Name: Ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej przy użyciu kwasu walproinowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj metodę ekspansji ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z krwi pępowinowej przy użyciu kwasu walproinowego i koktajlu cytokin. Ta technika zwiększa liczbę funkcjonalnych HSC do zastosowań w medycynie regeneracyjnej i terapii przeszczepowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant NYSTEM C030136 dla R.H. Serdecznie dziękujemy Bartkowi Jabłońskiemu za uwagi i korektę manuskryptu

Protokół ekspansji HSC ex vivo jest zgodny z wytycznymi Komitetu Etyki Badań w Mount Sinai School of Medicine.
1. Przygotowanie bufora i podłoża
<ol>
	<li>Przygotować bufor separacyjny na 24 godziny przed izolacją komórek CD34 + z UBC poprzez dodanie 2 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 33 ml 7,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 465 ml buforowanej soli fizjologicznej (1x PBS). Delikatnie wymieszać i utrzymywać bufor przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ciepłe podłoże w temperaturze pokojowej w dniu oczyszczania.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek jednojądrzastych (MNC) od jednostki UCB
<ol>
	<li>Dozować całą jednostkę UCB do kolby o średnicy75 cm2. Rozcieńczyć i delikatnie wymieszać UCB z równą objętością PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Określ liczbę probówek wymaganych do przetworzenia całej jednostki UCB (jedna stożkowa probówka o pojemności 50 ml może być użyta do przetworzenia 35 ml rozcieńczonego UCB). Dodać 15 ml pożywki o gradionym nasyceniu gęstości (patrz tabela materiałów) do każdej probówki i dozować rozcieńczony UCB na wierzch pożywki o gradiencie gęstości, tworząc dwie warstwy. 
	nuta: Dozuj rozcieńczony UCB bardzo powoli, trzymając probówkę pod kątem 45°, aby zapobiec mieszaniu się warstwy podłoża gradientu gęstości z UCB.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 30 minut przy niskiej prędkości przyspieszania i zwalniania. Po odwirowaniu MNC lokalizują się w białej warstwie (kożuchówce) między plazmą a warstwą ośrodków o gradiencie gęstości.</li>
	<li>Powoli zasysaj 2/3 osocza, nie naruszając warstwy kożuchowej sierści. Ostrożnie przenieś warstwę kożucha do nowej probówki o pojemności 50 ml. Zbierz wszystkie MNC z tej samej jednostki UCB do probówki o pojemności 50 ml, aż osiągniesz 25 ml. Użyj nowej probówki, jeśli objętość zebranych MNC przekracza 25 ml.</li>
	<li>Dodaj 25 ml zimnego PBS do probówki zawierającej 25 ml MNC i dobrze wymieszaj. Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Zimny PBS jest ważny, aby zapobiec zamykaniu przeciwciał na powierzchni komórki i zmniejszyć niespecyficzne znakowanie.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 50 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Pobrać 20 μl zawiesiny komórek w celu zliczenia. Policz liczbę komórek zabarwionych barwieniem pomarańczem akrydynowym/jodkiem propydyny za pomocą automatycznego licznika komórek. Obliczanie całkowitej liczby korporacji wielonarodowych. 
	nuta: Zliczanie komórek można również przeprowadzić metodą wykluczenia błękitu trypanowego przy użyciu hemocytometru.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Jeśli nie jest to wymagane natychmiast, korporacje wielonarodowe można zamrozić na tym etapie.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek CD34+ od UCB
<ol>
	<li>Przygotuj przeciwciało CD34 + sprzężone z roztworem kulek magnetycznych do izolacji komórek CD34 + z MNC. Wymieszaj 300 μl buforu separacyjnego ze 100 μl ludzkiej FcR ludzkiej IgG (odczynnika blokującego) i 100 μl kulek magnetycznych CD34 do izolacji komórek CD34 + z każdych 108 MNC. W celu wyizolowania większej liczby komórek CD34 + z (>108) MNC, należy odpowiednio zwiększyć ilość odczynników.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant z probówki odwirowanej w kroku 2.8. Zawiesić osad w roztworze kulek magnetycznych CD34 przygotowanym w kroku 3.1 (użyć 500 μl roztworu na10-8 komórek).</li>
	<li>Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 min. 
	nuta: Przygotować urządzenie do oddzielania komórek (patrz tabela materiałów) podczas okresu inkubacji. Zastąp roztwór do przechowywania buforem roboczym zgodnie z instrukcjami producenta i uruchom program mycia, a następnie program płukania.</li>
	<li>Dodać bufor do pracy z separatorem zimnych komórek do probówki zawierającej mieszaninę komórek, aż probówka zostanie całkowicie napełniona. Wirować przy 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w zimnym separatorze komórek, działającym buforem (2 ml / 10 8 komórek). Przenieść 2 ml mieszaniny zawiesiny komórek do probówek o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Załadować 3 zestawy probówek o pojemności 15 ml do stojaka separatora komórek, wstępnie schłodzonych w temperaturze 4 °C. Jeden zestaw probówek zawiera MNC, drugi zestaw probówek posłuży do zebrania frakcji ujemnej, a trzeci zestaw probówek posłuży do zebrania oczyszczonych komórek CD34+.</li>
	<li>Załaduj stojak do separatora komórek i uruchom program posseld2 preset program. 
	nuta: Alternatywna metoda, która wykorzystuje ręczny separator magnetyczny, może być użyta do zastąpienia urządzenia do separatora komórek12 .</li>
	<li>Probówki wirówkowe z frakcją dodatnią o stężeniu 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić oczyszczone komórki CD34+ w 1 ml pożywki wolnej od surowicy.</li>
	<li>Policz komórki zabarwione pomarańczą akrydynową/jodkiem propidyny za pomocą automatycznego licznika komórek. 
	nuta: Jeśli nie jest to wymagane natychmiast, oczyszczone komórki CD34+ można zamrozić na tym etapie.</li>
</ol>
4. VPA Ex Vivo Ekspansja oczyszczonych komórek UCB-CD34+ 
<ol>
	<li>Przygotuj wystarczającą objętość pożywki do pokrycia oczyszczonych komórek CD34 + o gęstości 3,3 x 104 komórek/ml. Skład pożywki hodowlanej to pożywka wolna od surowicy (patrz tabela materiałów) uzupełniona 10 μl / ml pióra / paciorkowca, 150 ng / ml czynnika komórek macierzystych (SCF), 100 ng / ml receptora kinazy tyrozynowej fms 3 (ligand FLT3), 100 ng / ml trombopoetyny (TPO) i 50 ng / ml interleukiny 3 (IL-3).</li>
	<li>Oczyszczone komórki CD34+ na płytce 12-dołkowej (5 x 104 komórki CD34+ / 1,5 ml pożywki / basenik) i hodowla w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .</li>
	<li>Oceń czystość wyizolowanych komórek CD34+ i skład komórek za pomocą analizy FACS, jak opisano poniżej w kroku 6.3.</li>
	<li>Dodać VPA w końcowym stężeniu 1 mM do kultur komórek traktowanych przez 16 godzin koktajlem cytokinowym.</li>
	<li>Hodować komórki przez dodatkowe 7 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 . 
	nuta: Nośnik pozostaje niezmieniony w czasie trwania ekspansji ex vivo.</li>
</ol>
5. Barwienie przeciwciał do analizy cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór barwiący przeciwciała do barwienia 2 x 104–6 x 104 komórek i roztworu izotypu, aby określić strategię bramkowania FACS i określić poziom niespecyficznego wiązania. Rozcieńczyć przeciwciała (1/100 APC anty-CD34, 1/200 FITC anty-CD90) i odpowiednie izotypy do 50 μl buforu separacyjnego (skład buforu separacyjnego określono w kroku 1.1). 
	nuta: Wykonaj pojedyncze barwienie komórek każdym przeciwciałem w celu opracowania strategii bramkowania FMO. Zestaw kulek całkowitej kompensacji przeciwciał (patrz tabela materiałów) może być używany do konfiguracji kompensacji.</li>
	<li>Homogenizować kulturę komórkową, wielokrotnie pipetując. Policz komórki i odpipetuj 5 x 104 komórki do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu separacyjnego i odwirować przy 400 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl roztworu barwiącyego. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 450 μl buforu separacyjnego i odwirować przy 400 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu separacyjnego. Trzymaj komórki na lodzie przez co najmniej 5 minut, aż do wykonania analizy FACS. Dodaj 1 μl 7-AAD do bramki żywotnych komórek.</li>
	<li>Załaduj wybarwioną próbkę komórek na maszynę FACS i pobierz komórki o najniższym natężeniu przepływu.</li>
	<li>Dla każdego fluoroforu przeanalizuj kontrole izotypu i pojedyncze barwione komórki, aby ustawić bramkowanie dla barwienia FITC (CD90), APC (CD34) i PerCP/Cy5.5 (7-AAD).</li>
	<li>Bramkować frakcję ujemną PerCP / Cy5.5 i wykreślić APC vs FITC w celu określenia procentu żywotnych komórek CD34 +, CD90 + i CD34 + CD90 +, które definiują populację HSPC / HSC w hodowli.</li>
</ol>
6. Barwienie przeciwciał do sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić rozprężone komórki, pipetując wiele razy. Policz liczbę komórek i przenieś całą kulturę do probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml.</li>
	<li>Napełnij rurkę buforem do separacji na zimno</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór barwiący przeciwciała do barwienia 5 x 105–2 x 106 komórek i roztwór izotypu do barwienia 1 x 105 komórek i określić bramkowanie FACS. Rozcieńczyć przeciwciała 1/10 (anty-CD34 APC), 1/20 (FITC-CD90) i odpowiadające im izotypy w 500 μl buforu separacyjnego na każdy warunek.</li>
	<li>Przygotuj pojedyncze kontrolki kompensacji koloru za pomocą zestawu kulek całkowitej kompensacji przeciwciał zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przenieść supernatant z kroku 5.2 do nowej probówki i utrzymywać go w temperaturze 37 °C. Ta pożywka hodowlana zostanie ponownie wykorzystana do hodowli posortowanych komórek.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w zimnym buforze separacyjnym, aby uzyskać stężenie 5 x 105 komórek / ml. Przenieś 1 x 105 komórek w probówkach o pojemności 1,5 ml w celu barwienia izotypu, a pozostałe komórki, które zostaną posortowane do innych probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osady komórek w roztworze barwiącym izotyp, a osad komórek, który zostanie posortowany w roztworze barwiącym przeciwciała.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 450 μl buforu separacyjnego i odwirowywać przy 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić granulki za pomocą 2 ml zimnego buforu do separacji.</li>
	<li>Aby zapobiec zatykaniu, przefiltruj próbki przez sitko o wielkości 40 μm i umieść na lodzie do momentu uzyskania FACS.</li>
	<li>Ustaw sortownik komórek do sortowania z prawidłowymi parametrami.</li>
	<li>Uruchom próbki izotypowe, aby ustawić napięcie i wzmocnienie dla rozproszenia do przodu i bocznego oraz zidentyfikować populacje ujemnej fluorescencji.</li>
	<li>Uruchom kontrolki pojedynczego koloru, aby ustawić współczynniki kompensacji i zastosować skompensowany parametr do protokołu kolekcji.</li>
	<li>Uruchom małą porcję próbki (Ab) (~ 50 000 zdarzeń), aby ustalić strategię bramkowania.</li>
	<li>Skonfiguruj decyzje sortowania, aby zebrać frakcję komórek CD34+ CD90-.</li>
	<li>Posortować komórki do probówek zbiorczych pokrytych 2 ml buforem separacyjnym</li>.
	<li>Po posortowaniu ponownie przeliczyć komórki i odwirować je przy 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce odzyskanej w kroku 5.5, aby osiągnąć końcowe stężenie 3 x 104 komórek/ml.</li>
	<li>Płytka CD34 + CD90 - oczyszczone komórki w 12-dołkowych płytkach z 1,5 ml pożywki / dołka (5 x 104 CD34 + CD90- komórki/1,5 ml pożywki/basenik).</li>
	<li>Ocenić czystość za pomocą analizy FACS przy użyciu 50 μl pożywki zawierającej komórki.</li>
	<li>Traktować kultury komórek CD34 + CD90- VPA w końcowym stężeniu 1mM.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .</li>
</ol>

<ol><li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li>
<li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li>
<li>Wagner, J. E. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I%2FII+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li>
<li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide%2C+a+SIRT1+inhibitor%2C+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), 342-355.e1 (2012).</li>
<li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+Expansion+of+HSCs%3A+New+Possibilities+for+HSC+Transplants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li>
<li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood%3A+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89(2015).</li>
<li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , In press (2019).</li>
<li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li>
<li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34%2B+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420(2017).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34%28%2B%29+cord+blood+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mający na celu szybkie rozszerzenie w znacznym stopniu liczby funkcjonalnych ludzkich HSC z UCB. Badania pilotażowe i kinetyczne z wykorzystaniem tego protokołu wskazują, że komórki ekspandowane ex vivo szybko nabywają i utrzymują ekspresję kilku markerów fenotypowych HSC, w tym CD90, a także pierwotnych cech metabolicznych HSC9.
Ten protokół ekspansji ex vivo jest stosunkowo prosty i niezawodny. Oczyszczanie komórek CD34<sup...

Ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) z jednostek krwi pępowinowej (UCB) jest bardzo obiecująca dla zastosowań HSC w medycynie regeneracyjnej i terapii transplantacyjnej. Przeszczep za pomocą jednostek UCB ma kilka unikalnych zalet, takich jak łatwe pobieranie, wysoka dostępność, minimalne ryzyko infekcji, niskie ryzyko nawrotu choroby i niska częstotliwość występowania choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD). Jednak główną wadą ich stosowania w warunkach klinicznych jest ograniczona liczba HSC obecnych w każdej jednostce UCB1. Niewystarczająca liczba HSC powoduje opóźnione wszczepienie i powrót do stanu krwiotwórczego, ryzyko odrzucenia przeszczepu i nieprawidłową rekonstytucję immunologiczną.
Obecnie opracowano różne metody i strategie, aby ex vivo rozszerzyć ograniczoną liczbę HSC z UCB. Kombinacje różnych koktajli cytokin z małymi cząsteczkami lub związkami w hodowlach ex vivo skutkują różnym stopniem ekspansji liczb HSC2,3,4,5,6,7,8. Co ważne, warunki hodowli ex vivo wywołują stres, prowadząc do szybkiej proliferacji komórek, zwiększonej aktywności metabolicznej i utraty pierwotnych cech, które definiują pierwotne HSC. W związku z tym konieczne jest opracowanie protokołów, które doprowadzą do ekspansji dużej liczby funkcjonalnych HSC o cechach bardzo podobnych do pierwotnych HSC.
Bezsurowicowe hodowle komórek CD34+ wyizolowane z UCB i potraktowane kwasem walproinowym (VPA) powodują ekspansję dużej liczby prymitywnych HSC4,9,10. Ekspansja HSC nie wynika wyłącznie z rozpowszechnienia istniejących HSC wywodzących się z UCB. Zamiast tego ta ekspansja jest spowodowana nabyciem prymitywnego fenotypu w połączeniu z ograniczoną liczbą podziałów komórkowych i proliferacją9. W ciągu początkowych 24–48 godzin inkubacji z kombinacją cytokin i VPA, komórki CD34+ uzyskują profil transkryptomiczny i fenotypowy, które charakteryzują długoterminowe HSC. Znacznemu wzrostowi odsetka HSC towarzyszy szybki wzrost liczby HSC (63-krotny wzrost w ciągu 24 godzin od leczenia VPA)9. Warto zauważyć, że strategia ekspansji VPA-ex vivo rozszerza HSC o niskiej aktywności metabolicznej, co dodatkowo podkreśla ich prymitywne cechy.
Opisana tutaj metoda zapewnia warunki i zabiegi, które prowadzą do znacznego stopnia ekspansji ex vivo prymitywnych HSC do zastosowań klinicznych lub laboratoryjnych. Ta strategia ekspansji ex vivo wykorzystuje koktajl cytokin w połączeniu z leczeniem VPA. VPA jest zatwierdzonym przez FDA lekiem do leczenia zaburzeń afektywnych dwubiegunowych i innych chorób neurologicznych. Ekspansja HSC za pomocą VPA jest szybka i następuje w ciągu 7 dni, co minimalizuje zarówno czas manipulacji, jak i ryzyko zanieczyszczenia. Co ważne, protokół ten pozwala na pozyskanie długoterminowych markerów fenotypowych HSC, takich jak CD90 i CD49f, w ciągu 24-48 godzin po leczeniu VPA9. Rozszerzone przeszczepy HSC utworzone za pomocą tego protokołu mają zdolność do regeneracji układu krwiotwórczego, ponieważ mogą różnicować się we wszystkie linie komórek krwiotwórczych i ustanawiać długoterminowe wszczepienie po przeszczepieniu do modeli myszy NSG z mieloablacją4. Co więcej, protokół ten jest wysoce powtarzalny i pozwala na wydajną i szybką izolację żywotnych komórek CD34+ z UCB, co ma kluczowe znaczenie dla uprzemysłowienia tej procedury.
Protokół ekspansji VPA ex vivo ma również potencjał, aby przezwyciężyć znaczną utratę HSC, która występuje podczas edycji genów11. Edycja genów wymaga ekspozycji na cytokiny, które są niezbędne do cyklu komórkowego i aktywacji mechanizmów naprawy DNA. Ze względu na szybkie efekty leczenia VPA, metoda ta może być korzystna dla generowania większej liczby genetycznie zmodyfikowanych komórek w okresie czasu, który jest istotny dla obecnie stosowanych protokołów modyfikacji genów.

<table><tbody><tr><td>Pożywka ekspandacyjna</td> Pożywka do ekspansji komórek macierzystych <td>Sigma-Aldrich</td><td>Stemline II S0192-500ML</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI (oranż akrydynowy/jodek propidyny) roztwór do barwienia żywych / martwych komórek jądrzastych ssaków.</td><td>Nexcelom</td><td>CS2-0106-25mL</td><td></td></tr><tr><td>Mysz APC Anti-Human CD34 Clone 581</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>555824</td><td></td></tr><tr><td>Mysz APC IgG1 itp.; Isotype Control Clone MOPC-21</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>555751</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Roztwór płuczący</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 15 ml Probówka</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 ml Polistyrenowa probówka okrągłodenna</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml Probówka</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit, zawiera kulki cd34 i odczynnik blokujący fcr, ludzki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-703</td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Analizator i sortownik komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Aria II</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto 2000 Cell Licznik</td><td></td>żywotności</tr><tr><td>Separator komórek</td><td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komory liczące</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-PD100-002</td><td></td></tr><tr><td>Media gradientu gęstości</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-ludzki CD90 ( Thy1) Klon 5E10</td><td>BIOLEGEND</td><td>328108</td><td></td></tr><tr><td>Mysz FITC IgG1 i kappa; Izotyp Ctrl (FC) Przeciwciało</td><td>BIOLEGEND</td><td>400109</td><td></td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td></td><td>odwrócony</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko ligandu Flt-3</td><td>R& D Systems</td><td>308FKN</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko IL-3 (IL-3)</td> <td>R& D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko SCF R</td><td>& D Systems</td><td>255-SC</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko trombopoetyny (TPO)</td><td>R& D Systems</td><td>288-TP</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kulek do całkowitej kompensacji przeciwciał</td><td>thermofisher</td><td>A10497</td><td></td></tr><tr><td>Program krwi pępowinowej</td><td>i łożyskowej w Nowojorskim Centrum Krwi http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td><td></td><td></td></tr> sól <tr><td>sodowa kwasu walproinowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z ludzkich komórek cd34 + pochodzących z krwi pępowinowej przy użyciu kwasu walproinowego

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Jednostki krwi pępowinowej (UCB) stanowią alternatywne źródło ludzkich krwiotwórczych komórek macierzystych (HSC) dla pacjentów, którzy wymagają allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego. Chociaż UCB ma kilka unikalnych zalet, ograniczona liczba HSC w każdej jednostce UCB ogranicza ich zastosowanie w medycynie regeneracyjnej i przeszczepach HSC u dorosłych. Efektywną ekspansję funkcjonalnych ludzkich HSC można osiągnąć poprzez hodowlę ex vivo komórek CD34 + wyizolowanych z UCB i poddanych działaniu inhibitora deacetylazy, kwasu walproinowego (VPA). Szczegółowo opisany tutaj protokół opisuje warunki hodowli i metodologię szybkiego izolowania komórek CD34+ i rozszerzania w wysokim stopniu puli prymitywnych HSC. Rozszerzone HSC są zdolne do ustanowienia zarówno krótkotrwałego, jak i długoterminowego wszczepienia i są w stanie dać początek wszystkim typom zróżnicowanych komórek krwiotwórczych. Metoda ta ma również potencjał do zastosowania klinicznego w autologicznej terapii genowej HSC i stanowi atrakcyjne podejście do przezwyciężenia utraty funkcjonalnych HSC związanej z edycją genów.

Opisany tutaj protokół ex vivo zwiększa liczbę prymitywnych HSC generowanych z komórek CD34+ izolowanych z UCB (Rycina 1). Priming komórek CD34+ przez 16 h z użyciem koktajlu cytokin, a następnie traktowanie VPA przez kolejne 7 dni, prowadzi do znacznej ekspansji HSC. Co istotne, pula rozszerzonych komórek jest silnie wzbogacona w HSC, które są definiowane fenotypowo przez markery CD34+CD90+. Całkowita liczba komóre...

Tutaj opisujemy ekspansję ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej leczonej kombinacją koktajlu cytokin i VPA. Metoda ta prowadzi do znacznego stopnia ekspansji ex vivo prymitywnych HSC do zastosowań klinicznych lub laboratoryjnych.

Ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej przy użyciu kwasu walproinowego

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z jednostki krwi pępowinowej jest bardzo obiecująca dla zastosowania HSC w medycynie regeneracyjnej i terapii transplantacyjnej. W protokole tym wykorzystano koktajl cytokin w połączeniu z leczeniem kwasem walproinowym w celu szybkiego rozprężenia dużej liczby funkcjonalnych HSC o cechach bardzo podobnych do pierwotnych HSC. Ze względu na szybkie efekty leczenia kwasem walproinowym, metoda ta ma również potencjał do przezwyciężenia utraty HSC związanej z edycją genów.Metoda ta może być korzystna dla generowania większej liczby genetycznie zmodyfikowanych komórek w okresie czasu, który jest istotny dla obecnie stosowanych protokołów modyfikacji genów. Protokół ekspansji kwasu walproinowego ex vivo jest stosunkowo prosty i niezawodny. Oczyszczanie komórek CD34-dodatnich za pomocą separatora komórek jest wysoce powtarzalne i szybkie, co pozwala na szybkie odzyskanie wysoce oczyszczonych komórek CD34-dodatnich.24 godziny przed izolacją komórek CD-34 dodatnich z krwi pępowinowej należy przygotować bufor separacyjny, dodając dwa mililitry 0,5 molowego EDTA i 33 mililitry 7,5% BSA do 465 mililitrów 1X PBS. Delikatnie wymieszaj bufo

ex-vivo-expansion-hematopoietic-stem-cells-from-human-umbilical-cord

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Przedstawiono tutaj protokół do inicjowania, utrzymywania i analizowania hodowli mysich hematopoetycznych komórek macierzystych za pomocą ekspansji ex vivo na bazie alkoholu poliwinylowego, a także metody genetycznej manipulacji nimi za pomocą transdukcji lentiwirusowej i elektroporacji.

Ex vivo Ekspansja i manipulacja genetyczna krwionośnych komórek macierzystych myszy w kulturach na bazie alkoholu poliwinylowego

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Modelowanie erytropoezy daje cenną szansę na zrozumienie biologicznego znaczenia aktorów w tym procesie i ocenę nowych podejść terapeutycznych, które mogą złagodzić wady różnicowania. W tym miejscu opisujemy prostą i niezawodną metodę skutecznego różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ ex vivo.

Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo

Poznaj metodę ekspansji ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z krwi pępowinowej przy użyciu kwasu walproinowego i koktajlu cytokin. Ta technika zwiększa liczbę funkcjonalnych HSC do zastosowań w medycynie regeneracyjnej i terapii przeszczepowej.

Ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej przy użyciu kwasu walproinowego (Wideo) | JoVE Journal

Ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z ludzkich komórek CD34 ⁺ pochodzących z krwi pępowinowej przy użyciu kwasu walproinowego

Przeglądaj więcej filmów