otrzymanie komunikatu: "align_Z zakończone" 
		(krok III - nagłówek): 
		nagłówek 
		AIM2 
		0 0 0 
		0 0 0</li>
		<li>Kliknij enter. 
		(krok IV- konwersja pliku z powrotem z aim do isq): 
		toisq 
		cel2</li> powiedział:
		<li>Skopiuj nazwę isq (pliku zainteresowania): wybierz widoki w obszarze menedżer sesji i kliknij dane microCT. Znajdź plik, nad którym pracujesz, i kliknij go środkowym przyciskiem myszy. Następnie kliknij środkowym przyciskiem myszy z powrotem w oknie DECterm. Wymaż (za pomocą "backspace") plik ". ISQ" na końcu pliku i napisz:"_new. ISQ", aby rozpoznać wyrównany plik.</li>
		<li>Kliknij Enter | wchodzić.</li>
		<li>Poczekaj na otrzymanie komunikatu: "toisq_from_aim zakończone" 
		(krok V-odwrócenie): 
		isq 
		ZA</li>
		<li>Skopiuj nową nazwę isq (pliku zainteresowania): wybierz widoki w obszarze menedżer sesji i kliknij dane microCT. Znajdź plik, nad którym pracujesz, i kliknij go środkowym przyciskiem myszy. Następnie kliknij środkowym przyciskiem myszy z powrotem w oknie DECterm.</li>
		<li>Kliknij Enter | wchodzić. Poczekaj na otrzymanie komunikatu: "isq_to_aim zakończone" 
		flip 
		a 
		aa 
		zx 
		Poczekaj na otrzymanie komunikatu: "flip_aim zakończone" 
		od 
		Aa</li>
		<li>Skopiuj nową nazwę isq: wybierz widoki w obszarze menedżer sesji i kliknij dane microCT. Znajdź plik, nad którym pracujesz, i kliknij go środkowym przyciskiem myszy. Następnie kliknij środkowym przyciskiem myszy z powrotem w oknie DECterm. Wymaż (za pomocą "backspace") plik ". ISQ" na końcu pliku i napisz: "_flip. ISQ", aby rozpoznać wyrównany plik.</li>
		<li>Poczekaj na otrzymanie komunikatu: "from_aim_to_isq zakończone"</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kształtowego
	<ol>
		<li>Wybierz wycinek, który reprezentuje w przybliżeniu środek zęba, w którym prezentowana jest miazga koronalna, miazga korzeniowa obu kanałów i oba otwory wierzchołkowe.</li>
		<li>Ręcznie zaznacz interesujący Cię kontur na środkowym wycinku, klikając lewy górny panel konturowy - zaczynając od dystalnego punktu dystalnego wierzchołka korzenia, zaznacz granicę wierzchołkową koronalnie do nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich obszaru wierzchołkowego, przez mezjalną granicę wierzchołka korzenia mezjalnego po dystalnej granicy korzenia mezjalnego i mezjalnej granicy korzenia dystalnego przez obszar furkacji (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3 II, Rozdział IV).</li>
		<li>Skopiuj ten kontur (Ctrl+C, Ctrl+V) i dostosuj go odpowiednio do 5 plasterków umieszczonych po obu stronach środkowego plasterka.</li>
		<li>Aby obliczyć objętość tkanki konturu zaznaczonego dla każdej próbki, wybierz zadanie w sekcji Ocena μCT i kliknij Ocena 3D. W oknie oceny 3D kliknij wybierz obok zadania i wybierz filtr, aby obliczyć objętość tkanki (TV).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>histologia
	<ol>
		<li>Po usunięciu tkanek z mikrotomografu komputerowego należy odwapnić tkanki, umieszczając każdą próbkę w probówce mikrowirówkowej z 1 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) 0,5 M pH 8,0 na 10 dni. Zmieniaj roztwór EDTA co 3 dni.</li>
		<li>Odwodnienie: Umieść próbki w kasetach histologicznych i w rosnących stężeniach etanolu, po godzinie każda, w następujący sposób: 70% etanolu (w tym momencie proces można zatrzymać na kilka tygodni, o ile próbki są przechowywane w etanolu), 90% etanolu 2x, 100% etanolu 2x, ksylenu 2x (uwaga: używaj ksylenu w kapturze chemicznym i zgodnie z jego wytycznymi MSDS).
		<ol>
			<li>Przenieś kasety do ciekłej parafiny (60 °C) i pozostaw na noc w okapie chemicznym do odparowania ksylenu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Blokowanie: Użyj histologicznej maszyny blokującej, aby zanurzyć próbki w parafinie. Należy uważać, aby osadzić je we właściwej pozycji (tj. korona i korzenie powinny być ustawione równolegle do dolnej części formy, w taki sposób, aby ząb "leżał") w celu uzyskania odcinków strzałkowych. Próbki są teraz gotowe do cięcia za pomocą mikrotomu.</li>
		<li>Cięcie skrawków: Zacznij od krojenia grubych plastrów o grubości ~20 μm, aż dotrzesz do odpowiedniej części tkanki. Po rozpoznaniu dowolnej części zęba (korony lub korzeni) zmień na odcinki 6 μm i zmień kąt cięcia zgodnie z poprzednim rozdziałem.
		<ol>
			<li>Na przykład, jeśli poprzednia sekcja obejmowała koronę, ale nie korzenie, zmień kąt bloku w mikrotomie tak, aby korzenie zbliżały się do noża, a korona cofała się (części zęba można rozpoznać gołym okiem na samym bloku).</li>
			<li>Kontynuuj regulację kąta, aż uzyskasz przekroje strzałkowe, w tym miazgę czołową i korzeniową oraz otwór wierzchołkowy. Pokrój w tej orientacji jak najwięcej plasterków, aż odpowiednia tkanka zostanie przecięta.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby zapoznać się z protokołami barwienia (np. barwienie hemotoksyliną i eozyną (H&E), barwienie Browna i Brenna, barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian (TRAP), immunohistochemia), zobacz20,21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IL-6+on+apical+periodontitis%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Endodontics+Journal%22%5BJournal%5D)">The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review.</a> International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).</li>
<li>Marton, I. J., Kiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+protective+and+destructive+regulatory+pathways+in+apical+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endodontics%22%5BJournal%5D)">Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis.</a> Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).</li>
<li>Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+apical+periodontitis%3A+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Research%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1(2012).</li>
<li>Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+Associated+with+Apical+Periodontitis%3A+A+Multilevel+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endodontics%22%5BJournal%5D)">Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis.</a> Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).</li>
<li>Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+immunoglobulin-synthesizing+cells+in+human+dental+periapical+lesions+by+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+Medicine%22%5BJournal%5D)">Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry.</a> Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).</li>
<li>Lin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterococcus+faecalis+lipoteichoic+acid+regulates+macrophages+autophagy+via+PI3K%2FAkt%2FmTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Community%22%5BJournal%5D)">Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway.</a> Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).</li>
<li>Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Lipoxygenase+Knockout+Aggravated+Apical+Periodontitis+in+a+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model.</a> Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).</li>
<li>Barreiros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+mRNA+expression+of+RANK%2C+RANKL%2C+OPG%2C+TLR2+and+MyD88+during+apical+periodontitis+progression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice.</a> Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512(2018).</li>
<li>Barreiros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP2+and+MMP9+are+Associated+with+Apical+Periodontitis+Progression+and+Might+be+Modulated+by+TLR2+and+MyD88%5BTitle%5D)+AND+%22Brazillian+Dentistry+Journal%22%5BJournal%5D)">MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88.</a> Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).</li>
<li>Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR-2+reduces+while+combined+VEGFR-2+and+-3+signaling+increases+inflammation+in+apical+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis.</a> Journal of Oral Microbiology. 8, 32433(2016).</li>
<li>De Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cementocytes+Express+Receptor+Activator+of+the+Nuclear+Factor+Kappa-B+Ligand+in+Response+to+Endodontic+Infection+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endodontics%22%5BJournal%5D)">Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice.</a> Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).</li>
<li>Rider, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+CD14+%28Cluster+of+Differentiation+14%29+and+Toll-Like+Receptor+%28TLR%29+4+Signaling+Deteriorate+Periapical+Inflammation+in+TLR2+Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+Records+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice.</a> Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).</li>
<li>Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+hypertension+and+periapical+lesion%3A+an+in+vitro+and+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brazillian+Oral+Research%22%5BJournal%5D)">Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study.</a> Brazillian Oral Research. 30 (1), e78(2016).</li>
<li>Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Periapical+Diseases+in+Medication-Related+Osteonecrosis+of+the+Jaws%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research+International%22%5BJournal%5D)">Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws.</a> Biomedical Research International. 2017, 1560175(2017).</li>
<li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preexisting+Periapical+Inflammatory+Condition+Exacerbates+Tooth+Extraction-induced+Bisphosphonate-related+Osteonecrosis+of+the+Jaw+Lesions+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endodontics%22%5BJournal%5D)">Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice.</a> Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+Preconditioning+Enhances+Dental+Pulp+Stem+Cell+Therapy+for+Infection-Caused+Bone+Destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction.</a> Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).</li>
<li>Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sodium+sulfate+colitis+murine+model%3A+An+indispensable+tool+for+advancing+our+understanding+of+inflammatory+bowel+diseases+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).</li>
<li>Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+animal+models+for+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunopharmacology+and+Immunotoxicology%22%5BJournal%5D)">Experimental animal models for rheumatoid arthritis.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).</li>
<li>Shah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clastic+cells+are+absent+around+the+root+surface+in+pulp-exposed+periapical+periodontitis+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Disease%22%5BJournal%5D)">Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice.</a> Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).</li>
<li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP9+deficiency+increased+the+size+of+experimentally+induced+apical+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endodontics%22%5BJournal%5D)">MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis.</a> Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).</li>
<li>Bezerra da Silva, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88+knockout+mice+develop+initial+enlarged+periapical+lesions+with+increased+numbers+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22International+Endod+Journal%22%5BJournal%5D)">MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils.</a> International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).</li>
<li>Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Apical+Periodontitis%3A+Emerging+Role+of+Epigenetic+Regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators.</a> Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).</li>
<li>Metzger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+periapical+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Endodontics+Dentisrty+and+Traumatology%22%5BJournal%5D)">Macrophages in periapical lesions.</a> Endodontics Dentisrty and Traumatology. 16 (1), 1-8 (2000).</li>
<li>Lungova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth-bone+morphogenesis+during+postnatal+stages+of+mouse+first+molar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development.</a> Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).</li>
<li>Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+local+anaesthesia+on+anaesthetic+requirements+for+feline+ovariectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy.</a> Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).</li>
<li>Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preemptive+analgesia+and+local+anesthesia+as+a+supplement+to+general+anesthesia%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+Progress%22%5BJournal%5D)">Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review.</a> Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).</li>
<li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Direct+Pulp-capping+Model+for+the+Evaluation+of+Pulpal+Wound+Healing+and+Reparative+Dentin+Formation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentalization%22%5BJournal%5D)">Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice.</a> Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).</li>
<li>Yoneda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+root+canal+treatment+model+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a root canal treatment model in the rat.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3315(2017).</li>
<li>AlShwaimi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+in+mouse+periapical+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endodontics%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells in mouse periapical lesions.</a> Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Wprowadzono tutaj metodę indukcji wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy. Celem metody jest wykorzystanie stanu wierzchołkowego zapalenia przyzębia do zbadania mechanizmów i konsekwencji tego procesu zapalnego. Zapalenie przyzębia wierzchołkowego wywołano u myszy w wieku 6-8 tygodni, w wieku, w którym korzenie są w pełni rozwinięte24 lata. W celu wywołania wierzchołkowego zapalenia przyzębia w tym modelu, miazga zęba zęba trzonowego żuchwy myszy jest odsłaniana za pomocą wiertła ...

Celem tej metody jest wywołanie wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy poprzez zanieczyszczenie wierzchołka naturalną mikroflorą, a następnie zbadanie różnych cech tego patologicznego procesu.
Zapalenie przyzębia wierzchołkowego (AP) jest powszechną patologią o charakterze zapalnym w tkankach przyzębia otaczających korzeń zęba. Ta choroba zębów może powodować silny ból i musi być leczona przez dentystę. Opcje leczenia obejmują leczenie kanałowe (pierwotne lub wtórne), chirurgię endodontyczną, ekstrakcję zęba lub obserwację w zależności od wyników klinicznych i radiologicznych oraz opinii lekarza. Mechanizm tego procesu zapalnego, choć badany przez kilka dziesięcioleci1,2,3, nadal nie jest w pełni poznany. Biorąc pod uwagę powagę tej patologii, istnieje zatem wyraźna potrzeba badań nad jej fundamentalnym charakterem. W związku z tym systemy, w których możliwe jest badanie AP, cieszą się dużym zainteresowaniem naukowym.
Ponieważ AP jest złożonym procesem patologicznym obejmującym lokalne tkanki i układ odpornościowy, badania in vitro są niewystarczające do pełnego zrozumienia tych procesów. Badania próbek klinicznych tej choroby są również problematyczne ze względu na ograniczenia etyczne i znaczną zmienność między różnymi osobami i różnymi etapami klinicznymi4,5, a co za tym idzie konieczność modeli in vivo. Modele te opierają się na koncepcji wystawiania miazgi zębowej na zanieczyszczenie i obserwacji reakcji zapalnej organizmu na ten bodziec w tkankach okołowierzchołkowych6,7. Typowe modele in vivo obejmują gryzonie lub większe zwierzęta, takie jak psy. Pomimo wyzwania klinicznego w leczeniu myszy, które są bardzo małymi zwierzętami z miniaturowymi zębami, zalety modelu mysiego są znaczące: praktycznie praca z myszami jest technicznie prosta pod względem udogodnień i jest najbardziej opłacalna, a naukowo mysz jest dobrze zbadanym modelem zwierzęcym z łatwo dostępnymi narzędziami genetycznymi i molekularnymi oraz dobrze zbadanym genomem. Rzeczywiście, w poprzednich badaniach wykorzystano model mysi do badania sygnałów stanu zapalnego i resorpcji kości oraz komórek zaangażowanych w wierzchołkowe zapalenie przyzębia8,9,10,11. W związku z tym potrzebny jest jasny protokół dotyczący wykorzystania modelu mysiego do badania AP. Tutaj opisujemy taki protokół.
Opisany tutaj protokół ma tę dużą zaletę, że jest odpowiedni do badania myszy z nokautem (KO) i dowiaduje się, jak brak określonego genu wpływa na stan zapalny zębów7,12. Inne przydatne zastosowania tego protokołu obejmują badanie wpływu leków i schorzeń ogólnoustrojowych na rozwój wierzchołkowego zapalenia przyzębia13, wpływ wierzchołkowego zapalenia przyzębia na rozwój martwicy kości szczęk14,15 oraz terapia komórkami macierzystymi do regeneracji kości16.
Ten protokół może być również uogólniony jako model do badania miejscowego stanu zapalnego. Aby zbadać proces zapalny, opracowano kilka modeli myszy, które obejmują na przykład indukowane zapalenie jelita grubego lub zapalenie stawów17,18. Modele te mają działanie ogólnoustrojowe i nie mają wbudowanej kontroli u tego samego zwierzęcia. Modele indukowanego wierzchołkowego zapalenia przyzębia, które obejmują kontrolę przeciwległą bez stanu zapalnego, mają tę zaletę, że pozwalają przezwyciężyć te ograniczenia14,19.
Protokół opisany poniżej jest zatem przydatny dla badaczy, którzy są zainteresowani miejscowymi procesami zapalnymi. Kontrolowany charakter tego zapalenia, jego ograniczenie do określonego miejsca i kontralateralny ząb kontrolny sprawiają, że protokół ten jest cenny dla badania mechanizmów zaangażowanych w ten proces. Ponadto protokół jest przydatny dla badaczy zainteresowanych klinicznymi aspektami zapalenia okołowierzchołkowego. Model mysi jest idealny do badania różnych zmiennych choroby, oprócz korzyści płynącej z możliwości łatwego wykonywania manipulacji genetycznych w modelu mysim, w celu zbadania aktywności określonych genów w zapaleniu okołowierzchołkowym.
Technicznie, procedura kliniczna jest trudna do przeprowadzenia ze względu na małe wymiary zębów myszy. Korzystne będzie zobrazowanie tej procedury, aby dowiedzieć się o pozycjonowaniu, potrzebnym sprzęcie i wydajności.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek atypamezolu</td><td>Eurovet Animal Health</td><td>CAS 104075-48-1</td><td></td></tr><tr><td>ATR</td><td>dentsply</td><td>tecnika</td><td></td></tr><tr><td>maszyna blokująca</td><td>Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina</td><td>vetmarket</td><td>163451</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop kliniczny/lornetka</td> wiertło dentystyczne <td>Olympus</td><td>Sz61</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Komet dental</td><td>ZR8801L 315 008</td><td></td></tr><tr><td>szpatułka dentystyczna</td><td>Premier</td><td>1003737</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T Baker</td><td>8993</td><td></td></tr><tr><td>entelan</td><td>rtęć</td><td>1.07961</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór eozyny Y, alkoholowy</td> roztwór <td>HT110116</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hematoksyliny SIGMA, Mayer's</td><td>SIGMA</td><td>MHS 16</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek</td> <td>ketaminyVetoquinol</td><td>CAS 1867-669</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek medetomidyny (cepetor)</td><td>CP-pharma GmbH</td><td>CAS 86347-15-1</td><td></td></tr><tr><td>Mepiwakaina HCl 3%</td><td>Teva</td> Mikroszczotki <td>CAS 96-88-8</td><td></td></tr><tr><td>- regulowane aplikatory precyzyjne</td><td>PARKELL</td><td>S379</td><td></td></tr> skaner <tr><td>mikro-ct</td><td>scanco</td><td>uCT 40</td><td></td></tr><tr><td>parafin</td><td>Leica</td><td>39602004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu z chloramfenikolem (5%)</td><td>Pęseta Rekah pharmaceutical</td><td>CAS 56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>WAM</td><td></td><td>Ref-CT</td><td></td></tr><tr><td>ksylazyna</td><td>Eurovet Zdrowie zwierząt</td><td>CAS 7361-61-7</td><td></td></tr><tr><td>ksylen</td><td>Gadot</td><td>CAS 1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

wywoływanie wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy

Inducing Apical Periodontitis in Mice

Mechanizmy związane z miejscowym indukowanym stanem zapalnym mogą być badane za pomocą kilku dostępnych modeli zwierzęcych. Jednym z nich jest indukcja wierzchołkowego zapalenia przyzębia (AP). Zapalenie przyzębia wierzchołkowego jest powszechną patologią o charakterze zapalnym w tkankach przyzębia otaczających korzeń zęba. Aby lepiej zrozumieć naturę i mechanizm tej patologii, korzystne jest wykonanie zabiegu na myszach. Indukcję tego zębopochodnego zapalenia uzyskuje się poprzez wiercenie w zębie myszy, aż do odsłonięcia miazgi zębowej. Następnie miazga zęba pozostaje narażona na zanieczyszczenie naturalną florą jamy ustnej w miarę upływu czasu, powodując zapalenie przyzębia wierzchołkowego. Po tym czasie zwierzę składa się w ofierze, a ząb i kość szczęki mogą być analizowane na różne sposoby. Typowe analizy obejmują obrazowanie mikro-CT (w celu oceny resorpcji kości), barwienie histologiczne, immunohistochemię i ekspresję RNA. Protokół ten jest przydatny w badaniach w dziedzinie biologii jamy ustnej, aby lepiej zrozumieć ten proces zapalny w warunkach eksperymentalnych in vivo w jednolitych warunkach. Procedura wymaga ostrożnego obchodzenia się z myszami i izolowaną szczęką, a wizualna demonstracja techniki jest przydatna. Przedstawiono wszystkie aspekty techniczne zabiegów prowadzących do indukowanego zapalenia przyzębia wierzchołkowego i jego charakterystyki na modelu mysim.

Schemat blokowy kroków eksperymentalnych przedstawiono na Ryc. 1. Zgodnie z protokołem, myszy zostają poddane znieczuleniu, a ich pierwszy trzonowiec dolny po jednej stronie zostaje wywiercony aż do odsłonięcia miazgi, podczas gdy ząb przeciwległy pozostaje jako kontrola. Następnie zęby są pozostawiane w celu skażenia florą jamy ustnej przez 42 dni, podczas których są one monitorowane i podawane są leki przeciwbólowe. Po 42 dniach myszy zostają uśpione, a zęb...

Tutaj prezentujemy protokół miejscowego wywoływania wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy. Pokazujemy, jak wywiercić otwór w zębie myszy i odsłonić jego miazgę, aby wywołać miejscowy stan zapalny. Przedstawiono również metody analityczne mające na celu zbadanie charakteru tego zapalenia, takie jak mikrotomografia komputerowa i histologia.

Wywoływanie wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy

The mechanisms involved in local induced inflammation can be studied using several available animal models. One of these is the induction of apical ...

Nasz protokół umożliwia badanie okołowierzchołkowego zapalenia przyzębia w dostępnym i kontrolowanym modelu mysim. Dlatego protokół ten ma przewagę nad próbkami pacjentów lub modelami in vitro. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że mysz została dobrze przebadana, a metoda jest technicznie prosta pod względem wymagań obiektu i opłacalna.Ponieważ procedura ta jest trudna ze względu na małe wymiary zębów, korzystne jest wizualizację zabiegu, aby dowiedzieć się, jakie jest pozycjonowanie i działanie techniki. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca, umieść mysz po stronie dominującej dłoni na powierzchni z ekstrudowanej pianki polistyrenowej o zamkniętych komórkach i zabezpiecz łapy taśmą. Używając pojedynczej gumki na parę siekaczy i długich igieł przypiętych do powierzchni ekstrudowanej pianki polistyrenowej o zamkniętych komórkach, podeprzyj usta otwarte.Użyj zamkniętych kleszczy przyklejonych taśmą do pianki, aby cofnąć prawy policzek. I umieść piankę i mysz pod mikroskopem i źródłem światła. Następnie cofnij język za pomocą szpatułki dentystycznej i za pomocą igły o rozmiarze 27 wstrzyknij od 25 do 50 mikrolitrów znieczulenia miejscowego do fałdu śluzówkowo-pęcherzowego przylegającego do pierwszego zęba trzonowego żuchwy.Należy obserwować obrzęk tkanek wokół miejsca wstrzyknięcia. Aby odsłonić miazgę, użyj dowolnego odpowiedniego silnika dentystycznego wyposażonego w okrągłe, diamentowe wiertło dentystyczne o średnicy 0,8 milimetra o dużej prędkości i prędkości 800 obrotów na minutę, aby wywiercić część zgryzową pierwszego prawego zęba trzonowego żuchwy, aż rogi miazgi będą widoczne przez zębinę. Użyj pilnika K lub H o numerze ósmym lub 10, aby przebić miazgę i złamać zębinę pokrywającą rogi miazgi mezjalnej i dystalnej, aby umożliwić wprowadzenie pilnika do rogów.Kontynuuj pracę z pilnikami wewnątrz miazgi tak głęboko, jak to możliwe, jednocześnie poszerzając otwory z pilnikami, krwawienie z miazgi jest zwykle obserwowane wokół ostrych krawędzi zęba za pomocą wiertła i usuń ząb z izolacji, aby zmniejszyć ból podczas eksperymentu. Użyj mikroszczotki, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. I pozostaw przeciwległy lewy pierwszy trzonowiec żuchwy jako kontrolę.Przez pierwsze trzy dni po zabiegu należy ważyć zwierzęta i wstrzykiwać dootrzewnowo 0,1 miligrama na kilogram buprenorfiny raz dziennie. Kontynuuj monitorowanie zwierząt przez następne 42 dni, ważąc i dokonując ogólnej oceny behawioralnej dwa do trzech razy w tygodniu. I dostarczać granulki pokarmu zmiękczone wodą na szalce Petriego na podłogę klatki przez cały okres obserwacji.Pod koniec eksperymentu użyj nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby zebrać część szczęki, która zawiera trzy zęby trzonowe zarówno po stronie leczonej, jak i nieleczonej. I użyj kleszczy, aby usunąć jak najwięcej tkanki miękkiej, pozostawiając na próbkach głównie kości i zęby. Krótko wypłucz chusteczkę w PBS.Przed utrwaleniem w czteroprocentowym paraformaldehydzie przez 24 do 48 godzin. Następnie przepłukać próbki trzykrotnie w świeżym PBS. W przypadku mikrotomografii komputerowej lub analizy mikro-CT należy umieścić pobrane tkanki w probówce o średnicy 12 milimetrów zawierającej 1,5 mililitra PBS na stoliku skanera.Próbki są zorientowane w taki sposób, aby powierzchnie policzkowe lub językowe zęba i korzenia leżały równolegle do dna rurki. Użyj gąbki, aby oddzielić próbki. I przykryj górną część tuby elastyczną folią.Wybierz plik kontrolny i ustaw energię na 70 kilowoltów, intensywność na 114 mikroamperów, a rozdzielczość na sześć mikrometrów sześciennych rozmiaru woksela. Kliknij Scout-View. Po wyświetleniu obrazu kliknij opcję Linia odniesienia i zaznacz obszar próbek do skanowania, klikając przycisk Dodaj skanowanie po każdej próbce.Gdy wszystkie przykłady zostaną oznaczone, przejdź do listy zadań i wybierz pozycję Rozpocznij zadania interakcji. Do konturowania wycinków Micro-CT wybierz wycinek, który reprezentuje przybliżony środek zęba, w którym znajduje się miazga koronowa, miazga korzeniowa obu kanałów i oba otwory wierzchołkowe. Kliknij panel konturu i zaczynając od dystalnego punktu dystalnego wierzchołka korzenia, zaznacz granicę wierzchołkową koronalnie do promieniowego obszaru wierzchołkowego paque, przez mezjalną granicę wierzchołka korzenia mezjalnego, podążając za dystalną granicą korzenia mezjalnego i mezjalną granicą dystalnego korzenia, przez obszar furkacji.Skopiuj i wklej powstały kontur, a następnie dopasuj kontur odpowiednio do pięciu plasterków umieszczonych po obu stronach środkowego plasterka. Aby obliczyć objętość tkanki w konturze zaznaczonym dla każdej próbki, w obszarze Micro-CT Evaluation (Ocena mikrotomografii komputerowej) wybierz opcję Task (Zadanie) i kliknij opcję 3D-Evaluation (Ocena 3D). Następnie w oknie Ocena 3D kliknij Wybierz i wybierz filtr, aby obliczyć objętość tkanki.Pod koniec analizy Micro-CT przenieś tkanki ze skanera do mikroprobówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr EDTA przez 10 dni. Pod koniec odwapniania umieścić próbki w kasetach histologicznych zawierających rosnące stężenia etanolu, na jedną godzinę na każde stężenie. Po drugim zanurzeniu w etanolu przenieś próbki do ksylenu na dwa godzinne zanurzenie, przed przeniesieniem kaset do ciekłej parafiny o temperaturze 60 stopni Celsjusza w okapie chemicznym na noc, aby umożliwić odparowanie ksylenu.Następnego ranka umieść odwodnione próbki z koroną i korzeniami ustawionymi równolegle do dna formy w histologicznej maszynie blokującej, aby zatopić próbki w parafinie. Aby uzyskać skrawki, przymocuj próbkę bloku parafiny do mikrotonowego bloku tnącego i przycinaj próbkę, aż do osiągnięcia tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Gdy jakakolwiek część zęba jest widoczna, zacznij uzyskiwać odcinki o grubości sześciu mikrometrów, dostosowując kąt cięcia, aż do uzyskania odcinków strzałkowych, które obejmują miazgę koronalną i korzeniową oraz otwór wierzchołkowy.Tutaj pokazana jest cała leczona żuchwa. Powiększenie leczonego pierwszego prawego zęba trzonowego, pozwala na obserwację odsłonięcia zarówno mezjalnej, jak i dystalnej miazgi rogowej oraz wejścia do kanałów. Obrazowanie mikro-CT umożliwia wizualizację ekspozycji miazgi mezjalnej oraz mezjalnych i dystalnych okołowierzchołkowych obszarów przeziernych promieni rentgenowskich resorpcji kości.Rzeczywiście, w leczonych zębach mierzy się znaczną okołowierzchołkową resorbcję objętości tkanki w porównaniu z kontrolą. Analiza histologiczna wskazuje, że w leczonym zębie sama miazga zębowa wykazuje martwicę, którą można wyraźnie zaobserwować po barwieniu H i E w porównaniu z kontrolną zorganizowaną tkanką miazgi. Dodatkowo, co ważne, w okolicy okołowierzchołkowej leczonego zęba obserwuje się zmianę okołowierzchołkową złożoną z komórek odpornościowych, która jest nieobecna w zębach kontrolnych.Bardzo ważne jest, aby prawidłowo ustawić mysz podczas ekspozycji miazgi, ponieważ prawidłowe ustawienie umożliwia dobry dostęp do pyska zwierzęcia i optymalne wyniki. Zgodnie z tym protokołem można wykonać dodatkowe metody analizy stanu zapalnego okołowierzchołkowego, takie jak immunohistochemiczne barwienie tkanek i faks oraz szczegółowa analiza molekularna komórek. Protokół ten jest istotny nie tylko dla badań dentystycznych, ale także dla badań immunologicznych, ponieważ zapewnia model miejscowo indukowanego stanu zapalnego z wbudowaną kontrolą wewnętrzną.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia indukowanego przez ligaturę modelu mysiego zapalenia przyzębia obejmującego wiele zębów trzonowych szczęki, co skutkuje większymi obszarami zaangażowanej tkanki dziąsłowej i kości do późniejszej analizy, a także zmniejszeniem zużycia przez zwierzęta. Opisano również technikę oceny neutrofili w jamie ustnej w sposób analogiczny do osób badanych u ludzi.

Solidny model mysiego zapalenia przyzębia indukowany ligaturą do oceny neutrofili jamy ustnej

W tym badaniu, szczurzy model indukcji zapalenia przyzębia jest prezentowany poprzez kombinację ligatury retencyjnej i powtarzających się iniekcji lipopolisacharydu pochodzącego z Porphyromonas gingivalis, przez 14 dni wokół pierwszych zębów trzonowych szczęki. Techniki podwiązania i iniekcji LPS były skuteczne w wywoływaniu zapalenia ozębnej, co skutkowało utratą kości wyrostka zębodołowego i stanem zapalnym.

Indukcja zapalenia przyzębia poprzez połączenie ligatury i wstrzyknięcia lipopolisacharydu w modelu szczurzym

Ten artykuł przedstawia uproszczony protokół tworzenia modelu zapalenia miazgi u myszy za pomocą innowacyjnego knebla ustnego, po którym następuje analiza histologiczna.

Opracowanie modelu ekspozycji miazgi mysiej z nowatorskim kneblem do badań nad zapaleniem miazgi

To jest raport na temat eksperymentalnego modelu zapalenia okołoimplantowego wywołanego ligaturą u myszy. Opisujemy wszystkie etapy chirurgiczne, od przed- i pooperacyjnego postępowania ze zwierzętami, ekstrakcji, wszczepienia implantu i zapalenia okołoimplantowego wywołanego podwiązaniem.

Eksperymentalny model peri-implantitis wywołanego ligaturą u myszy

To badanie opisuje zmodyfikowaną metodę podwiązania nylonu 6-0 do wywoływania zapalenia przyzębia u myszy, która jest wysoce powtarzalna i stanowi alternatywę dla badaczy do badania chorób przyzębia od ich rozwoju do patologicznych konsekwencji.

Mysi model zaawansowanego zapalenia przyzębia wywołanego przez ligaturę nylonową w drugim górnym zębie trzonowym

Model heterotopowego przeszczepienia serca u myszy został uznany przez wielu badaczy za istotną metodę badania mechanizmów odrzutu i odpowiedzi immunologicznej. Jednak techniki z nią związane wciąż stanowią wyzwanie. Dzięki modyfikacji standardowych metod z sukcesem przeprowadziliśmy ponad 1000 przeszczepów.

Heterotopowe przeszczepienie serca u myszy

Model transplantacji jelita cienkiego myszy jest uznawany za istotne narzędzie do badania mechanizmów odrzutu immunologicznego oraz przesiewowego badania nowych leków immunosupresyjnych. Jednak zastosowanie tego modelu jest ograniczone, ponieważ techniki w nim wykorzystywane stanowią niezwykle trudne wyzwanie techniczne. W niniejszym materiale przedstawiamy zmodyfikowaną technikę.

Przeszczep jelita cienkiego u myszy

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest powszechnie stosowanym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów leżących u podstaw przerostu mięśnia sercowego i rozwoju niewydolności serca. W niniejszym materiale opisujemy procedury zwężania aorty w celu wywołania powtarzalnego stopnia przerostu serca u myszy.

Poprzeczne zwężenie aorty u myszy

Telemetry EKG stała się niezbędnym narzędziem w ocenie modeli zwierzęcych pod kątem arytmii serca i nagłej śmierci sercowej. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcję krok po kroku dotyczącą rejestracji telemetrycznego EKG w celu długoterminowego ambulatoryjnego monitorowania EKG u myszy.

Ambulatoryjne zapisy EKG u myszy

Poznaj metodę wywoływania wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy. Protokół obejmuje chirurgiczne narażenie miazgi zęba, analizę mikro-CT i histologię, umożliwiając badanie resorpcji kości i odpowiedzi immunologicznej in vivo.

Wywoływanie wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy

Przeglądaj więcej filmów