Wywoływanie wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy

Nasz protokół umożliwia badanie okołowierzchołkowego zapalenia przyzębia w dostępnym i kontrolowanym modelu mysim. Dlatego protokół ten ma przewagę nad próbkami pacjentów lub modelami in vitro. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że mysz została dobrze przebadana, a metoda jest technicznie prosta pod względem wymagań obiektu i opłacalna.

Ponieważ procedura ta jest trudna ze względu na małe wymiary zębów, korzystne jest wizualizację zabiegu, aby dowiedzieć się, jakie jest pozycjonowanie i działanie techniki. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca, umieść mysz po stronie dominującej dłoni na powierzchni z ekstrudowanej pianki polistyrenowej o zamkniętych komórkach i zabezpiecz łapy taśmą. Używając pojedynczej gumki na parę siekaczy i długich igieł przypiętych do powierzchni ekstrudowanej pianki polistyrenowej o zamkniętych komórkach, podeprzyj usta otwarte.

Użyj zamkniętych kleszczy przyklejonych taśmą do pianki, aby cofnąć prawy policzek. I umieść piankę i mysz pod mikroskopem i źródłem światła. Następnie cofnij język za pomocą szpatułki dentystycznej i za pomocą igły o rozmiarze 27 wstrzyknij od 25 do 50 mikrolitrów znieczulenia miejscowego do fałdu śluzówkowo-pęcherzowego przylegającego do pierwszego zęba trzonowego żuchwy.

Należy obserwować obrzęk tkanek wokół miejsca wstrzyknięcia. Aby odsłonić miazgę, użyj dowolnego odpowiedniego silnika dentystycznego wyposażonego w okrągłe, diamentowe wiertło dentystyczne o średnicy 0,8 milimetra o dużej prędkości i prędkości 800 obrotów na minutę, aby wywiercić część zgryzową pierwszego prawego zęba trzonowego żuchwy, aż rogi miazgi będą widoczne przez zębinę. Użyj pilnika K lub H o numerze ósmym lub 10, aby przebić miazgę i złamać zębinę pokrywającą rogi miazgi mezjalnej i dystalnej, aby umożliwić wprowadzenie pilnika do rogów.

Kontynuuj pracę z pilnikami wewnątrz miazgi tak głęboko, jak to możliwe, jednocześnie poszerzając otwory z pilnikami, krwawienie z miazgi jest zwykle obserwowane wokół ostrych krawędzi zęba za pomocą wiertła i usuń ząb z izolacji, aby zmniejszyć ból podczas eksperymentu. Użyj mikroszczotki, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. I pozostaw przeciwległy lewy pierwszy trzonowiec żuchwy jako kontrolę.

Przez pierwsze trzy dni po zabiegu należy ważyć zwierzęta i wstrzykiwać dootrzewnowo 0,1 miligrama na kilogram buprenorfiny raz dziennie. Kontynuuj monitorowanie zwierząt przez następne 42 dni, ważąc i dokonując ogólnej oceny behawioralnej dwa do trzech razy w tygodniu. I dostarczać granulki pokarmu zmiękczone wodą na szalce Petriego na podłogę klatki przez cały okres obserwacji.

Pod koniec eksperymentu użyj nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby zebrać część szczęki, która zawiera trzy zęby trzonowe zarówno po stronie leczonej, jak i nieleczonej. I użyj kleszczy, aby usunąć jak najwięcej tkanki miękkiej, pozostawiając na próbkach głównie kości i zęby. Krótko wypłucz chusteczkę w PBS.

Przed utrwaleniem w czteroprocentowym paraformaldehydzie przez 24 do 48 godzin. Następnie przepłukać próbki trzykrotnie w świeżym PBS. W przypadku mikrotomografii komputerowej lub analizy mikro-CT należy umieścić pobrane tkanki w probówce o średnicy 12 milimetrów zawierającej 1,5 mililitra PBS na stoliku skanera.

Próbki są zorientowane w taki sposób, aby powierzchnie policzkowe lub językowe zęba i korzenia leżały równolegle do dna rurki. Użyj gąbki, aby oddzielić próbki. I przykryj górną część tuby elastyczną folią.

Wybierz plik kontrolny i ustaw energię na 70 kilowoltów, intensywność na 114 mikroamperów, a rozdzielczość na sześć mikrometrów sześciennych rozmiaru woksela. Kliknij Scout-View. Po wyświetleniu obrazu kliknij opcję Linia odniesienia i zaznacz obszar próbek do skanowania, klikając przycisk Dodaj skanowanie po każdej próbce.

Gdy wszystkie przykłady zostaną oznaczone, przejdź do listy zadań i wybierz pozycję Rozpocznij zadania interakcji. Do konturowania wycinków Micro-CT wybierz wycinek, który reprezentuje przybliżony środek zęba, w którym znajduje się miazga koronowa, miazga korzeniowa obu kanałów i oba otwory wierzchołkowe. Kliknij panel konturu i zaczynając od dystalnego punktu dystalnego wierzchołka korzenia, zaznacz granicę wierzchołkową koronalnie do promieniowego obszaru wierzchołkowego paque, przez mezjalną granicę wierzchołka korzenia mezjalnego, podążając za dystalną granicą korzenia mezjalnego i mezjalną granicą dystalnego korzenia, przez obszar furkacji.

Skopiuj i wklej powstały kontur, a następnie dopasuj kontur odpowiednio do pięciu plasterków umieszczonych po obu stronach środkowego plasterka. Aby obliczyć objętość tkanki w konturze zaznaczonym dla każdej próbki, w obszarze Micro-CT Evaluation (Ocena mikrotomografii komputerowej) wybierz opcję Task (Zadanie) i kliknij opcję 3D-Evaluation (Ocena 3D). Następnie w oknie Ocena 3D kliknij Wybierz i wybierz filtr, aby obliczyć objętość tkanki.

Pod koniec analizy Micro-CT przenieś tkanki ze skanera do mikroprobówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr EDTA przez 10 dni. Pod koniec odwapniania umieścić próbki w kasetach histologicznych zawierających rosnące stężenia etanolu, na jedną godzinę na każde stężenie. Po drugim zanurzeniu w etanolu przenieś próbki do ksylenu na dwa godzinne zanurzenie, przed przeniesieniem kaset do ciekłej parafiny o temperaturze 60 stopni Celsjusza w okapie chemicznym na noc, aby umożliwić odparowanie ksylenu.

Następnego ranka umieść odwodnione próbki z koroną i korzeniami ustawionymi równolegle do dna formy w histologicznej maszynie blokującej, aby zatopić próbki w parafinie. Aby uzyskać skrawki, przymocuj próbkę bloku parafiny do mikrotonowego bloku tnącego i przycinaj próbkę, aż do osiągnięcia tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Gdy jakakolwiek część zęba jest widoczna, zacznij uzyskiwać odcinki o grubości sześciu mikrometrów, dostosowując kąt cięcia, aż do uzyskania odcinków strzałkowych, które obejmują miazgę koronalną i korzeniową oraz otwór wierzchołkowy.

Tutaj pokazana jest cała leczona żuchwa. Powiększenie leczonego pierwszego prawego zęba trzonowego, pozwala na obserwację odsłonięcia zarówno mezjalnej, jak i dystalnej miazgi rogowej oraz wejścia do kanałów. Obrazowanie mikro-CT umożliwia wizualizację ekspozycji miazgi mezjalnej oraz mezjalnych i dystalnych okołowierzchołkowych obszarów przeziernych promieni rentgenowskich resorpcji kości.

Rzeczywiście, w leczonych zębach mierzy się znaczną okołowierzchołkową resorbcję objętości tkanki w porównaniu z kontrolą. Analiza histologiczna wskazuje, że w leczonym zębie sama miazga zębowa wykazuje martwicę, którą można wyraźnie zaobserwować po barwieniu H i E w porównaniu z kontrolną zorganizowaną tkanką miazgi. Dodatkowo, co ważne, w okolicy okołowierzchołkowej leczonego zęba obserwuje się zmianę okołowierzchołkową złożoną z komórek odpornościowych, która jest nieobecna w zębach kontrolnych.

Bardzo ważne jest, aby prawidłowo ustawić mysz podczas ekspozycji miazgi, ponieważ prawidłowe ustawienie umożliwia dobry dostęp do pyska zwierzęcia i optymalne wyniki. Zgodnie z tym protokołem można wykonać dodatkowe metody analizy stanu zapalnego okołowierzchołkowego, takie jak immunohistochemiczne barwienie tkanek i faks oraz szczegółowa analiza molekularna komórek. Protokół ten jest istotny nie tylko dla badań dentystycznych, ale także dla badań immunologicznych, ponieważ zapewnia model miejscowo indukowanego stanu zapalnego z wbudowaną kontrolą wewnętrzną.