Ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej przy użyciu kwasu walproinowego

Ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z jednostki krwi pępowinowej jest bardzo obiecująca dla zastosowania HSC w medycynie regeneracyjnej i terapii transplantacyjnej. W protokole tym wykorzystano koktajl cytokin w połączeniu z leczeniem kwasem walproinowym w celu szybkiego rozprężenia dużej liczby funkcjonalnych HSC o cechach bardzo podobnych do pierwotnych HSC. Ze względu na szybkie efekty leczenia kwasem walproinowym, metoda ta ma również potencjał do przezwyciężenia utraty HSC związanej z edycją genów.

Metoda ta może być korzystna dla generowania większej liczby genetycznie zmodyfikowanych komórek w okresie czasu, który jest istotny dla obecnie stosowanych protokołów modyfikacji genów. Protokół ekspansji kwasu walproinowego ex vivo jest stosunkowo prosty i niezawodny. Oczyszczanie komórek CD34-dodatnich za pomocą separatora komórek jest wysoce powtarzalne i szybkie, co pozwala na szybkie odzyskanie wysoce oczyszczonych komórek CD34-dodatnich.

24 godziny przed izolacją komórek CD-34 dodatnich z krwi pępowinowej należy przygotować bufor separacyjny, dodając dwa mililitry 0,5 molowego EDTA i 33 mililitry 7,5% BSA do 465 mililitrów 1X PBS. Delikatnie wymieszaj bufor i utrzymuj go przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W dniu oczyszczenia ogrzej podłoże do temperatury pokojowej.

Dozuj całą jednostkę krwi pępowinowej do kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Rozcieńczyć krew równą objętością PBS w temperaturze pokojowej i delikatnie wymieszać. Następnie określ liczbę probówek potrzebnych do przetworzenia całej jednostki krwi pępowinowej.

Dodaj 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości do każdej probówki. Dozuj rozcieńczoną krew bardzo powoli na wierzch gradientu gęstości, trzymając probówkę pod kątem 45 stopni, aby utworzyć dwie warstwy. Odwirować probówkę o masie 400 g przez 30 minut z niską szybkością przyspieszania i zwalniania.

Po odwirowaniu komórki jednojądrzaste zostaną umieszczone w białej warstwie między warstwami osocza i ośrodków gradientu gęstości. Ostrożnie przenieś warstwę kożucha do nowej, 50-mililitrowej tubki. Zbierz wszystkie komórki jednojądrzaste z tej samej jednostki krwi pępowinowej do 50-mililitrowej probówki, aż osiągniesz 25 mililitrów.

Dodaj 25 mililitrów zimnego PBS do probówki zawierającej 25 mililitrów komórek jednojądrzastych i dobrze wymieszaj. Wirować w temperaturze 400 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 mililitrach zimnego PBS.

Następnie usuń 20 mikrolitrów zawiesiny komórek do policzenia. Użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć liczbę komórek wybarwionych oranżem akrydynowym lub jodkiem propidyny i obliczyć całkowitą liczbę komórek jednojądrzastych. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 400 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.

Najpierw wymieszaj 300 mikrolitrów buforu separacyjnego ze 100 mikrolitrami ludzkiej IgG FCR i 100 mikrolitrami kulek magnetycznych CD34, aby wyizolować komórki CD34-dodatnie z 10 milionów komórek jednojądrzastych. Następnie ostrożnie wyjmij supernatant z probówki z wcześniej odwirowanymi komórkami jednojądrzastymi. Ponownie zawiesić granulat w roztworze kulki magnetycznej, używając 500 mikrolitrów na 10 milionów komórek.

Delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Podczas inkubacji należy przygotować separator komórek, zastępując roztwór do przechowywania buforem roboczym i uruchamiając program mycia, a następnie program płukania. Następnie dodaj bufor do pracy z separatorem zimnych komórek do probówki zawierającej mieszaninę komórek, aż probówka zostanie całkowicie napełniona.

Odwirować probówkę o masie 400 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w zimnym separatorze działającym buforze przy użyciu dwóch mililitrów na 10 milionów komórek. Przenieś dwumililitrową mieszaninę zawiesiny komórek do 15-mililitrowych probówek.

Załaduj trzy zestawy probówek do stojaka separatora komórek, który został wstępnie schłodzony do czterech stopni Celsjusza. Jeden zestaw probówek zawiera MMC, drugi zestaw probówek zostanie użyty do zebrania frakcji ujemnej, a trzeci zestaw probówek zostanie użyty do zebrania oczyszczonych komórek CD34-dodatnich. Załaduj stojak do separatora komórek i uruchom zaprogramowany program.

Następnie odwirować probówki zawierające frakcję dodatnią w temperaturze 400 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić oczyszczone komórki CD34-dodatnie w jednym mililitrze pożywki bez surowicy. Następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki zabarwione pomarańczą akrydynową lub jodkiem propidyny.

Najpierw przygotuj wystarczającą objętość pożywki do pokrycia oczyszczonych komórek CD34-dodatnich o gęstości 33 000 komórek na mililitr. Umieść oczyszczone komórki CD34-dodatnie na 12-dołkowej płytce o gęstości komórek 50 000 komórek w 1,5 mililitra pożywki na dołek. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla przez 16 godzin.

Dodaj kwas walproinowy do kultur tak, aby końcowe stężenie wynosiło jeden milimol. Kontynuuj hodowlę komórek w tych samych warunkach przez dodatkowe siedem dni. W tym protokole ex vivo zwiększa się liczba prymitywnych hematopoetycznych komórek macierzystych generowanych z komórek CD34-dodatnich wyizolowanych z krwi pępowinowej.

Całkowita liczba komórek jądrzastych jest znacznie wyższa w kulturach traktowanych samym koktajlem cytokin. Pomimo większej całkowitej liczby komórek jądrzastych, liczba hematopoetycznych komórek macierzystych w kulturach, w których podawany jest sam koktajl cytokin, pozostaje niska przez cały okres ekspansji, w porównaniu z kulturami traktowanymi koktajlem cytokin i kwasem walproinowym. Największa liczba hematopoetycznych komórek macierzystych jest wytwarzana w hodowlach traktowanych kombinacją koktajlu cytokin i kwasu walproinowego.

W szczególności największą ekspansję osiąga się po pięciu do siedmiu dniach po leczeniu kwasem walproinowym. Ta zwiększona liczba hematopoetycznych komórek macierzystych koreluje z szybkim wzrostem odsetka hematopoetycznych komórek macierzystych, co jest zauważalne w ciągu 24 godzin od leczenia kwasem walproinowym. Podczas gdy wzrost odsetka utrzymuje się w ciągu pierwszych czterech dni hodowli ex vivo, stopniowo zmniejsza się po pięciu do siedmiu dniach leczenia.

Spadek ten jest jednak odwrotnie skorelowany ze wzrostem bezwzględnej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych. Szybki wzrost odsetka hematopoetycznych komórek macierzystych w kulturach traktowanych kwasem walproinowym wynika z nabycia fenotypu CD90. Komórki CD34-dodatnie wykazujące ekspresję markera fenotypowego CD90 osiągają prawie 40 do 50% komórek namnażonych w hodowlach ex vivo traktowanych koktajlem cytokin i kwasem walproinowym przez cztery dni.

Nabycie fenotypu CD90 jest następnie potwierdzane przez ekspansję ex vivo wysoko oczyszczonych komórek CD34-dodatnich, które nie mają ekspresji markera CD90. W ciągu 24 godzin od leczenia kwasem walproinowym prawie 75% rozszerzonych komórek ex vivo ulega ekspresji CD90. Ten fenotyp jest wysoce zachowany w ciągu pierwszych czterech dni w tych kulturach.

Rozcieńczoną krew pępowinową należy dozować bardzo powoli na górę gradientu gęstości, trzymając probówkę pod kątem 45 stopni, aby utworzyć dwie wyraźne warstwy. Po tej procedurze ekspansji ex vivo, rozszerzone komórki można wstrzyknąć do myszy NSG z mieloablacją w celu przetestowania ich funkcjonalności i potencjału wszczepienia. Rozszerzone komórki mogą być wykorzystane do testowania różnych pytań dotyczących biologii HSC zarówno ludzkiego, jak i mysiego oraz roli różnych genów lub kluczowego gracza w integralności funkcjonalnej HSC.

Funkcjonalność ekspandowanego ex vivo HSC z ludzkiej jednostki krwi pępowinowej, wykorzystującej tę technikę, zostanie wkrótce przetestowana w badaniu klinicznym u pacjentów z nowotworami hematologicznymi, którzy wymagają allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego. Technika ta pozwoliła nam również zbadać mechanizm leżący u podstaw ekspansji ex vivo po leczeniu VPA i uzyskać wgląd w biologię prymitywnych HSC.